PL213395B1 - Sensor białkowy do wykrywania związków fenolowych - Google Patents

Description

Opis patentowy

Przedmiotem wynalazku jest sensor białkowy, przeznaczony do wykrywania związków fenolowych i fenolu w przemyśle spożywczym oraz w środowisku wodnym.

Biosensory są powszechnie stosowane w technologiach przemysłowych, spożywczych i w ochronie środowiska. Składają się z części biologicznej i części aparaturowej przetwarzającej sygnał odebrany przez element biologiczny. Bioczujniki mogą być oparte na receptorach chemicznych, immunologicznych lub biokatalitycznych. W bioczujnikach starego typu w części biologicznej stosowano często żywą tkankę roślinną lub zwierzęcą obecnie zmierza się do immobilizowania białek na powierzchniach transduktora.

Znane są bioczujniki warstwowe otrzymane z wykorzystaniem różnych technik samoorganizacji cząstek na powierzchni z kwasów tłuszczowych, fosfolipidów lub porfiryn. Tego typu systemy stanowią podstawę do budowy biosensorów oraz biologicznych sensorów optycznych. Znane są innego rodzaju czujniki enzymatyczne, których konstrukcja oparta jest na modyfikacji elektrod (np. platynowe) za pomocą polimerów przewodzących oraz odpowiednich enzymów.

Z europejskiego zgłoszenia patentowego nr EP2083015 znane są biosensory, których część biologicznie aktywna wiązana jest kowalencyjnie w porowatych polipeptydach tworząc charakterystyczne układy poro-sensorowe. Z amerykańskiego patentu nr US7572356, znany jest jednoelektrodowy biosensor zbudowany z użyciem membrany do dializ. Bioczujnik tego typu posiada elektrodę pokrytą filmem otrzymanym z mieszaniny hydrofitowego polimeru przewodzącego oraz enzymu. Z międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO2009140343 znany jest elektrochemiczny biosensor do oznaczania stężenia hemoglobiny we krwi. Kolejnym elektrochemicznym biosensorem, dającym odpowiedź amperometryczną jest układ elektrod modyfikowanych ureazą i iminohydrolazą kreatyninową opisany w amerykańskim zgłoszeniu patentowym nr US 2010025265.

Z europejskiego zgłoszenia nr EP2082038 znany jest sensor biologiczny do wykrywania toluenu i ksylenu zbudowany z transformowanych szczepów Acinetobacter baylyi adp1. Innym bioczujnikiem znanym ze zgłoszenia nr EP1672353 jest biosensor do wykrywania toksyn w żywych tkankach, którego działanie opiera się na detekcji różnicy stężeń soli, zmian pH i polaryzacji między błonami zbudowanymi z ciekłych kryształów. Urządzenie to ma charakter fluorescencyjny. Z kolejnego europejskiego zgłoszenia patentowego nr EP1790984 znany jest bioczujnik, stabilny w warunkach utleniania. Urządzenie to zbudowane jest z białek kowalencyjnie immobilizowanych do grup w karboksylowych w hydrożelu modyfikowanym epichlorohydryną lub polisacharydami. W wynalazku według europejskiego zgłoszenia patentowego nr EP1828759 mediacyjny charakter rutynowych kompleksów został wykorzystany w konstrukcji warstwowych biosensorów, w których białka enzymatyczne były unieruchamiane w przewodnikowych względnie półprzewodnikowych warstwach węglowych. Z polskiego zgłoszenia patentowego nr P381953 znany jest warstwowy bioczujnik do wykrywania związków fenolowych w środowisku wodnym. Czujnik ma warstwę aktywną w postaci białka-lakazy zimmobilizowanej w filmie Langmuira-Blodgett (LB) otrzymanym z N-heptylo-3,6-bis(tiofeno)karbazolu, kwasu 22-trikozenowego i aldehydu glutarowego. Zimmobilizowane, korzystnie kowalencyjnie, białko - lakaza wykazuje dużą czułość na obecność fenolu oraz sól sodową kwasu 2,2'-azyno-bis-3-etylobenzenotiazolo-6-sulfonowego w roztworze wodnym.

W ostatnich latach coraz częściej elektrochemiczne elektrody modyfikowane są za pomocą białek enzymatycznych w celu konstrukcji selektywnych urządzeń diagnozujących substancje toksyczne w środowisku. W systemie tego typu białka są kowalencyjnie wiązane do układów kopolimerowych pokrywających elektrodę.

Istotę sensora białkowego do wykrywania związków fenolowych według wynalazku stanowi sensor zawierający warstwę aktywną w postaci lakazy zimmobilizowanej kowalencyjnie na powierzchni elektrochemicznego filmu, otrzymanego z kopolimeru w skład którego wchodzi kwas tiofenokarboksylowy, 3-metylotiofen i N-heptylo-3,6-bis(tiofeno)karbazol.

Korzystnie sensor utworzony jest w równomolowej mieszaniny kwasu tiofenokarboksylowego, 3-metylotiofenu i N-heptylo-3,6-bis(tiofeno)karbazolu oraz lakazy.

Sensor białkowy według wynalazku wytworzony jest z ultracienkiego filmu elektrochemicznego i nadaje się do wykrywania fenolu i jego toksycznych pochodnych w środowiskach wodnych oraz w przemyśle spożywczym. Zaletą biosensora jest jego bardzo duża czułość oraz fakt, że nadaje się do wykrywania różnych stężeń, a także jego szeroka aktywność substratowa. Nie bez znaczenia jest również dość długa żywotność zimmobilizowanego białka, które zachowuje swoją katalityczną

PL 213 395 B1 aktywność w ciągu kolejnych trzydziestu cykli reakcyjnych tj. około 4 miesiące. Warstwa elektrochemicznego filmu z immobilizowaną lakazą według wynalazku i powtarzalność otrzymanych wyników oraz różne odpowiedzi czujnika zbudowanego z kopolimeru w skład którego wchodzi kwas tiofenokarboksylowy, 3-metylotiofen oraz N-heptyIo-3,6-bis(tiofeno)karbazoI. na różne stężenia związków fenolowych, typują ten materiał do budowy czujników stosowanych w diagnostyce środowiska.

Przedmiot wynalazku jest wyjaśniony w przykładzie realizacji i na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schemat pracy sensora białkowego, fig. 2 - wykres zależności aktywności lakazy unieruchomionej w elektrochemicznym filmie mierzonej wzrostem natężenia płynącego prądu od zmiany przyłożonego napięcia, a fig. 3 - wykres zależności aktywności lakazy unieruchomionej w elektrochemicznym filmie mierzonej wzrostem natężenia płynącego prądu od zmiany przyłożonego napięcia w obecności tlenu.

P r z y k ł a d

Sensor białkowy zawierający lakazę zimmobilizowaną kowalencyjnie w elektrochemicznym filmie otrzymano z kopolimeru wytworzonego z równomolowej mieszaniny kwasu tiofenokarboksylowego, 3-metylotiofenu oraz N-heptylo-3,6-bis(tiofeno)karbazolu P w wyniku elektrodepozycji lakazy na platynowej elektrodzie Pt modyfikowanej polimerem przewodzącym P. Proces elektrodepozycji białka B na modyfikowanej elektrodzie pracującej prowadzono galwanostatycznie przy napięciu równym 200 μΑ w 0,1 M roztworze elektrolitu - LiCIO4 w buforze octanowym o pH 5,0. Następnie sensor białkowy według wynalazku wprowadzono do naczynia pomiarowego, o pojemności 50 ml zaopatrzonego w układ dwóch elektrod: elektrodę kalomelową (SCE) jako elektrodę odniesienia Eo oraz cylindryczną elektrodę platynową jako elektrodę pomocniczą Ep. Do pomiaru aktywności zimmobilizowanego białka użyto 0,2 mM hydrochinonu jako substratu, reakcję katalityczną prowadzono w warunkach beztlenowych i utlenionych, przepuszczając przez roztwór prąd w zakresie napięć -200 - 1000 mV. Proces i pomiar aktywności zimmobilizowanego białka prowadzono w temperaturze pokojowej w 0,1 molowym buforze octanowym o pH 5,0. Zmianę natężenia prądu notowano przy użyciu galwanostatu/potencjostatu ELECTROCHEMA. Układ pomiarowy w trakcie prowadzonego procesu zmieniał sygnał chemiczny na mierzalny sygnał amperometryczny.

Aktywność lakazy zimmobilizowanej, przedstawiono na fig. 2 jako funkcję natężenia prądu w zależności od wzrastającego napięcia, w obecności hydrochinonu jako substratu. Omawiane badania nad aktywnością lakazy były wykonywane przy zastosowaniu hydrochinonu, soli sodowej kwasu 2,2'-azyno-bis-3-etylobenzeno-tiazolo-6-sulfonowego (ABTS-u) oraz syringaldazyny jako substratów. Przedstawiony na fig. 3 wykres uwidacznia istotny wpływ tlenu na katalityczne właściwości białka.

Z przeprowadzonych badań wynika, że obecność kopolimeru zbudowanego z kwasu tiofenokarboksylowego, 3-metylotiofenu oraz N-heptylo-3,6-bis(tiofeno)karbazolu ze względu na mediacyjny charakter elektroprzewodzącego układu, usprawnia transport elektronów, przez co znacznie poprawia aktywność katalityczną unieruchomionego białka.

Długość życia zimmobilizowanego białka według wynalazku wynosi co najmniej 4 miesiące. Stała, wysoka zdolność utleniania substratu zachowana jest przez kolejnych 30 cykli reakcyjnych. Aktywność białka zimmobilizowanego w filmie stanowi około 80 % aktywności użytego do immobilizacji białka natywnego.

Claims (2)

1. Sensor białkowy do wykrywania związków fenolowych, zawierający warstwę aktywną - lakazę zimmobilizowaną w elektrochemicznym filmie osadzoną na podłożu stałym, znamienny tym, że lakaza zimmobilizowana jest kowalencyjnie na powierzchni elektrochemicznego filmu otrzymanego z kopolimeru w skład którego wchodzi kwas tiofenokarboksylowy, 3-metylotiofen i N-heptylo-3,6-bis(tiofeno)karbazol.

2. Sensor według zastrz. 1, znamienny tym, że utworzony jest z równomolowej mieszaniny kwasu tiofenokarboksylowego, 3-metylotiofenu N-heptylo-3,6-bis(tiofeno)karbazolu oraz lakazy.