PL212549B1 - Nowa zewnatrzkomórkowa DD-peptydaza, jej otrzymywanie i zastosowania - Google Patents

Description

Opis wynalazku

DD-karboksypeptydazy/transpeptydazy (DD-peptydazy) są enzymami biorącymi udział w ostatnim etapie biosyntezy peptydoglikanu ściany komórkowej baktem. DD-peptydazy są związane z błoną cytoplazmatyczną, tylko nieliczne promieniowce rodzaju Streptomyces, Actinomadura i Saccharopolyspora erythraea wydalają je na zewnątrz komórki. Zewnątrzkomórkowe DD-peptydazy są stosunkowo łatwe do wyodrębnienia i oczyszczenia, stanowią bardzo dogodny model do badań PBPs (białka wiążące penicylinę). Ponadto DD-peptydazy, w przeciwieństwie do PBPs o wysokiej masie cząsteczkowej, reagują z syntetycznymi peptydami jako substratami, co bardzo ułatwia badanie ich właściwości katalitycznych. Większość wniosków wyciągniętych z wyników badań dotyczących zewnątrzkomórkowych DD-peptydaz potwierdza się także dla enzymów związanych z błonami cytoplazmatycznymi.

DD-peptydazy są najbardziej czułymi dotychczas poznanymi indykatorami związków β-laktamowych, mogą być wykorzystywane do poszukiwania nowych, naturalnych antybiotyków β-, γ-laktamowych, pirazolidynonów, β-laktonów. Okazało się, co wykazano w niniejszej pracy, że DD-peptydaza 64-575 II może służyć także do detekcji i badania alkaloidów izochinoliny. Aktywność DD-peptydazy 64-575 II jest hamowana przez nowe związki z grupy alkaloidów izochinoliny.

Mechanizm działania DD-peptydaz polega na przeniesieniu elektrofilowej grupy R-CO- z hydrolizowanego wiązania peptydowego D-alanylo-D-alamnowej części cząsteczki prekursora peptydoglikanu na grupę hydroksylową seryny znajdującą się w centrum aktywnym enzymu, a następnie na akceptor. Akceptorem może być cząsteczka H2O (aktywność DD-karboksypeptydaz) lub związek z grupą aminową NH2-R (aktywność DD-transpeptydaz).

DD-peptydazy wiążą antybiotyki β-laktamowe, które są strukturalnymi analogami D-alanylo-D-alaninowego zakończenia prekursora biosyntezy peptydoglikanu. Acylowany przez antybiotyk β-laktamowy enzym tworzy trwały kompleks, następuje hamowanie biosyntezy peptydoglikanu i w konsekwencji śmierć komórki bakteryjnej.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowej DD-peptydazy, metody jej otrzymywania oraz jej zastosowań bazujących na jej specyficznej aktywności enzymatycznej, w szczególności wykorzystaniu do wykrywania i/lub poszukiwania leków.

Przedmiotem wynalazku jest zewnątrzkomórkowa DD-peptydaza 64-575 II wytwarzana przez szczep Saccharopolyspora erythraea zdeponowany w PCM pod numerem depozytowym B/00018. Drugim przedmiotem wynalazku jest zastosowanie DD-karboksypeptydazy/DD-transpeptydazy (DD-peptydazy) jak określono w pierwszym przedmiocie wynalazku do wytwarzania testów do wykrywania leków z grupy zawierającej antybiotyki β-laktamowe, korzystnie penicyliny, cefalosporyny, monobaktamy, karbapenemy, izopenicyliny N albo mikroorganizmów je wytwarzających. Równie korzystnie zastosowanie według drugiego przedmiotu wynalazku charakteryzuje się tym, że grupa dodatkowo zawiera alkaloidy izochinoliny oraz ich analogi. Trzecim przedmiotem wynalazku jest zastosowanie enzymu jak określono w pierwszym przedmiocie wynalazku do uzyskiwania aktywności enzymatycznej wybranej z grupy obejmującej aktywność: DD-karboksypeptydazy,DD-transpeptydacji do badania aktywności syntazy izopenicyliny N poprzez określanie zawartości izopenicyliny N w trakcie procesu biosyntezy penicyliny. Czwartym przedmiotem wynalazku jest szczep mikroorganizmu Saccharopolyspora erythraea zdeponowany w PCM pod numerem depozytowym B/00018. oraz jego zastosowanie do wytwarzania zewnątrzkomórkowej DD-peptydazy.

Prezentowany wynalazek bazuje na zaobserwowaniu i wykorzystaniu faktu powinowactwa zewnątrzkomórkowej DD-peptydazy 64-575 II do alkaloidów izochinoliny. W efekcie możliwe stają się: nowe zastosowanie DD-peptydazy 64-575 II do celów screeningowych, np. poszukiwania drobnoustrojów wytwarzających alkaloidy izochinoliny, a także produktów pochodzenia roślinnego, czy zwierzęcego o takiej budowie, a także zastosowanie ujawnionej DD-peptydazy 64-575 II podczas oczyszczania związków czynnych o budowie alkaloidu izochinoliny. Proponowany test przy użyciu ujawnionej DD-peptydazy jest szybszy i znacznie bardziej czuły niż metody mikrobiologiczne. Ponadto, wysokie powinowactwo DD-peptydaz oraz długi czas trwania kompleksu enzym-alkaloid może służyć do wstępnej oceny przydatności poszukiwanego/badanego związku. Ponieważ dotychczas nie został ustalony mechanizm przeciwbakteryjnego działania alkaloidów izochinoliny, dzięki prezentowanemu wynalazkowi wyłaniają się także nowe możliwości badawcze. W szczególności możliwe jest blokowanie ostatniego etapu biosyntezy peptydoglikanu ściany komórkowej bakterii, gdyż w tym etapie biorą udział DD-peptydazy.

PL 212 549 B1

Do badań, które doprowadziły do uzyskania enzymu według wynalazku użyto szczepu promieniowca Saccharopolyspora erythraea PZH 64-575 II, który wcześniej poddano mutagenezie przy zastosowaniu promieni UV. Uzyskany mutant został zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) pod numerem depozytowym B/00018. Szczepem wyjściowym był drobnoustrój Saccharopolyspora erythraea PZH 64-575 należący do kolekcji własnej PZH.

Podłoża i warunki wzrostu.

Drobnoustrój hodowano na podłożu sporulacyjnym, następnie przesiewano na podłoża płynne.

Podłoże stałe sporulacyjne w 1 dm³ wody destylowanej zawierało: wyciąg mięsny (Difco) 1 g, wyciąg drożdżowy (Difco) 1 g, pankreatyczny hydrolizat kazeiny (Bacto-Casitone, Difco) 2 g, glukozę 2 g, agar (Bacto-Agar, Difco) 25 g. Wartość pH przed sterylizacj ą doprowadzono do 8,0. Pod ł o ż e sterylizowano 30 min. w 117°C. Zaszczepione zarodnikami skosy inkubowano 14 dni w temp. 32°C.

Podłoże płynne dla wzrostu Saccharopolyspora erythraea (1) zawierało: wyciąg namokowy kukurydzy (Cerestar, Włochy) 30 g, sacharozę 30 g, (NH4)2SO4 4 g, CaCO3 6 g w 1 dm³ wody wodociągowej. Podłoże sterylizowano 20 min. w 121°C.

cm³ podłoża płynnego (1) szczepiono 1 cm³ zawiesiny zawierającej 10⁹ zarodników, a następnie hodowlę inkubowano w stożkowych kolbach fermentacyjnych o pojemności 500 cm³, w ciągu 48 godz. w temp. 32°C na wytrząsarce przy 240 rpm. (Series 25 Incubator Shaker, New Brunswick Scientific, Edison, New Jersey, USA). Następnie 36 cm³ podłoża (1) szczepiono 4 cm³ hodowli w podłożu płynnym (1) i inkubowano 24 godz. w temp. 32°C na wytrząsarce przy 240 rpm.

Podłoże płynne do produkcji zewnątrzkomórkowych DD-karboksypeptydaz (2) zawierało: mąkę sojową 30 g, skrobię ziemniaczaną 40 g, dekstrynę (Bacto-Dextrin, Difco) 20 g, (NH4)2SO4 2 g, CaCO3 8 g w 1 dm³ wody wodociągowej, pH doprowadzano do wartości 8,3. Sterylizację przeprowadzano 30 min. w 121°C.

cm³ podłoża (2) szczepiono 5 cm³ hodowli Saccharopolyspora erythraea w podłożu (1). Hodowlę inkubowano od 96 do 220 godz. w temp. 32°C na wytrząsarce przy 240 rpm. Brzeczkę fermentacyjną odwirowywano przy 7000 g w ciągu 20 min. Otrzymano 3,3 dm³ supernatantu hodowli o zawartości białka 4,0 mg^cm³.

Zastosowane metody badawcze:

1. ) Test enzymatyczny do oznaczania aktywności DD-karboksypeptydazy 64-575 II przeprowadzono według Frere i współprac. 1976¹.

Podczas procesu oczyszczania DD-peptydazy w kolejnych frakcjach sprawdzano aktywność enzymatyczną.

₃

Mieszanina reakcyjna do oznaczania aktywności DD-peptydaz składała się z: 60 mm³ roztworu zawierającego 0,05 mg^cm^-3 dinukleotydu flawinoadeninowego (Sigma) w 0,1 M buforze Tris-HCl o pH 8,0; 10 mm³ roztworu zawierającego 0,05 mg^cm^-3 peroksydazy chrzanowej o aktywności 1230 j/mg^-1 (Sigma) w wodzie dest., 5 mm³ roztworu zawierającego 5 mg •cm^-3 chlorku o-dianizydyny (Sigma) w wodzie dest., 2 mm³ roztworu zawierającego 11,77 mg^cm^-3 oksydazy D-aminokwasów wyodrębnionej z nerek wieprzowych (Sigma) o aktywności 6,7 j/mg^-1 w 0,1 M buforze Tris-HCl o pH 8,0.

Próbki do oznaczania aktywności DD-karboksypeptydaz (a) składały się z: 10 (20) mm³ roztworu oczyszczanego enzymu, 20 mm³ roztworu zawierającego 4,52 mg^cm^-3 tripeptydu N^a, N^!'Ac₂-L-Lys-D-Ala-D-Ala w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 8,0. Próbki standardowe (b) zawierały zamiast roztworu substratu 20 mm³ roztworu zawierającego 0,089 mg^cm^-3 D-alaniny (Sigma). Próbka ślepa (c) zawierała zamiast roztworu substratu 20 mm³ 0,1 M buforu fosforanowego o pH 8,0. Wszystkie próbki (a), (b), (c) przygotowywano w temp. 4°C, następnie inkubowano 30 min. w temp. 37°C, po czym umieszczano na 2 min. w łaźni wodnej o temp. 100°C. Po ochłodzeniu do próbek (a), (b) i (c) dodawano po 77 mm³ mieszaniny reakcyjnej, a następnie inkubowano je 10 min. w temp. 37°C. Do każdej próbki dodawano 0,350 cm³ mieszaniny zawierającej metanol, wodę destylowaną i stężony kwas siarkowy w stosunku objętościowym 5:5:6. Ekstynkcję mierzono spektrofotometrycznie przy długości fali 540 nm na spektrofotometrze Spekol 11 (Carl Zeis Jena, REN). Ilość uwalnianej D-Ala odczytywano z krzywej wzorcowej. Aktywność DD-karboksypeptydazy wyrażano w jednostkach j/cm^-3 lub j.-mg'¹. Standardowa jednostka aktywności j. jest to ilość enzymu, która katalizuje hydrolizę 1 μΜ tripeptydu Ac2-L-Lys-D-Ala-D-Ala w ciągu 1 minuty w 37°C.

2. ) Oznaczanie białka metodą Bradford oraz przy długości fali 280 nm.

Do badań użyto odczynnika barwnego Bio-Rad, który rozcieńczano pięciokrotnie wodą dest. Oznaczenie wykonano w sposób następujący: do 0,1 cm³ supernatantu hodowli (Iiofilizatu) dodano 5 cm³ rozcieńczonego odczynnika barwnego, wymieszano dokładnie i po 5 minutach oznaczano spek4

PL 212 549 B1 trofotometrycznie przy długości fali 595 nm, wobec próby ślepej. Próbka ślepa zawierała 0,1 cm³ 0,15 M roztwór chlorku sodu z 5 cm³ rozcieńczonego odczynnika barwnego. Ilość białka odczytywano z krzywej wzorcowej.

Podczas procesu oczyszczania enzymu ilość białka w poszczególnych frakcjach oznaczano poprzez pomiar absorpcji przy długości fali 280 nm.

3.) Elektroforeza w warunkach denaturujących w żelu poliakrylamidowym.

Przygotowywano 12% żel poliakrylamidowy o składzie: 4 cm³ roztworu zawierającego 0,292 gcm³ akrylamidu (Sigma) i 8,0 mgTm^-3 Ν,Ν'-metylenobisakrylamidu (Sigma) w wodzie redest.; 2,5 cm³ 1,5 M buforu Tris-HCl o pH 8,8; 0,1 cm³ 10% roztworu laurylosiarczanu sodowego (SDS) (Sigma); 3,4 cm³ wody redest.; 0,2 cm³ 10% roztworu nadsiarczanu amonu (APS) (Sigma) w wodzie redest.; 20 mm³ Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametylenodiaminy (Temed) (Sigma). Przygotowany roztwór wprowadzano między szybki aparatu.

Przygotowywano 6% żel zagęszczający o składzie: 1 cm³ roztworu zawierającego 0,292 grom^-3 akrylamidu i 8,0 mg· cm³ N,N'-metylenobisakrylamidu; 1,25 cm³ 0,5 M buforu Tris-HCl o pH 6,8; 50 mm³ 10% roztworu SDS; 2,65 cm³ wody redest.; 50 mm³ 10% roztworu APS; 5 mm³ Temed. Przygotowany roztwór wprowadzano między szybki aparatu i wkładano odpowiedni grzebień. Po spolimeryzowaniu wyjmowano grzebień. Żel przemywano buforem do elektroforezy o składzie: tris (Sigma) 6 g, glicyna 28,8 g, 10 cm³ 10% roztworu SDS, woda redest. do 1000 cm³, pH 8,3 nastawiono przy użyciu roztworu 1 M HCl. Do próbek badanych frakcji podczas oczyszczania enzymu dodawano 5 mm³ mieszaniny denaturującej o następującym składzie: 0,6 cm³ buforu rozpuszczającego, 0,2 cm³ 20% roztworu SDS, 0,2 cm³ 2-merkaptoetanolu (Sigma). Skład buforu rozpuszczającego: 2,5 cm³ 1 M buforu Tris-HCl o pH 6,8, 4,0 cm³ 100% roztworu gliceryny i 0,6 cm³ 0,1% roztworu błękitu bromofenolowego w 5 mM NaOH z dodatkiem 10^-4 M azydku sodowego. Przygotowywano próbki z białkami standardowymi o masach cząsteczkowych: 14,3 kDa, 20,1 kDa, 29 kDa, 45 kDa, 66 kDa, 97,4 kDa (Sigma): do 2 mm³ roztworu zawierającego 250 μg białek standardowych dodawano 13 mm³ wody redest., 5 mm³ mieszaniny denaturującej. Wszystkie próbki gotowano 2 min. Górną i dolną komorę aparatu zalewano buforem do elektroforezy, do zagłębień w żelu nanoszono 20 mm³ próbki. Elektroforezę prowadzono około 1,5 godz. w temp. 4°C przy stałym natężeniu prądu 15 mA (200 V) w aparacie Mini Protean Gel (Bio-Rad). Białka barwiono błękitem kumasynowym, lub enzym znakowano kwasem fluoresceinylo-6-aminopenicylanowym (Flup). Po każdym etapie oczyszczania enzymu we frakcjach o wysokiej aktywności DD-peptydazy sprawdzano ilość różnych zanieczyszczeń białkowych wykonując elektroforezę. Po pierwszym i drugim etapie oczyszczania uzyskano wiele prążków świadczących o znacznym zanieczyszczeniu aktywnych frakcji. Po etapie trzecim uzyskano 5 prążków białek, a po ostatnim etapie pojedynczy prążek.

4.) Znakowanie DD-peptydazy kwasem fluoresceinylo-6-aminopenicylanowym (Flup).

Przygotowywanie do elektroforezy próbek enzymu Flup wykonywano metodą Galleni². Dziesięć mm³ roztworu enzymu inkubowano 15 min. w temp. 37°C z 2 mm³ 15 μΜ roztworu Flup. Do próbek dodawano 4 mm³ mieszaniny denaturującej i gotowano w ciągu 2 min. Po przeprowadzonej elektroforezie żel umieszczano w wodzie destylowanej i fotografowano w świetle ultrafioletowym ^_max. = 312 nm) przy użyciu dwuwymiarowego gęstościomierza (Cybertech CS-1, Dalton, Waalwijk, Holandia). Elektroforezę białek znakowanych Flup wykonywano po kolejnych etapach oczyszczania DD-peptydazy, a położenie świecącego w UV prążka DD-peptydaza-Flup porównywano do prążków barwionych błękitem kumasynowym.

Oczyszczanie DD-peptydazy 64-575 II.

Etap 1. Supernatant hodowli wysycano (NH4)2SO4 do stężenia 35% i pozostawiano w temp. 5°C w ciągu 24 godz. Zawiesinę wirowano 30 min. przy 10000 g, a następnie osad zawieszano w 150 cm³ 0,01 M buforu fosforanowego o pH 8,0. Zawiesinę dializowano przez 24 godz. wobec 0,01 M buforu fosforanowego o pH 8,0 w temp. 4°C. Po dializie zawiesinę wirowano 30 min. przy 10000 g. Otrzymany roztwór enzymu liofilizowano.

Etap 2. Dalsze oczyszczanie enzymu prowadzono metodą chromatografii jonowymiennej przy użyciu żywicy DEAE-Cellulose 3201 (Merck). Liofilizat enzymu rozpuszczano w 500 cm³ 0,01 M buforu Tris-HCl o pH 8,0. Następnie w celu inhibicji proteaz dodano fluorku fenylometylosulfonylowego (PMSF) (Boehringer Mannheim) do stężenia końcowego 0,5 mM. Roztwór enzymu pozostawiano 1 godzinę w temperaturze 5°C. Następnie dodawano 150 g równoważonej żywicy DEAE-Cellulose, zawiesinę mieszano około 30 min. Żywicę z zaadsorbowanym enzymem wprowadzano na kolumnę i przemywano ją 1 dm³ 0,01M buforu Tris-HCl o pH 8,0. Wzrastającym gradientem stężeń NaCl (300 cm³

PL 212 549 B1

0,01 M buforu Tris-HCl o pH 8,0 do którego dodawano 1 dm³ buforu zawierającego 0,5 M NaCl) wymywano białka z żywicy. Zbierano najbardziej aktywne frakcje od 50 do 62. Uzyskano 130 cm³ roztworu zawierającego 1,185 mg-cm^-3 białka. Aktywne frakcje zatężano metodą ultrafiltracji przy użyciu aparatu Amicon 8200 (Amicon, membrana PM 10). Frakcje 46-49 wykazywały wysoką aktywność enzymatyczną, lecz były w znacznym stopniu zanieczyszczone białkami (niska aktywność właściwa).

Etap 3. Sączenie przez sito molekularne Sephadex G-100 (Pharmacia). Zagęszczone frakcje z etapu 2 sączono przez kolumnę o pojemności 1 dm³ z żelem Sephadex G-100. Jako bufor wymywający stosowano 0,01 M Tris-HCl o pH 8,0. Zebrano frakcje od 31 do 39 (90 cm³) o najwyższej aktywności właściwej. Następnie część eluatu o najwyższej aktywności zagęszczano metodą ultrafiltracji przy użyciu aparatu Amicon.

Etap 4. W kolejnym etapie oczyszczania stosowano chromatografię średniociśnieniową FPLC (Pharmacia), kolumnę Mono Q HR-5/5 (Pharmacia). Proces prowadzono pod ciśnieniem 2 MPa, prędkość przepływu wynosiła 0,7 cm³-min^-1. Dwa cm³ zagęszczonych frakcji z etapu 3 po dializie w 0,05 M buforze octanowym o pH 5,0 nanoszono na kolumnę. Do chromatografii użyto 10 cm³ 0,05 M buforu octanowego, 30 cm³ wzrastającego gradientu roztworu NaCl (od 0 do 0,5 M) w buforze octanowym, a następnie 5 cm³ 0,5 M roztworu NaCl w 0,05 M buforze octanowym. Zebrano frakcje 26, 27 i zatężano je metodą ultrafiltracji. Otrzymano czysty enzym, co stwierdzono elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowym uzyskując jeden prążek. Enzym znakowano także Flup. Rf świecącego prążka potwierdził się.

T a b e l a 1. Oczyszczanie zewnątrzkomórkowej DD-peptydazy 64-575 II

Etap oczyszczania	Białko całkowite [g]	Aktywność całkowita [j.]	Aktywność właściwa [j.-mg-1]	Wydajność [%]
supernatant	13,1	530	0,01	100
(NH4)2SO4	5,0	510	0,10	96
DEAE-Cellulose	0,154	325	2,1	65
Sephadex G-100	0,020	266	14,26	50,2
Mono Q	0,0051	240	47,1	48

Badanie zewnątrzkomórkowej DD-peptydazy 64-575 II.

1.) Określono powinowactwo ID₅₀(M) zewnątrzkomórkowej DD-peptydazy 64-575 II do związków β-laktamowych.

-1

Próbki zawierały: 15 mm roztworu enzymu o stężeniu 68 μΜ (akt. wł. 45 j.-mg^-) w 0,01 M buforze fosforanowym o pH 8,0; 5 mm³ roztworu wodnego badanego antybiotyku β-laktamowego o stęże-3 -3 3 niu od 1 ng-cm do 3 mg-cm^- (w zależności od antybiotyku), 20 mm roztworu substratu Ac₂-L-Lys-D-Ala-D-Ala o stężeniu 1,3 mg-cm^-3 w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 8,0. Próbki przygotowywano w temp. 0°C. Próbka kontrolna zawierała zamiast roztworu antybiotyku β-laktamowego 5 mm³ wody dest. Próbkę do oznaczania powinowactwa oraz próbkę kontrolną inkubowano 30 min. w temp. 37°C. Następnie dodawano mieszaninę reakcyjną i oznaczenie wykonywano analogicznie jak opisano wyżej.

Hamowanie aktywności DD-peptydaz przez antybiotyki β-laktamowe wyrażane jest wielkością powinowactwa ID₅₀(M), które jest równe molowemu stężeniu antybiotyku β-laktamowego, powodujące w warunkach doświadczenia obniżenie o 50% uwalniania D-alaniny z tripeptydu Ac2-L-Lys-D-Ala-D-Ala w temp. 37°C, przy pH 8,0 w ciągu 30 min. Wyniki obliczono przy zastosowaniu statystycznego programu analizy korelacji i przedstawiono w tabeli 2.

T a b e l a 2. Powinowactwo zewnątrzkomórkowej DD-peptydazy 64-575 II do związków β-laktamowych

Związek β-Laktamowy	ID50 (M)
1	2
Aztreonam	1,6-10'3
Cefsulodyna	0,45-10'3
Sulbaktam	5,5-10'4
Azlocylina	2,2-10'4

PL 212 549 B1 cd. tabeli 2

1	2
Ceftazydym	1,2·10-4
Kwas klawulanowy	2,0-10-5
Piperacylina	1,8·10-5
Mezlocylina	7,9-10-6
Cefotaksym	5,5·10-6
Flukloksacylina	4,4-10-6
Cefoperazon	4,1 ·10-6
Kloksacylina	3,0-10-6
Oksacylina	1,7·10-6
Cefalotyna	1,1-10-®
Karbenicylina	1,4·10-6
Penicylina G	6,1-10-7
Tikarcylina	6,0-10-7
Ampicylina	3,3-10-7
Cefalorydyna	3,3-10-7
Cefaleksyna	3,3-10-7
Metampicylina	2,9-10-7
Amoksycylina	2,3-10-7
Ceftriakson	1,9-10-7
Cefaklor	1,4-10-7
Cefazolina	1,4-10-7
Cefuroksym	8,5-10-8
Hetacylina	8,5-10-8
Cefotetan	6,2-10-8
Imipenem	5,8-10-8
Cefoksytyna	4,5-10-8
Cefalorydyna, z betainą	3,9-10-8
Isopenicylina N	3,7-10-8
Cefradyna	2,6-10-8
Cefapiryna	2,5-10-8
Nitrocefina	1,5-10-8
Cefamandol	1,5-10-8

DD-peptydaza 64-575 II wykazuje na ogół niższe powinowactwo do penicylin niż do cefalosporyn.

2.) Określono stałą dysocjacji (K) oraz stałą szybkości (k2) reakcji DD-peptydazy 64-575 II z penicyliną G.

Stałą dysocjacji K oraz stałą szybkości k2 określono metodą „reporter substrate” opisaną przez De Meester³. Badania prowadzono przy użyciu różnych stężeń enzymu i penicyliny G. Stężenia enzymu wynosiły: 2,15 nM, 4,3 nM, 8,6 nM, 21,5 nM; stężenia penicyliny G wynosiły: 0,05 μΜ, 0,1 μΜ, 0,3 μΜ, 0,5 μΜ, 0,7 μΜ; stężenie substratu C6H5-CO-NH-(CH3)-CO-S-CH2-COOH (S2d) wynosiło 200 μΜ; stężenie akceptora D-Ala wynosiło 50 mM. Reakcje prowadzono w kuwecie w temp. 37°C, dodając

PL 212 549 B1 kolejno: substrat akceptor, penicylinę, 0,1 M bufor Tris-HCl o pH 8,0 do końcowej objętości 0,5 cm³. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodawano roztworu enzymu. Inhibicję enzymu mierzono kontrolując spadek ekstynkcji przy użyciu spektrofotometru (Hewlett-Packard) przy długości fali 250 nm i w czasie 200 s. Stężenia enzymu w reakcjach dobierano tak, aby przy określonym stężeniu inhibitora różnice ekstynkcji między początkiem i końcem reakcji wynosiły 10% wartości różnicy ekstynkcji dla reakcji bez inhibitora. Wartości stałej inhibicji (ki) obliczano przy użyciu programu komputerowego do obliczeń kinetycznych, gdzie Km-stęż. S2d << Km. Wartości K i k2 obliczano przy użyciu programu Enzfitter.

Stała dysocjacji (K) reakcji enzymu z penicyliną G wynosi 2,02-10^-7 M, stała szybkości k2 wynosi 0,74 s^-1. Stała szybkości k₂/K wynosi 3,7-10⁶ M^-1s^-1.

3.) Oznaczanie inhibicji DD-peptydazy 64-575 II przez alkaloid izochinoliny, kwas 7-hydroksy-6-oxo-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowy mm³ roztworu DD-peptydazy o stężeniu 25,5 μΜ, 10 mm³ roztworu inhibitora inkubowano 30 min. w temperaturze 37°C. Następnie dodawano 20 mm³ roztworu substratu-tripeptydu i dalej postępowano jak opisano wyżej.

Absorbancja próby kontrolnej enzymu (Aen) wynosiła 0,350-0,370, absorbancja prób inhibitora (Apr) wynosiła 0,05-0,10.

Powinowactwo DD-peptydazy 64-575 II do alkaloidu izochinoliny wynosi ID50(M)=2,6 x 10^-4 M. Czas trwania kompleksu DD-peptydaza 64-575 II - alkaloid izochinoliny wynosi 4,5 godz.

Charakterystyka DD-peptydazy 64-575 II

1. ) Oznaczono punkt izoelektryczny metodą ogniskowania izoelektrycznego.

Do elektroforezy używano 7% żelu poliakrylamidowego. Stabilizację pH w zakresie 3,8-8,5 uzyskiwano przy zastosowaniu nośników amfolitycznych (Pharmacia). Jako elektrod używano roztwory: 1M NaOH, 1M H3PO4. Preelektroforezę przeprowadzano około 30 min. przy natężeniu prądu 10 mA. Następnie na żel nanoszono 20 mm³ roztworu enzymu. Czas przebiegu elektroforezy wynosił ok. 1,5 godziny, napięcie prądu wzrastało do 1400 V. W celu sprawdzenia wartości pH w różnych miejscach żelu brzeg żelu cięto na kwadraty o długości 0,5 cm. Każdy kwadrat umieszczano w probówce i zalewano 1 cm³ wody destylowanej; po 10 godz. sprawdzano pH. Wykonano wykres zależności pH od szerokości żelu podanej w cm. Żel po elektroforezie pozostawiano na 30 min. w 50% roztworze kwasu trichlorooctowego, 30 min. w wodzie destylowanej, a na noc w roztworze różnicującym. Następnie żel barwiono błękitem kumasynowym 30 min. i odbarwiano roztworem różnicującym. Punkt izoelektryczny enzymu wynosi 4,5.

2. ) Masa cząsteczkowa DD-peptydazy 64-575 II

Wykonano elektroforetyczne badanie enzymu i białek standardowych w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących oraz znakowanie enzymu kwasem fluoresceinylo-6-aminopenicylanowym. Z krzywej zależności względnej drogi migracji pasma białka od masy cząsteczkowej obliczono, że masa cząsteczkowa enzymu wynosi 49000 ± 2000 Da.

3. ) Aktywność DD-peptydazy 64-575 II w różnych warunkach

Oznaczanie optimum temperatury: Aktywność DD-peptydazy 64-575 II oznaczano stosując enzym o stężeniu 25,5 μΜ w 20 mM buforze fosforanowym o pH 8,0. Pomiar aktywności enzymu wykonywano w następujących temperaturach: 10°C, 20°C, 30°C, 37°C, 50°C, 60°C, 70°C, 85°C, 90°C. Max aktywności enzym wykazuje w temp. 50°C (Tab. 3).

T a b e l a 3. Wpływ temperatury na aktywność DD-peptydazy 64-575 II

temperatura [°C]	10	20	30	37	50	60	70	85	90
aktywność właściwa [j.-mg-1]	13,2	23,7	37,0	50,9	62,8	58,6	57,9	7,0	4,2

Oznaczanie optimum pH: Aktywność DD-peptydazy 64-575 II oznaczano stosując enzym o stężeniu 25,5 μΜ w 50 mM buforze octanowym o pH: 4,0 i 5,0; w 10 mM buforze kakodylanowym o pH 6,0; w 20 mM buforze fosforanowym o pH: 7,0 i 8,0 a także w 50 mM buforze boranowym o pH 9,0 i 10,0. Przewodnictwo jonowe użytych buforów wynosiło około 200 μS (konduktometr E 527, Metrohm Herisau, Szwajcaria). Najwyższą aktywność enzym wykazuje w pH 10,0 (Tab. 4).

PL 212 549 B1

T a b e l a 4. Wpływ pH na aktywność DD-peptydazy 64-575 II

pH	aktywność właściwa [j.-mg-1]
4	0
5	16,2
6	39,0
7	44,5
8	50,9
9	61,0
10	62,0

4.) Badanie stabilności DD-peptydazy 64-575 II

Oznaczanie termostabilności: Aktywność DD-peptydazy 64-575 II oznaczano stosując enzym o stężeniu 25,5 μΜ w 20 mM buforze fosforanowym o pH 8,0. Próbki enzymu inkubowano 1 godz. w temperaturach: 20°C, 37°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C. Następnie próbki chłodzono i sprawdzano aktywność. Po 1 godz. inkubacji enzym wykazuje termostabilność do temperatury 37°C, w temperaturach 50-70°C następuje coraz większy spadek aktywności enzymu, który traci ją całkowicie po inkubacji w temperaturze 80°C (Tab. 5).

T a b e l a 5. Wpływ temperatury na stabilność DD-peptydazy 64-575 II

temperatura [°C]	10	20	30	37	50	60	70	80
aktywność właściwa [j.-mg-1]	50,8	50,7	50,8	50,9	43,8	28,1	21,0	0,0

Oznaczanie stabilności DD-peptydazy 64-575 II w różnych zakresach pH: Próbki enzymu o stężeniu 25,5 μΜ inkubowano 20 godz. w temperaturze 4°C w 50 mM buforze boranowo-fosforanowym o pH 2,75, 50 mM buforze octanowym o pH 3,0, 4,0, 5,0, buforze fosforanowym o pH 6,0, 7,0, 8,0, 50 mM buforze boranowym o pH 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 12,5. Następnie pH próbek doprowadzano do 8,0 i oznaczano aktywność DD-karboksypeptydazy. Enzym jest stabilny w szerokim zakresie pH. Po 20 godz. inkubacji w pH od 3,0 do pH 12,0 zachowuje on 100% aktywności, natomiast traci całkowicie aktywność w pH 2,75 oraz pH 12,5 (Tab. 6).

T a b e l a 6. Wpływ pH na stabilność DD-peptydazy 64-575 II

pH	2,75	3,0	4,0	5,0	6,0	7,0	8,0	9,0	10,0	11,0	12,0	12,5
aktywność właściwa [j.-mg-1]	0,0	50,7	50,9	50,6	50,7	50,9	50,9	50,8	50,9	50,9	50,8	0,0

5.) Określenie stałej Michaelisa (Km), szybkości maksymalnej (Vmax) oraz stałej katalitycznej (kkat.) reakcji hydrolizy substratów przy udziale DD-peptydazy 64-575 II.

Wyznaczano stałą Michaelisa (Km), szybkość maksymalną (Vmax) oraz stałą katalityczną (kkat) reakcji hydrolizy: Ac2-L-Lys-D-Ala-D-Ala, Ac-L-Lys-D-Ala-D-Ala oraz tioestru C6H5-CO-NH-(CH3)-CO-S-CH2-COOH (S2d) przy udziale enzymu. Aktywność enzymu oznaczano jak opisano wcześniej, stosując roztwór oczyszczonego enzymu o następujących stężeniach końcowych: 25,5 μΜ, 50 μΜ, 0,1 mM. Pomiar aktywności enzymu wykonywano przy następujących stężeniach substratów Ac2-L-Lys-D-Ala-D-Ala i Ac-L-Lys-D-Ala-D-Ala: 5 mM; 2 mM; 1 mM; 0,5 mM; 0,2 mM. Próbki inkubowano w czasie: 5, 10, 15 min. w temp. 37°C. W temperaturze 37°C stała Michaelisa wyznaczona z krzywej Lineweavera-Burka oddziaływania enzymu z diacetylotripeptydem wynosi 1,59 mM, szybkość maksymalna wynosi 0,77 mM-s^-1; stała katalityczna 2,97-10⁴ s^-1. Stała Michaelisa wyznaczona z krzywej Lineweavera-Burka oddziaływania enzymu z monoacetylotripeptydem wynosi 0,85 mM, szybkość maksymalna 2,64 mM-s^-1, stała katalityczna 1,04-10⁵ s^-1. Przebieg funkcji opisującej zależność odwrotności szybkości reakcji od odwrotności stężenia substratu ustalono w oparciu o regresję liniową.

PL 212 549 B1

Współczynnik regresji liniowej reakcji hydrolizy diacetylotripeptydu wynosi 0,99, hydrolizy monoacetylotripeptydu wynosi 0,996.

Aktywność enzymu dla tioestru C6H5-CO-NH-(CH3)-CO-S-CH2-COOH (S2d) oznaczano bezpośrednio mierząc zmiany ekstynkcji przy użyciu spektrofotometru (Hewlett-Packard) połączonego z komputerem umożliwiającym zapis wyników, przy długości fali 250 nm. Początkowe stężenie substratu wynosiło 0,2 mM, natomiast stężenie enzymu wynosiło 17,2 nM. Reakcja przebiegła w czasie 3000 s (każdy impuls był rejestrowany co 1 s) w temp. 37°C. Stała Michaelisa hydrolizy tioestru S2d przy udziale enzymu równa się 30·10^-3 mM, szybkość maksymalna 0,74·10 mM-s'¹, stała katalityczna 43 s^-1.

6.) Oznaczanie aktywności transpeptydacji

DD-peptydazy o masie cząsteczkowej około 50 kDa wykazują aktywność DD-karboksypeptydacji oraz transpeptydacji. Zgodnie z oczekiwaniami DD-peptydaza 64-575 II wykazuje też aktywność transpeptydacji.

Aktywność transpeptydacji badanego enzymu sprawdzano przy użyciu HPLC (Merck Hitachi). Stosunek ilości produktów transpeptydacji do produktów DD-karboksypeptydacji mierzono poprzez oddzielenie produktów i substratów na kolumnie LiChrospher 100, C18 (Merck, Darmstadt, Germany). Eluentem A był 0,1% kwas trifluorooctowy o pH 3, eluentem B był acetonitryl (Aldrich). Szybkość przepływu rozpuszczalników wynosiła 1 cm³-min.^-1. Stosowano ciśnienie 15,6 MPa. Wymywanie z kolumny przeprowadzano 12 min. w warunkach izokratycznych (stosunek ilości eluentu A:B wynosił 78:22, obj./obj.), poprzedzając w czasie 10 min. przepływem acetonitrylu. Substratami reakcji były: D-alanina (o różnych stężeniach: 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) oraz 0,2 mM roztwór C6H5-CO-NH-(CH3)-CO-S-CH2-COOH (S2d). Przebieg reakcji DD-karboksypeptydacji kontrolowano bezpośrednio przy użyciu spektrofotometru (Hewlett-Packard). Stężenia enzymu (od 1,07 nM do 10,75 nM) dobierano tak, aby hydrolizowało 10% substratu S2d. Ilość hydrolizowanego substratu S2d oceniano na podstawie różnic ekstynkcji. Reakcje przerywano poprzez dodanie 5 mm³ 100 μΜ roztworu penicyliny G. Próbki wstawiano do lodu, obniżano pH do 3,0 używając 1M roztworu HCl i wstrzykiwano 20 mm³ do HPLC. Aby określić czasy retencji wykonywano następujące próby kontrolne: sam substrat S2d, substrat S2d z enzymem, penicylina G, sam akceptor D-Ala.

Czas retencji dla produktów hydrolizy i transpeptydacji wynosi odpowiednio 6 min. 10 s. i 3 min. 40 s. Ilość produktów reakcji sprawdzano przy długości fali 235 nm i uzyskiwano wartości powierzchni pól pod krzywymi proporcjonalne do ilości poszczególnych produktów. Obliczono stosunek ilości produktów DD-transpeptydacji do DD-karboksypeptydacji. Aktywność transpeptydacji do DD-karboksypeptydacji (T/H) w zależności od wzrastającego stężenia akceptora D-Ala przy jednakowym stężeniu donora reakcji S2d wzrasta od 0,6 przy stężeniu akceptora 10 mM do 3,7 przy stężeniu akceptora 50 mM. (Tab. 8).

T a b e l a 8. Stosunek aktywności transpeptydacji do DD-karboksypeptydacji (T/H) DD-peptydazy 64-575 II z 0,2 mM C6H5-CO-NH-CH(CH3)-CO-S-CH2-COOH jako donorem oraz D-alaniną jako akceptorem

stężenie D-alaniny [mM]	T/H
10	0,6
20	1,6
30	2,0
40	2,5
50	3,7
60	3,7

Reakcja enzym: antybiotyk β-laktamowy jest wysoce specyficzna. DD-peptydaza 64-575 II rozpoznaje antybiotyki β- i γ-laktamowe (np. laktywicyna), a test pozwalający je wykrywać polega na inhibicji przez nie aktywności enzymu. W związku z tym DD-peptydaza 64-575 II może być stosowana do: oznaczania powinowactwa związków β-laktamowych, w tym nowych zmodyfikowanych pod względem budowy chemicznej antybiotyków (test do wskazywania kierunków modyfikacji antybiotyków β-laktamowych), oznaczania aktywności syntazy izopenicyliny N (dotychczas stosowane są uciążliwe metody przy użyciu radioaktywnych odczynników), poszukiwania nowych drobnoustrojów produkujących antybiotyki β-laktamowe opornych na β-laktamazy, oznaczania antybiotyków β-laktamowych w żywności np. mleku, mięsie, a także w surowicy krwi. Metody enzymatyczne przy zastosowaniu DD-peptydaz są obecnie najbardziej czułymi metodami wykrywającymi antybiotyki β-laktamowe w ilości

PL 212 549 B1 kilkunastu ng^cm³, podczas gdy np. metodą NMR można wykryć od 1 do 0,25 mg Tm^-3 związku β-laktamowego. Zewnątrzkomórkowa DD-peptydaza 64-575 II wykazuje wysokie powinowactwo do antybiotyków β-laktamowych i może być zastosowana do ilościowego określania tych związków.

DD-peptydaza 64-575 II została także wykorzystana do skreeningu kolekcji różnych szczepów Streptomyces sp. w celu zidentyfikowania szczepów produkujących nowe związki aktywne. W wyniku przeprowadzonych testów zidentyfikowano szczep Streptomyees sp. 8812 produkujący nowy związek aktywny: kwas 7-hydroksy-6-oxo-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowy. Tego typu badania mogą być prowadzone zgodnie z opisanym poniżej schematem.

Test na inhibicję DD-peptydazy 64-575 II.

Podczas hodowli Streptomyees sp. 8812 oraz w kolejnych etapach oczyszczania inhibitora stosowano test enzymatyczny na inhibicję DD-peptydazy 64-575 II. W ten sposób oceniano postęp w biosyntezie inhibitorów, a także wybierano frakcje o najwyższej aktywności inhibicji (która przekłada się na znalezienie związków o najwyższej aktywności przeciwbakteryjnej).

Zewnątrzkomórkową DD-karboksypeptydazę/DD-transpeptydazę 64-575 II wytwarzaną przez szczep Saccharopolyspora erythraea PZH 64-575 II, otrzymano w Samodzielnej Pracowni Promieniowców i Grzybów Niedoskonałych Państwowego Zakładu Higieny. Enzym oczyszczono do jednej proteiny oraz zbadano jego właściwości fizyko-chemiczne w Centrum Inżynierii Białek i Laboratorium Enzymologii Uniwersytetu w Liege.

Aktywność właściwa enzymu wynosi 50 IU/mg.

Oznaczanie aktywności DD-karboksypeptydazy 64-575 II przeprowadzono wg Frere i współprac. 1976¹.

₃

Mieszanina reakcyjna do oznaczania aktywności DD-peptydaz składała się z: 60 mm³ roztworu zawierającego 0,05 mg^cm^-3 dinukleotydu flawinoadeninowego (Sigma) w 0,1 M buforze Tris-HCl o pH 8,0; 10 mm³ roztworu zawierającego 0,05 mg^cm^-3 peroksydazy chrzanowej o aktywności 1230 j.-mg^-1 (Sigma) w wodzie dest., 5 mm³ roztworu zawierającego 5 mg •cm^-3 chlorku o-dianizydyny (Sigma) w wodzie dest., 2 mm³ roztworu zawierającego 11,77 mg^cm^-3 oksydazy D-aminokwasów wyodrębnionej z nerek wieprzowych (Sigma) o aktywności 6,7 j/mg^-1 w 0,1 M buforze Tris-HCl o pH 8,0.

Próbki do oznaczania aktywności DD-karboksypeptydaz (a) składały się z: 10 mm³ roztworu enzymu o stężeniu 50 μΜ, 20 mm³ roztworu zawierającego 4,52 mg^cm^-3 tripeptydu N^a, N^:Ac-L-Lys-D-Ala-D-Ala w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 8,0. Próbki standardowe (b) zawierały zamiast roztworu substratu 20 mm³ roztworu zawierającego 0,089 mg^cm^-3 D-alaniny (Sigma). Próbka ślepa (c) zawierała zamiast roztworu substratu 20 mm³ 0,1 M buforu fosforanowego o pH 8,0. Wszystkie próbki (a), (b), (c) przygotowywano w temp. 4°C, następnie inkubowano 30 min. w temp. 37°C, po czym umieszczano na 2 min. w łaźni wodnej o temp. 100°C. Po ochłodzeniu do próbek (a), (b) i (c) dodawano po 77 mm³ mieszaniny reakcyjnej, a następnie inkubowano je 10 min. w temp. 37°C. Do każdej próbki dodawano 0,350 cm³ mieszaniny zawierającej metanol, wodę destylowaną i stężony kwas siarkowy w stosunku objętościowym 5:5:6. Ekstynkcję mierzono spektrofotometrycznie przy długości fali 540 nm na spektrofotometrze Spekol 11 (Carl Zeis Jena, RFN). Ilość uwalnianej D-Ala odczytywano z krzywej wzorcowej.

Oznaczanie inhibicji DD-peptydazy 64-575 II:

mm³ roztworu DD-peptydazy 64-575 II o stężeniu 50 μΜ, 10 (20) mm³ roztworu oczyszczanego inhibitora inkubowano 30 min. w temperaturze 37°C. Następnie dodawano 20 mm³ roztworu substratu-tripeptydu i dalej postępowano jak opisano wyżej.

Absorbancja próby kontrolnej enzymu (Aen) wynosiła 0,350-0,370, absorbancja prób inhibitora (Apr) wynosiła 0,05-0,10. Wartości inhibicji obliczano w % zahamowania aktywności DD-peptydazy. I [%] = 100%-( Aprx100%/Aen).

Claims (6)

1. Zewnątrzkomórkowa DD-peptydaza 64-575 II wytwarzana przez szczep Saccharopolyspora erythraea zdeponowany w PCM pod numerem depozytowym B/00018.

2. Zastosowanie DD-karboksypeptydazy/DD-transpeptydazy (DD-peptydazy) jak określono w zastrz. 1 do wytwarzania testów do wykrywania leków z grupy zawierającej antybiotyki β-laktamowe, korzystnie penicyliny, cefalosporyny, monobaktamy, karbapenemy, izopenicyliny N albo mikroorganizmów je wytwarzających.

PL 212 549 B1

3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że grupa dodatkowo zawiera alkaloidy izochinoliny oraz ich analogi.

4. Zastosowanie enzymu jak określono w zastrz. 1 do uzyskiwania aktywności enzymatycznej wybranej z grupy obejmującej aktywność: DD-karboksypeptydazy,DD-transpeptydacji do badania aktywności syntazy izopenicyliny N poprzez określanie zawartości izopenicyliny N w trakcie procesu biosyntezy penicyliny.

5. Szczep mikroorganizmu Saccharopolyspora erythraea zdeponowany w PCM pod numerem depozytowym B/00018.

6. Zastosowanie szczepu mikroorganizmu jak określono w zastrz. 5 do wytwarzania zewnątrzkomórkowej DD-peptydazy.