PL219444B1

PL219444B1 - Method for producing a microvascular device

Info

Publication number: PL219444B1
Application number: PL404879A
Authority: PL
Inventors: Roman Szafran
Original assignee: Politechnika Wroclawska
Priority date: 2013-07-29
Filing date: 2013-07-29
Publication date: 2015-04-30
Also published as: PL404879A1

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania urządzenia mikronaczyniowego do badań i symulacji zjawisk transportu: przepływu krwi oraz transportu substancji, w szczególności leków, zachodzących w sieci mikronaczyń krwionośnych, w szczególności naczyniach włosowatych, arteriolach i drobnych żyłkach, w tym w naczyniach patologicznie zdegenerowanych w guzach nowotworowych.The subject of the invention is a method of producing a microvascular device for the study and simulation of transport phenomena: blood flow and transport of substances, in particular drugs, occurring in the network of microvessels, in particular capillaries, arterioles and small veins, including pathologically degenerated vessels in cancerous tumors.

Sposób wytwarzania urządzenia mikronaczyniowego znajduje zastosowane przy wytwarzaniu mikroukładów wykorzystywanych przy prowadzeniu badań podstawowych in vitro in silico z zakresu biologii i biochemii w medycynie, farmakologii i biotechnologii, umożliwiając obserwację reakcji fizjologicznych organów, tkanek i pojedynczych komórek na czynniki biofizyczne i biochemiczne. Umożliwia wytwarzanie mikrourządzeń pozwalających na badania i optymalizację transportu leków, w tym leków w postaci mikrokapsułek oraz mikro- i nanocząstek, jak również liposomów, w strukturach tkankowych i sieci naczyń krwionośnych, w szczególności mikronaczyń, zwłaszcza zwyrodniałych na skutek przebiegających zmian chorobowych w chorobach nowotworowych, arteriosklerozie, cukrzycy, nadciśnieniu czy po radioterapii. Mikrosystemy umożliwiają precyzyjną kontrolę warunków prowadzenia badań in vitro hodowli tkankowych komórek śródbłonka znane są z publikacji Wang L , Zhang Z-L., Wdzieczak-Bakala J., Pang D-W., Liu J., Chen Y. Patterning cells and shear flow conditions: Convenient observation of endothelial cell remoulding, enhanced production of angiogenesis factors and drug response. Lab Chip, 2011, 11, 4235-4240. Z kolei w publikacji Ishikawa T., Fujiwara H., Matsuki N., Yoshimoto T., Imai Y., Ueno H., Yamaguchi T Asymmetry of blood flow and cancer cell adhesion in a microchannel with symmetric bifurcation and confluence. Biomed Microdevices; 2011, 13, 159-167 opisano mikroukład z systemem kanałów w kształcie rombu wykonany metodą litografii miękkiej w polimerze PDMS do badania przepływu krwi w rozwidleniach i łącznikach kanałów typu Y. Układ ten nie odzwierciedlał jednak struktury naczyniowej tkanek. Natomiast z publikacji Tatsuya Tanaka, Takuji Ishikawa, Keiko Numayama-Tsuruta, Yohsuke Imai, Hironori Ueno, Takefumi Yoshimoto, Noriaki Matsuki, Takami Yamaguchi, Inertial migration of cancer cells in blood flaw in microchannels, Biomed Microdevices (2012) 14:25-33 znany jest mikroukład z prostym kanałem do badań migracji komórek nowotworowych Żaden z obecnie znanych układów nie umożliwiał pełnego odwzorowania rzeczywistej struktury naczyń włosowatych i arteriol tkanek, a co za tym idzie prowadzenia badań i symulacji zjawisk transportu zachodzących w guzach nowotworowych.The method of producing a microvascular device is used in the production of microcircuits used in the conduct of basic in vitro research in silico in the field of biology and biochemistry in medicine, pharmacology and biotechnology, making it possible to observe the reactions of physiological organs, tissues and individual cells to biophysical and biochemical factors. It enables the production of microdevices for research and optimization of drug transport, including drugs in the form of microcapsules and micro- and nanoparticles, as well as liposomes, in tissue structures and blood vessel networks, in particular microvessels, especially degenerated due to pathological changes in neoplastic diseases, arteriosclerosis, diabetes, hypertension or after radiotherapy. Microsystems enable precise control of the conditions for conducting in vitro tests of tissue culture of endothelial cells are known from the publications of Wang L, Zhang ZL., Wdzieczak-Bakala J., Pang DW., Liu J., Chen Y. Patterning cells and shear flow conditions: Convenient observation of endothelial cell remoulding, enhanced production of angiogenesis factors and drug response. Lab Chip, 2011, 11, 4235-4240. In turn, in the publication of Ishikawa T., Fujiwara H., Matsuki N., Yoshimoto T., Imai Y., Ueno H., Yamaguchi T Asymmetry of blood flow and cancer cell adhesion in a microchannel with symmetric bifurcation and confluence. Biomed Microdevices; 2011, 13, 159-167 describes a microcircuit with a diamond-shaped channel system made by soft lithography in PDMS for testing blood flow in Y-channel bifurcations and connectors. However, this system did not reflect the vascular structure of the tissues. From the publication of Tatsuya Tanaka, Takuji Ishikawa, Keiko Numayama-Tsuruta, Yohsuke Imai, Hironori Ueno, Takefumi Yoshimoto, Noriaki Matsuki, Takami Yamaguchi, Inertial migration of cancer cells in blood flaw in microchannels, Biomed Microdevices (2012) 14: 25-33 there is a known microcircuit with a straight channel for studying the migration of neoplastic cells. None of the currently known systems was able to fully reproduce the actual structure of capillaries and tissue arterioles, and thus to conduct research and simulation of transport phenomena occurring in neoplastic tumors.

W amerykańskim opisie patentowym nr US7517453 autorzy opisują mikrourządzenie będące modelem sieci naczyń krwionośnych w postaci prostoliniowych, prostokątnych kanałów o różnych szerokościach. Do wykonania kanałów w podłożu z elestomeru silikonowego wykorzystano klasyczną, wieloetapową metodę fotolitografii i miękkiej litografii. Na podstawie graficznego odwzorowania sieci kanałów wykonano maskę przez którą naświetlano pokryty substancją fotoaktywną wafel krzemowy. Następnie strukturę kanałów wytrawiano otrzymując matrycę odwrotną. Matrycę taką pokrywano warstwą elastomeru silikonowego, który po utwardzeniu zdejmowano z matrycy otrzymując warstwę polimerową z siecią kanałów. Przedstawiona metoda jest wieloetapowa i czasochłonna, nie umożliwia uzyskania kanałów o krawędziach nieregularnych, pofałdowanych o płynnie zmiennej głębokości, stykających się i przecinających pod różnymi kątami, cechującej się gwałtownymi przewężeniami i pęcherzykowatymi wybrzuszeniami.In the US patent no. US7517453, the authors describe a microdevice that is a model of a network of blood vessels in the form of rectilinear, rectangular channels of various widths. The classic, multi-stage method of photolithography and soft lithography was used to create channels in the silicone elastomer substrate. Based on the graphic representation of the channel network, a mask was made through which the silicon wafer covered with a photoactive substance was irradiated. The channel structure was then etched to form an inverse die. Such a matrix was covered with a layer of silicone elastomer, which after curing was removed from the matrix to obtain a polymer layer with a network of channels. The presented method is multi-stage and time-consuming, it does not make it possible to obtain channels with irregular edges, corrugated with smoothly variable depth, touching and crossing at different angles, characterized by sudden constrictions and bubble-like bulges.

Z amerykańskiego opisu patentowego nr US7725267 opisano mikrourządzenie będące modelem sieci mikronaczyń krwionośnych oraz model matematyczny służący do symulacji przepływu płynu i adhezji komórek do ścian mikronaczyń. Przedstawiona metoda fabrykacji struktury jest wieloetapowa i bazuje na czasochłonnej metodzie wytwarzania układów MEMS - fotolitografii z powtórnym nakładaniem fotorezystu oraz miękkiej litografii w elastomerze silikonowym. Metoda wymaga wytworzenia fotomasek na podstawie zdigitalizowanych obrazów naczyń krwionośnych, następnie wykonania matrycy, naświetlania fotorezystu, ponownego nakładania fotorezystu w miejscach naświetlonych w celu utworzenia wypukłości. Na tak utworzoną matrycę nakładany i utwardzany jest elastomer, który następnie jest zdejmowany z matrycy. W ten sposób otrzymywane są półokrągłe kanały o stałej średnicy (wysokości). Z nałożenia dwóch struktur o półkolistych kanałach powstaje właściwa struktura o przekroju kołowym. Zaproponowana metoda jest wieloetapowa, żmudna i pracochłonna. Część etapów musi być wykonywana ręcznie, przez co nie jest ona przystosowana do wielkoskalowej produkcji seryjnej. Przygotowanie struktury wymaga od kilkunastu do kilkudziesięciu godzin. Otrzymane struktury cechuje stała wysokość (głębokość kanału) zależna od wielkości siły napięcia powierzchniowego fotorezystu oraz kąta zwilżania powierzchni fotomaski, co uniemożliwia wytwarzanie kanałów o dowolnejU.S. Patent No. US7725267 describes a microdevice modeling a network of microvessels and a mathematical model to simulate fluid flow and cell adhesion to microvascular walls. The presented method of fabricating the structure is multi-stage and is based on the time-consuming method of producing MEMS systems - photolithography with photoresist repeated application and soft lithography in a silicone elastomer. The method requires creating photoresists based on digitized images of blood vessels, then making a matrix, irradiating the photoresist, and re-applying the photoresist in the exposed areas in order to create a relief. The elastomer is placed and hardened on the thus formed matrix, which is then removed from the matrix. In this way, semicircular channels with a constant diameter (height) are obtained. From the superposition of two structures with semicircular channels, the proper structure with a circular cross-section is created. The proposed method is multi-stage, tedious and labor-intensive. Some of the steps have to be performed manually, which is why it is not adapted to large-scale serial production. Preparation of the structure requires from several to several dozen hours. The obtained structures are characterized by a constant height (channel depth) depending on the strength of the surface tension of the photoresist and the contact angle of the photoresist surface, which makes it impossible to produce channels of any type

PL 219 444 B1 głębokości i stosunku średnicy do wysokości, jak również odwzorowanie uwypukleń, pęcherzy i przewężeń występujących w guzach nowotworowych.The depth and diameter-to-height ratio, as well as the mapping of bulges, blisters and constrictions present in neoplastic tumors.

Z polskiego zgłoszenia patentowego nr PL391030 znany jest mikrosystem przepływowy do oznaczania bioanalitów metodą optyczną w próbkach wieloskładnikowych, w szczególności płynów fizjologicznych. Mikrosystem składa się z elementu polimerowego - poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) oraz elementu ceramicznego, przy czym w elemencie polimerowym znajduje się meandryczny mikrokanał o długości odpowiednio dostosowanej do prowadzonej reakcji analitycznej z rozgałęzieniem w kształcie litery „Y”. Na końcach mikrokanału znajdują się otwory wlotowe i otwór wylotowy, natomiast element polimerowy połączony jest z elementem ceramicznym poprzez warstwę szkliwa. Przed otworem wylotowym znajduje się celka światłowodowa wraz ze światłowodami, przy czym na spodniej stronie elementu ceramicznego umieszczona jest grzałka.The Polish patent application no. PL391030 describes a flow microsystem for the optical determination of bioanalytes in multicomponent samples, in particular physiological fluids. The microsystem consists of a polymer element - poly (dimethylsiloxane) (PDMS) and a ceramic element, while the polymer element has a meandering microchannel with a length appropriately adapted to the analytical reaction carried out with a Y-shaped branch. At the ends of the microchannel there are inlet openings and an outlet opening, while the polymeric element is connected to the ceramic element through the glaze layer. In front of the outlet opening there is an optical fiber cell with optical fibers, and a heater is placed on the underside of the ceramic element.

Dotychczas znane metody wytwarzania sieci mikrokanałów nie pozwalają na oddanie rzeczywistej zdegenerowanej struktury sieci naczyń krwionośnych guzów nowotworowych Wyidealizowane kanały mikroukładów o przekroju prostokątnym lub kołowym nie są w stanie oddać zniekształceń (zwyrodnień) naczyń krwionośnych jakie występują w guzach nowotworowych, arteriosklerozie, cukrzycy, nadciśnieniu czy po radioterapii.The methods of producing a network of microchannels known so far do not allow to reflect the real degenerate structure of the network of blood vessels of neoplastic tumors. radiation therapy.

Sposób wytwarzania urządzenia mikronaczyniowego, według wynalazku, polega na tym, że w pierwszym etapie na podstawie zaprojektowanej mapy układu naczyń krwionośnych, w szczególności mikronaczyń, przygotowanej na podstawie zdjęcia fizycznej struktury, modelu matematycznego lub zgodnie z założeniami projektowymi, wytwarza się warstwy funkcjonalne oraz elementy i struktury pomocnicze, w tym celu podłoże w postaci warstwy elastomeru przygotowuje się poprzez powlekanie obrotowe nośnika w postaci folii poliestrowej oraz graweruje się struktury kanałów, po uprzednim osłonięciu powierzchni arkuszem ściśle przylegającego papieru osłonowego, poprzez naświetlanie skupioną wiązką lasera CO₂ o długości fali 10,6 μm, w drugim etapie łączy się warstwy funkcjonalne urządzenia wzajemnie lub z dnem oraz wiekiem urządzenia: warstwę funkcjonalną na nośniku z folii poliestrowej przemywa się w rozworze KOH w etanolu, naświetla się w komorze UV promieniowaniem o długości fali 185 nm i 253,7 nm, po czym łączy się z uprzednio wyprażonym w temperaturze nie niższej niż 200°C arkuszem szkła stanowiącym dno i złączoną strukturę umieszcza się na okres od 5 do 15 min na termostatowanej płycie grzejnej o temperaturze od 90 do 150°C, lub łączy się z uprzednio naświetloną w komorze UV powierzchnią z tworzywa sztucznego PMMA lub PC stanowiącą wieko urządzenia, po czym złączoną strukturę umieszcza się w prasie hydraulicznej pod naciskiem nie niższym niż 1 bar, a następnie w obecności izopropanolu usuwa się podłoże i ponownie łączy elementy uprzednio naświetlone w komorze UV w jedną całość, a następnie w trzecim etapie modyfikuje się wewnętrzne powierzchnie mikrokanałów, za pomocą elastomeru, powłoki krzemianowej i/lub roztworów i zawiesin protein, glikoprotein, proteoglikanów lub kultur komórkowych.The method of producing a microvascular device according to the invention consists in the fact that in the first step, on the basis of a designed map of the arrangement of blood vessels, in particular microvessels, prepared on the basis of a photo of the physical structure, a mathematical model or in accordance with design assumptions, functional layers and elements and auxiliary structures, for this purpose, the substrate in the form of an elastomer layer is prepared by rotating the carrier in the form of a polyester film and the channel structures are engraved, after the surface is covered with a sheet of tightly adhering casing paper, by irradiating with a focused CO ₂ laser beam with a wavelength of 10.6 μm, in the second stage, the functional layers of the device are joined together or with the bottom and the lid of the device: the functional layer on a polyester film carrier is washed in the development of KOH in ethanol, irradiated in the UV chamber with radiation with a wavelength of 185 nm and 253.7 nm, then connect y with a previously roasted at a temperature of not less than 200 ° C the glass sheet as the bottom and the bonded structure is placed for a period of 5 to 15 minutes on a thermostatic heating plate at a temperature of 90 to 150 ° C, or combined with a previously irradiated in the chamber UV with a surface made of PMMA or PC plastic, which is the lid of the device, then the connected structure is placed in a hydraulic press under a pressure of not less than 1 bar, and then in the presence of isopropanol, the substrate is removed and the elements previously exposed in the UV chamber are joined together again, and then, in a third step, the inner surfaces of the microchannels are modified with an elastomer, a silicate coating and / or solutions and suspensions of proteins, glycoproteins, proteoglycans or cell cultures.

Korzystnie jako elastomer stosuje się polidimetylosiloksan (PDMS).Preferably, polydimethylsiloxane (PDMS) is used as the elastomer.

Korzystnie w pierwszym etapie wytwarza się elementy pomocnicze, w szczególności elektrody, ścieżki sygnałowe i przewodzące ładunki elektryczne, w warstwach funkcjonalnych, dnie i wieku urządzenia, w taki sposób, że w wygrawerowane laserowo puste przestrzenie i kanały wprowadza się mechanicznie substancję przewodzącą prąd, w szczególności mieszaninę PDMS i węgla, nanorurek węglowych lub proszku metalicznego w postaci pasty.Preferably, in the first step, auxiliary elements, in particular electrodes, signal and electrically conductive paths, are produced in the functional layers, the bottom and the lid of the device, in such a way that a conductive substance, in particular a conductive substance, in particular, is mechanically introduced into the laser-engraved voids and channels. mixture of PDMS and carbon, carbon nanotubes or metallic powder in the form of a paste.

Korzystnie w drugim etapie połączone elementy umieszcza się w izopropanolu w celu ułatwienia zdjęcia folii poliestrowej, po czym usuwa się nośnik poliestrowy z powierzchni elastomeru.Preferably, in a second step, the combined elements are placed in isopropanol to facilitate removal of the polyester film, after which the polyester carrier is removed from the elastomer surface.

Korzystnie w trzecim etapie modyfikuje się średnicę kanałów za pomocą elastomeru: przetłacza się mieszaninę prepolimeru i aktywatora polimeryzacji oraz, korzystnie, rozpuszczalnika obniżającego lepkość mieszaniny, usuwa się nadmiar elastomeru, a następnie przetłacza się powietrze, po czym urządzenie umieszcza się na termostatowanej płycie grzejnej, a przez kanały przetłacza się w sposób ciągły powietrze przez okres dwóch godzin w temperaturze 60°C,Preferably, in the third step, the diameter of the channels is modified by means of an elastomer: the mixture of prepolymer and polymerization activator and, preferably, a solvent that lowers the viscosity of the mixture, are forced, excess elastomer is removed, and then air is forced, and the device is placed on a thermostatic heating plate, and air is continuously blown through the canals for a period of two hours at a temperature of 60 ° C,

Korzystnie w trzecim etapie zmniejsza się średnicę kanałów poprzez podanie do ich wnętrza prekursorów krzemionki, oraz etanolu i wody o kwaśnym odczynie i ogrzewa się do temperatury 100°C przez okres od 5 do 60 sekund, po czym nadmiar mieszaniny usuwa się z wnętrza kanałów poprzez przetłoczenie powietrza, a następnie urządzenie umieszcza się na termostatowanej płycie grzejnej w temp. 200°C w celu utwardzenia warstwy krzemionki opłaszczającej wewnętrzną powierzchnię mikrokanałów.Preferably, in the third step, the diameter of the channels is reduced by feeding silica precursors, as well as ethanol and acidic water inside them, and heated to a temperature of 100 ° C for a period of 5 to 60 seconds, after which the excess mixture is removed from the inside of the channels by forcing air, and then the device is placed on a thermostatic heating plate at 200 ° C in order to harden the silica layer covering the inner surface of the microchannels.

Korzystnie w trzecim etapie zatłacza się do kanałów roztwory i zawiesiny protein, glikoprotein, proteoglikanów lub kultur komórkowych, a następnie usuwa się ich nadmiar poprzez przetłoczeniePreferably, in the third stage, solutions and suspensions of proteins, glycoproteins, proteoglycans or cell cultures are injected into the channels, and then their excess is removed by forcing

PL 219 444 B1 powietrza i suszy przez okres od 1 do 15 minut, w wyniku czego na ich powierzchni tworzy się biokompatybilny film proteinowo białkowy.Air and drying for 1 to 15 minutes, as a result of which a biocompatible protein-protein film is formed on their surface.

Przez warstwę funkcjonalną mikrourządzenia rozumie się jedną lub kilka warstw wykonanych z elastomeru, w szczególności PDMS, które są położone pomiędzy dnem i wiekiem mikrourządzenia. W warstwie funkcjonalnej grawerowana jest struktura kanałów i komór przepływnych dla płynu i/lub nanoszona struktura przewodząca ładunki elektryczne.The functional layer of the microdevice is understood to mean one or more layers made of elastomer, in particular PDMS, which lie between the bottom and the age of the microdevice. In the functional layer, the structure of the fluid flow channels and chambers is engraved and / or an electrically conductive structure is applied.

Wielokrotne naświetlanie powierzchni skupioną wiązką lasera w różnych punktach podłoża prowadzi do powstania sieci kanałów o zmiennej geometrii, o prostych lub pofałdowanych ścianach, o zmiennej głębokości i szerokości, stykających się i krzyżujących pod dowolnym kątem, gwałtownie zwężających i rozszerzających, tworzących pęcherze i szyjki. W sposób bezpośredni możliwe jest uzyskanie kanałów o średnicy od 30 do 300 mikrometrów.Repeated irradiation of the surface with a focused laser beam at different points of the substrate leads to the formation of a network of channels of variable geometry, with straight or corrugated walls, of variable depth and width, touching and crossing at any angle, rapidly narrowing and expanding, forming blisters and necks. It is possible to obtain channels with a diameter of 30 to 300 micrometers directly.

Sposób wytwarzania urządzenia mikronaczyniowego, według wynalazku jest wydajny, prosty i bezpośredni - kanały są bezpośrednio grawerowane w strukturze PDMS, a nie jest tworzona matryca, która dopiero służy do wytworzenia właściwych kanałów tak jak ma to miejsce w litografii miękkiej Sposób według wynalazku umożliwia wytworzenie mikrourządzenia w zautomatyzowany sposób dzięki prostej sekwencji powtarzalnych czynności, przez co znajduje zastosowanie do szybkiego wytwarzania urządzeń prototypowych jak i wielkoskalowej produkcji seryjnej. Nie wymaga stosowania pomieszczeń czystych (ang. clean room) oraz drogich urządzeń i odczynników chemicznych stosowanych w metodach wytwarzania układów MEMS, w szczególności nie wymaga przygotowania fotomasek oraz matryc replikacji. Umożliwia przygotowanie funkcjonalnego urządzenia mikronaczyniowego składającego się z: pojedynczej lub wielokrotnej cienkiej warstwy elastomeru, w szczególności PDMS z wygrawerowaną strukturą odwzorowującą w sposób dokładny fizyczną sieć naczyń krwionośnych, w szczególności zdegenerowaną na skutek zmian chorobowych, w postaci łączących i rozchodzących się oraz przecinających pod dowolnym kątem naczyń krwionośnych w szczególności mikronaczyń (arteriol, żyłek, naczyń włosowatych oraz ich kombinacji) o dowolnie zmiennym kształcie, średnicy i wysokości oraz komór i kanałów pomocniczych magazynujących, doprowadzających i odprowadzających płyny z sieci naczyń oraz elementów pomocniczych, w szczególności dna i wieka, zaopatrzonych w jeden lub więcej otworów i/lub portów przyłączeniowych dla kapilar doprowadzających i odprowadzających płyny z układu, jak również elementów przewodzących ładunki elektryczne, w szczególności elektrod, ścieżek przewodzących i sygnałowych oraz przyłączy dla układów pomiarowych.The method of producing a microvascular device, according to the invention, is efficient, simple and direct - the channels are directly engraved in the PDMS structure, and no matrix is created that only serves to create the right channels, as it is in the case of soft lithography. automated method thanks to a simple sequence of repetitive activities, which makes it applicable for the rapid production of prototype devices as well as large-scale serial production. It does not require the use of clean rooms and expensive devices and chemical reagents used in the methods of producing MEMS systems, in particular, it does not require the preparation of photoresists and replication matrices. It enables the preparation of a functional microvascular device consisting of: a single or multiple thin layer of elastomer, in particular PDMS with an engraved structure that accurately reflects the physical network of blood vessels, in particular degenerated due to lesions, in the form of connecting and diverging and intersecting at any angle blood vessels, in particular microvessels (arteriol, venules, capillaries and their combinations) of any shape, diameter and height, as well as auxiliary chambers and channels for storing, supplying and draining fluids from the vascular network and auxiliary elements, in particular the bottom and lid, provided with one or more openings and / or connection ports for capillaries supplying and discharging fluids from the system, as well as electrically conductive elements, in particular electrodes, conductive and signal paths and connections for the systems in measuring.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach wykonaniaThe subject of the invention is presented in more detail in the examples of implementation

P r z y k ł a d 1P r z k ł a d 1

Sposób wytworzenia urządzenia mikronaczyniowego do symulacji przepływu krwi w mikronaczyniach krwionośnych modelowego guza nowotworowego.A method of producing a microvascular device for simulating blood flow in microvessels of a model neoplastic tumor.

a) Projektowanie urządzeniaa) Designing the device

Na podstawie obrazu rastrowego struktury modelowej guza nowotworowego opracowanej na podstawie wyników symulacji komputerowych unaczynienia tkanek nowotworowych, przygotowywana została mapa układu naczyń krwionośnych, w szczególności mikronaczyń. W tym celu obraz w postaci pliku rastrowego wczytywany został do oprogramowania typu CAD w skali 1:1 na jedną z warstw rysunkowych. Następnie na wczytaną strukturę na kolejnej warstwie rysunkowej naniesione zostały linie i polilinie oraz wypełnione pola w kształcie prostokątów i trójkątów oraz okręgów o początkach i końcach umieszczonych w początkach i końcach naczyń krwionośnych uwidocznionych na obrazie rastrowym i oddające w sposób dokładny kształt naczyń. Naczynia krwionośne o różnej średnicy i głębokości odwzorowane zostały na różnych warstwach i przypisywane zostały im inne kolory z palety barw. W ten sposób uzyskano wektorową mapę mikrokanałów odpowiadającą w sposób dokładnych geometrii naczyń krwionośnych zobrazowanych na obrazie rastrowym, kodującą za pomocą kolorów średnicę i wysokość kanału. Do mapy mikrokanałów dorysowano na oddzielnej warstwie rysunkowej i w innym kolorze strukturę kanałów pomocniczych doprowadzających i odprowadzających płyny z sieci mikrokanałów oraz komory.Based on the raster image of the model structure of the neoplastic tumor, developed on the basis of the results of computer simulations of the vascularization of neoplastic tissues, a map of the blood vessel system, in particular microvessels, was prepared. For this purpose, the image in the form of a raster file was loaded into CAD software in a 1: 1 scale on one of the drawing layers. Then, lines and polylines as well as filled boxes in the shape of rectangles and triangles as well as circles with beginnings and ends placed at the beginnings and ends of the blood vessels shown in the raster image and accurately reflecting the shape of the vessels were marked on the loaded structure on the next drawing layer. Blood vessels of different diameters and depths were mapped on different layers and different colors were assigned to them from the color palette. In this way, a vector map of microchannels was obtained which corresponded precisely to the geometry of blood vessels visualized in the raster image, coding the diameter and height of the canal with the use of colors. The structure of auxiliary channels supplying and discharging fluids from the microchannel network and the chamber was drawn on a separate drawing layer and in a different color to the microchannel map.

Na oddzielnej warstwie rysunkowej narysowano w skali 1:1 prostokątny kształt dna i wieka oraz otwory do których przyłączane będą kapilary doprowadzające i odprowadzające płyny z mikrourządzenia. Elementy dna i wieka przestrzennie pokrywały się z odpowiedniki zakończeniami kanałów na bezpośrednio przylegającej do nich warstwie funkcjonalnej.On a separate drawing layer, the rectangular shape of the bottom and the lid as well as the openings to which the capillaries supplying and discharging liquids from the microdevice will be connected will be drawn. The elements of the bottom and the lid spatially coincided with the counterparts with the ends of the channels on the functional layer immediately adjacent to them.

Rysunek zaprojektowanego mikrourządzenia został bezpośrednio wyeksportowany ze środowiska graficznego CAD do środowiska pracy stacji grawerującej w sposób sekwencyjny kolejno dla każPL 219 444 B1 dej z warstw funkcjonalnych oraz dna i wieka mikrourządzenia, w ten sposób, że warstwy rysunkowe składające się na projekt jednej warstwy funkcjonalnej lub dna lub wieka mikrourządzenia zostały wyeksportowane jednocześnie, podczas gdy pozostałe warstwy rysunkowe były wyłączone.The drawing of the designed microdevice was directly exported from the CAD graphical environment to the working environment of the engraving station in a sequential manner for each of the functional layers and the bottom and lid of the microdevice, in such a way that the drawing layers making up the design of one functional layer or the bottom microdevice or lid were exported at the same time, while other drawing layers were turned off.

b) Fabrykacja elementów mikrourządzeniab) Fabrication of microdevice components

Warstwę funkcjonalną o grubości 100 mikrometrów wytworzono metodą powlekania obrotowego w powlekaczu obrotowym (ang. spin coater) w ten sposób, że mieszanina prepolimeru PDMS (polidimetylosiloksanu) i aktywatora polimeryzacji w stosunku wagowym 10:1 została odpowietrzona pod ₃ próżną, a następnie zadana w ilości 5 cm³ na wirujący z prędkością 700 obrotów na minutę w komorze roboczej powlekacza dysk o średnicy 100 mm wykonany z folii poliestrowej (folia do wydruków kserograficznych). Materiał był następnie wirowany przez 3 minuty, po czym zmniejszano stopniowo prędkość obrotową dysku przez 1 minutę do zera. W trakcie prowadzenia procesu powlekania w komorze powlekacza wytwarzane było nadciśnienie za pomocą doprowadzonego sprężonego, pozbawionego pyłów suchego powietrza. Następnie folia poliestrowa wraz z naniesioną warstwą elastomeru umieszczona została w szklanej szalce Petriego w suszarce szafkowej, w której zachodził proces polimeryzacji w temperaturze 60°C na okres trzech godzin. Następnie na powierzchnię polimeru naniesiono arkusz przylegającego papieru osłonowego (papier wagowy) w celu ochrony przed zabrudzeniem pyłami podczas grawerowania. Gotowe podłoże przechowywano w eksykatorze nad sitami molekularnymi 4A w atmosferze suchego powietrza o wilgotności względnej 1%.A functional layer having a thickness of 100 micrometers was prepared by spin coating in a spin coater (ang. Spin coater) in such a way that the prepolymer mixture of PDMS (polydimethylsiloxane) and an activator of polymerization in a weight ratio of 10: 1 was deaerated under _three vain, and the desired amount 5 cm ³ on a 100 mm diameter disc rotating at a speed of 700 revolutions per minute in the coater's working chamber made of polyester foil (foil for xerographic printouts). The material was then centrifuged for 3 minutes after which the rotational speed of the disc was gradually reduced to zero over 1 minute. During the coating process, an overpressure was generated in the coater chamber by means of compressed, dust-free dry air. Then the polyester film with the applied elastomer layer was placed in a glass Petri dish in a drying cabinet, in which the polymerization process took place at a temperature of 60 ° C for three hours. A sheet of adhering casing paper (weighing paper) was then applied to the surface of the polymer to prevent dust contamination during engraving. The finished substrate was stored in a desiccator above 4A molecular sieves in an atmosphere of dry air with a relative humidity of 1%.

Następnie podłoże grawerowano skupioną wiązką lasera CO₂ o długości fali 10.6 μm o mocy 30 wat w miejscach, w których zgodnie z projektem warstwa elastomeru miała zostać płytko grawerowana lub przecięta do powierzchni nośnika. W tym celu dla każdej linii o określonym kolorze przyporządkowano wektorowy tryb pracy stacji grawerującej oraz ustalono moc wiązki laserowej w zakresie 0,1-100% mocy znamionowej, częstotliwość impulsu w zakresie 100-1000 DPI, prędkość przesuwu głowicy laserowej w zakresie 0,00025 m/s - 0,25 m/s, jak również odległość płaszczyzny roboczej od punktu ogniskowania wiązki laserowej w zakresie 0,1-10 mm. W zależności od kombinacji parametrów uzyskano kanały o średnicach od 30 do 300 mikronów o głębokościach od 30 do 100 mikronów w wierzchniej warstwie PDMS, jak również możliwe było całkowite przecięcie podłoża dzięki czemu wycięto arkusz warstwy funkcjonalnej dopasowany do dna i wieka mikrourządzenia. Dla uzyskania komór o średnicy 5 mm zastosowano tryb rastrowy usuwając zbędny PDMS z wnętrza komory wiązką lasera. Dla uzyskania kanałów o średnicy powyżej 0,3 mm zastosowano tryb wektorowy. W tym trybie przecięto na obrzeżach kanału warstwę elastomeru do powierzchni nośnika, a następnie usunięto mechanicznie PDMS z wnętrza kanału za pomocą ostrego szpikulca pod mikroskopem stereoskopowym.Subsequently, the substrate was engraved with a focused CO ₂ laser beam with a wavelength of 10.6 μm at 30 watts at the places where, according to the design, the elastomer layer was to be shallowly engraved or cut to the surface of the carrier. For this purpose, for each line of a specific color, the vector operating mode of the engraving station was assigned and the power of the laser beam was set in the range of 0.1-100% of the rated power, the pulse frequency in the range of 100-1000 DPI, the speed of the laser head in the range of 0.00025 m / s - 0.25 m / s, as well as the distance of the working plane from the focal point of the laser beam in the range of 0.1-10 mm. Depending on the combination of parameters, channels with diameters from 30 to 300 microns with depths from 30 to 100 microns in the top layer of PDMS were obtained, as well as it was possible to completely cut the substrate, thanks to which a sheet of the functional layer was cut to fit the bottom and lid of the microdevice. To obtain chambers with a diameter of 5 mm, the raster mode was used, removing unnecessary PDMS from the inside of the chamber with a laser beam. The vector mode was used to obtain channels with a diameter greater than 0.3 mm. In this mode, the elastomer layer at the periphery of the canal was cut to the surface of the support, and then the PDMS was mechanically removed from the inside of the canal with a sharp spike under a stereoscopic microscope.

Dno mikrourządzenia wykonano ze szkła, a wieko z PMMA (polimetakrylanu metylu) w ten sposób, że arkusz materiału przecięto z wykorzystaniem skupionej wiązki lasera CO2 o mocy 30 wat otrzymując prostokątne arkusze o wymiarach 76x26 mm. W wieku wykonano otwory służące do przyłączenia kapilar doprowadzających i odprowadzających płyny.The bottom of the microdevice is made of glass and the lid of PMMA (polymethyl methacrylate) so that the material sheet is cut with a focused 30 watt CO2 laser beam to give rectangular sheets with dimensions of 76 x 26 mm. In the lid, holes were made to connect the capillaries supplying and draining fluids.

c) Łączenie elementów mikrourządzeniac) Connecting microdevice components

W celu przeniesienia warstwy elastomeru z nośnika oraz trwałego i szczelnego hydraulicznie połączenia z dnem mikrourządzenia usunięto z powierzchni elastomeru ochronny arkusz papieru osłonowego. Następnie warstwę funkcjonalną na nośniku z folii poliestrowej przemyto roztworem KOH ₃ w etanolu o stężeniu 40 g/dm³, po czym trzykrotnie przemyto wodą dejonizowanej i wysuszono w strumieniu czystego sprężonego powietrza . Następnie arkusz szkła (szkiełko mikroskopowe podstawowe) wyprażono w temperaturze 200°C w piecu, w atmosferze powierza w czasie 30 minut. Następnie warstwę funkcjonalną naświetlono w komorze UV promieniowaniem o długości fali 185 nm i 253,7 nm przez 1 minutę. Następnie oba elementy umieszczono i połączono w dopasowanym szablonie, przy czym temperatura szkła wynosiła 150°C. Po dociśnięciu elementów za pomocą wałka gumowego i usunięciu pęcherzy powietrza pomiędzy warstwami, zespół umieszczono na termostatowanej płycie grzejnej o temperaturze 120°C na okres 10 min, po czym elementy umieszczono w prasie hydraulicznej pod naciskiem 1 bara na okres 20 min. Następnie połączone elementy zanurzono na okres 5 sekund w izopropanolu, po czym usunięto nośnik poliestrowy z powierzchni elastomeru.A protective sheet of casing paper was removed from the elastomer surface in order to transfer the elastomer layer from the carrier and to permanently and hydraulically connect to the bottom of the microdevice. The functional layer on the polyester film carrier was then washed with a 40 g / dm ³ _{KOH 3} solution in ethanol, then washed three times with deionized water and dried in a stream of clean compressed air. The glass sheet (microscope slide) was then calcined at 200 ° C in an oven under air for 30 minutes. Then the functional layer was irradiated in a UV chamber with radiation of wavelength 185 nm and 253.7 nm for 1 minute. The two pieces were then placed and joined into a matching template, the glass temperature being 150 ° C. After pressing the elements with a rubber roller and removing the air bubbles between the layers, the assembly was placed on a thermostatic heating plate at a temperature of 120 ° C for a period of 10 minutes, and then the elements were placed in a hydraulic press under the pressure of 1 bar for a period of 20 minutes. The connected elements were then immersed in isopropanol for 5 seconds, after which the polyester support was removed from the elastomer surface.

W celu trwałego i szczelnego wzajemnego połączenia warstwy funkcjonalnej z wiekiem mikrourządzenia wykonanym z PMMA oba elementy - zespół dna i warstwy funkcjonalnej oraz wieko naświetlono w komorze UV promieniowaniem o długości fali 185 nm i 253,7 nn i w atmosferze powietrza, przy czym powierzchnie podlegające łączeniu były skierowane bezpośrednio w kierunku źródła promieniowania UV. Następnie oba elementy pozycjonowano wzajemnie i połączono, po czym dociśnięto za pomocą wałka gumowego i umieszczono w prasie hydraulicznej pod naciskiem 1 bar na okres 10 minut.In order to permanently and tightly connect the functional layer with the age of the PMMA microdevice, both elements - the bottom and functional layer assembly and the lid were irradiated in the UV chamber with radiation with a wavelength of 185 nm and 253.7 nn and in the air atmosphere, while the surfaces to be joined were directed directly towards the source of UV radiation. Then, both elements were positioned and joined together, then pressed with a rubber roller and placed in a hydraulic press under a pressure of 1 bar for a period of 10 minutes.

PL 219 444 B1PL 219 444 B1

d) Modyfikacja światła oraz wewnętrznej powierzchni mikrokanałówd) Modification of the light and the inner surface of the microchannels

W celu zmniejszenia pola powierzchni przekroju mikrokanałów przez ich wnętrze przetłoczono mieszaninę prepolimeru PDMS oraz aktywatora polimeryzacji w stosunku wagowym 10:1 z dodatkiem rozpuszczalnika - alkoholu amylowego w proporcjach wagowych 1:1, za pomocą pompy strzykawkowej. Mieszaninę przed podaniem do wnętrza kanałów odpowietrzono pod próżnią. Nadmiar mieszaniny z wnętrza kanałów usunięto poprzez odessanie nadmiaru za pomocą strzykawki, a następnie przetłaczano powietrze z natężeniem przepływu 1 ml/min. Następnie mikrourządzenie umieszczono na termostatowanej płycie grzejnej o temperaturze 75°C, a przez kanały przetłaczano w sposób ciągły powietrze z natężeniem 0,5 ml/min o temperaturze 75°C przez okres 2 godzin. W ten sposób otrzymano kanały o średnicy 15 mikrometrów.In order to reduce the cross-sectional area of the microchannels through their interior, a mixture of PDMS prepolymer and a polymerization activator in a weight ratio of 10: 1 with the addition of a solvent - amyl alcohol in a weight ratio of 1: 1 was forced through their interior using a syringe pump. The mixture was deaerated in vacuo prior to entering the channels. The excess mixture inside the channels was removed by aspirating the excess with a syringe, and then forcing air at a flow rate of 1 ml / min. The microdevice was then placed on a thermostatic heating plate at 75 ° C, and air was continuously pumped through the channels at a rate of 0.5 ml / min at 75 ° C for 2 hours. Thus, channels with a diameter of 15 micrometers were obtained.

Następnie wewnętrzną powierzchnię kanałów opłaszczono za pomocą wodnego roztworu kolagenu o stężeniu 7 mg/ml, w ten sposób że mieszaninę podano do wnętrza mikrokanałów, po czym niezwłocznie nadmiar mieszaniny z wnętrza kanałów usunięto poprzez odessanie za pomocą strzykawki, a następnie przetłoczono powietrze z natężeniem 3 ml/min przez okres 10 min w celu wysuszenia powierzchni mikrokanałów. W efekcie w kanałach utworzył się biokompatybilny film kolagenowy opłaszczający ich wewnętrzną powierzchnię.Then the inner surface of the channels was coated with an aqueous solution of collagen at a concentration of 7 mg / ml, in such a way that the mixture was fed inside the microchannels, and immediately the excess mixture inside the channels was removed by suction with a syringe, and then air was forced through at 3 ml. / min for 10 minutes in order to dry the surface of the microchannels. As a result, a biocompatible collagen film was formed in the channels, covering their inner surface.

P r z y k ł a d 2P r z k ł a d 2

Sposób wytworzenia trójwymiarowego (wielowarstwowego) urządzenia mikronaczyniowego do separacji składników krwi.A method of producing a three-dimensional (multilayer) microvascular device for the separation of blood components.

a) Projektowanie mikrourządzeniaa) Microdevice design

W oprogramowaniu typu CAD w skali 1:1 na jednej z warstw rysunkowych naniesione zostały zgodnie z założeniami projektowymi linie i polilinie oraz wypełnione pola w kształcie prostokątów i trójkątów oraz okręgów. Mikrokanały o różnej średnicy i głębokości odwzorowywane zostały na różnych warstwach i przypisywane zostały im inne kolory z palety barw. W ten sposób uzyskano wektorową mapę mikrokanałów kodującą za pomocą kolorów średnicę i wysokość kanału. Do mapy mikrokanałów dorysowano na oddzielnej warstwie rysunkowej i w innym kolorze strukturę kanałów pomocniczych doprowadzających i odprowadzających płyny z sieci mikrokanałów oraz komory. Na oddzielnej warstwie rysunkowej narysowano w skali 1:1 narysowano układ elementów przewodzących prąd: elektrody oraz ścieżki przewodzące i przyłącza elektryczne za pomocą linii i polilini oraz wypełnionych pól w kształcie prostokątów, trójkątów oraz okręgów w różnym kolorze, tak aby ich położenie względem sieci mikrokanałów i kształt odpowiadały projektowanej strukturze.In the CAD software in the 1: 1 scale, lines and polylines as well as filled boxes in the shape of rectangles, triangles and circles were marked on one of the drawing layers in accordance with the design assumptions. Microchannels of different diameters and depths were mapped on different layers and different colors from the color palette were assigned to them. In this way, a vector map of microchannels was obtained, coding the diameter and height of the channel using colors. The structure of auxiliary channels supplying and discharging fluids from the microchannel network and the chamber was drawn on a separate drawing layer and in a different color to the microchannel map. On a separate drawing layer, in a 1: 1 scale, a system of current-conducting elements is drawn: electrodes, conductive paths and electrical connections using lines and polylines and filled fields in the shape of rectangles, triangles and circles of different colors, so that their position in relation to the microchannel network and the shape corresponded to the designed structure.

Na oddzielnej warstwie rysunkowej narysowano w skali 1:1 prostokątny kształt dna i wieka oraz otwory do których przyłączane będą kapilary doprowadzające i odprowadzające płyny z mikrourządzenia oraz otwory do przyłączy elektrycznych. Elementy dna i wieka przestrzennie pokrywały się z odpowiednimi zakończeniami kanałów na bezpośrednio przylegającej do nich warstwie funkcjonalnej.On a separate drawing layer, the rectangular shape of the bottom and the lid, as well as the openings to which the capillaries supplying and discharging liquids from the microdevice, and the openings for electrical connections will be connected, are drawn. The elements of the bottom and the lid spatially coincided with the corresponding ends of the channels on the functional layer directly adjacent to them.

Rysunek zaprojektowanego mikrourządzenia został bezpośrednio wyeksportowany ze środowiska graficznego CAD do środowiska pracy stacji grawerującej w sposób sekwencyjny kolejno dla każdej z warstw funkcjonalnych oraz dna i wieka mikrourządzenia, w ten sposób, że warstwy rysunkowe składające się na projekt jednej warstwy funkcjonalnej lub dna lub wieka mikrourządzenia zostały wyeksportowane jednocześnie, podczas gdy pozostałe warstwy rysunkowe były wyłączone.The drawing of the designed microdevice was directly exported from the CAD graphic environment to the working environment of the engraving station in a sequential manner for each of the functional layers and the bottom and lid of the microdevice, in such a way that the drawing layers constituting the design of one functional layer or the bottom or lid of the microdevice were exported simultaneously while other drawing layers were turned off.

Dwie warstwy funkcjonalne (jedna zawierająca mikrokanały i jedna zawierająca elektrody oraz ścieżki przewodzące) o grubości 50 mikrometrów każda, wytworzono metodą powlekania obrotowego w powlekaczu obrotowym (ang spin coater) w ten sposób, że mieszanina prepolimeru PDMS (polidimetylosiloksanu) i aktywatora polimeryzacji w stosunku wagowym 10 I została odpowietrzona pod ₃ próżną, a następnie zadana w ilości 5 cm³ na wirujący z prędkością 1200 obrotów na minutę w komorze roboczej powlekacza dysk o średnicy 100 mm wykonany z folii poliestrowej (folia do wydruków kserograficznych). Materiał był następnie wirowany przez 1 minutę, po czym zmniejszano stopniowo prędkość obrotową dysku przez 1 minutę do zera. W trakcie prowadzenia procesu powlekania w komorze powlekacza wytwarzane było nadciśnienie za pomocą doprowadzonego sprężonego pozbawionego pyłów suchego powietrza. Następnie folia poliestrowa wraz z naniesioną warstwą elastomeru umieszczona została w szklanej szalce Petriego w suszarce szafkowej, w której zachodził proces polimeryzacji w temperaturze 60°C na okres trzech godzin. Następnie na powierzchnię polimeru naniesiono arkusz przylegającego papieru osłonowego (papier wagowy) w celu ochrony przed zabrudzeniem podczas grawerowania laserowego. Gotowe podłoże przechowywano w eksykatorze nad sitami molekularnymi 4A w atmosferze suchego powietrza o wilgotności względnej 1%.Two functional layers (one containing microchannels and one containing electrodes and conducting paths) with a thickness of 50 micrometers each, were produced by the spin coater method in such a way that a mixture of PDMS prepolymer (polydimethylsiloxane) and polymerization activator in a weight ratio 10 I was deaerated under ₃ vacuum, and then applied in the amount of 5 cm ³ to a 100 mm diameter disc, rotating at 1200 rpm in the coater working chamber, made of polyester foil (foil for xerographic printouts). The material was then centrifuged for 1 minute after which the rotation speed of the disc was gradually reduced to zero over 1 minute. During the coating process, an overpressure was generated in the coater chamber by means of compressed, dust-free dry air. Then the polyester film with the applied elastomer layer was placed in a glass Petri dish in a drying cabinet, in which the polymerization process took place at a temperature of 60 ° C for three hours. A sheet of adhering casing paper (weighing paper) was then applied to the surface of the polymer to protect against soiling during laser engraving. The finished substrate was stored in a desiccator above 4A molecular sieves in an atmosphere of dry air with a relative humidity of 1%.

PL 219 444 B1PL 219 444 B1

Następnie podłoże grawerowano skupioną wiązką lasera CO₂ o długości fali 10,6 μm o mocy 30 wat w miejscach, w których zgodnie z projektem warstwa elastomeru miała zostać powierzchniowo grawerowana lub przecięta do powierzchni nośnika. W tym celu dla każdej linii o określonym kolorze przyporządkowano wektorowy tryb pracy stacji grawerującej oraz ustalono moc wiązki laserowej w zakresie 0,1-100% mocy znamionowej, częstotliwość impulsu w zakresie 100-1000 DPI, prędkość przesuwu głowicy laserowej w zakresie 0,00025 m/s-0,25 m/s, jak również odległość płaszczyzny roboczej od punktu ogniskowania wiązki laserowej w zakresie 0,1-10 mm. W zależności od kombinacji parametrów uzyskano kanały o średnicach od 30 do 300 mikronów o głębokościach od 30 do 50 mikronów w wierzchniej warstwie PDMS, jak również możliwe było całkowite przecięcie podłoża dzięki czemu wycięto arkusz warstwy funkcjonalnej dopasowany do dna i wieka mikrourządzenia. Dla uzyskania kanałów o średnicy powyżej 0,3 mm oraz komór o średnicy 2 i 4 mm zastosowano tryb wektorowy. W tym trybie przecięto na obrzeżach kanału i komory warstwę PDMS do powierzchni nośnika, a następnie usunięto mechanicznie PDMS z wnętrza kanału oraz komór za pomocą ostrego szpikulca pod mikroskopem stereoskopowym.The substrate was then engraved _{with a 10.6 μm, 30 watt, focused CO 2} laser beam where the elastomer layer was designed to be surface engraved or cut into the carrier surface. For this purpose, for each line of a specific color, the vector operating mode of the engraving station was assigned and the power of the laser beam was set in the range of 0.1-100% of the rated power, the pulse frequency in the range of 100-1000 DPI, the speed of the laser head in the range of 0.00025 m / s-0.25 m / s, as well as the distance of the working plane from the focal point of the laser beam in the range of 0.1-10 mm. Depending on the combination of parameters, channels with diameters from 30 to 300 microns with depths from 30 to 50 microns in the top layer of PDMS were obtained, as well as it was possible to completely cut the substrate, thanks to which a functional layer sheet was cut to fit the bottom and lid of the microdevice. The vector mode was used to obtain channels with a diameter greater than 0.3 mm and chambers with a diameter of 2 and 4 mm. In this mode, the PDMS layer was cut at the periphery of the canal and the chambers to the surface of the carrier, and then the PDMS was mechanically removed from the inside of the canal and the chambers using a sharp spike under a stereoscopic microscope.

Warstwę funkcjonalną na której rozmieszczone zostały ścieżki przewodzące oraz elektrody wykonano w ten sposób, że ich strukturę wg projektu wygrawerowano w podłożu w sposób opisany powyżej. Z obszarów z których została usunięta warstwa elastomeru wprowadzono mechanicznie za pomocą ostrza skalpela pastę przewodzącą prąd będącą mieszaniną prepolimeru PDMS oraz aktywatora polimeryzacji w stosunku wagowym 10:1 oraz węgla pierwiastkowego (carbon black) w stosunku wagowym 2:10 do PDMS. Następnie element umieszczono w suszarce szafkowej w temperaturze 60°C na okres 3 godzin.The functional layer on which the conductive paths and electrodes were arranged were made in such a way that their structure according to the design was engraved in the substrate in the manner described above. From the areas where the elastomer layer was removed, a conductive paste was mechanically introduced using a scalpel blade, consisting of a mixture of PDMS prepolymer and polymerization activator in a weight ratio of 10: 1 and carbon black in a weight ratio of 2:10 to PDMS. Then the element was placed in a drying cabinet at 60 ° C for 3 hours.

Dno mikrourządzenia wykonano ze szkła, a wieko z PMMA (polimetaktylanu metylu) w ten sposób, że arkusz materiału przecięto z wykorzystaniem skupionej wiązki lasera CO2 o mocy 30 wat otrzymując prostokątne arkusze o wymiarach 76x26 mm. W wieku wykonano otwory służące do przyłączenia kapilar doprowadzających i odprowadzających płyny.The bottom of the microdevice is made of glass and the lid of PMMA (polymethyl methacrylate) so that the material sheet is cut with a focused 30 watt CO2 laser beam to give rectangular sheets with dimensions of 76 x 26 mm. In the lid, holes were made to connect the capillaries supplying and draining fluids.

c) Łączenie elementów mikrourządzeniac) Connecting microdevice components

W celu przeniesienia warstwy PDMS z nośnika oraz trwałego i szczelnego hydraulicznie połączenia warstwy funkcjonalnej zawierającej mikrokanały z dnem mikrourządzenia usunięto z powierzchni elastomeru ochronny arkusz papieru osłonowego. Następnie warstwę funkcjonalną na no₃ śniku z folii poliestrowej przemyto roztworem KOH w etanolu o stężeniu 40 g/dm³, po czym trzykrotnie przemyto wodą dejonizowanej i wysuszono w strumieniu czystego sprężonego powietrza. Następnie arkusz szkła (szkiełko mikroskopowe podstawowe) wyprażono w temperaturze 250°C w piecu, w atmosferze powierza w czasie 45 minut. Następnie warstwę funkcjonalną naświetlono w komorze UV promieniowaniem o długości fali 185 nm i 253,7 nm przez 1,5 minuty. Następnie oba elementy umieszczono i połączono w dopasowanym szablonie, przy czym temperatura szkła wynosiła 150°C. Po dociśnięciu elementów za pomocą wałka gumowego i usunięciu pęcherzy powietrza pomiędzy warstwami, zespół umieszczono na termostatowanej płycie grzejnej o temperaturze 150°C na okres 5 min, po czym elementy umieszczono w prasie hydraulicznej pod naciskiem 2 bar na okres 10 min. Następnie połączone elementy zanurzono na okres 5 sekund w izopropanolu, po czym usunięto nośnik poliestrowy z powierzchni elastomeru. W celu trwałego i szczelnego wzajemnego połączenia warstwy funkcjonalnej zawierającej mikrokanały oraz warstwy zawierającej ścieżki przewodzące i elektrody oraz warstwy funkcjonalnej zawierającej elektrody i ścieżki przewodzące z wiekiem wykonanym z PMMA przeprowadzono procedurę opisaną powyżej z tą różnicą, że łączonego arkusza tworzywa sztucznego lub warstwy funkcjonalnej nie wygrzewano w piecu, ale naświetlano obydwa elementy w komorze UV, po czym złączono obydwa elementy, dociśnięto za pomocą wałka gumowego i umie-szczono w prasie hydraulicznej pod naciskiem 1 bar na okres 30 minut.In order to transfer the PDMS layer from the carrier and to permanently and hydraulically connect the functional layer containing microchannels to the bottom of the microdevice, a protective sheet of casing paper was removed from the elastomer surface. Then the functional layer ₃ on śniku no polyester film was washed with a solution of KOH in ethanol at a concentration of 40 g / dm ³ and then washed three times with deionized water and dried in a stream of clean air. The glass sheet (microscope slide) was then calcined at 250 ° C in an oven under air for 45 minutes. Then, the functional layer was irradiated in a UV chamber with radiation with a wavelength of 185 nm and 253.7 nm for 1.5 minutes. The two pieces were then placed and joined into a matching template, the glass temperature being 150 ° C. After pressing the elements with a rubber roller and removing the air bubbles between the layers, the assembly was placed on a thermostatic heating plate with a temperature of 150 ° C for a period of 5 minutes, then the elements were placed in a hydraulic press under a pressure of 2 bar for a period of 10 minutes. The connected elements were then immersed in isopropanol for 5 seconds, after which the polyester support was removed from the elastomer surface. In order to permanently and tightly connect the functional layer containing microchannels and the layer containing conductive tracks and electrodes, and the functional layer containing electrodes and conducting tracks with an age made of PMMA, the procedure described above was carried out with the difference that the bonded plastic sheet or functional layer was not annealed in in the oven, but both elements were irradiated in a UV chamber, then both elements were joined, pressed with a rubber roller and placed in a hydraulic press under a pressure of 1 bar for 30 minutes.

W celu zmniejszenia pola powierzchni przekroju mikrokanałów do ich wnętrza podano mieszaninę prekursorów krzemionki, którą przygotowano w ten sposób, że równomolową mieszaninę tetraetyloortokrzemianu, tetrametyloortokrzemianu oraz etanolu i wody o pH 4,5 ogrzewano w temperaturze 200°C przez okres 10 min do czasu zaniku zmętnienia. Następnie umieszczono ją w komorze suszarki szafkowej w temp. 65°C na okres 12 godzin. Następnie mieszaninę zatłoczono do kanałów mikrourządzenia i ogrzewano do temperatury 100°C przez 10 sekund, po czym nadmiar mieszaniny usunięto z wnętrza kanałów poprzez przetłoczenie powietrza z natężeniem 0,5 ml/min przez okres 1 minuty. Następnie mikrourządzenie umieszczono na termostatowanej płycie grzejnej o temperaturze 200°C na okres 10 min. W ten sposób zredukowano średnicę kanałów do 20 mikrometrów.In order to reduce the cross-sectional area of the microchannels, a mixture of silica precursors was applied to their interior, which was prepared in such a way that an equimolar mixture of tetraethylorthosilicate, tetramethylorthosilicate, ethanol and water at pH 4.5 was heated at 200 ° C for 10 minutes until the turbidity disappeared. . Then it was placed in the drying cabinet at 65 ° C for 12 hours. The mixture was then forced into the channels of the microdevice and heated to 100 ° C for 10 seconds, after which excess mixture was purged from inside the channels by forcing air at a rate of 0.5 ml / min for 1 minute. Then the microdevice was placed on a thermostatic heating plate with a temperature of 200 ° C for a period of 10 minutes. In this way, the diameter of the channels was reduced to 20 micrometers.

Claims

The method of producing a microvascular device, characterized in that in the first step, on the basis of a designed map of the blood vessel system, in particular microvessels, prepared on the basis of a photo of a physical structure, a mathematical model or in accordance with design assumptions, functional layers as well as auxiliary elements and structures are produced , for this purpose, the substrate in the form of an elastomer layer is prepared by rotating the carrier in the form of a polyester film, and the channel structures are engraved, after the surface is covered with a sheet of tightly adhering casing paper, by irradiating a focused CO ₃ laser beam with a wavelength of 10.6 μm, in the second stage, the functional layers of the device are joined together or with the bottom and the lid of the device: the functional layer on a polyester film carrier is washed in the development of KOH in ethanol, irradiated in the UV chamber with radiation with a wavelength of 185 nm and 253.7 nm, then merges with stubbornness The bottom glass sheet, previously calcined at a temperature of not less than 200 ° C, and the bonded structure are placed for a period of 5 to 15 minutes on a thermostatic heating plate at a temperature of 90 to 150 ° C, or it is combined with a previously exposed UV chamber with of PMMA or PC plastic constituting the lid of the device, then the connected structure is placed in a hydraulic press under a pressure of not less than 1 bar, then the substrate is removed in the presence of isopropanol and the elements previously exposed in the UV chamber are joined together again, and then in in the third step, the inner surfaces of the microchannels are modified with an elastomer, a silicate coating and / or solutions and suspensions of proteins, glycoproteins, proteoglycans or cell cultures.

2. The method according to p. The process of claim 1, wherein the elastomer is polydimethylsiloxane (PDMS).

3 The method according to p. A method as claimed in claim 1, characterized in that in the first step, auxiliary elements, in particular electrodes, signal paths and electrically conducting paths, are produced in functional layers, the bottom and a plurality of microdevices, in such a way that a substance is mechanically introduced into the laser-engraved voids and channels. electrically conductive, in particular a mixture of PDMS and carbon, carbon nanotubes or metallic powder in the form of a paste.

4. The method according to p. The process of claim 1, wherein in a second step, the combined elements are placed in isopropanol to facilitate removal of the polyester film, and the polyester carrier is removed from the elastomer surface.

5. The method according to p. The method of claim 1, characterized in that, in the third step, the diameter of the channels is modified using an elastomer: a mixture of prepolymer and polymerization activator is introduced into the laser-engraved voids and channels, the excess elastomer is removed and then air is forced, and the device is placed on a thermostated plate and air is continuously blown through the channels for two hours at 60 ° C.

6. The method according to p. 5. The process of claim 5, wherein a solvent is added to the mixture of prepolymer and polymerization activator to lower the viscosity of the mixture.

7. The method according to p. The method of claim 1, characterized in that, in the third step, the diameter of the channels is reduced by feeding silica precursors, as well as ethanol and acidic water inside them, and heating to 100 ° C for a period of 5 to 60 seconds, after which the excess mixture is removed from the inside of the channels by forcing air under low pressure, and then the device is placed on a thermostatic heating plate at 200 ° C in order to harden the silica layer covering the inner surface of the microchannels.

8. The method according to p. A method according to claim 1, characterized in that, in the third stage, solutions and suspensions of proteins, glycoproteins, proteoglycans or cell cultures are injected into the channels, and then their excess is removed by forcing air and dried for a period of 1 to 15 minutes, resulting in a biocompatible protein-protein film is formed.