PL214742B1 - Sposób otrzymywania przeciwbakteryjnego biomateriału przez immobilizację na jego powierzchni substancji przeciwbakteryjnej - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania przeciwbakteryjnej matrycy, przez immobilizację substancji o szerokim spektrum działania przeciwbakteryjnego wobec bakterii Gram-dodatnich i ujemnych, zawierających w swojej cząsteczce grupy aminowe i/lub karbonylowe ze stałymi matrycami zwłaszcza lateksowymi lub lateksowymi pokrytymi silikonem, stosowanymi jako materiał do współistnienia z biologicznymi systemami i przeznaczony do leczenia, diagnozowania, poprawiania lub zastępowania częściowego (lub całkowitego) tkanki, narządu, lub spełniania ich funkcji w organizmie, mający szczególne zastosowanie w urologii w postaci cewników i stentów urologicznych.

Czterema najbardziej powszechnymi powodami infekcji wymagającymi hospitalizacji są infekcje układu moczowego, oddechowego, infekcje chirurgiczne i krwioobiegu. Infekcje układu moczowego są najczęściej notowanymi infekcjami szpitalnymi, w liczbie do 40%. Znaczący procent tych infekcji wiąże się ze stosowaniem cewników moczowych. Cewniki te używane w 15% do 25%, w krótkoterminowej hospitalizacji, zwiększają predyspozycje do bakteriurii. 1 do 5% epizodów odcewnikowego bakteriomoczu jest przyczyną wtórnych infekcji krwi i poważnych komplikacji groźnych dla życia (Chenoweth C. i Saint S. w: Seifert H., Jansen B., Farr B. (Eds.), Catheter-related infections, Marcel Dekker. New York, 2005, str. 551-585; Johnson J. i współ., Ann. Intern. Med., 2006, 144, 116-126.

Użycie cewników może ingerować w naturalną ochronę układu moczowego, co sprzyja kolonizacji bakterii i prowadzi do tworzenia bakteryjnego biofilmu na wewnętrznej i zewnętrznej powierzchni cewnika (dotyczy to najczęściej bakterii Staphylococcus ureus, Staphylococcus epidermidis i Escherichia coli), który jest trudny do zwalczenia przez antybiotyki podane ogólnoustrojowo (Tenke i współautorzy, World J. Urol., 2006, 24, 13-20). Biofilm na cewnikach moczowych jest unikalny ze względu na obecność bakterii wytwarzających ureazę zdolną do hydrolizy mocznika do amoniaku, który alkalizuje środowisko i prowadzi do wytrącania kryształów soli obecnych w moczu, ich osadzania na warstwie biofilmu cewnika i przez to zamknięcia jego światła (Tenke P. i współautorzy, World J. Urol., 2006, 24, 13-20; Shaw G. i współautorzy. Urol. Res., 2005, 33, 17-22). Zarośnięty cewnik musi być usunięty co skutkuje zwiększeniem cierpienia pacjenta i wzrostem kosztów systemu ochrony zdrowia.

W celu zmniejszenia rozwoju zakażeń układu moczowego stosowane są rożne praktyki obejmujące zmniejszenie ilości zabiegów cewnikowania, wybór innych alternatywnych metod oraz eliminacje kolonizacji bakterii na cewnikach.

Zmniejszenie adhezji drobnoustrojów można osiągnąć przez modyfikację powierzchni biomateriału. Materiałem używanym najczęściej do powlekania cewników urologicznych jest silikon (nadający śliskość, zmniejszający tarcie) i hydrożel [Tunney M.M. i Gorman S.P., Biomateriale, 2002, 23, 4601-4608].

Dobre wyniki ograniczające rozwój biofilmu osiągnięto przez pokrycie cewników fosforylocholiną. Biomateriały takie zmniejszają także powstawanie osadów z hydroksyapatytu [Stickler D.J. i współautorzy, International Journal of Antimicrobial Agents 2002, 19, 499-506].

Materiałem powodującym redukcję adhezji bakterii do powierzchni biomateriału jest heparyna, którą związano kowalencyjnie z biomateriałem po odpowiednim oczyszczeniu, traktowaniu plazmą tlenową, kwasem akrylowym i roztworem chlorowodorku N-3-(dimetyloaminopropylo)-N-etylokarbodiimidu [Aksoy A.E., Hasrici V. i Hasrici N., Macromolecular Symposia, 2008, 269, 145-153].

W celu nadania odpowiednich właściwości biomateriałom zapewniających ich biozgodność i zapobiegających adhezji bakterii, poliuretan pokryto chitosanem po utlenianiu, polimeryzacji utlenionej powierzchni z kwasem akrylowym i reakcji z 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidem [Yang S.H. i współautorzy, Journal of Biomedical Materials Research Part B: App. Biomaterials, 2007, 83. 304-313].

Kolejnym sposobem zapobiegania powstawaniu osadów na cewnikach jest ich pokrycie polisiarczanem pentosanu-polisacharydem podobnym do heparyny [Zupka P. i współaut., Journal of Endourology 2000, 14(6), 483-488].

Podobnie, pokrycie biomateriału (m.in. poliuretanu i silikonu) mucyną spowodowało zmniejszenie jego hydrofilowość, a co za tym idzie adhezję bakterii do powierzchni [Shi L. i współaut., Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2000, 17, 229-239].

Sterylność cewników osiągnięto również poprzez pokrycie ich powierzchni związkami srebra. Zostały wyprodukowane cewniki impregnowane nanocząsteczkami srebra [Samuel U. i Guggenbichler J.P., International Journal of Antimicrobial Agents 2004, 23 (suppl. 1), S75-78] jak również cewniki

PL 214 742 B1 w których srebro naniesiono przy pomocy AgNO₃ i N.N.N', N-tetrametyloetylenodiaminy jako reduktora [Roe D. i współaut., Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2008, 61,869-876].

Przyłączenie dwutlenku tytanu do silikonu uprzednio potraktowanego kwasem siarkowym zredukowało przyczepność bakterii do biomateriału. Efekt bakteriobójczy wobec Escherichia coli został potwierdzony jedynie po naświetleniu promieniami UV [Sekiguchi Y. i współaut., International Journal of Urology 2007, 14, 426-430],

Celem osiągnięcia lepszej ochrony przeciwbakteryjnej cewniki silikonowe pokryto dwutlenkiem tytanu i srebrem [Yao Y. i współaut., J Biomed Mater Res B Appl Biomater 2008, 85, 453-460].

Kolejną metodą hamowania adhezji bakterii do powierzchni cewnika była jego impregnacja tlenkiem azotu [Regev-Shoshani G. i współaut., Antimicrobial Agents and Chemoteraphy, 2010. 54(1) 273-279],

Cel ten także osiągnięto przez zastosowanie inhibitorów fosforanu aminotransferazy N-acetyloD-glukozaminy (GlmU) i siarczanu protaminy takich jak jodoacetamid, N-etylomaleinoimid i jego analogi, które wykazują działanie antyadhezyjne [Burton E. i współaut., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2006, 50(5), 1835-1840].

Antybakteryjność cewników uzyskano w wyniku impregnacji substancjami o działaniu antyseptycznym tj. triklosanem i chlorheksydyną [Jones G.L. i współaut., Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 200,. 57, 266-272; Gaonkar T.A i współaut., Infection Control and Hospital Epidemiology, 2007, 28(5), 596-598] i antybiotykami: tobramycyną, cyprofloksacyną i ceftriaksonem [Cormio L. i współaut., European Urology, 2001, 40, 354-359].

Otrzymano również cewniki silikonowe o właściwościach przeciwbakteryjnych impregnując norfloksacyną przez zanurzenie w roztworze złożonym z polimerów: poli(etyleno-co-winylo octanu) i polimeru złożonego z poli(etylenotlenku) i poli(dimetylosiloksanu) zawierającym wspomniany antybiotyk [Park J.H. i współaut., Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 2003, 14(9), 951-962.].

Cewniki uwalniające gentamycynę przeznaczone do krótkiego cewnikowania otrzymano metodą zanurzeniową stosując roztwór poli(etyleno-co-winylo octanu) i poli(etylenotlenku) zawierający gentamycynę [Cho Y.W. i współaut., Biomaterials Science, Polymer Edition, 2003, 14(9), 963-972].

Cewniki silikonowe pokryto warstwą hydrożelu z liposomami zawierającymi cyprofloksacynę otrzymując biomateriał, który uwalniał zastosowany antybiotyk przez kilka dni [Pugach J.L. i współaut., The Journal of Urology, 1999, 162 (3), 883-887].

Do impregnacji cewników zastosowano również roztwór nitrofurazonu uzyskując ich sterylność przez 5 dni, wobec bakterii opornych na wiele leków [Jahnson J.P. i współaut., Antimicrobial Agents and Chemoterapy, 1999, 43(12), 2990-2995].

W celu osiągnięcia szerokiego spektrum działania i zahamowania rozwoju oporności do impregnacji cewników poliuretanowych zastosowano dwa antybiotyki ryfampicynę i minocyklinę, które wykazują synergizm działania i są skuteczne także wobec komórek drożdży [Munson E.L., Heard S.O., Doem G.V., Chest 2004; 126; 1628-1635].

Stosując proces dyfuzji kontrolowanej i różne stężenia trzech antybiotyków mupirocyny, kwasu fusydowego i ryfampicyny wprowadzono je do matrycy silikonowej cewnika otrzymując biomateriał wykazujący szeroki zakres działania przeciwbakteryjnego [Schiercholz J.M. i Pulverer G., Biomateriale, 1998, 19, 2065-2074],

Tworząc kompleks dikloksacyliny z czwartorzędowym jonem amonowym inkorporowano ten antybiotyk na powierzchnię poliuretanu [Sherertz R.J. i współaut., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1989, 33(8), 1174-1178.].

W przypadku cewników urologicznych poważny problem stanowi ich mineralizacja solami wapnia np. szczawianem i fosforanem. Aby zapobiec tworzeniu takich osadów stosuje się powlekanie enzymami rozkładającymi szczawian produkowanymi przez Oxalobacter formigenes [Watterson J.D. i współaut., Journal of endourology, 2003, 17(5), 269-274].

Dostępne i omówione sposoby otrzymywania cewników urologicznych o właściwościach przeciwbakteryjnych stosują niekowalencyjne wiązanie związków o właściwościach przeciwbakteryjnych typu impregnacja, inkorporacja.

Podjęte były także prace mające na celu trwalsze wiązanie substancji przeciwbakteryjnych z powierzchnią matrycy. Ich wynikiem jest przeciwbakteryjna matryca znana z polskiego zgłoszenia nr P-389488. Sposób tam opisany polega na tym, że stałą matrycę zwłaszcza lateksową silikonowaną utlenia się (wytrawia się), korzystnie kwasem azotowym, następnie na uaktywnioną powierzchnię nanosi się polisacharyd, korzystnie heparynę, po czym modyfikuje się go utleniając jego grupy

PL 214 742 B1 hydroksylowe do grup aldehydowych za pomocą metajodanu(VII) sodu bezpośrednio bądź pośrednio, po uprzednim wprowadzeniu ugrupowań diolowych przez działanie glicydolem, a następnie zmodyfikowaną matrycę poddaje się inkubacji z roztworem sparfloksacyny.

Sposób ten jest procesem dość skomplikowanym i długim poprzez występowanie w nim etapu utleniania grup hydroksylowych do grup aldehydowych.

Celem niniejszego wynalazku jest opracowanie prostszego, ekonomicznego i efektywnego sposobu otrzymywania przeciwbakteryjnej matrycy, zwłaszcza na bazie lateksu, przez immobilizację substancji przeciwbakteryjnej głównie z grupy fluorochinolonów: tosufloksacyny, sparfloksacyny, cyprofloksacyny, szczególnie skutecznej w infekcjach układu moczowego, za pomocą trwałych połączeń z zachowaniem centrum aktywności przeciwbakteryjnej, która będzie chronić pacjenta przed zakażeniami układu moczowego pochodzenia odcewnikowego i inkrustacją cewnika.

Nieoczekiwanie okazało się, że możliwe jest otrzymywanie matryc o dużej skuteczności przeciwbakteryjnej w sposób znacznie uproszczony z wyeliminowaniem procesu utleniania poprzez zastosowanie polisacharydu zawierającego grupy aminowe i bezpośrednią (niekiedy pośrednią) immobilizację substancji przeciwbakteryjnej z grupami karbonylowymi (ketonowymi, aldehydowymi), lub pośrednią immobilizację antybiotyku z grupami aminowymi, po uprzedniej aktywacji matrycy z naniesionym polisacharydem z użyciem łącznika dwufunkcyjnego aldehydowego.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania przeciwbakteryjnej matrycy polegający na tym, że na uaktywnioną powierzchnię stałą matrycy zwłaszcza lateksowej lub lateksowej silikonowanej nanosi się polisacharyd z grupami aminowymi, korzystnie o właściwościach kompatybilnych z organizmem żywym, korzystnie chitosan, po czym aktywuje się powierzchnię matrycy z polisacharydem poprzez reakcję z łącznikiem aldehydowym dwufunkcyjnym, korzystnie glutaraldehydem, a na wprowadzonych grupach aldehydowych wiąże się bezpośrednio, w środowisku rozpuszczalnika korzystnie organicznego, w temperaturze podwyższonej zwłaszcza 37-80°C, korzystnie 60°C, substancję przeciwbakteryjną zawierającą grupy aminowe w ilości umożliwiającej skuteczne hamowanie wzrost bakterii i ewentualnie w celu zwiększenia trwałości wiązania redukuje się otrzymane wiązania antybiotyku stosując wodór in statu nascendi.

Korzystnie, gdy w procesie immobilizacji, jako substancję o właściwościach przeciwbakteryjnych, posiadającą grupy aminowe stosuje się sparfloksacynę, tosufloksacynę, trovafloksacynę, gemifloksacynę, a także cefalosporyny zwłaszcza Cefradyn, CefadroksyI, Cefepim, polimyksyny, antybiotyki aminoglikozydowe zwłaszcza gentamycynę. amikacynę oraz substancję odkażającą jak etakrydyna.

Postawione wymagania spełniają również niektóre cefalosporyny (np.Cefradyn, Cefadroksyl, Cefepim), polimyksyny, antybiotyki aminoglikozydowe (np. gentamycyna. amikacyna), etakrydyna i inne.

Korzystnie, gdy proces wiązania substancji przeciwbakteryjnej przeprowadza się metodą niebezpośredniej redukcyjnej aminacji z zastosowaniem systemu matryca z grupą aminową-glutaraldehyd-związek aminowy, a następnie prowadzi się redukcję borowodorkiem sodu w metanolu.

Korzystnie, gdy proces wiązania leku przeprowadza się w atmosferze azotu.

Korzystnie, gdy reakcje wiązania przeprowadza się w rozpuszczalniku organicznym jak THF, dichloroetan, etanol, metanol, acetonitryl.

Według alternatywnego rozwiązania sposób polega na tym, że na uaktywnioną powierzchnię matrycy nanosi się polisacharyd z grupami aminowymi, korzystnie o właściwościach kompatybilnych z organizmem żywym, korzystnie chitosan, po czym wiąże się bezpośrednio na nim, w środowisku rozpuszczalnika, korzystnie organicznego, w temperaturze podwyższonej zwłaszcza 37-80°C, korzystnie 60°C, substancję przeciwbakteryjną, zawierającą grupy karbonylowe (ketonowe, aldehydowe) w ilości umożliwiającej skuteczne hamowanie wzrost bakterii, i ewentualnie w celu zwiększenia trwałości wiązania redukuje się otrzymane wiązania antybiotyku stosując wodór in statu nascendi, lub w przypadku substancji zawierających grupy karbonylowe trudno wiążące się metodą bezpośrednią przeprowadza się aktywację matrycy z grupami aminowymi za pomocą aldehydu glutarowego, a następnie dihydrazydu, po czym na aktywnej matrycy wiąże się substancję przeciwbakteryjną.

Korzystnie, gdy jako substancje przeciwbakteryjne, zawierające grupy karbonylowe stosuje się chinolony np. cyprofloksacyna, sparfloksacyna, tosufloksacyna, tetracykliny np. oksytetracyklina, doksycyklina, chlorotetracyklina, spektynomycyna, erytromycyna, ryfamycyny np. ryfampicyna. wankomycyna, streptograminy i inne.

PL 214 742 B1

Korzystnie, gdy w procesie wiązania substancji przeciwbakteryjnej metodą niebezpośredniej redukcyjnej aminacji z zastosowaniem systemu matryca z grupą aminową - związek karbonylowy stosuje się redukcję borowodorkiem sodu w metanolu lub matryca z grupą aminową - związek karbonylowyizopropoksyd tytanu(lV), a następnie prowadzi się redukcję borowodorkiem sodu w metanolu.

Korzystnie, gdy w przypadku grup karbonylowych trudno wiążących się, proces wiązania substancji przeciwbakteryjnej przeprowadza się po uprzedniej aktywacji matrycy z zastosowaniem linkerów glutaraldehydu i hydrazydu adypinowego.

Korzystnie, gdy reakcje wiązania przeprowadza się w rozpuszczalniku organicznym jak THF, dichloroetan, etanol, metanol, acetonitryl, DMSO.

Korzystnie, gdy proces wiązania leku przeprowadza się w atmosferze azotu.

W obu sposobach polisacharyd można nanosić na powierzchnię matrycy metodą zanurzenia i odparowywania rozpuszczalnika lub z zastosowaniem przemysłowych czy laboratoryjnych technik i urządzeń do nanoszenia warstw przy użyciu na przykład próżni czy natrysku plazmowego.

Zaletą wynalazku jest uproszczony sposób otrzymywania przeciwbakteryjnych matryc zwłaszcza lateksowych i lateksowych silikonowanych, ze związaną głównie kowalencyjnie substancją przeciwbakteryjną, zawierającą grupy karbonylowe albo aminowe, które to matryce wykazują długoterminową aktywność przeciwbakteryjną. Trwałość wiązania antybiotyku z powierzchnią matrycy może być zwiększona dodatkowo przez redukcję wodorem.

Sposób pozwala otrzymywać matryce, które będą chronione przed kolonizacją bakterii i tworzeniem biofilmu na powierzchni matrycy. Dodatkowo w zastosowanych warunkach reakcji, substancje przeciwbakteryjne wiążą się również w sposób niekowalencyjny (adsorpcja, wiązania jonowe, wiązania wodorowe), co pozwala chronić przed zakażeniem środowisko wokół otrzymanego biomateriału.

W przypadku, gdy matrycę stanowi cewnik urologiczny jego modyfikacja, według niniejszego wynalazku, będzie skutkować ochroną pacjenta przed zakażeniami układu moczowego pochodzenia odcewnikowego, ochroną przed tworzeniem biofilmu na jego powierzchni i ochroną przed jego inkrustacją i blokadą jego światła. Ochrona przed inkrustacją i blokadą światła cewnika, a tym samym przed dodatkowym cierpieniem pacjenta związanym z koniecznością jego wymiany ma szczególne znaczenie w przypadku cewników pooperacyjnych pozostających w organizmie pacjenta przez długi okres.

Ponadto, pokrycie powierzchni lateksu substancją przeciwbakteryjną, szczególnie tosufloksacyną i sparfloksacyną, zawierających grupy aminowe i karbonylowe, skutkuje zahamowaniem cytotoksyczności lateksu.

Zastosowanie polisacharydu z grupami aminowymi pozwala wiązać szerszą gamę substancji przeciwbakteryjnych, zawierających grupy aminowe lub karbonylowe.

Ponadto polisacharyd z grupami aminowymi umożliwia zastosowanie uproszczonej procedury immobilizacji antybiotyku, poprzez wiązanie bezpośrednie lub pośrednie po uprzedniej aktywacji z udziałem łącznika aldehydowego dwufunkcyjnego (lub łącznika aldehydowego i dihydrazydowego), bez konieczności utleniania polisacharydu.

P r z y k ł a d 1

Immobilizacja tosufloksacyny lub sparfloksacyny lub cyprofloksacyny poprzez wiązanie bezpośrednie substancji przeciwbakteryjnej na cewniku urologicznym wykonanym z silikonowanego lateksu typu Foley.

Doświadczeniu poddano serię 10 kawałków cewników urologicznych o masie ok. 0,15 g.

Celem aktywacji powierzchni, dodano 10 ml 40% kwasu azotowego(V), wytrząsano z szybkością 100 obr/min w temperaturze pokojowej przez 5 min, zlano roztwór kwasu, kawałki wypłukano wodą i osuszono.

Celem naniesienia chitosanu, dodano 10 ml mieszaniny kwasowo-metanolowej chitosanu (60 mg chitosanu rozpuszczono w 10 ml I mol/l roztworu kwasu octowego lub 0,1 mol/l roztworu kwasu solnego, dodano 1 ml PEG i 0,5 ml Tween 20 rozcieńczonego 1:10 metanolem i uzupełniono metanolem do 50 ml, wymieszano) i 2 ml tetrahydrofuranu (THF), wytrząsano z szybkością 200 obr/min w temperaturze 60°C przez ok. 20 h odparowując rozpuszczalnik, kawałki popłukano 3 porcjami wody destylowanej 1 porcją metanolu i wysuszono w temp 50°C lub w próżni.

Celem immobilizacji odpowiedniego chemioterapeutyku, dodano 10 ml roztworu sparfloksacyny w acetonitrylu o stężeniu 1 mg/ml, lub 10 ml roztworu tosufloksacyny w metanolu o stężeniu 2 mg/ml, lub 10 ml roztworu cyprofloksacyny w metanolu o stężeniu 1 mg/ml. Próby wytrząsano z szybkością

PL 214 742 B1

100 obr/min w temperaturze 60°C przez 24h, zlano roztwór leku i kawałki popłukano 3 porcjami wody destylowanej i wysuszono.

Celem zwiększenia trwałości wiązania, przeprowadzono redukcję, dodając, bezpośrednio po zlaniu roztworu leku, 10 ml metanolu i ok. 25 mg borowodorku sodu (NaBH4) i delikatnie wytrząsając w temperaturze pokojowej. Następnie zlano roztwór, kawałki popłukano 3 porcjami wody destylowanej i wysuszono w temp 50°C lub w próżni.

Otrzymane tym sposobem biomateriały zawierały średnio od 5 do 10 mg chemioterapeutyku na 1 g cewnika. Reakcję wiązania leku przeprowadzono w atmosferze azotu.

P r z y k ł a d 2

Immobilizacja cyprofloksacyny poprzez wiązanie pośrednie substancji przeciwbakteryjnej na cewniku urologicznym wykonanym z silikonowanego lateksu typu Foley, przy czym wiązanie zachodzi po uprzedniej aktywacji matrycy z polisacharydem z udziałem linkerów glutaraldehydu i dihydrazydu adypinowego. Doświadczeniu poddano serię 10 kawałków cewników urologicznych o masie ok. 0,15 g.

Celem aktywacji powierzchni, dodano 10 ml 40% kwasu azotowego(V), wytrząsano z szybkością 100 obr/min w temperaturze pokojowej przez 5 min. zlano roztwór kwasu, kawałki wypłukano wodą i osuszono.

Celem naniesienia chitosanu, dodano 10 ml mieszaniny kwasowo-metanolowej chitosanu (60 mg chitosanu rozpuszczono w 10 ml 1 mol/l roztworu kwasu octowego lub 0,1 mol/l roztworu kwasu solnego, dodano 1 ml PEG i 0,5 ml Tween 20 rozcieńczonego 1:10 metanolem i uzupełniono metanolem do 50 ml, wymieszano) i 2 ml tetrahydrofuranu (THF), wytrząsano z szybkością 200 obr/min w temperaturze 60°C przez ok. 20 h odparowując rozpuszczalnik, kawałki popłukano 3 porcjami wody destylowanej, 1 porcją metanolu i wysuszono w temp 50°C lub w próżni.

Celem aktywacji chitosanowej powierzchni, dodano 10 ml 7% roztworu wodno-metanolowego aldehydu glutarowego, pozostawiono w temperaturze pokojowej na noc, zlano roztwór i kawałki popłukano 3 porcjami wody destylowanej, następnie dodano 10 ml 7% roztworu dihydrazydu kwasu adypinowego, pozostawiono w temperaturze pokojowej na noc, zlano roztwór i kawałki popłukano 3 porcjami wody destylowanej, 1 porcją metanolu i wysuszono w temp 50°C lub w próżni.

Celem immobilizacji cyprofloksacyny do aktywnej powierzchni zawierającej ugrupowania hydrazydowe, dodano 10 ml roztworu cyprofloksacyny w metanolu o stężeniu 1 mg/ml. Próby wytrząsano z szybkością 100 obr/min w temperaturze 60°C przez 24h, zlano roztwór leku i kawałki popłukano 3 porcjami wody destylowanej i wysuszono.

P r z y k ł a d 3

Immobilizacja tosufloksacyny lub sparfloksacyny lub etakrydyny lub polimyksyny B, poprzez pośrednie wiązanie chemioterapeutyku na cewniku urologicznym wykonanym z silikonowanego lateksu typu Foley, przy czym wiązanie zachodzi po uprzedniej aktywacji matrycy z polisacharydem z udziałem łącznika aldehydowego dwufunkcyjnego.

Doświadczeniu poddano serię 10 kawałków cewników urologicznych o masie ok. 0,15 g.

Celem aktywacji powierzchni, dodano 10 ml 40% kwasu azotowego(V), wytrząsano z szybkością 100 obr/min w temperaturze pokojowej przez 5 min, zlano roztwór kwasu, kawałki wypłukano wodą i osuszono.

Celem naniesienia chitosanu, dodano 10 ml mieszaniny kwasowo-metanolowej chitosanu (60 mg chitosanu rozpuszczono w 10 ml 1 mol/l roztworu kwasu octowego lub 0,1 mol/l roztworu kwasu solnego, dodano 1 ml PEG i 0,5 ml Tween 20 rozcieńczonego 1:10 metanolem i uzupełniono metanolem do 50 ml, wymieszano) i 2 ml THF, wytrząsano z szybkością 200 obr/min w temperaturze 60°C przez ok. 20 h odparowując rozpuszczalnik, kawałki popłukano 3 porcjami wody destylowanej, 1 porcją metanolu i osuszono.

Celem związania dwufunkcyjnego łącznika z chitosanową powierzchnią, dodano 10 ml 7% roztworu wodno-metanolowego aldehydu glutarowego i wytrząsano w temperaturze 50°C przez 12 h. Zlano roztwór i kawałki popłukano 3 porcjami wody destylowanej, 1 porcją metanolu i wysuszono w temp 50°C lub w próżni.

Celem immobilizacji odpowiedniego chemioterapeutyku, dodano 10 ml roztworu sparfloksacyny w acetonitrylu o stężeniu 1 mg/ml, lub 10 ml roztworu tosufloksacyny w metanolu o stężeniu 2 mg/ml, lub 10 ml roztworu etakrydyny w metanolu o stężeniu 10 mg/ml, lub 10 ml polimyksyny B w buforze fosforanowym o pH 8,5 o stężeniu 5 mg/ml. Próby wytrząsano z szybkością 100 obr/min w temperaturze 50°C przez 24h, zlano roztwór leku i kawałki popłukano 3 porcjami wody destylowanej i wys uszono.

PL 214 742 B1

Celem zwiększenia trwałości wiązania, przeprowadzono redukcję dodając, bezpośrednio po zlaniu roztworu leku, 10 ml metanolu i ok. 25 mg borowodorku sodu (NaBH4) i delikatnie wytrząsając w temperaturze pokojowej. Następnie zlano roztwór, kawałki popłukano 3 porcjami wody destylowanej i wysuszono w temp. 50°C lub w próżni.

Otrzymane tym sposobem biomateriały zawierały średnio od 3 do 7 mg chemioterapeutyku na g cewnika.

Biomateriały szczególnie zawierające sparfloksacynę lub tosufloksacynę immobilizowane według wymienionych przykładów i poddane ocenie aktywności przeciwbakteryjnej wobec bakterii Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis wykazywały strefy zahamowania wzrostu murawy bakteryjnej pod i wokół testowanego fragmentu biomateriału na podłożu stałym Mueller-Hinton (20-30 mm) oraz hamowały wzrost bakterii w bulionie.

Cewniki lateksowe silikonowane ze związaną sparfloksacyną i tosufloksacyną immobilizowane według podanych przykładów i poddane ocenie cytotoksyczności przy użyciu linii komórkowej małpy zielonej (GMK) nie wykazały żadnej toksyczności w stosunku do tej linii w odróżnieniu od cewników lateksowych niemodyfikowanych (dostępnych komercyjnie), które wykazały znaczną toksyczność powodując kompletną destrukcję (lizę) tej linii.

Claims (12)

1. Sposób otrzymywania przeciwbakteryjnej matrycy przez immobilizację substancji o działaniu przeciwbakteryjnym na powierzchni stałej matrycy zwłaszcza lateksowej lub lateksowej silikonowanej, polegający na aktywacji powierzchni matrycy kwasem azotowym, nanoszeniu polisacharydu na aktywną matrycę, oraz wiązaniu w sposób głównie kowalencyjny antybiotyku na wprowadzonym powierzchniowo polisacharydzie, znamienny tym, że na aktywną powierzchnię matrycy nanosi się polisacharyd z grupami aminowymi, korzystnie o właściwościach kompatybilnych z organizmem żywym, korzystnie chitosan, po czym aktywuje się powierzchnię matrycy z polisacharydem w reakcji z łącznikiem aldehydowym dwufunkcyjnym, korzystnie glutaraldehydem, a na wprowadzonych grupach aldehydowych wiąże się bezpośrednio substancję przeciwbakteryjną, zawierającą grupy aminowe, w ilości umożliwiającej skuteczne hamowanie wzrost bakterii, w środowisku rozpuszczalnika, korzystnie organicznego w podwyższonej temperaturze, korzystnie 60°C, i ewentualnie redukuje się otrzymane wiązania stosując wodór in statu nascendi.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w procesie immobilizacji, jako substancję przeciwbakteryjną posiadającą grupy aminowe stosuje się sparfloksacynę, tosufloksacynę. trovafloksacynę, gemifloksacynę, a także cefalosporyny zwłaszcza Cefradyn, Cefadroksyl. Cefepim, polimyksyny, antybiotyki aminoglikozydowe zwłaszcza gentamycynę, amikacynę oraz substancję odkażającą jak etakrydyna.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces wiązania substancji przeciwbakteryjnej prowadzi się w środowisku rozpuszczalnika organicznego korzystnie acetonitrylu, metanolu lub w środowisku wodnym.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w procesie wiązania substancji przeciwbakteryjnej metodą niebezpośredniej redukcyjnej aminacji z zastosowaniem systemu matryca z grupą aminową-glutaraldehyd-związek aminowy prowadzi się redukcję borowodorkiem sodu w metanolu.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces wiązania substancji przeciwbakteryjnej przeprowadza się w atmosferze azotu.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcje wiązania przeprowadza się w rozpuszczalniku organicznym jak THF, dichloroetan, etanol, metanol, acetonitryl.

7. Sposób otrzymywania przeciwbakteryjnej matrycy przez immobilizację substancji o działaniu przeciwbakteryjnym na powierzchni stałej matrycy zwłaszcza lateksowej i lateksowej silikonowanej, polegający na aktywacji powierzchni matrycy kwasem azotowym, nanoszeniu polisacharydu na aktywną matrycę, oraz wiązaniu w sposób głównie kowalencyjny antybiotyku na wprowadzonym powierzchniowo polisacharydzie, znamienny tym, że na aktywną powierzchnię matrycy nanosi się polisacharyd z grupami aminowymi, korzystnie o właściwościach kompatybilnych z organizmem żywym, korzystnie chitosan, po czym wiąże się na nim bezpośrednio, w środowisku rozpuszczalnika, korzystnie organicznego, w podwyższonej temperaturze, korzystnie 60°C substancję przeciwbakteryjną, zawierającą grupy karbonylowe, w ilości umożliwiającej skuteczne hamowanie wzrost bakterii i ewentu8

PL 214 742 B1 alnie redukuje się otrzymane wiązania antybiotyku stosując wodór in statu nascendi lub w przypadku substancji zawierających grupy karbonylowe trudno wiążące się stosuje się metodę pośredniego wiązania substancji przeciwbakteryjnej. po uprzedniej aktywacji matrycy za pomocą linkerów dialdehydu, a następnie dihydrazydu.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że w procesie immobilizacji, jako substancję przeciwbakteryjną posiadającą grupy karbonylowe stosuje się chinolony zwłaszcza cyprofloksacynę, sparfloksacynę, tosufloksacynę. tetracykliny zwłaszcza oksytetracyklinę, doksycyklinę, chlorotetracyklinę, spektynomycynę, erytromycynę, ryfamycyny a zwłaszcza ryfampicynę, wankomycynę, streptograminy.

9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że w procesie wiązania substancji przeciwbakteryjnej metodą niebezpośredniej redukcyjnej aminacji z zastosowaniem systemu matryca z grupą aminową-związek karbonylowy stosuje się redukcję borowodorkiem sodu w metanolu lub matryca z grupą aminową-związek karbonylowy-izopropoksyd tytanu(IV), a następnie prowadzi się redukcję borowodorkiem sodu w metanolu.

10. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że proces wiązania prowadzi się w środowisku rozpuszczalnika organicznego jak THF, dichloroetan, etanol, acetonitryl, metanol, DMSO.

11. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że w przypadku grup karbonylowych trudno wiążących się, aktywację matrycy przeprowadza się z zastosowaniem linkerów glutaraldehydu i hydrazydu adypinowego.

12. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że proces wiązania substancji przeciwbakteryjnej przeprowadza się w atmosferze azotu.