PL210756B1 - Sposób wydzielania endotoksyn z masy bakteryjnej - Google Patents

Description

Ekstrakcja ciekłym dwutlenkiem węgla w stanie nadkrytycznym (scCO2) jest coraz szerzej wykorzystywaną techniką zarówno w skali laboratoryjnej jak i przemysłowej. Poprzez zmianę ciśnienia i temperatury oraz dodatek różnorodnych rozpuszczalników dodatkowych można zmieniać właściwości dwutlenku węgla a tym samym warunki ekstrakcji. Technikę tę adaptować można do ekstrakcji substancji o różnorodnym charakterze - zarówno polarnych jak i hydrofobowych - z rozmaitych źródeł (da Cruz Francisco et al., 2005, da Cruz Francisco et al., 2006, da Cruz Francisco et al., 2005c, da Cruz Francisco and Dey, 2003). Dwutlenek węgla jest substancją bezpieczną, nietoksyczną a także tanią, dzięki temu ekstrakcja scCO2 jest atrakcyjną alternatywą dla wielu istniejących metod.

Endotoksyny (lipopolisacharydy) to cząsteczki budujące zewnętrzną część ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych. Amfifilowa cząsteczka lipopolisacharydu składa się z hydrofobowej domeny zwanej lipidem A oraz połączonej z nią hydrofilowej części w której wyróżnia się oligosacharyd rdzeniowy oraz część polisacharydową o budowie podjednostkowej zwaną O-antygenem. W lipopolisacharydach typu gładkiego (smooth - S) - znajdowanego u większości naturalnie spotykanych gatunków bakterii Gram-ujemnych - antygen O-swoisty składa się z dużej ilości podjednostek cukrowych. U gatunków bakterii posiadają cych lipopolisacharyd typu szorstkiego (rough - R) brak antygenu O-swoistego, natomiast u niektórych mutantów posiadających lipopolisacharyd typu głęboko-szorstkiego (deep-rough) część rdzeniowa może być zredukowana nawet do dwu reszt cukrowych (Wilkinson 1996).

Klasyczne metody izolacji lipopolisacharydów wykorzystują ekstrakcję masy bakteryjnej rozpuszczalnikami organicznymi, na przykład mieszaniną fenolu i wody w wysokiej temperaturze (Wesphal i Jann, 1965), czy fenolu, chloroformu i eteru naftowego (Galanos i Luderitz, 1993). Obie metody opierają się na dezintegracji błony komórkowej bakterii, ale różnią się selektywnością, pierwsza z metod ekstrahuje głównie lipopolisacharydy typu szorstkiego podczas gdy druga głównie typu gładkiego. Mniej znana procedura (Darveau i Hancock, 1983) ekstrahuje równie skutecznie lipopolisacharydy typu R i S. Jeszcze inne metody wykorzystują kombinacje różnorodnych czynników: rozpuszczalników, detergentów, soli, kwasów lub zasad, czynników chelatujących lub enzymów (Ridley et al., 2000). Wszystkie wymienione metody są pracochłonne, często wykorzystują rozpuszczalniki organiczne lub inne niebezpieczne lub toksyczne odczynniki, dodatkowo trudno je przystosować do ekstrakcji w skali przemysłowej.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wydzielania endotoksyn z masy bakteryjnej, charakteryzujący się tym, że masę bakteryjną poddaje się wstępnie działaniu substancji wybranej z grupy zawierającej: związek wiążący jony wielowartościowe, substancję powierzchniowo czynną, substancję destabilizującą błonę zewnętrzną bakterii Gram-ujemnych, korzystnie sól chaotropowa i następnie ekstrakcji, przy czym stosowanym eluentem jest dwutlenek węgla w stanie nadkrytycznym z dodatkiem silnie polarnego rozpuszczalnika dodatkowego wybranego z grupy zawierającej wodę o stężeniu 15% lub rozpuszczalnik organiczny, korzystnie metanol, etanol, ich mieszaniny i roztwory wodne.

Opisana metoda może być zastosowana dla ekstrakcji lipopolisacharydów, których cząsteczki posiadają krótką część cukrową (LPS szorstki) jak i długą (LPS gładki). Wydajność ekstrakcji jest znacząco wyższa w porównaniu z wydajnością uzyskiwaną klasycznymi metodami (np. Wesphala i Janna czy Galanosa i Luderitza). Otrzymany izolat jest wolny od rozpuszczalników organicznych lub śladów toksycznych odczynników, nie wymaga więc długotrwałego oczyszczania (na przykład poprzez dializę) zatem może być wykorzystywany do produkcji szczepionek koniugatowych lub tworzenia substancji immunostymulujących.

Przygotowanie masy bakteryjnej polega na wstępnym traktowaniu masy bakteryjnej substancją chelatującą dwuwartościowe jony metali i/lub detergentem i/lub solą chaotropową - substancjami destabilizującymi błonę zewnętrzną komórki bakteryjnej. Właściwa ekstrakcja polega na przepompowywaniu mieszaniny ciekłego dwutlenku węgla oraz rozpuszczalnika dodatkowego pod ciśnieniem 150250 barów przez przygotowaną masę bakteryjną. Mieszanina, po przejściu przez naczynia ekstrakcyjne oraz zawór zwrotnej regulacji ciśnienia rozprężą się w zbiornikach ekstrakcyjnych uwalniając gazowy dwutlenek węgla. W naczyniach pozostaje wyekstrahowany lipopolisacharyd bakteryjny zawieszony w rozpuszczalniku dodatkowym, po zakończeniu etapu ekstrakcji jest on zbierany i liofilizowany.

Korzystnie substancją chelatującą jest wersenian sodowy (sól sodowa EDTA), kwas cytrynowy, trójpolifosforan sodu (STTP) czy inne.

Korzystnie detergentem jest siarczan dodecylu (SDS), dezoksycholan sodu lub inne.

PL 210 756 B1

Korzystnie czynnikiem destabilizującym błonę są sole chaotropowe jak tiocyjanian potasu (KSCN) lub inne.

Korzystnie rozpuszczalnikiem dodatkowym są metanol, etanol, woda oraz mieszaniny tych rozpuszczalników.

Zgodnie z korzystną realizacją wynalazku dotyczy on nowej metody izolacji endotoksyn (lipopolisacharydów) bakterii Gram-ujemnych. Izolacja polega na ekstrakcji wstępnie przygotowanej masy bakteryjnej przy pomocy ciekłego dwutlenku węgla techniką ekstrakcji dwutlenkiem węgla w stanie nadkrytycznym (SFE - supercritical fluid extraction). Masa bakteryjna, sucha, lub wstępnie potraktowana substancją chelatującą (EDTA, kwas cytrynowy, STTP czy inne) ekstrahowana jest nadkrytyczną mieszaniną CO2 i H2O. Najlepsze rezultaty osiąga się dla stężenia 15% H2O w CO2.

W dalszej części niniejszego opisu ujawniono przykład pokazują cy zmianę wydajnoś ci i czystości preparatu w zależności od zastosowanych warunków ekstrakcji, podana jest również ilość zanieczyszczeń białkami oraz kwasami nukleinowymi.

Do prowadzenia ekstrakcji może być wykorzystany komercyjnie dostępny system ekstrakcyjny SFE/2X100F firmy Thar Technology Inc. Pitsburgh (Pa, USA) (Ryc. 1).

Rysunek 1 przedstawia schemat systemu SFE/2X100F do ekstrakcji SFE. Opis składników: CO2 - zbiornik ciekłego dwutlenku węgla; SOL - zbiornik kosolwentu; EHP - elektryczny, wysokociśnieniowy wymiennik ciepła; V1, V2 - naczynia ekstrakcyjne; BPR - automatyczny regulator ciśnienia; CS1, CS2 - zbiorniki ekstrakcyjne.

Przykład wykonania ekstrakcji bakterii ze szczepu szorstkiego (PCM 2266).

Hodowla bakterii: Szczepy Salmonella enterica (Re - PCM 2266, Rc - PCM 2263, Ra - 2260) otrzymano z Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu. Bakterie hodowano w hodowli aerobowej z wytrząsaniem w bulionie odżywczym w 37°C, po 24 h hodowli masę bakteryjną wirowano, płukano 2x buforowanym roztworem soli (PBS) następnie 1x wodą i liofilizowano.

Wstępne traktowanie masy bakteryjnej przed ekstrakcją:

200 mg liofilizowanej masy bakteryjnej nasączono 2 ml 30 mM roztworu pięciozasadowej soli sodowej trójfosforanu (STTP) - czynnika chelatującego i wiążącego (Wzorek 2002) - po czym inkubowano przez 1 h w temperaturze pokojowej.

Ekstrakcja scCO2

Masę bakteryjną wstępnie potraktowaną STTP umieszczano pomiędzy dwiema warstwami bibuły filtracyjnej na warstwie waty szklanej w naczyniu ekstrakcyjnym systemu SFE/2X100F.

Ekstrakcję prowadzono w dwu etapach. W pierwszym etapie eluentem ekstrakcyjnym był czysty CO2 w stanie nadkrytycznym (scCO2) po którym masę bakteryjną traktowano mieszaniną 15% MeOH w scCO2. W tym etapie z masy bakteryjnej wypłukiwane były głównie lipidy neutralne (traktowanie pierwszym eluentem) oraz polarne (drugi eluent). W drugim etapie następowała właściwa ekstrakcja endotoksyny przy pomocy mieszaniny 15% H2O w scCO2. Ekstrakcję prowadzono przy ciśnieniu 250 barów, temperatura zbiornika ekstrakcyjnego podczas całego procesu wynosiła 40°C, natomiast temperatura naczynia ekstrakcyjnego wynosiła 40°C dla ekstrakcji czystym scCO2 i mieszaniną 15% MeOH w scCO2 oraz 60°C lub 90°C podczas ekstrakcji mieszaniną 15% H2O w scCO2.

Detekcja izolowanego lipopolisacharydu w ekstraktach

Detekcję ekstrahowanego lipopolisacharydu prowadzono kolorymetrycznie (metoda TBA z kwasem tiobarbiturowym) (Karkhanis et al., 1978) oraz poprzez detekcj ę w chromatografii gazowo-cieczowej połączonej ze spektrometrią masową GLC-MS (Rybka i Gamian, 2006).

Bibliografia da Cruz Francisco, J., Danielsson, B., Kozubek, A. and Dey, E. S. (2005a) Application of supercritical carbon dioxide for the extraction of alkylresorcinols from rye bran. J. Supercrit. Fluids 35, 220-226.

da Cruz Francisco, J., Danielsson, B., Kozubek, A. and Dey, E. S. (2006) Isolation of alkylresorcinols: classical and supercritical CO2 extraction methods. In: Modern Extraction Techniques, C. Turner, Ed. ACS Symposium Series, Washington, pp 51-61.

da Cruz Francisco, J., Danielsson, B., Kozubek, A. and Szwajcer Dey, E. (2005c) Extraction of Rye Bran by Supercritical Carbon Dioxide: Influence of Temperature, CO2, and Cosolvent Flow Rates. J. Agric. Food Chem. 53, 7432-7437.

da Cruz Francisco, J. and Dey, E. S. (2003) Supercritical fluids as alternative, safe, food-processing media: an overview. Acta Microb. Polonica 52, 35-43.

PL 210 756 B1

Darveau, R. P. and Hancock, R. E. W. (1983) Procedure for isolation of bacterial lipopolysaccharides from both smooth and rough Pseudomonas aeruginosa and Salmonella typhimurium strains. J. Bacteriol. 155, 831-838.

Galanos, C. and Luederitz, O. (1993) Isolation and purification of R-form lipopolysaccharides: further applications of the PCP method. Methods Carbohydrate Chem. 9, 11-18.

Karkhanis, Y. D., Zeltner, J. Y., Jackson, J. J. and Carlo, D. J. (1978) A new and improved microassay to determine 2-keto-3-deoxyoctonate in lipopolysaccharide of Gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 85, 595-601.

Ridley, B. L., Jeyaretnam, B. S. and Carlson, R. W. (2000) The type and yield of lipopolysaccharide from symbiotically deficient Rhizobium lipopolysaccharide mutants vary depending on the extraction method. Glycobiology 10, 1013-1023.

Rybka, J. and Gamian, A. (2006) Determination of endoxin by measurement of the acetylated methyl glycoside derivative of Kdo with gas-liquid chromatographymass spectrometry. J. Microb. Methods 64, 171-184.

Westphal, O. and Jann, K. (1965) Bacterial lipopolysaccharides. Extraction with phenol-water and further applications of the procedure. Methods Carbohydrate Chem. 5, 83-91.

Wilkinson, S. G. (1996) Bacterial lipopolysaccharides-themes and variations. Progr. Lipid Res. 35, 283-343.

Wzorek, Z. (2002) Useful properties of sodium tripolyphosphate. Czasopismo Techniczne (Krakow, Poland) 99, 67-73.

Claims (6)

1. Sposób wydzielania endotoksyn z masy bakteryjnej, znamienny tym, że masę bakteryjną poddaje się wstępnie działaniu substancji wybranej z grupy zawierającej: związek wiążący jony wielowartościowe, substancję powierzchniowo czynną, substancję destabilizującą błonę zewnętrzną bakterii Gram-ujemnych, korzystnie sól chaotropowa i następnie ekstrakcji, przy czym stosowanym eluentem jest dwutlenek węgla w stanie nadkrytycznym z dodatkiem silnie polarnego rozpuszczalnika dodatkowego wybranego z grupy zawierającej wodę o stężeniu 15% lub rozpuszczalnik organiczny, korzystnie metanol, etanol, ich mieszaniny i roztwory wodne.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że temperatura ekstrakcji zawiera się pomiędzy 40 a 100°C.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ciśnienie ekstrakcji zawiera się pomiędzy 100 250 barów.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrakcję prowadzi się co najmniej w dwóch etapach, ekstrakcji wstępnej i ekstrakcji zasadniczej, przy czym ekstrakcję wstępną prowadzi się w środowisku hydrofobowym, korzystnie w czystym CO2 lub CO2 z dodatkiem p łynnego rozpuszczalnika organicznego.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrakcję zasadniczą prowadzi się w środowisku amfifilowym, korzystnie w CO2 w stanie nadkrytycznym z dodatkiem wody.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w celu wyodrębnienia endotoksyn różniących się wielkością i/lub strukturą części cukrowej stosuje się zróżnicowane warunki ciśnienia, temperatury, składu eluentu oraz czasu ekstrakcji.