PL208722B1 - Element sorpcyjny do selektywnej mikroekstrakcji związków biologicznie czynnych - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest element sorpcyjny do selektywnej mikroekstrakcji związków biologicznie czynnych o właściwościach polarnych.

Do oznaczania składników w próbkach biologicznych stosuje się mikroekstrakcję do fazy stacjonarnej. Ważnym elementem sorpcyjnym zestawu do mikroekstrakcji jest umieszczony w igle przyrządu pręt metalowy odporny na korozję stosowanych rozpuszczalników, pokryty sorbentem. Celem zapewnienia wydajnej ekstrakcji oraz wysokiej selektywności stosuje się sorbenty o zróżnicowanej strukturze.

Znane jest stosowanie do ekstrakcji związków biologicznie czynnych sorbentów w postaci: polidimetylosiloksanu, poliakrylanu, kopolimeru glikolu etylenowego oraz diwinylobenzenu.

Niedogodnością dotychczas stosowanych sorbentów jest niska powtarzalność ekstrakcji, niewielka selektywność i ze względu na specyficzność ekstrakcji leków, zwłaszcza polarnych, brak właściwych grup funkcyjnych odpowiedzialnych za sorpcję przy dominującym mechanizmie jakim jest absorpcja, niewielka stabilność polimeru, spowodowana jego degradacją pod wpływem rozpuszczalników jakimi są metanol, acetonitryl, które powszechnie używane są do desorpcji analitów.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że wszystkie te niedogodności mogą być usunięte przez zastosowanie jako sorbenta analitu polipirolu, politiofenu lub polianiliny.

Przedmiotem wynalazku jest element sorpcyjny do selektywnej mikroekstrakcji związków biologicznie czynnych odznaczający się tym, że pokryty jest sorbentem stanowiącym: polipirol, politiofen lub polianilinę, naniesiony na podłoże przewodzące prąd. Podłoże przewodzące prąd stanowi korzystnie metal, z którego wykonany jest element sorpcyjny lub warstwę pośrednią, odporne na korozję stosowanych w mikroekstrakcji rozpuszczalników. W szczególności element sorpcyjny stanowi pręt wykonany ze stali stopowej odpornej na korozję w obecności stosowanych rozpuszczalników, złota, srebra lub platyny, a także z kwarcu pokrytego w znany sposób przewodzącą prąd warstwą pośrednią w postaci metalu lub przewodzą cego prąd polimeru.

Celem uzyskania nanoporowatej, homogennej struktury oraz jednorodnej i kontrolowanej warstwy polipirolu, politiofenu lub polianiliny, nanosi się je elektrochemicznie.

Istotną zaletą elementu sorpcyjnego według wynalazku jest znaczne zwiększenie efektywności oraz selektywności ekstrakcji polarnych analitów poprzez uformowanie na powierzchni polimeru nanoporowatej struktury o kontrolowanych parametrach. Obecność specyficznych grup funkcyjnych pozwala na selektywną sorpcję analitów na jednostkowych warstwach globularnych adsorbentu. Globularno-fraktalna struktura złoża umożliwia szybką wymianę mas w układzie i pozwala na wzbogacenie analitów w krótkim czasie do 15 minut z wysoką powtarzalnością. Powstające na powierzchni adsorbentu struktury nanokrystalitów hamują przenikanie do porów substancji wielkocząsteczkowych w postaci protein oraz lipoprotein, przez co możliwa jest selektywna sorpcja związków biologicznie czynnych o niewielkich masach cząsteczkowych. Uzyskuje się w ten sposób efekt ekstrakcji z jednoczesnym oczyszczaniem próbki. Ponadto rozwiązanie odznacza się zwartą konstrukcją, co znacznie polepsza jego użyteczność i funkcjonalność oraz umożliwia zastosowanie do ekstrakcji próbek o niewielkich objętościach.

Wytworzenie elementów sorpcyjnych według wynalazku zostało bliżej przedstawione w przykładach jego wykonania.

P r z y k ł a d I. Pręt o długości 50 mm i średnicy 0,3 mm wykonany ze stali stopowej odpornej na korozję rozpuszczalników. Następnie do elektrolizera wprowadza się elektrolit złożony z roztworu pirolu w metanolu o stężeniu 0,05 M i nadchloranu tetrabutyloamoniowego o stężeniu 0,1 M. Do tak przygotowanego elektrolitu wprowadza się pręt jak wyżej i przykłada do niego potencjał dodatni. Przeciwelektrodę stanowi siatka platynowa w kształcie walca zapewniająca równomierny rozkład sił pola elektrycznego wokół pręta. Do przeciwelektrody przykłada się potencjał ujemny. Jako elektrodę odniesienia stosuje się elektrodę chlorosrebrową, która jest podłączona do układu w taki sposób, by zapewniać bezprądowy pomiar potencjału pręta. Elektrolizę prowadzi się w warunkach potencjodynamicznych, przykładając napięcie 0,8V z szybkością zmian polaryzacji 2 rzędu 0,1 V/s. Elektrolizę prowadzi się przez okres 1 godziny. Temperaturę procesu kontroluje się za pomocą termostatu. Syntezę prowadzi się w temperaturze 20°C z użyciem potencjostatu, a pomiary impedancyjne z zastosowaniem miernika impedancji. W wyniku procesu elektrolizy uzyskuje się element pokryty polipirolem, który po wyjęciu z elektrolizera przemywa się etanolem, a następnie wodą destylowaną i suszy.

Otrzymuje się element sorpcyjny pokryty równomierną warstwą polipirolu o grubości 100 μm.

PL 208 722 B1

P r z y k ł a d II. Element o wymiarach jak w przykładzie I wykonany ze srebra wprowadza się do elektrolizera zawierającego elektrolit złożony z roztworu pirolu w acetonitrylu o stężeniu 0,05 M i nadchloranu tetrabutyloamoniowego o stężeniu 0,1 M. Do elementu przykłada się potencjał dodatni. Przeciw elektrodę stanowi siatka platynowa w kształcie walca zapewniająca równomierny rozkład sił pola elektrycznego wokół pręta. Do przeciwelektrody przykłada się potencjał ujemny. Jako elektrodę odniesienia stosuje się elektrodę chloro srebrową, która jest podłączona do układu w taki sposób, by zapewniać bezprądowy pomiar potencjału pręta. Elektrolizę prowadzi się w warunkach potencjodynamicznych przykładając napięcie IV z szybkością zmian polaryzacji rzędu 0,1 V/s. Elektrolizę prowadzi się przez okres 1,5 godziny w temperaturze 20°C. Temperaturę procesu kontroluje się za pomocą termostatu, a pomiary impedancyjne z zastosowaniem miernika impedancji. W wyniku procesu elektrolizy otrzymuje się element pokryty polipirolem o grubości 120 μm, który po wyjęciu z elektrolizera przemywa się etanolem, a następnie wodą destylowaną i suszy. Warstwa polipirolu jest równomiernie rozmieszczona na pręcie.

P r z y k ł a d III. Pręt kwarcowy o wymiarach jak w przykładzie I pokryty jest warstwą złota o grubości 0,08 μm wprowadza się do elektrolizera zawierającego elektrolit złożony z roztworu pirolu w acetonitrylu lub metanolu o stężeniu 0,05 M i nadchloranu tetrabutyloamoniowego o stężeniu 0,1 M. Do elektrolitu przykłada się potencjał dodatni. Przeciw elektrodę stanowi siatka platynowa w kształcie walca zapewniając równomierny rozkład sił pola elektrycznego wokół pręta. Do przeciwelektrody przykłada się potencjał ujemny. Jak elektrodę odniesienia stosuje się elektrodę chlorosrebrową, która jest podłączona do układu w taki sposób, by zapewniać bezprądowy pomiar potencjału pręta. Elektrolizę prowadzi się w warunkach galwanostatycznych w temperaturze 20°C w zakresie gęstości prądowej 300 mA/c². Syntezę prowadzi się z użyciem potencjostatu, a pomiary impedancyjne z zastosowaniem miernika impedancji. W wyniku procesu elektrolizy otrzymuje się elementy pokryte polipirolem o grubości 125 nm, które przemywa się etanolem, a następnie wodą destylowaną i suszy. Warstwa jest równomiernie rozmieszczona na pręcie, przy czym powierzchnia jest silnie rozwinięta w formie dendrytów.

Element sorpcyjny według wynalazku stosuje się w ten sposób, że do silanizowanego naczynia zawierającego ciekłą próbkę wprowadza się element sorpcyjny według wynalazku tak, aby złoże sorpcyjne było całkowicie zanurzone. Podczas ekstrakcji próbkę miesza się za pomocą mieszadła magnetycznego. Po 10-30 minutach element sorpcyjny przenosi się do mikroprobówki zawierającej 0,5-2 ml odpowiedniego rozpuszczalnika w celu desorpcji analitów. Jako rozpuszczalniki do desorpcji analitów ze złoża, stosowane są mieszaniny wody z acetonitrylem lub metanolem w stosunku objętościowym od 50 do 100% modyfikatora organicznego. Etap desorpcji trwa od 5 do 15 minut. Do analizy końcowej stosuje się wysokosprawną chromatografię cieczową.

Przed użyciem element sorpcyjny według wynalazku płucze się przez okres 10 minut metanolem, a następnie wodą destylowaną przez 2 min. Następnie w probówce zawierającej 2,5 ml wodnego roztworu mieszaniny związków beta-adrenolitycznych (metoprolol, Propranolol, oksprenolol) o stężeniach w zakresie od 10 do 300 μg/ml zanurza się go na okres 10 min. Po ekstrakcji element sorpcyjny przenosi się do fiolki z zawartością 2,5 ml czystego metanolu w celu desorpcji składników. Czas desorpcji wynosi 5 min. Następnie metanol odparowuje się do sucha, poprzez przepuszczanie przez próbkę strumienia powietrza, a pozostałość rozpuszcza się w 50 μl mieszaniny metanol/woda 1:1 i poddaje analizie techniką chromatografii cieczowej z detekcją UV-Vis, przy długości fali 215 nm oraz w połączeniu ze spektrometrią mas.

Jako fazę ruchomą stosuje się roztwory buforu octanowego (5 mM) w wodzie oraz w acetronitrylu. Warunki analiz chromatograficznych: kolumna: C₁₈ 150 x 34 mm, 3,5 nm; skład i przepływ fazy ruchomej: składnik A: 5 mM roztwór octanu amonu w wodzie; składnik B: 5 mM roztwór octanu amonu w acetonitrylu; stosowano elucję gradientową: Ustawienia spektrometru mas: zakres skanów 100 - 300 am; nebulizer 30 Psi; przepływ azotu 71/min, temp. 300°C. Dla każdego z roztworów o stężeniu 10; 30; 50; 100; 150; 300 μg/m wykonuje się 3 próby, pomiędzy którymi włókno jest kondycjonowane przez zanurzenie na 10 minut w roztworze metanol/woda 90:10.

Efektywność sorpcji związków beta-adrenolitycznych na elemencie sorpcyjnym, obliczona na podstawie zależności C/Co zawiera się w przedziale od 0,24 do 1,24% w odniesieniu do ilości substancji w roztworze wyjściowym.

Przed użyciem element sorpcyjny w ciągu 10 minut płucze się metanolem, a następnie wodą destylowaną w ciągu 2 min. Następnie w probówce zawierającej 2,5 ml wodnego roztworu mieszaniny związków antyarytmicznych (propafenon, meksyletyna) o stężeniach w zakresie od 10 do 300 μg/ml

PL 208 722 B1 zanurza się element sorpcyjny na okres 10 min. Po ekstrakcji element sorpcyjny przenosi się do fiolki z 2,5 ml czystego metanolu w celu desorpcji składników. Czas desorpcji 5 min. Następnie metanol odparowuje się do sucha, poprzez przepuszczanie przez próbkę strumienia powietrza, a pozostałość rozpuszcza się w 50 μΐ mieszaniny metanol/woda 1:1 i poddaje analizie techniką chromatografii cieczowej z detekcją UV-Vis, przy długości fali 215 nm oraz w połączeniu ze spektrometrią mas.

Jako fazę ruchomą stosuje się roztwory buforu octanowego (5 mM) w wodzie oraz w acetronitrylu. Warunki analiz chromatograficznych: kolumna: C₁₈ 150 x 34 mm, mi 3,5 μm; skład i przepływ fazy ruchomej: składnik A: 5 mM roztwór octanu amonu w wodzie; składnik B: 5 mM roztwór octanu amonu w acetonitrylu; stosowano elucję gradientową: Ustawienia spektrometru mas: zakres skanów 100 - 300 am; nebulizer 30 Psi; przepływ azotu 71/min, temp. 300°C. Dla każdego z roztworów (stężenia: 10; 30; 50; 100; 150; 300 μg/ml) wykonuje się 3 próby, pomiędzy którymi włókno jest kondycjonowane przez zanurzenie na 10 minut w roztworze metanol/woda 90:10.

Efektywność sorpcji związków beta-adrenolitycznych na elemencie sorpcyjnym, obliczona na podstawie zależności C/Co zawiera się w przedziale od 0,11 do 2,55% (ilości substancji w roztworze wyjściowym).

Element sorpcyjny według wynalazku przeznaczony jest do selektywnej mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej, w której anality zawarte są w próbce ciekłej.

Claims (3)

1. Element sorpcyjny do selektywnej mikroekstrakcji związków biologicznie czynnych, znamienny tym, że pokryty jest sorbentem stanowiącym: polipirol, politiofen lub polianilinę, naniesionym na podłoże przewodzące prąd.

2. Element sorpcyjny według zastrz. 1, znamienny tym, że podłoże przewodzące prąd stanowi metal, z którego wykonany jest element sorpcyjny lub warstwą pośrednią, odporne na korozję stosowanych rozpuszczalników.

3. Element sorpcyjny według zastrz. 1, znamienny tym, że korzystnie polipirol, politiofen lub polianilinę naniesione są elektrochemicznie.