PL217290B1

PL217290B1 - Method for the preparation of biological prostheses, particularly the heart valves

Info

Publication number: PL217290B1
Application number: PL392975A
Authority: PL
Inventors: Aleksandra Niemiec-Cyganek; Piotr Wilczek; Anna Barańska-Lesiak; Jerzy Nożyński; Barbara Kubin
Original assignee: Fundacja Rozwoju Kardiochirurgii Im Prof Zbigniewa Religi
Priority date: 2010-11-19
Filing date: 2010-11-19
Publication date: 2014-07-31
Also published as: PL392975A1

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest sposób przygotowania protez biologicznych, zwłaszcza zastawek serca, który umożliwia ich zasiedlenie komórkami w układzie in vitro lub in vivo gwarantujące ich regenerację i wzrost po wszczepieniu do ciała biorcy.The subject of the invention is a method of preparing biological prostheses, especially heart valves, which enables their colonization with cells in an in vitro or in vivo system, guaranteeing their regeneration and growth after implantation into the recipient's body.

W medycynie powszechnie wykorzystuje się pobrany od dawców materiał biologiczny pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego do wszczepienia biorcom. Pobrany od dawcy materiał biologiczny, przykładowo zastawkę serca lub łatę na serce, należy odpowiednio przygotować przed jego zasiedleniem komórkami biorcy. Proces przygotowania znany jest między innymi z publikacji S. Neuenschwander, S.P. Hoerstrup Heart valve tissue engineering Transplant Immunology, 12 359-365 z 2004 roku czy też z publikacji A. Lichtenberg, A. Haverich Cell seeded engineered cardiac valves based on allograft and xenograft scaffolds, Progress in Pediatric Cardiology, 21 211-217 z 2006 roku. W szczególności proces ten obejmuje przeprowadzenie sterylizacji tkanki, następnie usunięcie komórek dawcy przy jednoczesnym zachowaniu struktury macierzy zewnątrzkomórkowej oraz w ostatniej kolejności modyfikację chemiczną tkanki z użyciem nisko toksycznych związków sieciujących.In medicine, biological material of human or animal origin collected from donors is commonly used for implantation into recipients. The biological material taken from the donor, for example a heart valve or a heart patch, should be properly prepared before it is colonized with the recipient's cells. The preparation process is known, inter alia, from the publication of S. Neuenschwander, S.P. Hoerstrup Heart valve tissue engineering Transplant Immunology, 12 359-365 from 2004 or from the publication of A. Lichtenberg, A. Haverich Cell seeded engineered cardiac valves based on allograft and xenograft scaffolds, Progress in Pediatric Cardiology, 21 211-217 from 2006 . In particular, this process involves sterilizing the tissue, then removing the donor cells while maintaining the structure of the extracellular matrix, and finally chemically modifying the tissue with low-toxic cross-linkers.

Wynikiem tych procesów przygotowawczych powinien być materiał biologiczny możliwy do trwałego zasiedlenia komórkami biorcy, gwarantującego jego regenerację i/lub wzrost.The result of these preparatory processes should be biological material that can be permanently colonized with the recipient's cells, ensuring its regeneration and / or growth.

Sterylizacja materiału wyjściowego, przykładowo zastawek serca pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego odbywa się zazwyczaj w kąpieli antybiotykowej zawierającej przykładowo penicylinę, streptomycynę i środek przeciwgrzybiczny, na przykład amfoterycynę.Sterilization of the starting material, for example heart valves of human or animal origin, is usually carried out in an antibiotic bath containing, for example, penicillin, streptomycin and an antifungal agent, for example amphotericin.

Znanych jest wiele sposobów usuwania komórek dawcy, który to proces nazywany jest odkomórczaniem albo acelularyzacją materiału biologicznego. Najprostsze sposoby fizyczne, które polegają na cyklicznym zamrażaniu i rozmrażaniu tkanki, sonifikacji czy mechanicznym uszkadzaniu komórek, okazały się mało efektywne oraz prowadziły do uszkodzenia włókien kolagenowych. Obecnie stosowane są sposoby detergentowe, enzymatyczne i mieszane. Powszechnie wykorzystywanymi detergentami są na przykład glikol 4-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)fenylo-polietylenowy, dostępny pod handlową nazwą Triton X-100 czy też sól sodowa siarczanu dodecylu znana jako SDS ( R.W. Grauss, M.C. DeRuiter, Decellularization of rat aortic allografts reduces leafleat destruction and extracellular matrix remodeling, The Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery, 126 2003-2010, z 2003 roku). Ponadto w celu acelularyzacji używa się deoksycholanu sodu (E. Rieder, G. Weigel, Decellularization protocols of porcine heart valves differ importantly in efficiency of cell removal and susceptibility of the matrix to recellularization with human vascular cells, The Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery, 127 399-405 z 2004 roku albo lauroilosarkozynianu sodu ( A. Ketchedjian, R. Hopkins, Recellularization of decellularized allograft scaffolds in ovine great vessels reconstruction, Ann Thorac Surg, 79 888-896 z 2005 roku).There are many known methods of removing donor cells, a process called decellularization or acellularization of biological material. The simplest physical methods, which consist in cyclic freezing and thawing of tissue, sonication or mechanical damage to cells, turned out to be ineffective and led to collagen fibers damage. Currently, detergent, enzymatic and mixed methods are used. Commonly used detergents are, for example, 4- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl-polyethylene glycol, available under the trade name Triton X-100, or sodium dodecyl sulfate known as SDS (RW Grauss, MC DeRuiter, Decellularization of rat aortic allografts reduces leafleat destruction and extracellular matrix remodeling, The Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery, 126 2003-2010, 2003). In addition, for acellularization, sodium deoxycholate is used (E. Rieder, G. Weigel, Decellularization protocols of porcine heart valves differ importantly in efficiency of cell removal and susceptibility of the matrix to recellularization with human vascular cells, The Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery, 127 399-405 from 2004 or sodium lauroyl sarcosinate (A. Ketchedjian, R. Hopkins, Recellularization of decellularized allograft scaffolds in ovine great vessels reconstruction, Ann Thorac Surg, 79 888-896 from 2005).

Ponadto znany jest też sposób oparty na niszczeniu komórek wskutek szoku hipotonicznego w połączeniu z niejonowym detergentem, przykładowo Tritonem X-100 ( A. Lichtenberg, A. Haverich, In vitro re-endothelialization of detergent decellularized heart valves under simulated physiological dynamic conditions, Biomaterials 27 4221-4229 z 2006 roku).In addition, there is also a method based on the destruction of cells due to hypotonic shock in combination with a non-ionic detergent, for example Triton X-100 (A. Lichtenberg, A. Haverich, In vitro re-endothelialization of detergent decellularized heart valves under simulated physiological dynamic conditions, Biomaterials 27 4221-4229 from 2006).

W sposobach enzymatycznych stosuje się głównie trypsynę w połączeniu z kwasem wersetowymi czyli EDTA.In enzymatic methods, trypsin is mainly used in combination with verse acid or EDTA.

Sposoby mieszane proponują stosowanie trypsyny razem z SD S lub Tritonem X-100. W celu pełnej degradacji materiału genetycznego w każdym z powyżej wymienionych sposobów acelularyzacji można dodatkowo zastosować nukleazy, przykładowo dezoksyrybonukleazę i rybonukleazę (R.W. Grauss, M.C. DeRuiter, Decellularization of rat aortic allografts reduces leafleat destruction and extracellular matrix remodeling, The Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery, 126 2003-2010, z 2003 roku).Mixed processes propose the use of trypsin together with SD S or Triton X-100. In order to fully degrade the genetic material, in each of the above-mentioned acellularization methods, additionally nucleases can be used, for example deoxyribonuclease and ribonuclease (RW Grauss, MC DeRuiter, Decellularization of rat aortic allografts reduces leafleat destruction and extracellular matrix remodeling, The Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery, 126). 2003-2010, from 2003).

W przypadku wyżej wymienionych sposobów acelularyzacji autorzy obserwują wysoką skuteczność w usuwaniu komórek zarówno z płatków zastawki jak i naczyń bez znaczącego wpływu na składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, jednak doświadczenia własne wskazują, że najlepsze efekty acelularyzacji całych zastawek daje układ mieszany z zastosowaniem trypsyny z EDTA oraz z SDS.In the case of the above-mentioned methods of acellularization, the authors observe high efficiency in removing cells from both valve leaflets and vessels without a significant effect on the components of the extracellular matrix, but our own experience shows that the best results of acellularization of whole valves are achieved by a mixed system with the use of trypsin with EDTA and with SDS. .

Kolejnym etapem w przygotowaniu materiału biologicznego jest sieciowanie, którego celem jest obniżenie antygenowości materiału, poprawa jego wytrzymałości, opóźnienie procesu kalcyfikacji i poprawa odporności na degradację enzymatyczną. Ponieważ ostatecznie materiał biologiczny, przykładowo pozbawiona komórek czyli acelularna matryca zastawki serca będzie zasiedlona komórkami, związki sieciujące powinny wykazywać jak najniższą cytotoksyczność oraz nie powinny w znaczący sposób zmieniać natywnej struktury przestrzennej kolagenu, składnika matrycy zastawkowej. Próba wykoPL 217 290 B1 rzystania tradycyjnych związków sieciujących, głównie aldehydu glutarowego nie przyniosła dobrych efektów ze względu na wysoką cytotoksyczność tego związku i problemy z jego wypłukiwaniem z tkanki. Wśród nisko toksycznych związków pochodzenia naturalnego jako czynnik sieciujący stosowano: genipinę ( H-C Liang, H-W Sung, Effect of crosslinking degree of an acellular biological lissue on its tissue regeneration pattern, Biomaterials 25 3541-3552 z 2004 roku), proantocyjanidyny (PA) (W. Zhai, J. Chang Crosslinking of decellularized porcine heart valve matrix by procyjanidins, Biomaterials, 27 3684-3690 z 2006 roku), galusan epigalokatechiny (EGCG) (H. C. Goo, Y-S. Hwang Development of collagenase-resistant collagen and its interaction with adult human dermal fibroblasts, Biomaterials, 24 5099-5113 z 2003 roku) oraz kwercetynę (Z. Wanyin, L. Xiqin, Quercetin-crosslinked porcine heart valve matrix: Mechanical properties, stability, antycalcification and cytocompatibility, Acta Biomaterialia, 6 389-395 z 2010 roku). W przypadku każdego z wymienionych związków sieciujących uzyskiwano poprawę właściwości mechanicznych usieciowanych tkanek, opóźnienie kalcyfikacji, wzrost odporności na degradację enzymatyczną, a usieciowany materiał ulegał zasiedleniu komórkami. Jednakże nie są one pozbawione wad - kwas taninowy rozkłada się w organizmie do kwasu galusowego, który jest hepatotoksyczny, PA oraz EGCG mają bardzo wysoką cenę, a zastosowanie kwercetyny ze względu na jej niską rozpuszczalność w wodzie wymaga użycia kosolwenta - DMSO, czyli dimetylosulfotlenku, który usztywnia tkankę i może niekorzystnie wpływać na komórki.The next stage in the preparation of biological material is cross-linking, the aim of which is to reduce the antigenicity of the material, improve its strength, delay the calcification process and improve resistance to enzymatic degradation. Since ultimately the biological material, for example cell-free or acellular heart valve matrix, will be populated with cells, cross-linkers should have the lowest possible cytotoxicity and should not significantly alter the native spatial structure of collagen, a component of the valve matrix. The attempt to use traditional cross-linkers, mainly glutaraldehyde, did not bring good results due to the high cytotoxicity of this compound and problems with its leaching from the tissue. Among the low-toxic compounds of natural origin, the following cross-linking agents were used: genipin (HC Liang, HW Sung, Effect of crosslinking degree of an acellular biological lissue on its tissue regeneration pattern, Biomaterials 25 3541-3552 from 2004), proanthocyanidins (PA) (W Zhai, J. Chang Crosslinking of decellularized porcine heart valve matrix by procyjanidins, Biomaterials, 27 3684-3690 from 2006), epigallocatechin gallate (EGCG) (HC Goo, YS. Hwang Development of collagenase-resistant collagen and its interaction with adult human dermal fibroblasts, Biomaterials, 24 5099-5113 from 2003) and quercetin (Z. Wanyin, L. Xiqin, Quercetin-crosslinked porcine heart valve matrix: Mechanical properties, stability, antycalcification and cytocompatibility, Acta Biomaterialia, 6 389-395 from 2010). For each of the above-mentioned cross-linking compounds, an improvement in the mechanical properties of the cross-linked tissues, calcification delay, increased resistance to enzymatic degradation were achieved, and the cross-linked material was colonized with cells. However, they are not without drawbacks - tannic acid decomposes in the body into gallic acid, which is hepatotoxic, PA and EGCG have a very high price, and the use of quercetin due to its low solubility in water requires the use of a cosolvent - DMSO, i.e. dimethyl sulfoxide, which it stiffens the tissue and can adversely affect cells.

Wynalazek dotyczy sposobu przygotowania protez biologicznych, zwłaszcza zastawek serca, w którym pobrany materiał biologiczny pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego poddaje się sterylizacji, a następnie acelularyzacji i sieciowaniu. Istota wynalazku polega na tym, że sieciowanie przeprowadza się w roztworze soli sodowej kwasu moryno-5'-sulfonowego.The invention relates to a method of preparing biological prostheses, especially heart valves, in which the taken biological material of human or animal origin is sterilized and then acellularized and cross-linked. The essence of the invention consists in the fact that the cross-linking is carried out in a solution of the sodium salt of monosulfonic acid.

W korzystnym wykonaniu wykorzystuje się 0,1%-5% roztwór soli sodowej kwasu moryno-5'-sulfonowego.In a preferred embodiment, a 0.1% -5% solution of the sodium salt of morino-5'-sulfonic acid is used.

Ponadto zasadnym jest, gdy sieciowanie przeprowadza się w roztworze sieciującym o pH wybranym z przedziału od 5 do 8, korzystnie z wykorzystaniem buforu fosforanowego.Moreover, it is essential that the cross-linking is carried out in a cross-linking solution with a pH selected in the range from 5 to 8, preferably with the aid of a phosphate buffer.

Celowym jest także, gdy sieciowanie przeprowadza się w temperaturze wybranej z przedziału od 5°C do 50°C.It is also expedient when the cross-linking is carried out at a temperature chosen in the range of 5 ° C to 50 ° C.

Również korzystnym jest, gdy sieciowanie przeprowadza się przez okres wybrany z przedziału 24 h do 168 h.It is also preferred that the cross-linking is carried out over a period selected from 24 h to 168 h.

Wynalazek dotyczy sposobu przygotowania protez biologicznych, zwłaszcza zastawek serca, który umożliwia ich zasiedlenie komórkami w układzie in vitro lub in vivo z wykorzystaniem sieciowania chemicznego. Sieciowanie chemiczne jest oparte o zastosowanie niskotoksycznych związków sieciujących, a jego celem jest zmniejszenie antygenowości materiału biologicznego, zwłaszcza pochodzenia zwierzęcego, poprawienie jego właściwości mechanicznych, opóźnienie procesu kalcyfikacji oraz zapewnienie odporności na enzymatyczną degradację. Ze względu na kolejny etap tworzenia zastawki autologicznej, polegający na obsadzeniu matrycy zastawkowej komórkami, czynniki sieciujące powinny wykazywać jak najniższą cytotoksyczność oraz nie powinny w znaczący sposób zmieniać natywnej struktury przestrzennej kolagenu, składnika matrycy zastawkowej. Wszystkie wyżej wymienione cechy posiada sól sodowa kwasu moryno-5'-sulfonowego, rozpuszczalna w wodzie pochodna moryny.The invention relates to a method of preparing biological prostheses, especially heart valves, which enables them to be colonized with cells in an in vitro or in vivo system using chemical cross-linking. Chemical cross-linking is based on the use of low-toxic cross-linkers, and its aim is to reduce the antigenicity of biological material, especially of animal origin, improve its mechanical properties, delay the calcification process and ensure resistance to enzymatic degradation. Due to the next step in autologous valve formation, which consists in filling the valve matrix with cells, cross-linking agents should demonstrate the lowest possible cytotoxicity and should not significantly alter the native spatial structure of collagen, a component of the valve matrix. All the above-mentioned features have the sodium salt of morin-5'-sulfonic acid, a water-soluble derivative of morin.

Wynalazek został bliżej opisany w poniższym przykładzie wykonania.The invention is described in more detail in the following embodiment.

Pełna procedura przygotowania usieciowanej acelularnej zastawki serca pobranej od dawcy polega na tym, że wypreparowane zastawki serca są poddane sterylizacji w kąpieli antybiotykowej, następnie odkomórczeniu czyli acelularyzacji za pomocą roztworu trypsyna/EDTA i roztworu SDS. Resztki detergentu wymywane są kilkakrotnie za pomocą płynu Ringera. Użyty płyn Ringera zawiera 8,6 g/l NaCl, 0,3 g/l KCl oraz 0,48 g/l CaCl2 x 6 H2O. Kolejny etap - sieciowanie acelularnych matryc zastawkowych przebiega w 0,1-5% roztworze soli sodowej kwasu moryno-5'-sulfonowego, przy pH 5-8, w temperaturze 5-50°C przez 24-168 h. Sieciowanie korzystnie odbywa się z wykorzystaniem buforu fosforanowego, zawierającego przykładowo 0,1 M NaH2PO4 x 2 H2O w 95 ml wody destylowanej oraz 0,1 M NaH2PO4 x 12 H2O w 405 ml wody destylowanej. Słabo związane i nie związane resztki czynnika sieciującego są wymywane w medium do hodowli komórek z dodatkiem antybiotyków. W efekcie uzyskuje się matrycę zastawkową o zdecydowanie lepszych właściwościach mechanicznych w porównaniu z zastawką acelularną. W szczególności pierwszy etap przygotowania zastawki serca, czyli jej sterylizacja polega na tym, że wypreparowane zastawki, przykładowo zastawki świńskie płucne i aortalne, wypłukane w płynie Ringera umieszcza się, każdą osobno, w płynie sterylizującym, który zawiera: 500 ml płynu Ringera, 0,5 ml ciprinolu, 0,5 ml diflucanu oraz 5ml streptomycyny/penicyliny. Proces sterylizacji prowadzi się w temperaturze 4°C przez 24 h.The complete procedure for the preparation of cross-linked acellular heart valves collected from the donor is that the prepared heart valves are sterilized in an antibiotic bath, then decellularized, i.e. acellularized with trypsin / EDTA solution and SDS solution. Detergent residues are washed away several times with Ringer's solution. The Ringer's fluid used contains 8.6 g / L NaCl, 0.3 g / L KCl and 0.48 g / L CaCl2 x 6H2O. The next step - cross-linking of the acellular valve matrices takes place in a solution of 0.1-5% sodium salt of morin-5'-sulfonic acid, at pH 5-8, at a temperature of 5-50 ° C for 24-168 hours. Cross-linking preferably takes place with using a phosphate buffer containing, for example, 0.1 M NaH2PO4 x 2 H2O in 95 ml of distilled water and 0.1 M NaH2PO4 x 12 H2O in 405 ml of distilled water. The weakly bound and unbound remnants of the cross-linking agent are washed away in cell culture medium supplemented with antibiotics. The result is a valve matrix with significantly better mechanical properties compared to an acellular valve. In particular, the first stage of the preparation of the heart valve, i.e. its sterilization, consists in the fact that prepared valves, for example porcine pulmonary and aortic valves, rinsed with Ringer's fluid are placed separately in a sterilizing fluid containing: 500 ml of Ringer's fluid, 0, 5 ml of ciprinol, 0.5 ml of diflucan and 5 ml of streptomycin / penicillin. The sterilization process is carried out at 4 ° C for 24 hours.

PL 217 290 B1PL 217 290 B1

Kolejno przystępuje się do odkomórczenia zastawek serca czyli acelularyzacji. W tym celu wysterylizowane zastawki umieszcza się, każdą osobno, w roztworze Trypsyna/EDTA i inkubuje w temperaturze 37°C przez 48 h w warunkach ciągłego wytrząsania. Po 24 h wymienia się trypsynę na świeżą, a następnie inkubuje kolejne 24h w tych samych warunkach. Każda z zastawek powinna być zanurzona w 250 ml roztworu Trypsyna/EDTA. Po upływie 48 h zastawki przepłukuje się kilkakrotnie w płynie Ringera. Następnie zastawki umieszcza się w 0,5% roztworze SDS i inkubuje przez 30 minut w temperaturze 22°C. Na jedną zastawkę powinno przypadać 250 ml roztworu SDS.The next steps are decellularization of the heart valves, i.e. acellularization. For this, the sterilized valves are placed individually in a Trypsin / EDTA solution and incubated at 37 ° C for 48 h under constant shaking conditions. After 24 h, trypsin is replaced with fresh, and then incubated for another 24 h under the same conditions. Each valve should be immersed in 250 ml of Trypsin / EDTA solution. After 48 hours, the valves are rinsed several times in Ringer's solution. The valves are then placed in a 0.5% SDS solution and incubated for 30 minutes at 22 ° C. One valve should contain 250 ml of SDS solution.

Po inkubacji w detergencie zastawki intensywnie wypłukuje się w płynie Ringera, a następnie umieszcza każdą z zastawek w 250 ml płynu Ringera i płucze się przez około 90 minut. Co 30 min płyn wymienia się na świeży, a płukanie przeprowadza się na wytrząsarce.Following incubation in detergent, the valves are rinsed extensively in Ringer's and then each valve is placed in 250 ml of Ringer's and rinsed for approximately 90 minutes. Every 30 minutes, the fluid is changed to fresh and rinsing is performed on a shaker.

Kolejnym etapem przygotowanie zastawek jest sieciowanie. W tym celu przygotowuje się 1% roztwór czynnika sieciującego czyli soli sodowej kwasu moryno-5'-sulfonowego w buforze fosforanowym pH 7,4. Roztwór sieciujący przesącza się przez filtr antybakteryjny. Acelularne świńskie zastawki, każdą osobno, umieszcza się w 250 ml 1% roztworu sieciującego z dodatkiem środka przeciwgrzybicznego, przykładowo diflucan 0.5 ml na 250 ml roztworu sieciującego. Sieciowanie prowadzi się w temperaturze pokojowej 22°C z wytrząsaniem, przez 72 h.The next step in the preparation of the valves is cross-linking. For this purpose, a 1% solution of the cross-linking agent, i.e. sodium salt of morino-5'-sulfonic acid in a phosphate buffer pH 7.4 is prepared. The cross-linking solution is filtered through an antibacterial filter. Acellular pig valves, each individually, are placed in 250 ml of a 1% cross-linking solution with the addition of an antifungal agent, for example 0.5 ml diflucan per 250 ml of cross-linking solution. Cross-linking is carried out at room temperature of 22 ° C with shaking for 72 h.

Usieciowany materiał przechowuje się w roztworze sieciującym lub kąpieli antybiotykowej w lodówce.The cross-linked material is stored in a cross-linking solution or an antibiotic bath in a refrigerator.

Claims

Patent claims

A method for the preparation of biological prostheses, especially heart valves, in which the taken biological material of human or animal origin is sterilized and then acellularized and cross-linked, characterized in that cross-linking is carried out in a sodium salt of morin-5'-sulfonic acid.

2. The method according to p. The process of claim 1, wherein a solution of 0.1-5% sodium salt of morino-5'-sulfonic acid is used.

3. The method according to p. The method of claim 1 or 2, characterized in that the cross-linking is carried out in a cross-linking solution with a pH selected in the range from 5 to 8.

4. The method according to p. A process as claimed in any one of the preceding claims, characterized in that the cross-linking is carried out in a phosphate buffer.

5. The method according to p. Any one of claims 1 or 2, 3 or 4, characterized in that the cross-linking is performed at a temperature selected in the range 5 - 50 ° C.

6. The method according to p. 3. The method of any of the preceding claims, characterized in that cross-linking is carried out over a period selected from the range of 24 h to 168 h.