PL211126B1 - Sekwencje nukleotydowe fragmentów niezmutowanych i zmutowanych alleli loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego (Brassica napus L. var. oleifera), allospecyficzne markery SNP swoiste dla loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego, sekwencje nukleotydowe par starterów do amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego, sposób amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego, sekwencje nukleotydowe starterów do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C w reakcji mikrosekwencjonowania, sposób identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C, zestaw testowy do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut)roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C - Google Patents
Sekwencje nukleotydowe fragmentów niezmutowanych i zmutowanych alleli loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego (Brassica napus L. var. oleifera), allospecyficzne markery SNP swoiste dla loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego, sekwencje nukleotydowe par starterów do amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego, sposób amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego, sekwencje nukleotydowe starterów do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C w reakcji mikrosekwencjonowania, sposób identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C, zestaw testowy do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut)roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus CInfo
- Publication number
- PL211126B1 PL211126B1 PL381627A PL38162707A PL211126B1 PL 211126 B1 PL211126 B1 PL 211126B1 PL 381627 A PL381627 A PL 381627A PL 38162707 A PL38162707 A PL 38162707A PL 211126 B1 PL211126 B1 PL 211126B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- mutant
- locus
- fad3
- low
- oilseed rape
- Prior art date
Links
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 title claims description 86
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 76
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 title claims description 29
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 29
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 title claims description 28
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims description 27
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title claims description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims description 8
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 title claims description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 19
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 20
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 19
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 19
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 14
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 13
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 13
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 13
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 10
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 9
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 9
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 9
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 7
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 125000005313 fatty acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 4
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DPUOLQHDNGRHBS-UHFFFAOYSA-N Brassidinsaeure Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCCCCCC(O)=O DPUOLQHDNGRHBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- URXZXNYJPAJJOQ-UHFFFAOYSA-N Erucic acid Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCCCCCC(O)=O URXZXNYJPAJJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 244000060924 Brassica campestris Species 0.000 description 2
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 2
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- DPUOLQHDNGRHBS-KTKRTIGZSA-N erucic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCCCCC(O)=O DPUOLQHDNGRHBS-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 2
- 150000002889 oleic acids Chemical class 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N palmitic acid group Chemical group C(CCCCCCCCCCCCCCC)(=O)O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101100390320 Arabidopsis thaliana FAD3 gene Proteins 0.000 description 1
- BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N Aspoxicillin Chemical compound C1([C@H](C(=O)N[C@@H]2C(N3[C@H](C(C)(C)S[C@@H]32)C(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC(=O)NC)=CC=C(O)C=C1 BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N 0.000 description 1
- 235000005637 Brassica campestris Nutrition 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019892 Stellar Nutrition 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000008157 edible vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004383 glucosinolate group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 125000005481 linolenic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VAMFXQBUQXONLZ-UHFFFAOYSA-N n-alpha-eicosene Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCC=C VAMFXQBUQXONLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940068065 phytosterols Drugs 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 125000002640 tocopherol group Chemical class 0.000 description 1
- 235000019149 tocopherols Nutrition 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 211126 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 381627 (51) Int.Cl.
C12N 15/53 (2006.01) C12N 9/02 (2006.01) C07H 21/04 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 29.01.2007 C12P 7/64 (2006.01)
C12Q 1/68 (2006.01) C12Q 1/26 (2006.01) C12N 15/82 (2006.01)
Sekwencje nukleotydowe fragmentów niezmutowanych i zmutowanych alleli loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego (Brassica napus L. var. oleifera), allospecyficzne markery SNP swoiste dla loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego, sekwencje nukleotydowe par starterów do amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego, sposób amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego, sekwencje (54) nukleotydowe starterów do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C w reakcji mikrosekwencjonowania, sposób identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C, zestaw testowy do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C (73) Uprawniony z patentu:
INSTYTUT HODOWLI I AKLIMATYZACJI ROŚLIN, Radzików, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono:
04.08.2008 BUP 16/08 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.04.2012 WUP 04/12 (72) Twórca(y) wynalazku:
KATARZYNA MIKOŁAJCZYK, Poznań, PL IWONA BARTKOWIAK-BRODA, Poznań, PL MIROSŁAWA DABERT, Poznań, PL
WOJCIECH M. KARŁOWSKI, Poznań, PL STANISŁAW SPASIBIONEK, Poznań, PL (74) Pełnomocnik:
rzecz. pat. Aleksandra Twardowska
PL 211 126 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są sekwencje nukleotydowe fragmentów alleli loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego, alleospecyficzne markery SNP swoiste dla loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego, obejmujące sekwencje nukleotydowe starterów do amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego, sposób amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego, sekwencje nukleotydowe starterów do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C w reakcji mikrosekwencjonowania, sposób identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C, zestaw testowy do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C.
Rzepak (Brassica napus L. var. oleifera) jest jedną z głównych oleistych roślin uprawnych strefy klimatu umiarkowanego.
Wytworzenie tzw. odmian podwójnie ulepszonych (00), charakteryzujących się brakiem kwasu erukowego w oleju nasion oraz bardzo niską zawartością glukozynolanów w śrucie białkowej, jak również wdrożenie ich do produkcji [Downey i Rakow, 1987] spowodowało, że rzepak jest obecnie jednym z głównych źródeł oleju roślinnego, ze stałą tendencją wzrostu jego produkcji [Bartkowiak-Broda i wsp., 2005].
Dla utrzymania konkurencyjności rzepaku wśród innych roślin oleistych istotne jest dalsze ulepszanie cech jakościowych zarówno oleju jak i śruty białkowej.
Odmiany hodowlane rzepaku ozimego zawierają od 42 do 49% oleju w suchej masie nasion, natomiast odmiany jare - około 40% [Krzymański 1984], przy czym jego jakość zależy od składu kwasów tłuszczowych [Scarth i McVetty, 1999; Thelen i Ohlrogge, 2002; Rakow i Raney, 2003].
Nasiona ozimych odmian podwójnie ulepszonych rzepaku zawierają odpowiednio: 4-6% sumy nasyconych kwasów tłuszczowych (palmitynowego C16:0 i stearynowego C18:0), 0-2% C22:1 kwasu erukowego, 56-68% C18:1 kwasu oleinowego, 18-22% kwasu linolowego C18:2 i 10-13% kwasu linolenowego C18:3 [Krzymański 1970].
Jakość oleju odmian podwójnie ulepszonych zaspokaja zapotrzebowania konsumentów na olej jadalny [Spasibionek 2006]; skład kwasów tłuszczowych, a szczególnie zawartość tzw. niezbędnych nienasyconych kwasów tłuszczowych (NNKT) oraz tzw. naturalnych przeciwutleniaczy, jak tokoferole i fitosterole - które nie s ą syntetyzowane w organizmie czł owieka i zwierzą t, odpowiada tendencjom zdrowego żywienia [Fitzpatrick i Scarth, 1998; Scarth i McVetty, 1999; Simopoulos, 2000; Leckband i wsp., 2002].
Natomiast, w związku z niespożywczym zastosowaniem oleju w przemyśle i technologii - a szczególnie z coraz szerszym wykorzystaniem oleju rzepakowego, jako źródła energii odnawialnej - do produkcji biokomponentów biopaliw [Topfer i wsp., 1995; McDonell i wsp., 1999; Altin i wsp., 2001], wzrasta zapotrzebowanie na genotypy rzepaku produkujące nasiona o zmienionym, w stosunku do stosowanych dotąd odmian podwójnie ulepszonych, składzie kwasów tłuszczowych w oleju [Friedt i Luhs, 1999; Mikołajczyk i Bartkowiak-Broda, 2003].
Dla celów technologicznych korzystny jest tzw. olej naturalnie stabilny. Charakteryzuje się on zmienioną, w stosunku do oleju produkowanego przez genotypy 00, zawartością poszczególnych kwasów tłuszczowych: podwyższoną zawartością jednonienasyconego kwasu oleinowego (z około 60-65% do ponad 75%) oraz obniżoną zawartością trójnienasyconego kwasu linolenowego (z około 10-14% do poniżej 3%).
Genotypy rzepaku wytwarzające taki olej określa się jako HO (ang. High Oleic) i LL (ang. Low Linolenic).
Taki olej nie ulega utlenianiu podczas dłuższego składowania oraz wykazuje większą stabilność podczas działania wysokiej temperatury [Sommers, 1998].
W wielu ośrodkach na świecie prowadzone są prace nad uzyskaniem nowych genotypów o zmienionym składzie kwasów tłuszczowych w oleju nasion [Scarth i McVetty, 1999; Rakow i Raney 2003; Spasibionek, 2006].
PL 211 126 B1
Pierwszy niskolinolenowy mutant (M11) został uzyskany w wyniku mutagenezy chemicznej kanadyjskiej odmiany jarej rzepaku - Oro [Rakow, 1973; Robbelen 1975], a w wyniku hodowli rekombinacyjnej otrzymano niskolinolenowe odmiany rzepaku jarego - Stellar [Scarth 1988] i Apollo [Scarth
1994].
W Polsce, w Instytucie Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Oddział w Poznaniu, uzyskano drogą mutagenezy chemicznej nowe mutanty rzepaku ozimego charakteryzujące się obniżoną zawartością kwasu linolenowego, jak również podwyższoną - kwasu oleinowego [Spasibionek i wsp., 2000 i 2003; Spasibionek, 2006].
Są one wdrażane do prac hodowlanych poprzez hodowlę rekombinacyjną jak również przez wyprowadzanie linii podwojonych haploidów.
Analiza jakościowa składu kwasów tłuszczowych otrzymywanych genotypów prowadzona jest na poziomie fenotypowym z zastosowaniem chromatografii gazowej.
Jednakże proces selekcyjny jest utrudniony ze względu na złożone podłoże genetyczne tej cechy [Pleines i Friedt 1989], która dodatkowo ulega modyfikującemu wpływowi warunków środowiska, jak temperatura i światło [Bartkowiak-Broda i Krzymański, 1983].
Dlatego dogodne narzędzie selekcyjne stanowiłyby markery DNA umożliwiające analizę genotypów we wczesnych stadiach rozwoju oraz niezależnie od zmiennych warunków środowiska [Snowdon i Friedt, 2004].
Wykazano szereg markerów DNA sprzężonych z cechą zawartości kwasu linolenowego, jak również zaprojektowano specyficzne markery dla niskolinolenowych mutantów rzepaku otrzymanych w różnych ośrodkach badawczych.
Wykryto markery RAPD: 25a [Tanhuanpaa i wsp., 1995] oraz OPP05 [Jourdren i wsp., 1996a] sprzężone z zawartością kwasu linolenowego na poziomie odmian 00, jak również OPP08 [Jourdren i wsp., 1996] sprzężony z niską zawartością kwasu linolenowego.
Znalazły one zastosowanie podczas selekcji genotypów niskolinolenowych w obrębie pokolenia segregującego uwsobnionych linii rekombinantów, a także linii podwojonych haploidów (DH) wprowadzonych z mieszańca F1 otrzymanego w wyniku krzyżowania odmiany podwójnie ulepszonej rzepaku ozimego z niskolinolenową kanadyjską odmianą jarą Apollo [Mikołajczyk i wsp., 1999; 2004].
Wykryto również inne markery RAPD sprzężone z niską - oraz typową dla odmian typu 00 zawartością kwasu linolenowego w oleju nasion rzepaku, a niektóre z nich przekształcono w bardziej efektywne i ekonomiczne markery SCAR (ang. Sequence Characterized Amplified Region) [Javidfar i wsp., 2006].
Jednak oba typy markerów są przydatne jedynie do badań linii DH lub uwsobnionych linii homozygotycznych, a ponadto mają one dominujący charakter i nie są specyficzne.
Dlatego, do analizy otrzymywanych nowych mutantów o zmienionym składzie kwasów tłuszczowych w oleju nasion korzystne byłoby stosowanie swoistych markerów SNP (ang. Single Nucleotide Polymorphism), obejmujące amplifikację określonych loci, a następnie ich mikrosekwencjonowanie w celu detekcji mutacji [Syvanen 2005].
Dla zaprojektowania markera SNP konieczna jest lokalizacja w genomie miejsca mutacji.
W przypadku cechy zawartości kwasu linolenowego zastosowano metodę „candidate gene approach” [Farris i wsp., 1999], polegającą na wyborze a priori, w oparciu o badania szlaków metabolicznych, genu zaangażowanego w ekspresję badanej cechy.
W wyniku analiz biochemicznych wykazano, że za cechę zawartości kwasu linolenowego odpowiedzialny jest enzym desaturaza fad3, a analiza DNA roślin pokolenia segregującego otrzymanego w wyniku krzyżowania form rodzicielskich o zróżnicowanej zawartości kwasu linolenowego z zastosowaniem markerów RFLP wykazała QTL (ang. Quantitative Trait Locus) z zastosowaniem sondy jaką był cDNA dla genu fad3 [Thormann i wsp., 1996].
W komórkach roślinnych synteza de novo kwasów tłuszczowych przebiega w stromie plastydów prowadząc do powstania 16-to węglowego nasyconego kwasu palmitynowego (C16:0) oraz kwasów 18-to węglowych - nasyconego stearynowego (C18:0) oraz jednonienasyconego oleinowego (C18:1).
Dalsze etapy modyfikacji reszt kwasów tłuszczowych, jak również tworzenie triacylogliceroli zachodzą w cytozolu.
Kwas linolenowy (C18:3), powstaje w wyniku reakcji syntezy trzeciego wiązania nienasyconego w dwunienasyconym kwasie linolowym (C18:2), katalizowanej przez desaturazę fad3 związaną podobnie, jak inne desaturazy kwasów wielonienasyconych, z błonami siateczki śródplazmatycznej [Topfer i wsp., 1995].
PL 211 126 B1
W genomie rzepaku b ę d ą cym allotetraploidem (genom AACC) powstał ym w wyniku połączenia genomów Brassica campestris (AA) oraz B. oleracea (CC) [U 1935] gen fad3 posiada po dwa allele w dwóch loci - odpowiednio w genomie A oraz C.
Zaprojektowano startery do amplifikcji genu fad3 z B. napus [Jourdren i wsp., 1996b].
Porównanie sekwencji DNA obu form roślin rzepaku umożliwiło identyfikację dwóch niezależnych miejsc mutacji, jak również zaprojektowanie kodominujących markerów specyficznych typu RG-PCR (ang. Restriction-Site Generating PCR) [Barret i wsp., 1999].
Dla innego mutanta rzepaku jarego - typu HOLL, otrzymanego z odmiany Quantum, opracowano dwa markery SNP (ang. Single-Nucleotide Polymorphism) - dla odpowiednich pojedynczych mutacji punktowych odpowiedzialnych za zawartość kwasów oleinowego i linolenowego [Hu i wsp., 2003].
Nowy genotyp niskolinolenowego mutanta - M681, charakteryzujący się zawartością kwasu linolenowego w oleju nasion poniżej 2%, został uzyskany w IHAR-Oddział Poznań, z podwójnie ulepszonej linii hodowlanej rzepaku ozimego PN 1775 na drodze mutagenezy chemicznej [Spasibionek i wsp., 2000].
Celem pracy było poznanie charakteru tej mutacji oraz zaprojektowanie specyficznych markerów DNA dla efektywnej selekcji genotypów niskolinolenowych w procesie hodowlanym.
Sekwencje nukleotydowe fragmentów alleli loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego według wynalazku charakteryzują się tym, że stanowią je sekwencje od drugiego do siódmego eksonu genu desaturazy fad3 pokazane na Fig. 4a-d odpowiednio.
Allelospecyficzne markery SNP swoiste dla loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego, według wynalazku charakteryzują się tym, że sekwencje nukleotydowe par starterów stosowanych do amplifikacji poszczególnych loci stanowią:
dla locus A:
alAF 5-AGTGAGATTCTTAGCATCTGCC-3 i 00AC_rev 5-AAGTGGTAATGAGGGATTTGTGG-3, dla locus C:
alCF 5-TCTTGGGTTCCGGTAATCTTT-3 i 00AC_rev 5-AAGTGGTAATGAGGGATTTGTGG-3, natomiast sekwencje nukleotydowe starterów stosowanych do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C w reakcji mikrosekwencjonowania stanowią:
w locus A - starter mutA-1f 5-(A)6TGTACAATAATAGGAATGGAGTTATTTA-3, w locus C - starter mutC-1f 5-(A)25GCCTTGGTACAGAGGCAAG-3.
W sposobie amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego w łańcuchowej reakcji polimerazy PCR według wynalazku, z wykorzystaniem starterów o odpowiednich sekwencjach nukleotydowych istota rozwiązania polega na tym, że stosuje się pary starterów posiadających następujące sekwencje nukleotydowe:
dla locus A:
alAF 5-AGTGAGATTCTTAGCATCTGCC-3 i 00AC_rev 5-AAGTGGTAATGAGGGATTTGTGG-3, dla locus C:
alCF 5-TCTTGGGTTCCGGTAATCTTT-3 i 00AC_rev 5-AAGTGGTAATGAGGGATTTGTGG-3, przy czym dla rozdziału produktów amplifikacji korzystnie stosuje się elektroforezę na żelu agarozowym.
Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się mieszaninę reakcyjną, zawierającą w objętości 20 μΐ od 50 do 200 ng genomowego DNA jako matrycy, 1 x stężony bufor do PCR (Fermentas),
2,5 mM MgCl2, 0,1 mM dNTP, 0,25 μM startery, 1U polimerazy Taq HiFi (Novazym).
W sposobie według wynalazku podczas reakcji PCR w termocyklerze korzystnie denaturację wstępną prowadzi się w temperaturze 95°C w czasie 3 minut, a następnie 35 cykli, obejmujących: denaturację właściwą w temperaturze 95°C przez czas 10 sek., przyłączanie starterów w temperaturze 60°C przez 30 sek. oraz wydłużanie (elongację) w temperaturze 72°C przez czas 1 min. oraz wydłużanie końcowe, prowadzone w temperaturze 72°C przez czas 5 min.
Sekwencje nukleotydowe starterów stosowanych do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C w reakcji mikrosekwencjonowania, według wynalazku charakteryzują się tym, że stanowią je odpowiednio:
PL 211 126 B1 w locus A - starter mutA-1f 5-(A)6TGTACAATAATAGGAATGGAGTTATTTA-3, w locus C - starter mutC-1f 5-(A)25GCCTTGGTACAGAGGCAAG-3.
W sposobie identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C, według wynalazku, w którym z badanych roślin rzepaku izoluje się genomowy DNA, następnie amplifikuje się niezależnie fragmenty locus A i locus C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego w odrębnych reakcjach łańcuchowych polimerazy PCR, w których stosuje się różne mieszaniny reakcyjne, z których każda zawiera tylko jedną parę starterów specyficznych dla danego locus - A lub C, a następnie identyfikuje się allele niezmutowane i zmutowane genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego przy użyciu starterów specyficznych w locus A i w locus C w niezależnych dla każdego locus reakcjach mikrosekwencjonowania, istota rozwiązania polega na tym, że do amplifikacji fragmentów loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego stosuje się pary starterów:
dla locus A:
alAF 5-AGTGAGATTCTTAGCATCTGCC-3 i 00AC_rev 5-AAGTGGTAATGAGGGATTTGTGG-3, dla locus C:
alCF 5-TCTTGGGTTCCGGTAATCTTT-3 i 00AC_rev 5-AAGTGGTAATGAGGGATTTGTGG-3, natomiast do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) i niskolinolenowego mutanta (LLMut) roś lin rzepaku ozimego w locus A i w locus C w reakcji mikrosekwencjonowania stosuje się startery:
w locus A - starter mutA-1f 5-(A)6TGTACAATAATAGGAATGGAGTTATTTA-3, w locus C - starter mutC-1f 5-(A)25GCCTTGGTACAGAGGCAAG-3, przy czym formę podwójnie ulepszoną (00) roślin rzepaku ozimego identyfikuje w locus A w pozycji 1740 nukleotyd C, a w locus C w pozycji 2177 nukleotyd G, zaś formę niskolinolenowego mutanta (LLMut) identyfikuje w locus A w pozycji 1740 nukleotyd T, a w locus C w pozycji 2177 nukleotyd A.
W zestawie testowym do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C, zawierają cym startery o okreś lonych sekwencjach nukleotydowych, enzym, odczynniki do amplifikacji fragmentów DNA w reakcji PCR, oraz ewentualnie instrukcję, jak również standardowy osprzęt do przeprowadzenia testu, istota rozwiązania polega na tym, że jako startery zawiera do amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego:
dla locus A - parę starterów alAF 5-AGTGAGATTCTTAGCATCTGCC-3 i 00AC_rev 5-AAGT-GGTAATGAGGGATTTGTGG-3, dla locus C - parę starterów alCF 5-TCTTGGGTTCCGGTAATCTTT-3 i OOAC_rev 5-AAGT-GGTAATGAGGGATTTGTGG-3, zaś do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C w reakcji mikrosekwencjonowania zawiera:
w locus A - starter mutA-1f 5-(A)6TGTACAATAATAGGAATGGAGTTATTTA-3, w locus C - starter mutC-1f 5-(A)25GCCTTGGTACAGAGGCAAG-3, umieszczone w odrębnych pojemniczkach, korzystnie w postaci liofilizowanej, enzymy i odczynniki do przygotowania matryc oraz reakcji mikrosekwencjonowania, kontrolne próbki DNA z roślin rzepaku form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut), a nadto standardowy osprzęt do przeprowadzenia reakcji PCR oraz identyfikacji produktu specyficznego, korzystnie metodą elektroforetyczną.
Przedmiot wynalazku został przedstawiony bliżej na przykładach realizacji objaśnionych rysunkiem, na którym:
- na Fig. 1 - uwidoczniono ilustrację wyniku amplifikacji locus A i locus C genu desaturazy fad3;
- na Fig. 2a - uwidoczniono ilustrację elektroforetycznego rozdziału produktów amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego, odpowiednio: formy podwójnie ulepszonej (00) i niskolinolenowego mutanta (LLMut), z zastosowaniem swoistych starterów;
- na Fig. 2b - uwidoczniono ilustrację elektroforetycznego rozdziału produktów amplifikacji genu desaturazy fad3 w reakcji PCR przy użyciu swoistych par starterów dla locus A i locus C;
- na Fig. 3a i Fig. 3b - zobrazowano lokalizacje i sekwencje nukleotydowe zaprojektowanych specyficznych starterów;
PL 211 126 B1
- na Fig. 4a- Fig. 4d - pokazano sekwencje nukleotydowe fragmentów alleli loci A i C genu desaturazy fad3 formy podwójnie ulepszonej (00) i niskolinolenowego mutanta (LLMut).
W pierwszym etapie opracowywania allelospecyficznych markerów SNP swoistych dla loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego, dokonano odczytania sekwencji nukleotydowych fragmentów genu desaturazy fad3 pochodzących z form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut), poprzez izolację genomowego DNA z roślin, jakimi były:
- podwójnie ulepszona linia hodowlana rzepaku ozimego PN 1775 oraz linia PN 1712, charakteryzująca się obniżoną zawartością kwasu linolenowego w oleju nasion i wyprowadzona z niskolinolenowego mutanta M681 uzyskanego w wyniku mutagenezy chemicznej linii PN 1775 (Tabela 1) [Spasibionek i wsp., 2000].
T a b e l a 1
Zawartość kwasów tłuszczowych [%] w genotypach linii rzepaku ozimego
| Linia B. napus | Forma | C16:0 | C18:0 | C18:1 | C18:2 | C18:3 | C20:1 | C22:1 |
| PN 1775 | OO | 4,6 | 1,6 | 64 | 18,1 | 9,5 | 2,3 | 0 |
| PN 1712 | LLMut | 3,6 | 1,8 | 65,7 | 25,1 | 1,7 | 2,1 | 0 |
PN 1775- podwójnie ulepszona (00) linia hodowlana,
PN 1712- uwsobniona linia niskolinolenowego mutanta (LLMut),
C16:0 - kwas palmitynowy, C18:0 - kw. stearynowy, C18:1 - kw. oleinowy, C18:2 - kw. linolowy, C18:3 - kw. linolenowy, C20:0 - kw. eikozenowy, C22:1 - kw. erukowy, a takż e linia podwojonych haploidów (DH) wyprowadzona z uwsobnionej linii niskolinolenowego mutanta PN 1712 metodą izolowanych mikrospor [Cegielska-Taras i wsp., 2002].
DNA izolowano z liści roślin według modyfikowanej metody opisanej przez Doyle'a [1990] lub stosując zestawy odczynników DNeasy Plant Mini Kit lub DNeasy Plant Maxi Kit (Qiagen), według procedur opisanych przez producenta.
Geny desaturazy fad3 amplifikowano w reakcji PCR na matrycach uzyskanych genomowych DNA z zastosowaniem starterów zdegenerowanych, o następujących BNLINDES 385 5-GTGG-ACATGGGAGTTTYTCNGA-3 i BNLINDES 1020 5-TGGCATCGACCAARTGRTARTG-3 [Jourdren i wsp., 1996b].
W wyniku amplifikacji genu desaturazy fad3 w reakcji PCR uzyskano po dwa produkty dla roślin B. napus (genom AACC). Dla B. oleracea. (genom CC) uzyskano produkt o długości powyżej 2000 pz, a dla B. campestris (AA) - poniżej 2000 pz.
Zamplifikowane produkty PCR odpowiadały genom desaturazy fad3 zlokalizowanym w loci A i C (Fig. 1). Uzyskane produkty klonowano stosując zestaw enzymów i odczynników TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen), według procedury producenta.
Z klonów pozytywnych, zawierających inserty, izolowano plazmidowy DNA z wykorzystaniem zestawu odczynników QIAfilter Midi Kit (Qiagen), zgodnie z zaleceniami producenta.
Obie nici uzyskanych produktów sekwencjonowano automatycznie, z zastosowaniem odczynników DTCS firmy Beckman Coulter oraz BigDye v3.1 firmy Applied Biosystems na sekwenatorach CEQ2000XL i ABI Prism 3130XL.
Uzyskane sekwencje nukleotydowe były analizowane z wykorzystaniem narzędzi NCBI BLASTN.
Porównanie sekwencji klonów zawierających fragmenty genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego z sekwencjami w bazie danych NCBI wykazało, że są homologiczne z genem desaturazy fad3 A. thaliana (At2g29980) i obejmują sekwencję od drugiego do siódmego eksonu.
Ich długość wynosiła, odpowiednio: w locus C - 2420 pz, a w locus A - około 1870. Różnica długości fragmentów z loci A i C wynosząca około 550 pz wynikała z różnicy długości drugiego intronu.
Poza tym, sekwencje pochodzące z obu loci były wysoce podobne (96% identycznych nukleotydów).
Analiza sekwencji genu fad3 formy 00 oraz LLMut B. napus wykazała szereg miejsc mutacji, przy czym dwa z nich okazały się istotne statystycznie.
Jedno, w obrębie locus A, dotyczyło zamiany nukleotydu - z C na T w eksonie siódmym, w pozycji 1740, powodującą zmianę szóstego kodonu, w wyniku której w miejscu zasadowej reszty argininy znajduje się reszta cysteiny, która dzięki obecności grup tiolowych może powodować tworzenie
PL 211 126 B1 dodatkowego mostka siarczkowego, co może mieć znaczący wpływ na zmianę struktury syntetyzowanego białka.
Drugie istotne miejsce mutacji, w obrębie locus C, wystąpiło w pozycji 2177, w miejscu 5' szóstego intronu - o sekwencji GT, stanowiącej miejsce donorowe w procesie splicingu i dotyczyło zamiany G na A.
Projektowanie starterów i amplifikacja poszczególnych loci (A i C)
Ze względu na identyczność sekwencji w obu loci w rejonie mutacji, konieczne było wykrywanie genotypów osobno w każdym locus.
Locus A amplifikowano w reakcji PCR z zastosowaniem swoistego startera alAF 5-AGTG-AGATTCTTAGCATCTGCC-3 oraz startera uniwersalnego dla obu loci 00AC_rev 5-AAGTGGT-AATGAGGGATTTGTGG-3.
Amplifikację fragmentu genu w locus C prowadzono za pomocą swoistego startera alCF 5-TCT-TGGGTTCCGGTAATCTTT-3 oraz startera OOAC_rev. Amplifikację prowadzono w 20 μ!, stosując 50-200 ng genomowego DNA jako matrycy, 1 x stężony bufor do PCR (Fermentas), 2,5 mM MgCl2, 0,1 mM dNTP, 0,25 μΜ startery, 1U polimerazy Taq HiFi (Novazym), w następujących warunkach:
denaturacja wstępna w temperaturze 96°C przez okres 3 minut, a następnie 35 cykli obejmujących:
denaturację w temperaturze 95°C przez 10 sek., przyłączanie starterów w temperaturze 60°C przez 30 sek. oraz wydłużanie w temperaturze 72°C przez czas 1 minuty.
Wydłużanie końcowe prowadzono w temperaturze 72°C przez 5 minut. Specyficzność amplifikacji została sprawdzona w reakcjach PCR na matrycach plazmidowych DNA z wklonowanymi fragmentami alleli genu fad3 w locus A i C (Fig. 2a i b), jak również potwierdzona przez sekwencjonowanie.
Wykrywanie mutacji metodą mikrosekwencjonowania
Do identyfikacji mutacji w locus A zaprojektowano starter mutA-1f 5-(A)6TGTACAATAATAGGAATGGAGTTATTTA-3, natomiast - do identyfikacji mutacji w locus C - starter mutC-1f 5-(A)25GCCTTGGTACAGAGGCAAG-3.
Lokalizacje i sekwencje nukleotydowe zaprojektowanych specyficznych starterów przedstawia Fig. 3a i Fig. 3b.
Matrycami do mikrosekwencjonowania były opisane powyżej produkty amplifikacji w reakcji PCR poszczególnych loci, które były oczyszczane od starterów oraz dNTP za pomocą kolumienek firmy Qiagen, bądź enzymatycznie, z zastosowaniem defosforylacji alkaliczną fosfatazą SAP i trawienia egzonukleazą exo I (Fermentas).
Mikrosekwencjonowanie prowadzono z zastosowaniem zestawu odczynników SnapShot (Applied Biosystems), zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta, stosując od 5 do 50 ng DNA matrycy oraz startery w stężeniu końcowym 0,2 μΜ.
W reakcjach mikrosekwencjonowania prowadzonych niezależnie dla poszczególnych loci stosowano zarówno starter mutA-1f, jak i starter mutC-1f, w celu kontrolowania jakości badanej, w danej reakcji, matrycy.
Produkty mikrosekwencjonwania rozdzielano w aparacie ABIPrism 3130XL (Applied Biosystems). Uzyskano czytelne obrazy analiz SNP w programie GeneMapper (Applied Biosystems).
Przykłady zastosowania markerów i sposobu i zestawu do identyfikacji zmutowanych, i niezmutowanych alleli loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego według wynalazku
Z zastosowaniem nowo opracowanych markerów SNP definiowano genotypy form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego oraz segregującego pokolenia linii DH wyprowadzonych z mieszańca F1 otrzymanego w wyniku krzyżowania form 00 i LLMut.
Dla loci A i C genu desaturazy fad3 przyjęto oznaczenia literowe A i a oraz C i c odpowiednio dla sekwencji pozbawionych mutacji (00) oraz sekwencji niskolinolenowego mutanta rzepaku ozimego (LLMut).
Na podstawie ustalonych genotypów wyróżniono grupy roślin obejmujące odpowiednio genotypy homozygotyczne dla niezmutowanej formy loci A i C, heterozygotyczne dla obu loci, homozygotyczne
PL 211 126 B1 dla locus A w formie zmutowanej, homozygotyczne dla locus C formie zmutowanej lub homozygotyczne dla obu loci w formie zmutowanej.
Otrzymane genotypy zestawiono w poniżej zamieszczonej tabeli 2 z wynikami analiz biochemicznych składu kwasów tłuszczowych w celu określenia korelacji pomiędzy obecnością form zmutowanych genu fad3, a zawartością kwasu linolenowego.
T a b e l a 2
Nr Nr linii Geno-
| próby | DH | C16:U | C18:0 | C18:1 | C18:2 | C18:3 | C20:1 | C22:1 | suma | typ | |
| Kwas | Kwas | Kwas | Kwas | Kwas | Kwas | Kwas | locus locus | ||||
| palmity | steary- | oleino- | linolo | linolen- | eikoze- | e rako- | |||||
| -nowy | nowy | wy | -wy | owy | nowy | wy | A | C | |||
| 55 | 24Z4 | *6,9 | 4,7 | 64,8 | 18 | 3,6 | 1,2 | 0,7 | 99,9 | AA | CC |
| 93 | 24/12a | 4,4 | 2,4 | 70,8 | 18,9 | 2,5 | 1 | 0 | 100 | AA | cc |
| 24/12b | 5,1 | 2,5 | 70,5 | 18 | 2,5 | 1 | 0,2 | 99,8 | |||
| 94 | 24/15a | *6,6 | 3,8 | 72,1 | 13,3 | 3,3 | 0,8 | 0 | 99,9 | AA | CC |
| 24/15b | 5,1 | 2,5 | 67,3 | 16,1 | 4,7 | 1,5 | 2.7 | 99,9 | |||
| 95 | 24/23a | 4,6 | 1,6 | 69,3 | 19 | 4,4 | 1,1 | 0 | 100 | AA | CC |
| 24/23b | 5,2 | 2,1 | 59,8 | 22,3 | 5,4 | 3 | 2,2 | 100 | |||
| 62 | 24/26a | 4,8 | 1,8 | 65,6 | 23,6 | 3 | 1,2 | 0 | 100 | aa | cc |
| 24/26b | 5,4 | 1,6 | 62,7 | 23,3 | 2,9 | 2,1 | 1,9 | 99,9 | |||
| 63 | 24/28 | 4,9 | 1,7 | 66,9 | 19,3 | 6,3 | 0,9 | 0 | 100 | AA | CC |
| 64 | 24/34 | 4,8 | 2,1 | 71,3 | 18,6 | 2,1 | 1,1 | 0 | 100 | AA | cc |
| 65 | 24/36 | 4,2 | 2,5 | 70,5 | 17,7 | 3,3 | 1,3 | 0,5 | 100 | AA | cc |
| 101 | 24/156a | *7,3 | 2,7 | 57,5 | 27,8 | 3,8 | 0,9 | 0 | 100 | AA | cc |
| 24/156b | *6,1 | 2,6 | 59,8 | 26,5 | 4 | 1 | 0 | 100 | |||
| 103 | 24/163a | *7,9 | 5 | 64,2 | 17,6 | 4 | 1,3 | 0 | 100 | AA | CC |
| 24/163b | *6,4 | 2,9 | 63,8 | 21,4 | 4,6 | 0,9 | 0 | 100 | |||
| 109 | 24/177 | 5,4 | 3 | 69,5 | 18,9 | 2,2 | 1 | 0 | 100 | aa | cc |
| 110 | 24/182a | 5,4 | 1,7 | 63,7 | 21,4 | 6,9 | 0,9 | 0 | 100 | AA | CC |
| 24/182b | 5,3 | 1,7 | 64 | 20,4 | 7,5 | 1 | 0 | 99,9 | |||
| 88 | 24/184 | 5,1 | 2,8 | 66,4 | 21,5 | 3,2 | 1 | 0 | 100 | AA | cc |
| 52 | 2383\4 | 4 | 3,5 | 72 | 17,8 | 1,7 | 1 | 0 | 100 | aa | cc |
| 31 | 23\5 | 4,9 | 1,7 | 69,3 | 15,9 | 7,3 | 0,9 | 0 | 100 | AA | CC |
| 53 | 23/6a | 4,2 | 2,7 | 73 | 16 | 3,2 | 0,9 | 0 | 100 | AA | cc |
| 23/6b | 4,1 | 2,7 | 74,7 | 14,5 | 3 | 1 | 0 | 100 | |||
| 32 | 23\7 | 5,2 | 2,8 | 68,7 | 19,3 | 3,1 | 0,9 | 0 | 100 | AA | cc |
| 33 | 23/8a | *6 | 3 | 68,6 | 18 | 3,5 | 0,9 | 0 | 100 | AA | CC |
| 35 | 23\11 | 5 | 4,4 | 67,9 | 19.4 | 1,9 | 1,4 | 0 | 100 | aa | cc |
| 36 | 23/14a | *6,1 | 2,3 | 63,1 | 22,5 | 4,3 | 1,2 | 0,5 | 100 | aa | CC |
| 37 | 23/15 | 4,8 | 1,9 | 67,9 | 22,5 | 1,9 | 1 | 0 | 100 | aa | cc |
| 38 | 23/16 | 5,2 | 2,5 | 67,1 | 19,1 | 4,9 | 1 | 0,2 | 100 | AA | cc |
| 27 | 23/26 | 5,7 | 2,6 | 62,1 | 24 | 4,4 | 1,2 | 0 | 100 | aa | CC |
| 28 | 23/28 | 5,9 | 2,2 | 60,9 | 25 | 4,2 | 1,1 | 0,6 | 99,9 | Aa | CC |
| 40 | 23/30 | 5,4 | 2,5 | 63,8 | 24,8 | 2,5 | 1 | 0 | 100 | aa | cc |
| 45 | 23/32 | 5,4 | 2,2 | 64 | 21,1 | 6,3 | 1 | 0 | 100 | AA | CC |
| 48 | 23/42 | *6 | 3,1 | 61,5 | 23,3 | 5,1 | 0,9 | 0 | 99,9 | AA | cc |
| LL | |||||||||||
| mut | 1711/1 | 4,3 | 2,6 | 71,8 | 18,8 | 1,4 | 1,1 | 0 | 100 | aa | cc |
| LL | |||||||||||
| mut | 1711/2 | 4,7 | 2,5 | 70,3 | 19,7 | 1,5 | 1,1 | 0,2 | 100 | aa | cc |
| LL | |||||||||||
| mut | 1711/3 | 4,4 | 2,5 | 66,8 | 22,8 | 1,9 | 1,1 | 0,5 | 100 | aa | cc |
| 00 | 1769/1 | 4,3 | 1,8 | 69,1 | 16 | 7,2 | 1,3 | 0,3 | 100 | AA | cc |
| 00 | 1769/2 | 4,6 | 1,7 | 69,6 | 16,1 | 6 | 1,6 | 0,3 | 99,9 | AA | CC |
| ”00 | 1769/3 | 4,2 | 1,6 | 67,4 | 16,5 | 7,1 | 2 | 1,2 | 100 | AA | CC |
| 00 | 1769/4 | 4,3 | 1,6 | 70,8 | 15,6 | 6,5 | 1,2 | 0 | 100 | AA | CC |
PL 211 126 B1
Formy 00 oraz LLMut charakteryzowały się zawartością kwasu linolenowego, odpowiednio: 6-7,2% i 1,4-1,9% oraz genotypami AACC i aacc. Linie DH o genotypach AACC, AAcc, aaCC oraz aacc wykazywały poziom zawartości kwasu linolenowego od 7,5 do 1,7%.
Wyznaczony współczynnik korelacji r między liczbą zmutowanych loci w formie homozygotycznej a zawartością kwasu linolenowego wynosił -0,856, wskazując jednoznacznie na silną negatywną korelację między poziomem kwasu linolenowego a mutacjami zidentyfikowanymi w obrębie genu desaturazy fad3.
Opracowane, swoiste dla nowej mutacji, markery SNP będą stanowiły cenne narzędzie selekcyjne i znajdą szerokie zastosowanie w programach hodowlanych, ponieważ, w przeciwieństwie do stosowanych dotąd metod biochemicznych, wyniki analiz nie zależą od zmiennych warunków środowiska, jak również od jakości i stopnia dojrzałości analizowanych nasion.
Nowe markery pozwalają na identyfikację homo- i heterozygotycznych genotypów w loci A i C genu desaturazy fad3 badanych roślin, które są silnie skorelowane z zawartością kwasu linolenowego w oleju nasion, co znacznie zwiększy efektywność procesu selekcyjnego w programach hodowlanych rzepaku ozimego, do których włączane są linie niskolinolenowego mutanta LLMut.
Literatura
Altin R., Cetinkaya S., Yϋcesu H.S. (2001) The potential of using vegetable oil fuels as fuel for diesel engines. Energy conversion and management 42: 529-538.
Arondel V., Lemieux B., Hwanh I., Gibson S., Goodman H.M., Somerville CR. (1992) Mapbased cloning of a gene controlling omega-3 fatty acid desaturation in Arabidopsis. Science 258: 1353-1354.
Barret P., Delourme R., Brunei D., Jourdren C, Horvais R., Renard M. (1999) Low linolenic acid level in rapeseed can be easily assesed through the detection of two single base substitution in fadS genes. Proc. 10th International Rapeseed Congress, Canberra, Australia, 26-29.09.1999, CD ROM.
Bartkowiak-Broda I., Krzymański J. (1983) Inheritance of C18 fatty acid composition in seed oil of zero erucic winter rape Brassica napus L. Proc. Int. Rapeseed Conf. Paris, vol. 1, pp. 477-482.
Bartkowiak-Broda I., Mikołajczyk K., Spasibionek S., Cegielska-Taras T. (2005) Genetic and breeding research aiming at increasing the value of rapeseed oil as a source of renewable energy. Jezowski S., Wojciechowicz K.M., Zenkteler E. (eds.), Alternative plants for sustainable agriculture, 129-139, 2006. Institute of Plant Genetics PAS, Poznań, Poland.
Byczyńska B., Krzymański J. (1969) Szybki sposób otrzymywania estrów metylowych kwasów tłuszczowych do analizy metodą chromatografii gazowej. Tłuszcze jadalne XIII: 108-114.
Cegielska-Taras T., Tykarska T., Szala L., Kuraś L., Krzymański J. (2002) Direct plant development from microspore-derived embryos of winter oilseed rape Brassica napus L. ssp. Oleifera (DC.) Metzger. Euphytica 124 (3): 341-347.
Downey R.K., Rakow G. (1987) Rapeseed and mustard. In: W.R. Fehr (editor), Principles of cultivar development, Vol. 2, Crop species, Macmillan Publishing Company, New York, pp. 437-486.
Doyle J.J., Doyle J.L. (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: 13-15.
Farris J.D., Li W.L., Liu D.J., Chen P.D., Gill B.S. (1999) Candidate gene analysis of quantitative disease resistance in wheat. Theor. Appl. Genet. 98: 219-225.
Fitzpatrick K., Scarth R. (1998) Improving the health and nutritional value of seed oils. P.B.I. Bulletin NRC-CRC January: 15-19.
Friedt W., Lϋhs W. (1999) Breeding of rapeseed (Brassica napus) for modified seed ąuality synergy of conventional and moderm approaches. Proc. 10th International Rapeseed Congress, Canberra, Australia, 26-29.09.1999, CD ROM.
Hu X., Sullivan M.L., Gupta M., Thompson S.A. (2003) Cloning of fad2 and fad3 genes and development of gene-specific markers for high oleic and low linolenic acids in Canola (Brassica napus L.). Proc. 11th International Rapeseed Congress, Copenhagen, Denmark, 6-10 July 2003, pp. 186-189.
Javidfar F., F., Ripley V.L., Roslinsky V., Zeiali H., Abdmishani C. (2006) Identification of molecular markers associated with oleic and linolenic acid in spring oilseed rape (Brassica napus L.). Plant Breeding 125: 65-71.
Jourdren C, Barret P., Horvais R., Delourme R., Renard M. (1996)a Identification of RAPD markers linked to linolenic acid genes in rapeseed. Euphytica 90: 351-357.
PL 211 126 B1
Jourdren C, Barret P., Brunel D., Delourme R., Renard M. (1996)b Specific molecular marker of the genes controlling linolenic acid content in rapeseed. Theor. Appl. Genet. 93: 512-518.
Krzymański J. (1984) Hodowlane możliwości ulepszania zawartości oleju i białka w nasionach rzepaku. Wyniki badań nad rzepakiem ozimym 1983. IHAR Radzików: 104-111.
Leckband G., Frauen M., Friedt W. (2002) NAPUS 2000. Rapeseed (Brassica napus) breeding for improvement human nutrition. Food Research International 35: 273-278.
McDonell K., Ward S., Leahy J.J., McNulty P. (1999) Properties of Rapeseed Oil for use as a Diesel Fuel Extender. JAOCS 76 (5): 539-543.
Mikołajczyk K., Bartkowiak-Broda I. (2003) Markery DNA w hodowli jakościowej rzepaku ozimego (Brassica napus L.) w aspekcie modyfikacji zawartości kwasów tłuszczowych. Rośliny Oleiste - Oilseed Crops XXIV: 33-49.
Mikołajczyk K., Spasibionek S., Cegielska-Taras T., Nowakowska J., Bartkowiak-Broda I. (2004) Analiza linii podwojonych haploidów rzepaku (Brassica napus L.) różniących się zawartością kwasu linolenowego z zastosowaniem metody RAPD. W: Genetyka w ulepszaniu roślin użytkowych, wyd. Przez: P. Krajewski, Z. Zwierzykowski P. Kachlicki, Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk, Rozprawy i Monografie (11): 111-116.
Mikołajczyk K., Spasibionek K., Krzymański J. (1999) Poszukiwanie markerów DNA sprzężonych z cechą obniżonej zawartości kwasu linolenowego w materiałach hodowlanych rzepaku ozimego. Rośliny Oleiste - Oilseed Crops XX (2): 414-421.
Pleines S., Freidt W. (1989) Genetic control of linolenic acid concentration in seed oil of rapeseed (Brassica napus L.). Theor. Appl. Genet. 78: 793-797.
Rakow G. (1973) Selektion auf Linol- und Linolensauregehalt in Rapssamen nach mutagener Behandlung. Z. Pflanzenzϋchtg. 69: 62-82.
Rakow G., Raney J.P. (2003) Present status and future perspectives of breeding for seed quality in Brassica oilseed crops. 11th International Rapeseed Congress, Copenhagen, Denmark, 6-10 July 2003. BO5. 3: 181-185.
Robbelen G., Nitsch A. (1975) Genetical and physiological investigations on mutants for polynoic fatty acids in rapeseed, Brassica napus L. Z. Pflanzenzϋchtg. 75: 93-105.
Scarth R., McVetty P.B.E. (1999) Designer oil Canola - a review of a new-food grade Brassica oils with focus on high oleić, low linolenic types. Proc. 10th International Rapeseed Congress, Canberra, Australia, 26-29.09.1999, CD ROM.
Scarth R., McVetty P.B.E., Rimmer S.R., Stefansson B.R. (1988) 'Stellar' low linolenic-high linoleic acid summer rape. Can. J. Plant Sci. 68: 509-511.
Scarth R., Rimmer S.R., McVetty P.B.E. (1994) 'Apollo' low linolenic acid summer rape. Can. J. Plant Sci. 75: 203-204.
Simopoulos A.P. (2000) Human requirement for n-3 polyunsaturated fatty acida. Poultry Science 79: 961-970.
Snowdon R.J., Friedt W. (2004) Molecular markers in Brassica oilseed breeding: current status and future possibilities. Plant Breeding 123: 1-8.
Sommers D.J., Friesen K.R.D., Rakow G. (1998) Marker assisted selectionof low linolenic acid in oilseed species. Theor. Appl. Genet. 96: 897-903.
Spasibionek S. (2006) New mutants of winter rapeseed (Brassica napus L.) with changed fatty acid composition. Plant Breed. 125: 259-267.
Spasibionek S., Byczyńska B., Krzymański J. (2000) Mutanty rzepaku ozimego podwójnie ulepszonego o zmienionym składzie kwasów tłuszczowych. Rośliny Oleiste - Oilseed Crops XXI (3): 715-724.
Spasibionek S., Krzymański J., Bartkowiak-Broda I. (2003) Mutants of Brassica napus with changed fatty acids composition. Proc. 11th International Rapeseed Congress, Copenhagen, Denmark, 6-10 July 2003, pp. 221-224.
Syvanen A.-C. (2005) Toward genome-wide SNP genotyping. Nature Genetic Supplement 37: S5-S10.
Tanhuanpaa P. K., Vilkki J.P., Vilkki H. J. (1995) Association of RAPD marker with linolenic acid concentration in the seed oil of rapeseed (Brassica napus L.). Genome 38: 414-416.
Thormann C.E., Romero J., Mantet J., Osborn T.C. (1996) Mapping loci controlling the concentration of erucic and linolenic acids in seed oil of Brassica napus L. Theor. Appl. Genet. 93: 282-286.
Topfer R., Martini N., Schell J. (1995) Modification of plant lipid synthesis. Science 268: 681-686.
U N. (1935) Genome analysis in Brassica with special reference to the experimental formation of B. napus peculiar mode of fertilization. Jpn. J. Bot. 7: 389-452.
PL 211 126 B1
Claims (9)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sekwencje nukleotydowe fragmentów niezmutowanych i zmutowanych alleli loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego (Brassica napus L. var. oleifera), znamienne tym, że stanowią je sekwencje od drugiego do siódmego eksonu genu desaturazy fad3 pokazane na Fig. 4a - 4d odpowiednio.
- 2. Allelospecyficzne markery SNP swoiste dla loci A i C genu desaturazy fad3, form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego, znamienne tym, że obejmują:sekwencje nukleotydowe par starterów do amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego, stanowiące:dla locus A - parę starterów alAF 5-AGTGAGATTCTTAGCATCTGCC-3 i 00AC_rev 5-AAGT-GGTAATGAGGGATTTGTGG-3, dla locus C - parę starterów alCF 5-TCTTGGGTTCCGGTAATCTTT-3 i 00AC_rev 5-AAGT-GGTAATG AGGGATTTGTGG-3, sekwencje nukleotydowe starterów stosowanych do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C w reakcji mikrosekwencjonowania, stanowiące:w locus A - starter mutA-1f 5-(A)6TGTACAATAATAGGAATGGAGTTATTTA-3, w locus C - starter mutC-1f 5-(A)25GCCTTGGTACAGAGGCAAG-3.
- 3. Sekwencje nukleotydowe starterów stosowanych do amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego, znamienne tym, że sekwencje nukleotydowe par starterów stosowanych do amplifikacji poszczególnych loci stanowią:dla locus A - para starterów alAF 5-AGTGAGATTCTTAGCATCTGCC-3 i 00AC_rev 5-AAGT-GGTAATGAGGGATTTGTGG-3 dla locus C - para starterów alCF 5-TCTTGGGTTCCGGTAATCTTT-3 i OOAC_rev 5-AAGT-GGTAATGAGGGATTTGTGG-3.
- 4. Sposób amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego w łańcuchowej reakcji polimerazy PCR, za pomocą starterów o odpowiednich sekwencjach nukleotydowych, znamienny tym, że stosuje się pary starterów posiadających następujące sekwencje nukleotydowe:dla locus A - para starterów alAF 5-AGTGAGATTCTTAGCATCTGCC-3 i 00AC_rev 5-AAGTGGT-AATGAGGGATTTGTGG-3, dla locus C - para starterów alCF 5-TCTTGGGTTCCGGTAATCTTT-3 i 00AC_rev 5-AAGTGG-TAATGAGGGATTTGTGG-3, przy czym dla rozdziału produktów amplifikacji korzystnie stosuje się elektroforezę na żelu agarozowym.
- 5. Sposób amplifikacji według zastrz. 4, znamienny tym, że korzystnie stosuje się mieszaninę reakcyjną, zawierającą w objętości 20 μl od 50 do 200 ng genomowego DNA jako matrycy, 1 x stężony bufor do PCR (Fermentas), 2,5 mM MgCl2, 0,1 mM dNTP, 0,25 μM startery, 1U polimerazy Taq HiFi (Novazym).
- 6. Sposób amplifikacji według zastrz. 4, znamienny tym, że podczas reakcji PCR w termocyklerze denaturację wstępną prowadzi się korzystnie w temperaturze 95°C w czasie 3 minut, a następnie 35 cykli, obejmujących: denaturację właściwą w temperaturze 95°C przez czas 10 sek., przyłączanie starterów w temperaturze 60°C przez 30 sek. oraz wydłużanie (elongację) w temperaturze 72°C przez czas 1 min. oraz wydłużanie końcowe, prowadzone w temperaturze 72°C przez czas 5 min.
- 7. Sekwencje nukleotydowe starterów stosowanych do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C w reakcji mikrosekwencjonowania, znamienne tym, że stanowią je odpowiednio:w locus A - starter mutA-1f 5-(A)6TGTACAATAATAGGAATGGAGTTATTTA-3, w locus C - starter mutC-1f 5-(A)25GCCTTGGTACAGAGGCAAG-3.
- 8. Sposób identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C, w którym z badanych roślin rzepaku izoluje się genomowy DNA, następnie amplifikuje się niezależnie fragmenty locus A i locus C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego w odrębnych reakcjach łańcuchowych polimerazy PCR, w których stosuje się różne mieszaniny reakcyjne, z którychPL 211 126 B1 każda zawiera tylko jedną parę starterów specyficznych dla danego locus - A lub C, a następnie identyfikuje się allele niezmutowane i zmutowane genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego przy użyciu starterów specyficznych w locus A i w locus C w niezależnych dla każdego locus reakcjach mikrosekwencjonowania, znamienny tym, że do amplifikacji fragmentów loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego stosuje się pary starterów:dla locus A: alAF 5-AGTGAGATTCTTAGCATCTGCC-3 i 00AC_rev 5-AAGTGGTAATGAGGG-ATTTGTGG-3, dla locus C: alCF 5-TCTTGGGTTCCGGTAATCTTT-3 i 00AC_rev 5-AAGTGGTAATGAGGGA-TTTGTGG-3, natomiast do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) i niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C w reakcji mikrosekwencjonowania stosuje się startery:w locus A - starter mutA-1f 5-(A)6TGTACAATAATAGGAATGGAGTTATTTA-3, w locus C - starter mutC-1f 5-(A)25GCCTTGGTACAGAGGCAAG-3, przy czym formę podwójnie ulepszoną (00) roślin rzepaku ozimego identyfikuje w locus A w pozycji 1740 nukleotyd C, a w locus C w pozycji 2177 nukleotyd G, zaś formę niskolinolenowego mutanta (LLMut) identyfikuje w locus A w pozycji 1740 nukleotyd T, a w locus C w pozycji 2177 nukleotyd A.
- 9. Zestaw testowy do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C, zawierają cy startery o okreś lonych sekwencjach nukleotydowych, enzym oraz odczynniki do amplifikacji fragmentów DNA w reakcji PCR, oraz ewentualnie instrukcję, jak również standardowy osprzęt do przeprowadzenia testu, znamienny tym, że jako startery zawiera do amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego:dla locus A - parę starterów alAF 5-AGTGAGATTCTTAGCATCTGCC-3 i 00AC_rev5-AAGTGG-TAATGAGGGATTTGTGG-3, dla locus C - parę starterów alCF 5-TCTTGGGTTCCGGTAATCTTT-3 i 00AC_rev 5-AAGTGG-TAATGAGGGATTTGTGG-3, zaś do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskołinołenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C w reakcji mikrosekwencjonowania zawiera:w locus A - starter mutA-1f 5-(A)6TGTACAATAATAGGAATGGAGTTATTTA-3, w locus C - starter mutC-1f 5-(A)25GCCTTGGTACAGAGGCAAG-3, umieszczone w odrębnych pojemniczkach, korzystnie w postaci liofilizowanej, enzymy i odczynniki do przygotowania matryc oraz reakcji mikrosekwencjonowania, kontrolne próbki DNA z roślin rzepaku form 00 i LLMut, a nadto standardowy osprzęt do przeprowadzenia reakcji PCR oraz identyfikacji produktu specyficznego, korzystnie metodą elektroforetyczną.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL381627A PL211126B1 (pl) | 2007-01-29 | 2007-01-29 | Sekwencje nukleotydowe fragmentów niezmutowanych i zmutowanych alleli loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego (Brassica napus L. var. oleifera), allospecyficzne markery SNP swoiste dla loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego, sekwencje nukleotydowe par starterów do amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego, sposób amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego, sekwencje nukleotydowe starterów do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C w reakcji mikrosekwencjonowania, sposób identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C, zestaw testowy do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut)roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL381627A PL211126B1 (pl) | 2007-01-29 | 2007-01-29 | Sekwencje nukleotydowe fragmentów niezmutowanych i zmutowanych alleli loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego (Brassica napus L. var. oleifera), allospecyficzne markery SNP swoiste dla loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego, sekwencje nukleotydowe par starterów do amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego, sposób amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego, sekwencje nukleotydowe starterów do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C w reakcji mikrosekwencjonowania, sposób identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C, zestaw testowy do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut)roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL381627A1 PL381627A1 (pl) | 2008-08-04 |
| PL211126B1 true PL211126B1 (pl) | 2012-04-30 |
Family
ID=43035883
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL381627A PL211126B1 (pl) | 2007-01-29 | 2007-01-29 | Sekwencje nukleotydowe fragmentów niezmutowanych i zmutowanych alleli loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego (Brassica napus L. var. oleifera), allospecyficzne markery SNP swoiste dla loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego, sekwencje nukleotydowe par starterów do amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego, sposób amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego, sekwencje nukleotydowe starterów do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C w reakcji mikrosekwencjonowania, sposób identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C, zestaw testowy do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut)roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL211126B1 (pl) |
-
2007
- 2007-01-29 PL PL381627A patent/PL211126B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL381627A1 (pl) | 2008-08-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102712911B (zh) | 包含突变fad3等位基因的芸苔属植物 | |
| US9832942B2 (en) | Altered FAD2 and FAD3 genes in Brassica and the molecular marker assisted detection thereof | |
| WO2012106105A1 (en) | Method to develop high oleic acid soybeans using conventional soybean breeding techniques | |
| EP2451268A1 (en) | Method to develop high oleic acid soybeans using conventional soybean breeding techniques | |
| AU2008202988A1 (en) | Plant fad2 coding sequence balancing for fatty acid profiling in edible oils | |
| CA2983893A1 (en) | Brassica plants with modified seed oil composition | |
| WO2016089677A2 (en) | Novel qtl of brassica plant correlated to fatty acid profile | |
| WO2017176576A1 (en) | High oleic acid soybean seeds | |
| JP2025036407A (ja) | ブラシカ・ジュンセア系統ｎｕｂｊ１２０７ | |
| US20080168586A1 (en) | Brassica Plant Comprising a Mutant Fatty Acid Desaturase | |
| Mikolajczyk et al. | Allele‐specific SNP markers for the new low linolenic mutant genotype of winter oilseed rape | |
| WO2020168277A1 (en) | Brassica plants producing elevated levels of polyunsaturated fatty acids | |
| PL211126B1 (pl) | Sekwencje nukleotydowe fragmentów niezmutowanych i zmutowanych alleli loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego (Brassica napus L. var. oleifera), allospecyficzne markery SNP swoiste dla loci A i C genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego, sekwencje nukleotydowe par starterów do amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego, sposób amplifikacji loci A i C genu desaturazy fad3 roślin rzepaku ozimego, sekwencje nukleotydowe starterów do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C w reakcji mikrosekwencjonowania, sposób identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut) roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C, zestaw testowy do identyfikacji niezmutowanych i zmutowanych alleli genu desaturazy fad3 form - podwójnie ulepszonej (00) oraz niskolinolenowego mutanta (LLMut)roślin rzepaku ozimego w locus A i w locus C | |
| Ishikawa et al. | A PCR-based method to test for the presence or absence of β-conglycinin α′-and α-subunits in soybean | |
| CN113755633A (zh) | 高通量检测棉花GhFAD2-1基因高油酸突变位点的KASP分子标记 | |
| Mikolajczyk et al. | Development of allele-specific SNP markers for the new low-linolenic mutant of winter oilseed rape | |
| Lemesh et al. | The use of specific DNA markers for the identification of alleles of the FAD3 genes in rape (Brassica napus L.) | |
| Prasetyo et al. | Identification of single nucleotide polymorphism in FATA gene encoding for Acyl-ACP thioesterase type-a of oil palm. | |
| CN118256642A (zh) | 一种与芥菜型油菜亚麻酸含量qtl位点紧密连锁的分子标记及应用 | |
| HK40075907B (zh) | 芥菜品系nubj1207 | |
| Hu et al. | Cloning of Fad2 and Fad3 Genes and Development of Gene-Specific Markers for High Oleic and Low Linolenic Acids in Canola (Brassica napus L.) |