PL211549B1 - Sposób stymulowania katalizatorów białkowych używanych w reakcjach biochemicznych, zwłaszcza enzymów stosowanych w reakcjach otrzymywania sacharydów - Google Patents
Sposób stymulowania katalizatorów białkowych używanych w reakcjach biochemicznych, zwłaszcza enzymów stosowanych w reakcjach otrzymywania sacharydówInfo
- Publication number
- PL211549B1 PL211549B1 PL379950A PL37995006A PL211549B1 PL 211549 B1 PL211549 B1 PL 211549B1 PL 379950 A PL379950 A PL 379950A PL 37995006 A PL37995006 A PL 37995006A PL 211549 B1 PL211549 B1 PL 211549B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- enzyme
- irradiated
- reactions
- reaction
- enzymes
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims description 105
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims description 105
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title claims description 21
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 title claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 title description 15
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 title description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 5
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 claims description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 2
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 claims 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 96
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 19
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 19
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 18
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 18
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 15
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 11
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 11
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 11
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 8
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 8
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 7
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 7
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 7
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 7
- 229920001450 Alpha-Cyclodextrin Polymers 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 4
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 4
- 229950006191 gluconic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 4
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 description 3
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 2
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 2
- 108010055629 Glucosyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 102000000340 Glucosyltransferases Human genes 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- GDSRMADSINPKSL-HSEONFRVSA-N gamma-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO GDSRMADSINPKSL-HSEONFRVSA-N 0.000 description 2
- 229940080345 gamma-cyclodextrin Drugs 0.000 description 2
- 230000009229 glucose formation Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000012451 post-reaction mixture Substances 0.000 description 2
- LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L potassium sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001476 sodium potassium tartrate Substances 0.000 description 2
- 235000011006 sodium potassium tartrate Nutrition 0.000 description 2
- JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dimethoxybenzidine Chemical compound C1=C(N)C(OC)=CC(C=2C=C(OC)C(N)=CC=2)=C1 JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000000731 Fagus sylvatica Species 0.000 description 1
- 235000010099 Fagus sylvatica Nutrition 0.000 description 1
- 241000223258 Thermomyces lanuginosus Species 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-VPENINKCSA-N aldehydo-D-xylose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-VPENINKCSA-N 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-RWMJIURBSA-N alpha-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO HFHDHCJBZVLPGP-RWMJIURBSA-N 0.000 description 1
- 229940043377 alpha-cyclodextrin Drugs 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 1
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- -1 cations metals Chemical class 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000000886 photobiology Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób stymulowania katalizatorów białkowych używanych w reakcjach biochemicznych. Sposób jest szczególnie przydatny do stymulowania enzymów wyizolowanych z organizmów żywych i stosowanych w reakcjach otrzymywania i przetwarzania sacharydów.
Enzymy to biokatalizatory białkowe, naturalnie występujące w organizmach żywych, ich działanie sprowadza się do katalizy reakcji biochemicznych poprzez obniżenia energii aktywacji. Enzymy można poddawać różnym modyfikacjom, mającym na celu zwiększenie ich aktywności, stabilności czy zmianę selektywności. Wyodrębnianie enzymów z różnych mikroorganizmów oraz modyfikacje biologiczne na poziomie genetycznym pozwalają na uzyskanie enzymów o różnej aktywności, stabilności, selektywności i specyficzności. Przykładowo enzym stosowany do otrzymywania mieszaniny α-, β- i γ-cyklodekstryn po modyfikacji genetycznej umożliwia uzyskanie w przeważającej ilości jednego z produktów γ-cyklodekstryn, co znane jest z amerykańskiego opisu patentowego
US6960461 (Int. Cl7 A61K31/724; C07H21/04; C12P19/18; C12P21/02; C12N5/06; C12N9/10).
Dobór natomiast korzystnych dla enzymu warunków fizykochemicznych umożliwia uchwycenie maksimum jego aktywności, co opisano w patencie japońskim o nr zgłoszenia JP7107971 (Int.CI6 C12N9/10; C12R1:07), który podaje zależność aktywności enzymu cyklodekstryn glukozyltransferaza od temperatury, pH i obecności kationów metali.
Światło jest falą elektromagnetyczną o określonej długości fali, natężeniu itp. cechach. Polaryzacja światła to, obok barwy i natężenia, jedna z jego cech. Występują trzy rodzaje polaryzacji światła: liniowa, kołowa i eliptyczna.
Badania przeprowadzone na Uniwersytecie Rolniczym w Krakowie wykazały wpływ światła spolaryzowanego na właściwości i degradację skrobi różnego pochodzenia oraz na amylopektynę. Stwierdzono, że naświetlanie skrobi przez krótki okres czasu światłem widzialnym liniowo spolaryzowanym indukuje degradację polisacharydów skrobiowych. Dłuższe naświetlanie prowadzi do rekombinacji łańcuchów polisacharydów. Warunkiem wystąpienia zarówno degradacji jak i rekombinacji było istnienie krystalicznych domen w granuli skrobi zdolnych do absorbcji światła spolaryzowanego. Natomiast wyizolowana amylopektyna nie wykazywała pod wpływem światła spolaryzowanego żadnych zmian fizykochemicznych.
Wzrost wydajności reakcji hydrolizy skrobi amylazy naświetlanej światłem niespolaryzowanym oraz spolaryzowanym liniowo, przedstawiono w publikacji M. Fiedorowicz, G. Chaczaturian; Effect of Illumination with the Visible Polarized and Nonpolarized Light on α-Amylolysis of Starches of Different Botanical Origin, J. Agric. Food Chem., 2003, 51 (26), str. 7815-7819. Znane są także biologiczne efekty oddziaływania światła spolaryzowanego na organizmy żywe, co opisano w artykule T. Kubasowa, IV). Fenyo, Z. Somosy, L. Gazso, I. Kertesz; lnvestigations on Biological Effect of Polarized Light; Photochemistry and Photobiology, Vol. 48, No. 4, 1988, str. 505-509. W niemieckim opisie zgłoszeniowym DE4015406 (Int.Cl5 A61N5/06; A61F7/00) ujawniono korzystne oddziaływanie światła spolaryzowanego o określonej barwie na ludzki organizm, co znalazło zastosowanie w medycynie i kosmetyce.
Nieoczekiwanie okazało się, że zastosowanie w reakcji enzymatycznej enzymu naświetlanego światłem liniowo spolaryzowanym wpływa na jego aktywność, stabilność i selektywność w reakcji otrzymywania i przetwarzania węglowodanów. W niniejszym rozwiązaniu przedstawiono nowy sposób fizycznej stymulacji wyizolowanych enzymów, należących do grup. oksydoreduktaz, transferaz i hydrolaz, które wykorzystywane są w typowych reakcjach enzymatycznych wykonywanych w przemysłowych warunkach.
Istota rozwiązania charakteryzuje się tym, że pojedynczy enzym (scharakteryzowany jednym numerem EC przez Komitet Nazewnictwa Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej z ang. Nomenclature Committee International Union of Biochemistry) klasyfikowany do grupy oksydoreduktaz, transferaz, hydrolaz lub kilka różnych enzymów (enzymy posiadające różne numery EC) poddaje się naświetleniu światłem liniowo spolaryzowanym przed wykonaniem reakcji enzymatycznej. Enzym lub kilka enzymów naświetla się w postaci roztworu lub dyspersji w buforze o pH (pH = 4-10), w którym enzym wykazuje najwyższą aktywność i stabilność. Temperatura roztworu lub dyspersji enzymu podczas naświetlania powinna być stała i nie może przekraczać 37°C. Korzystna stymulacja enzymu dokonywana jest poprzez naświetlanie światłem liniowo spolaryzowanym o długości fali z zakresu światła widzialnego wynoszącym od 500 - 780 nm. Natężenie promieniowania wynosi 3 - 20 mW/cm2. Optymalna ilość energii dostarczonej w wyniku naświetlenia do enzymu jest stała dla danego enzymu i zależy od natężenia źródła promieniowania, czasu naświetlania i waha się w graniPL 211 549 B1 cach 13 - 150 J dla 1 ml roztworu lub dyspersji. Enzym może być stymulowany bezpośrednio przed wprowadzeniem do reakcji. Naświetlony enzym może być przechowywany bez dostępu światła w niskiej temperaturze nieprzekraczającej 8°C przez okres czasu zapewniający trwał o ść stymulacji, przy czym trwałość stymulacji światłem zależna jest od rodzaju enzymu.
Zaletą rozwiązania jest zmiana aktywności, stabilności i selektywności enzymów naświetlonych światłem liniowo spolaryzowanym. Optymalną ilość energii dostarczanej do enzymu w celu jego stymulacji można regulować poprzez zmianę natężenia źródła promieniowania i czasu naświetlania. Stymulowany tą metodą enzym może być przechowywany przez dłuższy okres czasu bez utraty jego właściwości uzyskanych w wyniku naświetlania, a czas przechowywania może wynosić kilka miesięcy. Reakcję enzymatyczną z naświetlanymi tym sposobem enzymami wykonuje się w sposób standardowy i ze standardowych substratów, po czym wybiera się typową dla powstających produktów metodę analizy.
Przedmiot wynalazku w czterech przykładach wykonania zilustrowano na rysunku obrazującym wyniki reakcji katalizowanych naświetlanymi enzymami, na którym.
fig. 1 przedstawia wykres słupkowy wydajności reakcji otrzymywania α-, β- i γ-cyklodekstryn dla różnych czasów naświetlania enzymu, przy stężeniu skrobi sago wynoszącym 0,015 g/ml i stężeniu enzymu 0,004 ml/ml, fig. 2 analogiczny wykres jak na fig. 1, przy stężeniu skrobi sago wynoszącym 0,03 g/ml i stężeniu enzymu 0,008 ml/ml, fig. 3 wykres stężenia ksylozy w mieszaninie poreakcyjnej od czasu reakcji dla enzymów naświetlanych i enzymu wzorcowego, fig. 4 wykres stężenia glukozy w mieszaninie poreakcyjnej od czasu reakcji dla enzymu naświetlanego i enzymu wzorcowego, fig. 5 wykres stężenia kwasu glukonowego w mieszaninie poreakcyjnej od czasu reakcji katalizowanej enzymami naświetlanych i nienaświetlanych dla glukoamylazy i oksydazy glukozowej, a fig. 6 wykres wydajności reakcji otrzymywania α-, β- i γ-cyklodekstryn w warunkach jak na fig. 1 dla enzymów przechowywanych bez dostępu światła ponad 3 miesiące w temperaturze 4°C.
P r z y k ł a d 1 - Otrzymywanie α-, β- i γ-cyklodekstryn
Materiały
- Skrobia sago, firma Wah Chang International Group of Companies, Singapore
- Enzym, cyklodekstryn glukozyltransferaza (CGTase) należąca do grupy transferaz (EC 2.4.1.19), produkt handlowy pod nazwą Toruzyme, firma Novozymes, Dania.
Stymulacja enzymu
Niewielką ilość (2,0 ml) roztworu enzymu o pH 7,0 umieszczono w szklanej kuwecie. Kuweta posiadała wymiary 1 cm x 1 cm, wysokość 2,5 cm, i zamykana była teflonową zatyczką. Enzym naświetlano w kuwecie z odległości 30 cm od źródła światła. Stosowano iluminator typu KB 502 firmy Kabid, Chorzów, Polska, zaopatrzony w lampę ksenonową XBO 150 firmy Oriel, Anglia emitującą światło widzialne o długości fali do 780 nm i liniowo polaryzujący filtr firmy Polaroid, USA, który wycinał promieniowanie o długości fali poniżej 500 nm. Natężenie promieniowania wynosiło w tej pozycji 8 mW/cm2, a energia promieniowania przypadająca na 1,0 ml enzymu wynosiła 28,8 J na godzinę. Enzym naświetlano przez czas 30, 45, 60 minut oraz 2 i 5 godzin. Podczas naświetlania utrzymywano stałą temperaturę roztworu enzymu, która wynosiła 20 ± 1°C.
Enzymy stymulowane przez 30, 45, 60 minut dodatkowo przechowywano w ciemności w temperaturze 4°C przez okres 90 dni.
Reakcja enzymatyczna
Stymulowane światłem enzymy używano w reakcjach otrzymywania cyklodekstryn. Jako odnośnik stosowano enzym nienaświetlany. Skrobię sago rozpuszczoną w buforze fosforanowym ogrzewano na mieszadle magnetycznym przez 15 minut w temperaturze 85-90°C. Po ostudzeniu roztworów skrobi do temperatury pokojowej dodano enzymy. Stężenie skrobi sago w mieszaninach reakcyjnych, w przeliczeniu na suchą masę, wynosiło 0,015 i 0,03 g/ml natomiast zawartość enzymu 0,004 i 0,008 ml/ml. Mieszaninę reakcyjną termostatowano w łaźni wodnej w temperaturze 37°C delikatnie mieszając przez 2 godziny.
Analiza produktów
Zawartość α, β i γ-cyklodekstryn w mieszaninie poreakcyjnej oznaczano metodą chromatografii cieczowej. Stosowano chromatograf firmy Shimadzu z detektorem firmy Merck Hitachi i kolumną APS-Hypersil firmy Agilent Technologies, USA. Jako rozpuszczalnik używano roztwór acetonitryl/woda (75.25, v/v), natężenie objętościowe przepływu przez kolumnę wynosiło 0,7 ml/min, przy temperatu4
PL 211 549 B1 rze 45°C. Wszystkie próbki były przed analizą przefiltrowane przez sączek celulozowy firmy Whatman o średnicy porów 5,0 μm. Na podstawie pola powierzchni pików obliczono zawartość α-, β-, γ-cyklodekstryn, korzystając z uprzednio wykonanej krzywej wzorcowej dla α-, β-, γ-cyklodekstryn pochodzących z firmy Sigma-Aldrich, USA.
Wyniki
W reakcjach o niskich stężeniach skrobi i enzymu, stymulacja enzymu światłem powodowała powstawanie największej ilości β-cyktodekstryny, podczas kiedy zastosowanie enzymu nienaświetlanego dawało najwięcej α-cyklodekstryny. Optymalnym czasem naświetlania było 60 minut (fig. 1). W przypadku wyższych stężeń skrobi i enzymu, naświetlanie enzymu powodowało zwiększenie wydajności całkowitej reakcji. Jednak najbardziej wzrosła ilość otrzymywanych β- i γ-cyklodekstryny, a optymalny czas naświetlania wynosił 2 godziny (fig. 2). Stymulacja enzymu światłem liniowo spolaryzowanym powodowała wzrost aktywności i zmianę selektywności enzymu.
Enzym stymulowany światłem i przechowywany przez 90 dni w temperaturze 4°C, bez dostępu światła dawał w reakcji enzymatycznej (fig. 6) podobne rezultaty jak enzym naświetlony bezpośrednio przed wykonaniem reakcji (fig. 1).
P r z y k ł a d 2 - Otrzymywanie ksylozy
Materiały
- Ksylan z drewna bukowego firmy Sigma-Aldrich, USA
- Enzym endo-1,4-e-ksylanaza z Thermomyces lanuginosus z grupy enzymów hydrolizujących (EC 3.2.1.8) o aktywności 2500 U/g firmy Sigma-Aldrich, USA.
Stymulacja enzymu
Mieszaninę enzymu 1 ml, zawierającą 0,02 g ksylanazy zawieszonej w buforze fosforanowym 22 mmol/dm3 pH 4.7 umieszczono w szklanej kuwecie o wymiarach 1 cm x 1 cm, wysokość 1,5 cm, zamykanej teflonową zatyczką. Enzym umieszczony w kuwecie naświetlano światłem liniowo spolaryzowanym z odległości 22 cm od źródła światła. Stosowano iluminator typu KB 502 firmy Kabid, Chorzów, Polska, zaopatrzony w lampę ksenonową XBO 150 firmy Oriel, Anglia emitującą światło widzialne o długości fali do 780 nm i liniowo polaryzujący filtr firmy Polaroid, USA, który wycinał promieniowanie o długości fali poniżej 500 nm. Natężenie promieniowania wynosiło w tej pozycji 16 mW/cm2, a energia promieniowania przypadająca na 1,0 ml mieszaniny enzymu wynosiła 57,6 J na godzinę. Naświetlanie prowadzono przez 1-2 godzin. W podobnych warunkach naświetlano enzym światłem nie spolaryzowanym uzyskanym poprzez zastosowanie filtra HN 22 Polaroid, USA nie polaryzacyjnego, który wycinał promieniowanie o długości fali poniżej 500 nm. W tych warunkach natężenie promieniowania wynosiło 18 mW/cm2, a energia promieniowania nie spolaryzowanego przypadająca na 1,0 ml mieszaniny enzymu wynosiła 64,8 J na godzinę. Podczas naświetlania utrzymywano stałą temperaturę mieszaniny enzymu, która wynosiła 15 ± 1°C.
Reakcja enzymatyczna
Ksylan rozpuszczony w buforze fosforanowym 22 mmol/dm3 pH 4.7 ogrzewano na mieszadle magnetycznym przez 15 minut w temperaturze 90°C. Po ostudzeniu do temperatury pokojowej dodano mieszaninę enzymu - ksylanazy w buforze fosforanowym. Stężenie ksylanu w mieszaninie reakcyjnej wynosiło w przeliczeniu na suchą masę 2 mg/ml natomiast zawartość ksylanazy 250 U/g ksylanu. Mieszaninę reakcyjną termostatowano w łaźni wodnej w temperaturze 37°C. Po odpowiednim czasie reakcji oznaczono zawartość ksylozy w mieszaninach poreakcyjnych.
W analogiczny sposób wykonano reakcję ze stosowanym jako wzorzec enzymem nienaświetlanym.
Analiza produktów
Zawartość ksylozy oznaczano za pomocą roztworu kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS) z dodatkiem winianu sodowo-potasowego w środowisku alkalicznym, następnie mierzono absorbancję uzyskanych roztworów przy długości fali 540 nm. Zawartość ksylozy obliczono na podstawie wartości uzyskanej absorbancji korzystając z uprzednio wykonanej krzywej wzorcowej wykonanej dla DL-ksylozy pochodzącej z firmy Fluka, Szwajcaria.
Wyniki
Stymulacja ksylozy zarówno światłem nie spolaryzowanym jak i liniowo spolaryzowanym powoduje wzrost aktywności enzymu uwidaczniający się większą wydajnością reakcji. Wydajność reakcji otrzymywania ksylozy jest jednak większa w przypadku użycia enzymów naświetlanych światłem spolaryzowanym i rośnie wraz z czasem ich naświetlania (fig. 3).
PL 211 549 B1
P r z y k ł a d 3 - Otrzymywanie glukozy
Materiały
- Skrobia sago firmy Wah Chang International Group of Companies, Singapore,
- Enzym 1,4-a-D-glukan glukohydrolaza z grupy hydrolaz (EC 3.2.1.3) powszechnie nazywany glukoamylazą lub amyloglukozydazą o aktywności 365 U/g, dostępny pod nazwą handlową OPTIDEX® L-400 firmy Genencor International, USA
Stymulacja enzymu
Niewielką ilość (1,0 ml) roztworu enzymu oraz 1 ml buforu octanowego o pH 6,0 umieszczono w szklanej kuwecie. Kuweta posiadała wymiary 1 cm x 1 cm, wysokość 2,5 cm, i zamykana była teflonową zatyczką. Enzym naświetlano w kuwecie z odległości 35 cm od źródła światła. Do naświetlania stosowano iluminator typu KB 502 firmy Kabid, Chorzów, Polska, zaopatrzony w lampę ksenonową XBO 150 firmy Oriel, Anglia emitującą światło widzialne o długości fali do 780 nm i liniowo polaryzujący filtr firmy Polaroid, USA, który wycinał promieniowanie o długości fali poniżej 500 nm. Natężenie promieniowania wynosiło w tej pozycji 4 mW/cm2, a energia promieniowania przypadająca na 1,0 ml enzymu wynosiła 14,4 J na godzinę. Enzym naświetlano przez 60 minut. Podczas naświetlania utrzymywano stałą temperaturę roztworu enzymu, która wynosiła 18 ± 1°C.
Reakcja enzymatyczna
Skrobię sago rozpuszczoną w buforze fosforanowym pH 7 ogrzewano na mieszadle magnetycznym przez 15 minut w temperaturze 85-90°C. Po ostudzeniu do temperatury pokojowej dodano enzym. Stężenie sago w mieszaninie reakcyjnej, w przeliczeniu na suchą masę wynosiło 2 mg/ml natomiast zawartość glukoamylazy 7,3 U/1 mg sago. Mieszaninę reakcyjną termostatowano w łaźni wodnej w temperaturze 37°C. Po odpowiednim czasie reakcji oznaczono w mieszaninie poreakcyjnej zawartość glukozy.
W analogiczny sposób wykonano reakcję ze stosowanym jako wzorzec enzymem nienaświetlanym.
Analiza produktów
Zawartość glukozy oznaczano za pomocą roztworu kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS) z dodatkiem winianu sodowo-potasowego w środowisku alkalicznym, następnie mierzono absorbancję uzyskanych roztworów przy długości fali 540 nm. Zawartość glukozy obliczono na podstawie wartości uzyskanej absorbancji korzystając z uprzednio wykonanej krzywej wzorcowej wykonanej dla D-(+)glukozy pochodzącej z firmy Sigma-Aldrich.
Wyniki
Stymulacja glukoamylazy światłem liniowo spolaryzowanym spowodowała wzrost aktywności enzymu. Zastosowanie w enzymatycznej reakcji otrzymywania glukozy, enzymu naświetlanego światłem spolaryzowanym liniowo powodowało wzrost wydajności tylko w początkowym czasie reakcji tzn. po 15 i 30 minutach (fig. 4).
P r z y k ł a d 4 - Otrzymywanie i utlenianie glukozy
Materiały
- Skrobia sago firmy Wah Chang International Group of Companies, Singapore,
- Enzym 1,4-a-D-glukan glukohydrolaza z grupy hydrolaz (EC 3.2.1.3) powszechnie nazywany glukoamylazą lub amyloglukozydazą o aktywności 120 U/mg Sigma-Aldrich, Polska.
- oksydaza glukozowa (GOD) typ ll-S, z grupy oksydoreduktaz (EC 1.1.3.4) z Aspergillus Niger Koch-Light Laboratory Ltd., Colnbrook, Anglia.
Stymulacja enzymów
Sporządzono mieszaninę enzymów: glukoamylazy 0,03 g i oksydazy glukozowej 0,06 g w 2,0 ml roztworu buforowego fosforanowego 0.1M o pH 6.5 sporządzonego z NaH2PO4 i Na2HPO4.
Mieszaninę enzymów umieszczono w szklanej kuwecie o wymiarach 1 cm x 1 cm i wysokości 2,5 cm, zamykanej teflonową zatyczką. Mieszaninę enzymów naświetlano stosując iluminator typu KB 502 firmy Kabid, Chorzów, Polska, zaopatrzony w lampę ksenonową XBO 150 firmy Oriel, Anglia emitującą światło widzialne do długości fali 780 nm oraz liniowo polaryzujący filtr firmy Polaroid, USA, który wycinał promieniowanie o długości fali poniżej 500 nm. Grupę enzymów naświetlano w kuwecie z odległości 30 cm od źródła promieniowania. Natężenie promieniowania wynosiło w tej pozycji 8 mW/cm2, a energia promieniowania przypadająca na 2,0 ml mieszaniny enzymów wynosiła 57,6 J na godzinę. Enzymy naświetlano przez 60 minut. Podczas naświetlania utrzymywano stałą temperaturę mieszaniny enzymów, która wynosiła 18 ± 1°C.
PL 211 549 B1
Reakcja enzymatyczna
Skrobię sago rozpuszczoną w buforze fosforanowym pH 7 ogrzewano na mieszadle magnetycznym przez 15 minut w temperaturze 85-90°C. Po ostudzeniu do temperatury pokojowej dodano naświetlane enzymy. Stężenie skrobi w mieszaninie reakcyjnej, w przeliczeniu na suchą masę wynosiło 2 mg/ml natomiast zawartość enzymów: glukoamylazy 7,3 U/1 mg skrobi, oksydazy glukozowej 15,0 U/1 mg. Mieszaninę reakcyjną termostatowano w łaźni wodnej w temperaturze 37°C. Po odpowiednim czasie reakcji oznaczono w mieszaninie poreakcyjnej zawartość kwasu glukonowego.
W analogiczny sposób wykonano reakcje z nienaświetlanymi enzymami, z naświetlaną glukoamylazą i nienaświetlaną oksydazą glukozową oraz z nienaświetlaną glukoamylazą i naświetlaną oksydazą glukozową.
Analiza produktów
Postęp reakcji utleniania glukozy do kwasu glukonowego badano określając zawartość powstałego H2O2. Nadtlenek wodoru użyto jako utleniacz w reakcji utleniania o-dianisidine (Sigma-Aldrich, Poland) (0.05 mg/ml) (1.0 ml) z zastosowaniem peroksydazy (POD) typ II (EC: 1.11.1.7), (SigmaAldrich, Poland) (170 PU/mL) (1.0 mL). Mieszanina reakcyjna (pH 6.5) była inkubowana w temperaturze 25°C. Reakcję kończono poprzez dodanie do mieszaniny reakcyjnej 5 ml kwasu sulfonowego o stężeniu 0.2 g/ml. Postęp reakcji monitorowano spektrofotometrycznie (UV/VIS Shimadzu Spectrophotometr) przy długości fali 525 nm. Wyniki reakcji odczytywano z krzywej kalibracyjnej utleniania 1 mg/ml β-D-glukozy do kwasu D-glukonowego i H2O2 przy pH 6.5 i w temperaturze 25°C.
Wyniki
Stymulacja mieszaniny enzymów światłem liniowo spolaryzowanym powodowała wzrost ich aktywności katalitycznej. Zastosowanie w enzymatycznej reakcji otrzymywania i utleniania glukozy, enzymów naświetlanych światłem spolaryzowanym liniowo powodowało wzrost wydajności reakcji (fig. 5).
Claims (2)
1. Sposób stymulowania katalizatorów białkowych używanych w reakcjach biochemicznych, zwłaszcza enzymów stosowanych w reakcjach otrzymywania sacharydów, polegający na naświetlaniu enzymu światłem spolaryzowanym przed wprowadzeniem do reakcji, znamienny tym, że wodny roztwór lub dyspersje biokatalizatora składającego się z pojedynczego enzymu należącego do grupy oksydoreduktaz, transferaz, hydrotaz lub kilku enzymów z powyższych grup w środowisku roztworu buforowego o pH zawierającym się w zakresie 4-10 i stałej temperaturze nie wyższej niż 37°C, naświetla się światłem liniowo spolaryzowanym o długości fali od 500 - 780 nm i natężeniu 3 - 20 mW/cm2, przy czym optymalna ilość energii dostarczona w wyniku naświetlenia jest stała dla biokatalizatora i zawiera się w granicach 13 - 150 J na godzinę dla 1 ml roztworu lub dyspersji.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że naświetlony biokatalizator przechowuje się przez dłuższy okres czasu bez dostępu światła w niskiej temperaturze poniżej 8°C.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL379950A PL211549B1 (pl) | 2006-06-19 | 2006-06-19 | Sposób stymulowania katalizatorów białkowych używanych w reakcjach biochemicznych, zwłaszcza enzymów stosowanych w reakcjach otrzymywania sacharydów |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL379950A PL211549B1 (pl) | 2006-06-19 | 2006-06-19 | Sposób stymulowania katalizatorów białkowych używanych w reakcjach biochemicznych, zwłaszcza enzymów stosowanych w reakcjach otrzymywania sacharydów |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL379950A1 PL379950A1 (pl) | 2007-12-24 |
| PL211549B1 true PL211549B1 (pl) | 2012-05-31 |
Family
ID=43028005
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL379950A PL211549B1 (pl) | 2006-06-19 | 2006-06-19 | Sposób stymulowania katalizatorów białkowych używanych w reakcjach biochemicznych, zwłaszcza enzymów stosowanych w reakcjach otrzymywania sacharydów |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL211549B1 (pl) |
-
2006
- 2006-06-19 PL PL379950A patent/PL211549B1/pl not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL379950A1 (pl) | 2007-12-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ozyilmaz et al. | Clarification of apple, grape and pear juices by co-immobilized amylase, pectinase and cellulase | |
| Jakob et al. | Activation of diadinoxanthin de‐epoxidase due to a chiororespiratory proton gradient in the dark in the diatom Phaeodactylum tricornutum | |
| Yandri et al. | Immobilization of Aspergillus fumigatus α-amylase via adsorption onto bentonite/chitosan for stability enhancement | |
| Noda et al. | Sweet potato β-amylase immobilized on chitosan beads and its application in the semi-continuous production of maltose | |
| Wilson et al. | Preparation and use of insolubilized amyloglucosidase for the production of sweet glucose liquors | |
| Abd El-Ghaffar et al. | Chitosan and its amino acids condensation adducts as reactive natural polymer supports for cellulase immobilization | |
| Naganagouda et al. | Gelatin blends with alginate: Gel fibers for α-galactosidase immobilization and its application in reduction of non-digestible oligosaccharides in soymilk | |
| Phadungcharoen et al. | Facile and green fabrication of biocatalytic chitosan beads by one-step genipin-mediated β-glucosidase immobilization for production of bioactive genistein | |
| Romero-Fernández et al. | Preparation of a robust immobilized biocatalyst of β-1, 4-endoxylanase by surface coating with polymers for production of xylooligosaccharides from different xylan sources | |
| Kaushal et al. | Emerging trends and future prospective in enzyme technology | |
| Viswanathan | Effect of degree of substitution of octenyl succinate starch on enzymatic degradation | |
| CN105349521A (zh) | 一种基于稻壳固定化玉米赤霉烯酮降解酶的霉菌毒素脱毒剂的制备方法及其应用 | |
| EP0042395B1 (fr) | Enzymes immobilisees sur un support solide | |
| Mislovičová et al. | Immobilized glucose oxidase on different supports for biotransformation removal of glucose from oligosaccharide mixtures | |
| CN1209813A (zh) | 聚合材料的酶促凝胶化 | |
| EP3322802B1 (en) | Light-driven system and methods for chemical modification of an organic substrate | |
| Kubicka et al. | Changes of specific activity of lipase and lipoxygenase during germination of wheat and barley | |
| PL211549B1 (pl) | Sposób stymulowania katalizatorów białkowych używanych w reakcjach biochemicznych, zwłaszcza enzymów stosowanych w reakcjach otrzymywania sacharydów | |
| Ozyilmaz et al. | Simultaneous co-immobilization of glucose oxidase and catalase in their substrates | |
| Hordieieva et al. | Eco-friendly TEMPO/laccase/O 2 biocatalytic system for degradation of Indigo Carmine: operative conditions and laccase inactivation | |
| Bera et al. | Optimization of the conditions for immobilization of crude pectinase on chitin using ultrasound and glutaraldehyde and its application in grape juice clarification | |
| RU2711786C1 (ru) | Способ получения гетерогенного препарата бромелайна, ковалентно связанного с матрицей хитозана | |
| Djabali et al. | Relationship between potato starch isolation methods and kinetic parameters of hydrolysis by free and immobilised α-amylase on alginate (from Laminaria digitata algae) | |
| CN1332984C (zh) | 一种制备窄分子量分布壳聚寡糖的方法 | |
| Bruno et al. | Variables that affect immobilization of Mucor miehei lipase on nylon membrane |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20090619 |