PL219528B1 - Elektroda enzymatyczna do wykrywania związków fenolowych w produktach winiarskich - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest elektroda enzymatyczna przeznaczona do wykrywania związków fenolowych w produktach winiarskich, znajdująca zastosowanie w przemyśle spożywczym.

Detektory biologiczne są powszechnie stosowane w technologiach przemysłowych, spożywczych i ochronie środowiska. Urządzenie takie składa się z części biologicznej i części aparaturowej przetwarzającej sygnał odebrany przez element biologiczny. Bioczujniki mogą być oparte na receptorach chemicznych, immunologicznych lub biokatalitycznych takich jak enzymy.

Znane są bioczujniki warstwowe otrzymane z wykorzystaniem różnych technik samoorganizacji cząstek na powierzchni z kwasów tłuszczowych, fosfolipidów, porfiryn oraz kopolimerów/polimerów przewodzących.

Z chińskiego zgłoszenia patentowego nr CN102124598 znane są biosensory, których czułe elementy stanowią oksydoreduktazy kapsułkowane w liposomach i immobilizowane są na powierzchni porowatych elektrod węglowych. Tego typu elektrody enzymatyczne pełnią rolę bioczujników oraz elementów bioogniw paliwowych. Również z chińskiego zgłoszenia nr CN101710094 znany jest biosensor medyczny służący do automatycznego wykrywania erytrocytów i leukocytów we krwi, wytworzony jest z półprzepuszczalnej membrany na której immobilizowane są białka enzymatyczne. Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO2007008241 dotyczy wytwarzania i aplikacji sensora do pomiarów temperatury win butelkowanych, którego działanie oparte jest na technologiach podczerwieni. Znany jest bioczujnik wykrywający obecność metanolu w badanych próbkach win. Chemiluminescencyjny czujnik wykorzystuje w swym działaniu reakcję katalizowaną przez oksydazę alkoholanową.

W ostatnich latach coraz częściej elektrochemiczne elektrody modyfikowane są za pomocą białek enzymatycznych w celu konstrukcji selektywnych urządzeń analizujących różne substancje w przemyśle spożywczym. W systemie tego typu białka są adsorpcyjnie wiązane do układów kopolimerowych pokrywających elektrodę.

Istotą elektrody enzymatycznej do wykrywania związków fenolowych w produktach winiarskich według wynalazku jest to że zawiera warstwę aktywną w postaci tyrozynazy zimmobilizowanej adsorpcyjnie na powierzchni elektrochemicznego filmu, otrzymanego z kopolimeru w skład którego wchodzi kwas tiofeno-octowy, 3-metylotiofen oraz N-butylo-4,4'-bis(2-(3,4-etylenodioksytiofeno))-difenyloamina.

Korzystnie elektroda utworzona jest z równomolowej mieszaniny kwasu tiofeno-octowego, 3-metylotiofenu oraz N-butylo-4,4'-bis(2-(3,4-etylenodioksytiofeno))difenyloaminy oraz tyrozynazy.

Elektroda enzymatyczna według wynalazku wytworzona jest z ultracienkiego filmu elektrochemicznego i nadaje się do wykrywania różnych pochodnych fenolu w produktach winiarskich. Zaletą elektrody enzymatycznej jest jej bardzo duża czułość i fakt, że nadaje się do wykrywania różnych stężeń, a także jej szeroka aktywność substratowa. Nie bez znaczenia jest również dość długa żywotność zimmobilizowanego białka, które zachowuje swoją katalityczną aktywność w ciągu kolejnych trzydziestu cykli reakcyjnych tj. 4 miesiące. Enzymatyczna warstwa bioaktywna według wynalazku i powtarzalność otrzymanych wyników oraz różne odpowiedzi czujnika zbudowanego z kopolimeru w skład którego wchodzi kwas tiofeno-octowy, 3-metylotiofen oraz A-butylo-4,4'-bis(2-(3,4-etylenodioksytiofeno))difenyloamina, na różne stężenia związków fenolowych, typują ten materiał do budowy czujników stosowanych w przemyśle winiarskim.

Przedmiot wynalazku jest wyjaśniony w przykładzie realizacji i na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schemat pracy elektrody enzymatycznej, fig. 2 - wykres zależności aktywności tyrozynazy zmobilizowanej w elektroprzewodzącym filmie mierzonej wzrostem natężenia płynącego prądu od zmiany przyłożonego napięcia, fig. 3 - wykres zależności aktywności tyrozynazy zmobilizowanej w elektroprzewodzącym filmie mierzonej wzrostem natężenia płynącego prądu od zmiany pH środowiska reakcji.

P r z y k ł a d.

Elektroda enzymatyczna zawierająca tyrozynazę zimmobilizowaną adsorpcyjnie w elektroprzewodzącym kopolimerze wytworzonym z kwasu tiofeno-octowego, 3-metylotiofenu oraz N-butylo-4,4'-bis(2-(3,4-etylenodioksytiofeno))difenyloaminy P powstała w wyniku elektrodepozycji tyrozynazy na platynowej elektrodzie Pt modyfikowanej polimerem użytymi w równomolowych ilościach przewodzącym P. Proces elektrodepozycji białka B na modyfikowanej elektrodzie pracującej prowadzono galwano₂ statycznie przy gęstości płynącego prądu 3 mA/cm² w buforze fosforanowym o pH 7,0 w czasie 10 minut.

PL 219 528 B1

Następnie elektrodę enzymatyczną wprowadzono do naczynia pomiarowego, o pojemności 25 ml zaopatrzonego w układ dwóch elektrod: elektrodę kalomelową (SCE) jako elektrodę odniesienia Eo oraz cylindryczną elektrodę platynową jako elektrodę pomocniczą Ep. Do pomiaru aktywności zimmobilizowanej tyrozynazy użyto 0,2 mM katecholu jako substratu, rekcję katalityczną prowadzono w warunkach beztlenowych, przepuszczając przez roztwór prąd w zakresie napięć -300 - 1200 mV. Proces i pomiar aktywności zimmobilizowanej tyrozynazy prowadzono w temperaturze pokojowej w 0,01 molowym buforze fosforanowym o pH 7,0. Zmianę natężenia prądu notowano przy użyciu galwanostatu/potencjostatu ELECTROCHEMA. Układ pomiarowy w trakcie prowadzonego procesu zmieniał sygnał chemiczny na mierzalny sygnał amperometryczny.

Aktywność tyrozynazy zimmobilizowanej, przedstawiono na fig. 2 jako funkcję natężenia prądu w zależności od wzrastającego napięcia, w obecności katecholu jako substratu, linią ciągła zaznaczony jest pierwszy cykl reakcyjny, linią przerywaną - trzydziesty. Omawiane badania nad aktywnością tyrozynazy były prowadzone przy zastosowaniu katecholu, o-aminofenolu oraz L-3,4-dihydroksyfenyloalaniny jako substratów.

Przedstawiony na fig. 3 wykres uwidacznia istotny wpływ pH środowiska na katalityczne właściwości elektrody enzymatycznej.

Z przeprowadzonych badań wynika, że obecność kopolimeru zbudowanego z kwasu tiofeno-octowego, 3-metylotiofenu oraz N-butylo-4,4'-bis(2-(3,4-etylenodioksytiofeno))difenyloaminy ze względu na mediacyjny charakter elektroprzewodzącego układu, usprawnia transport elektronów, przez co znacznie poprawia aktywność katalityczną unieruchomionego białka.

Długość życia zimmobilizowanej tyrozynazy według wynalazku wynosi co najmniej 4 miesiące. Stała, wysoka zdolność utleniania substratu zachowana jest przez kolejnych 30 cykli reakcyjnych.

Aktywność tyrozynazy zimmobilizowanej w elektrochemicznym filmie stanowi około 95% aktywności użytego do immobilizacji białka natywnego.

Claims (2)

Zastrzeżenia patentowe

1. Elektroda enzymatyczna do wykrywania związków fenolowych w produktach winiarskich, znamienna tym, że zawiera warstwę aktywną w postaci tyrozynazy zimmobilizowanej adsorpcyjnie na powierzchni elektrochemicznego filmu, otrzymanego z kopolimeru w skład którego wchodzi kwas tiofeno-octowy, 3-metylotiofen oraz N-butylo-4,4'-bis(2-(3,4-etylenodioksytiofeno))-difenyloamina.

2. Elektroda według zastrz. 1, znamienna tym, że utworzona jest z równomolowej mieszaniny kwasu tiofeno-octowego, 3-metylotiofenu oraz N-butylo-4,4'-bis(2-(3,4-etylenodioksytiofeno))difenyloaminy oraz tyrozynazy.