PL208383B1 - Microcapsules containing active biological substances, especially live cells and/or microorganisms, possibly genetically modified or natural or synthetic substances for biomedical application, their production method and device for application of this meth - Google Patents
Microcapsules containing active biological substances, especially live cells and/or microorganisms, possibly genetically modified or natural or synthetic substances for biomedical application, their production method and device for application of this methInfo
- Publication number
- PL208383B1 PL208383B1 PL383775A PL38377507A PL208383B1 PL 208383 B1 PL208383 B1 PL 208383B1 PL 383775 A PL383775 A PL 383775A PL 38377507 A PL38377507 A PL 38377507A PL 208383 B1 PL208383 B1 PL 208383B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- microcapsules
- liquid
- nozzle
- synthetic
- natural
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
Opis wynalazkuDescription of the invention
Przedmiotem wynalazku są trójwarstwowe mikrokapsułki zawierające wewnątrz substancje biologicznie aktywne, zwłaszcza żywe komórki i/lub mikroorganizmy, ewentualnie genetycznie modyfikowane, albo naturalne lub syntetyczne substancje do zastosowań biomedycznych), w których enkapsulowany materiał biologicznie aktywny, oddzielony jest od zewnętrznej, warstwy błonotwórczego polimeru syntetycznego, cieczą separującą, korzystnie gliceryną lub ciekłymi glikolami polietylenowymi, jednoetapowy sposób ich wytwarzania oraz urządzenie do stosowania tego sposobu, mające odpowiednią konstrukcję dyszy, podłączone do generatora wysokiego napięcia elektrycznego stałego lub zmiennego, podawanego w sposób ciągły lub impulsowy, umożliwiające otrzymanie sferycznych mikrokapsułek o rozmiarach od 0,01 mm do 8,00 mm i gładkiej powierzchni, w których hydrożelowa mikromatryca zawierająca immobilizowany materiał biologicznie aktywny, jest oddzielona od zewnętrznej, półprzepuszczalnej membrany, warstwą cieczy separującej.The subject of the invention is three-layer microcapsules containing biologically active substances inside, in particular living cells and / or microorganisms, possibly genetically modified, or natural or synthetic substances for biomedical applications), in which the encapsulated biologically active material is separated from the outer layer of the film-forming synthetic polymer, a separating liquid, preferably glycerin or liquid polyethylene glycols, a one-step method of their production and a device for the application of this method, having a suitable nozzle design, connected to a continuous or pulsed high voltage generator of constant or impulse voltage, making it possible to obtain spherical microcapsules with sizes from 0.01 mm to 8.00 mm and a smooth surface, in which the hydrogel microarray containing the immobilized biologically active material is separated from the outer, semi-permeable membrane by a sepa liquid layer rushing.
Sposób i urządzenie według wynalazku znajduje zastosowanie do enkapsulacji różnych substancji biologicznie aktywnych, naturalnych i syntetycznych, enzymów, hormonów, żywych komórek, bakterii, także modyfikowanych genetycznie, które mogą być zastosowane w bioreaktorach, systemach wspomagania utraconych funkcji narządów wewnętrznych oraz we wszczepach.The method and device according to the invention is used for the encapsulation of various biologically active substances, natural and synthetic, enzymes, hormones, living cells, bacteria, also genetically modified, which can be used in bioreactors, systems supporting lost functions of internal organs and in implants.
Materiał biologicznie aktywny, a w szczególności mikroorganizmy, grzyby, bakterie oraz żywe komórki roślin i ssaków najskuteczniej enkapsuluje się w matrycach hydrożelowych, zapewniających odpowiednie warunki do życia immobilizowanym w ich wnętrzu komórkom. Powszechnie stosowanym hydrożelem jest alginian sodu, który po sieciowaniu jonami wapnia (Ca+2) lub baru (Ba+2), tworzy biozgodne hydrożele. Niestety, w przypadku wszczepów, żele te, ze względu na dużą przepuszczalność nie są w stanie osłonić zawartych w ich wnętrzu komórek przed dostępem przeciwciał biorcy (immunoizolacja), co prowadzi do zniszczenia wszczepionych komórek. Aby skutecznie immunoizolować komórki, matryce hydrożelowe, a najczęściej alginianowe otacza się membranami półprzepuszczalnymi o punkcie odcię cia (cut-off) poniż ej 160 kDa. Powszechnie stosowane w tym celu jest metoda nakł adania na zewnętrzną powierzchnię kulki alginianowej warstwy syntetycznych poliaminokwasów, takich jak: poli-L-lizyna, poli-D-lizyna, poli-L-ornityna, poliwinyloamina, polietylenoimina oraz metoda wieloelektrolitowa Wanga (błona z polimetyleno-ko-guanidydy). We wszystkich wymienionych przypadkach półprzepuszczalna membrana wytwarzana jest poprzez cykl kąpieli na przemian w rozcieńczonych roztworach polikationów i polianionów.Biologically active material, in particular microorganisms, fungi, bacteria and living cells of plants and mammals, are most effectively encapsulated in hydrogel matrices that provide appropriate living conditions for the cells immobilized inside them. A commonly used hydrogel is sodium alginate, which, after cross-linking with calcium (Ca +2 ) or barium (Ba +2 ) ions, forms biocompatible hydrogels. Unfortunately, in the case of implants, these gels, due to their high permeability, are not able to protect the cells contained inside them against the access of the recipient's antibodies (immuno-isolation), which leads to the destruction of the implanted cells. In order to effectively immuno-isolate cells, hydrogel matrices, and most often alginate ones, are surrounded by semi-permeable membranes with a cut-off point lower than 160 kDa. Commonly used for this purpose is the method of applying a layer of synthetic polyamino acids to the outer surface of the alginate ball, such as: poly-L-lysine, poly-D-lysine, poly-L-ornithine, polyvinylamine, polyethyleneimine, and the Wang multi-electrolyte method (polymethylene film). -co-guanidides). In all the mentioned cases, the semi-permeable membrane is produced by a bath cycle alternating in dilute solutions of polycations and polyanions.
Wytworzone w ten sposób mikrokapsułki charakteryzują się dobrą biozgodnością i własnościami transportowymi, ale mają bardzo małą wytrzymałość mechaniczną. Znacznie ogranicza to ich zastosowanie w bioreaktorach, a często także jako wszczepy.The microcapsules produced in this way have good biocompatibility and transport properties, but have very low mechanical strength. This significantly limits their use in bioreactors, and often also as implants.
Własności mechaniczne mikrokapsułek można znacznie poprawić otaczając alginianowy rdzeń kapsułki membraną z polimeru syntetycznego, stosując nakładanie kwasu poliakrylowego metodą Baumanna [Effect of media composition on long-term in vitro stability of barium alginate and polyacrylic acid multilayer microcapsules. A. Gaumann, M. Laudes, B. Jacob, R. Pommersheim, C. Laue, W. Vogt, J. Schrezenmeir, Biomaterials, 21, 1911-1917, 2000; Xenotransplantation of parathyroid in rats using barium-alginate and polyacrylic acid multilayer microcapsules. A. Gaumann, M. Laudes, B. Jacob, R. Pommersheim, C. Laue, W. Vogt, J. Schrezenmeir, Exp. Toxicol. Pathol., 53, 35-43, 2001] lub polimeryzując in situ estry cyjanoakrylanowe [The synthesis of semi-permeable membrane microcapsules using in situ cyanoacrylate ester polymerization. R. J. Holl, R. P. Chambers, J. Microencapsul., 19, 699-724, 2002]. W innej metodzie [Preliminary report of polymer-encapsulated dopamine-secreting cell grafting into the brain. I. Date, Y. Miyoshi, T. Ono, T. Imaoka, T. Furuta, S. Asari, T. Ohmoto, H. Iwata, Cell Transplantation, 5, S17-S19, 1996] komórki produkujące neurohormon po enkapsulacji w mikrokapsułkach agarozowych pokrytych membraną z sulfonowanego polistyrenu wszczepiane były do mózgu świnki morskiej.The mechanical properties of the microcapsules can be significantly improved by surrounding the alginate core of the capsule with a synthetic polymer membrane using the Baumann method of polyacrylic acid deposition [Effect of media composition on long-term in vitro stability of barium alginate and polyacrylic acid multilayer microcapsules. A. Gaumann, M. Laudes, B. Jacob, R. Pommersheim, C. Laue, W. Vogt, J. Schrezenmeir, Biomaterials, 21, 1911-1917, 2000; Xenotransplantation of parathyroid in rats using barium-alginate and polyacrylic acid multilayer microcapsules. A. Gaumann, M. Laudes, B. Jacob, R. Pommersheim, C. Laue, W. Vogt, J. Schrezenmeir, Exp. Toxicol. Pathol., 53, 35-43, 2001] or by in situ polymerizing cyanoacrylate esters [The synthesis of semi-permeable membrane microcapsules using in situ cyanoacrylate ester polymerization. R. J. Holl, R. P. Chambers, J. Microencapsul., 19, 699-724, 2002]. In another method [Preliminary report of polymer-encapsulated dopamine-secreting cell grafting into the brain. I. Date, Y. Miyoshi, T. Ono, T. Imaoka, T. Furuta, S. Asari, T. Ohmoto, H. Iwata, Cell Transplantation, 5, S17-S19, 1996] neurohormone producing cells after encapsulation in microcapsules agarose membranes covered with a sulfonated polystyrene membrane were implanted into the brain of the guinea pig.
W 1984 roku Stevenson i Sefton zaproponowali zastosowanie jako czynnika membranotwórczego nierozpuszczalnych w wodzie poliakrylanów: mieszaniny 2-hydrosyetylometakrylanu metylu i metakrylanu metylu w stosunku 80:20, a następnie 75:25 rozpuszczone w glikolu trójetylenowym [Microencapsulation of mammalian cells in synthetic semi-permeable membranes. W. T. K. Stevenson, J. W. Blysniuk, M. Sugamori, M. V. Sefton, Transactions of the Annual Meeting of the Society for Biomaterials in Conjunction with the International Biomaterials Symposium, 7, 200, 1984]. W ciągu następnych lat metodą tą opłaszczano różne komórki, w tym: PC12 [Dopamine secretion by PC12 cells microencapsulated in a hydroxyethyl mathacrylate-methyl methacrylate copolymer. T. Roberts,In 1984, Stevenson and Sefton proposed the use of water-insoluble polyacrylates as a membrane forming agent: a mixture of 2-hydroxyethylmethacrylate and methyl methacrylate in the ratio 80:20, then 75:25 dissolved in triethylene glycol [Microencapsulation of mammalian cells in synthetic semi-permeable membranes . W. T. K. Stevenson, J. W. Blysniuk, M. Sugamori, M. V. Sefton, Transactions of the Annual Meeting of the Society for Biomaterials in Conjunction with the International Biomaterials Symposium, 7, 200, 1984]. Over the next years, this method was used to coat various cells, including: PC12 [Dopamine secretion by PC12 cells microencapsulated in a hydroxyethyl mathacrylate-methyl methacrylate copolymer. T. Roberts,
PL 208 383 B1PL 208 383 B1
U. De Boni, M. V. Sefton, Biomaterials, 267-275, 1996], chomicze fibroblasty [Metabolic activity of CHO fibroblasts in HEMA-MMA microcapsules. H. Uludag, M. V. Sefton, Biotechnology and Bioengineering, 39, 672-678, 1992], erytrocyty i wyspy Langerhansa [Microencapsulation of live animal cells using polyacrylates. M. V. Sefton, W. T. K. Stevenson, Advances in Polymer Science, 107, 142-197,U. De Boni, M. V. Sefton, Biomaterials, 267-275, 1996], hamster fibroblasts [Metabolic activity of CHO fibroblasts in HEMA-MMA microcapsules. H. Uludag, M. V. Sefton, Biotechnology and Bioengineering, 39, 672-678, 1992], erythrocytes and Langerhans islands [Microencapsulation of live animal cells using polyacrylates. M. V. Sefton, W. T. K. Stevenson, Advances in Polymer Science, 107, 142-197,
1993], hepatocyty [Viability and protein secretion from human hepatoma (HepG2) cells encapsulated in 480-μΓΠ polyacrylate microcapsules by submerged nozzle-liquid jet extrusion. H. Utudag, V. Horvath, J. P. Black, M. V. Sefton, Biotechnology and Bioengineering, 44, 1199-1204, 1994; Microencapsulation of viable hepatocytes in HEMA-MMA microcapsules: A preliminary study. G. M. D. Wells, M. M. Fisher, M. V. Sefton, Biomaterials, 14, 615-620, 1993]. W 2003 roku autorzy wprowadzili istotne zmiany do swojej procedury wytwarzania mikrokapsułek, modyfikując skład roztworu membranotwórczego poprzez zmniejszenie ilości metakrylanów do 10% i 9% oraz wprowadzenie 30%-owego dodatku poliwinylopirolidonu jako substancji porotwórczej. Spowodowało to 25-krotny wzrost przepuszczalności membrany, na skutek wzrostu gęstości porów [Viability of hydroxyethyl methacrylate-methyl methacrylate-microencapsulated PC12 cells after mental pouch implantation within agarose gels. A. J. Fleming, M. V. Sefton, Tissue Engineering, 9, 1023-1036, 2003]. Wzrost przeżywaIności enkapsulowanych komórek zapewniło wcześniejsze zanurzanie kapsułek w agarozie.1993], hepatocytes [Viability and protein secretion from human hepatoma (HepG2) cells encapsulated in 480-μΓΠ polyacrylate microcapsules by submerged nozzle-liquid jet extrusion. H. Utudag, V. Horvath, J. P. Black, M. V. Sefton, Biotechnology and Bioengineering, 44, 1199-1204, 1994; Microencapsulation of viable hepatocytes in HEMA-MMA microcapsules: A preliminary study. G. M. D. Wells, M. M. Fisher, M. V. Sefton, Biomaterials, 14, 615-620, 1993]. In 2003, the authors made significant changes to their microcapsule manufacturing procedure, modifying the composition of the membrane dope solution by reducing the amount of methacrylates to 10% and 9% and introducing a 30% addition of polyvinylpyrrolidone as a blowing agent. This resulted in a 25-fold increase in membrane permeability due to an increase in pore density [Viability of hydroxyethyl methacrylate-methyl methacrylate-microencapsulated PC12 cells after mental pouch implantation within agarose gels. A. J. Fleming, M. V. Sefton, Tissue Engineering, 9, 1023-1036, 2003]. The increase in survival of the encapsulated cells was ensured by the earlier dipping of the capsules in agarose.
Konieczność zachowania komórek przy życiu w czasie procesu enkapsulacji uniemożliwia niestety wykorzystanie wielu innych polimerów syntetycznych, które z powodzeniem stosowane są do immobilizacji i enkapsulacji enzymów, hormonów i innych syntetycznych substancji leczniczych. Jednocześnie nie jest możliwe także zastosowanie innych metod wytwarzania membran z polimerów syntetycznych, takich jak powszechnie stosowana w przemyśle farmaceutycznym metoda emulsyjna (membrana z polimetakrylanu metylu) [Encapsulation of water-soluble drugs by a modified solvent evaporation method. I. Effect of process and formulation variables on drug entrapment. R. Alex, R. Bodmeier, J. Microencapsul., 7, 347-355, 1990; Preparation and in vitro evaluation of propylthiouracil microspheres made of Eudragit RL 100 and cellulose acetate butyrate polymers using the emulsion-solvent evaporation method. W. M. Obeidat, J. C. Price, J. Microencapsul., 22, 281-289, 2005] czy membrana z polistyrenu położona na kulce z octanomaślanu celulozy [Microencapsulation of ketoprofen using w/o/w/ complex emulsion technique. I. El-Gibaly, S. M. Safwat, M. O. Ahmed, J. Microencapsul., 13, 67-87, 1996], metoda emulsyjna z odparowaniem rozpuszczalnika (membrana z etylocelulozy) [Ethylcellulose microspheres containing sodium diclofenac: Development and characterization. M. A. Baccarin, R. C. Evangelista, R. M. Lucinda-Silva, Acta Farmaceutica Bonaerense, 25, 401-404, 2006], wolnorodnikowa polimeryzacja emulsyjna (membrana z kopolimeru akrylamidu z metylometakrylanem metylu) [Development of 5-fluorouracil loaded poly(acrylamide-comethylmethacrylate) novel core-shell microspheres: in vitro release studies. V. R. Babu, M. Sairam, K. M. Hosamani, T. M. Aminabhavi, International Journal of Pharmaceutics, 15, 55-62, 2006] czy koacerwacja (membrana z etylocelulozy) [Preparation and release kinetics of microencapsulated cisplatin with ethylcellulose. B. Hecguet, C. Fournier, G. Depadt, P. Cappelaere, J. Pharm. Pharmacol., 36, 803-807, 1984]. We wszystkich tych przypadkach czas kontaktu żywych komórek z toksycznymi organicznymi rozpuszczalnikami polimerów syntetycznych jest zbyt długi, powodując obumieranie komórek, bądź znaczne osłabienie ich fizjologii w skutek zatrucia.The need to keep cells alive during the encapsulation process, unfortunately, prevents the use of many other synthetic polymers, which are successfully used to immobilize and encapsulate enzymes, hormones and other synthetic medicinal substances. At the same time, it is also not possible to use other methods of producing membranes from synthetic polymers, such as the emulsion method commonly used in the pharmaceutical industry (polymethyl methacrylate membrane) [Encapsulation of water-soluble drugs by a modified solvent evaporation method. I. Effect of process and formulation variables on drug entrapment. R. Alex, R. Bodmeier, J. Microencapsul., 7, 347-355,1990; Preparation and in vitro evaluation of propylthiouracil microspheres made of Eudragit RL 100 and cellulose acetate butyrate polymers using the emulsion-solvent evaporation method. W. M. Obeidat, J. C. Price, J. Microencapsul., 22, 281-289, 2005] or a polystyrene membrane on a cellulose acetate butyrate ball [Microencapsulation of ketoprofen using w / o / w / complex emulsion technique. I. El-Gibaly, S. M. Safwat, M. O. Ahmed, J. Microencapsul., 13, 67-87, 1996], solvent evaporation emulsion method (ethylcellulose membrane) [Ethylcellulose microspheres containing sodium diclofenac: Development and characterization. MA Baccarin, RC Evangelista, RM Lucinda-Silva, Acta Farmaceutica Bonaerense, 25, 401-404, 2006], free radical emulsion polymerization (acrylamide-methylmethacrylate copolymer membrane) [Development of 5-fluorouracil loaded poly (acrylamide-comethylhacrylate) core-shell microspheres: in vitro release studies. V. R. Babu, M. Sairam, K. M. Hosamani, T. M. Aminabhavi, International Journal of Pharmaceutics, 15, 55-62, 2006] or coacervation (ethylcellulose membrane) [Preparation and release kinetics of microencapsulated cisplatin with ethylcellulose. B. Hecguet, C. Fournier, G. Depadt, P. Cappelaere, J. Pharm. Pharmacol., 36, 803-807, 1984]. In all these cases, the contact time of living cells with toxic organic solvents of synthetic polymers is too long, causing the cells to die or significantly weakening their physiology as a result of poisoning.
Praktycznie, jedyna skuteczna metoda opłaszczania żywych komórek polimerami syntetycznymi polega na koekstruzji (współtłoczenie) zawiesiny komórek w roztworze soli fizjologicznej lub zolu polisacharydowym z organicznym roztworem syntetycznego polimeru, stosowana przez Seftona [Viability and protein secretion from human hepatoma (HepG2) cells encapsulated in 480-μΓΠ polyacrylate microcapsules by submerged nozzle-liquid jet extrusion. H. Utudag, V. Horvath, J. P. Black, M. V. Sefton, Biotechnology and Bioengineering, 44, 1199-1204, 1994]. W technice tej, podobnie jak w metodzie z podwójną dyszą [sposób jednoetapowego wytwarzania mikrokapsułek, zwłaszcza zawierających żywe komórki, ich zbiory lub substancje biologicznie aktywne oraz urządzenie do ich wytwarzania. D. Lewińska, J. Bukowski, S. Rosiński, M. Kożuchowski, A. Werynski, Zgłoszenie Patentowe RP P-367593, 2004], dochodzi do krótkiego, ale bezpośredniego kontaktu komórek z roztworem polimeru syntetycznego. Takie rozwiązanie techniczne uniemożliwia zastosowanie większości biozgodnych, wysokocząsteczkowych polimerów syntetycznych takich jak polisulfon, polieterosulfon, czy poliamid. W trakcie wytwarzania kropli dochodzi do natychmiastowego wytrącania się (żelowania) polimeru syntetycznego na końcu dyszy ekstruzyjnej, powodując zatykanie się dyszy.In practice, the only effective method of coating living cells with synthetic polymers is to co-extrusion (co-extrusion) of a suspension of cells in saline or polysaccharide sol with an organic synthetic polymer solution, used by Septon [Viability and protein secretion from human hepatoma (HepG2) cells encapsulated in 480- μΓΠ polyacrylate microcapsules by submerged nozzle-liquid jet extrusion. H. Utudag, V. Horvath, J. P. Black, M. V. Sefton, Biotechnology and Bioengineering, 44, 1199-1204, 1994]. In this technique, as in the double nozzle method [method of one-step production of microcapsules, especially those containing living cells, their crops or biologically active substances, and a device for their production. D. Lewińska, J. Bukowski, S. Rosiński, M. Kożuchowski, A. Werynski, Polish Patent Application P-367593, 2004], there is a short but direct contact of cells with a synthetic polymer solution. Such a technical solution makes it impossible to use most biocompatible, high-molecular synthetic polymers such as polysulfone, polyethersulfone or polyamide. In the course of drop production, the synthetic polymer immediately precipitates (gels) at the end of the extrusion nozzle, causing the nozzle to clog.
Nieoczekiwanie okazało się, że sposobem według wynalazku, możliwe jest jednoetapowe wytwarzanie mikrokapsułek zawierających substancje biologicznie aktywne, zwłaszcza żywe komórkiUnexpectedly, it turned out that with the method according to the invention, it is possible to prepare microcapsules containing biologically active substances, especially living cells in one step.
PL 208 383 B1 i/lub mikroorganizmy, ewentualnie genetycznie modyfikowane, w hydrożelowym rdzeniu, w specjalnie do tego celu zaprojektowanym urządzeniu według wynalazku, posiadającym odpowiednio zbudowaną głowicę.And / or microorganisms, optionally genetically modified, in a hydrogel core, in a device according to the invention specially designed for this purpose, having an appropriately constructed head.
Mikrokapsułki zawierające wewnątrz substancje biologicznie aktywne, zwłaszcza żywe komórki i/lub mikroorganizmy, ewentualnie genetycznie modyfikowane albo naturalne lub syntetyczne substancje do zastosowań biomedycznych, według wynalazku charakteryzuje się tym, że ma budowę trójwarstwową, gdzie wewnętrzną warstwę stanowiącą enkapsulowany materiał biologicznie aktywny, zawieszony lub rozpuszczony w wodzie, podłożu hodowlanym lub wodnym roztworze polisacharydu, oddziela od zewnętrznej warstwy błonotwórczego polimeru syntetycznego, ciecz separująca, korzystnie gliceryna i/lub ciekłe glikole polietylenowe.Microcapsules containing biologically active substances inside, in particular living cells and / or microorganisms, optionally genetically modified or natural or synthetic substances for biomedical applications, according to the invention are characterized in that they have a three-layer structure, where the inner layer is the encapsulated biologically active material, suspended or dissolved in water, culture medium or aqueous polysaccharide solution, separates from the outer layer of the film-forming synthetic polymer, a separating liquid, preferably glycerin and / or liquid polyethylene glycols.
Mikrokapsułki według wynalazku, korzystnie, mają wymiar od 0,01 do 8,0 mm, zwłaszcza od 0,17 mm do 5,31 mm.The microcapsules according to the invention preferably have a size of from 0.01 to 8.0 mm, in particular from 0.17 mm to 5.31 mm.
Mikrokapsułki według wynalazku, korzystnie, mają membranę polimerową o strukturze porowatej.The microcapsules according to the invention preferably have a polymer membrane with a porous structure.
Korzystnie, jako warstwy błonotwórczego polimeru, mikrokapsułki według wynalazku, zawierają polieterosulfony, polisulfony, poliamidy, poliuretany, poliiminy.Preferably, as layers of the film-forming polymer, the microcapsules according to the invention contain polyethersulfones, polysulfones, polyamides, polyurethanes, polyimines.
Korzystnie, mikrokapsułki według wynalazku mają membrany z polimerów syntetycznych o grubość od 10 μm do 1000 μm, o gładkiej powierzchni i porowatej strukturze, typowej dla membran syntetycznych otrzymywanych metodą inwersji faz.Preferably, the microcapsules according to the invention have synthetic polymer membranes with a thickness of 10 µm to 1000 µm, with a smooth surface and a porous structure typical of synthetic membranes produced by the phase inversion method.
Korzystnie, mikrokapsułki według wynalazku jako ciecz separującą zawierają glicerynę oraz glikole polietylenowe o masie cząsteczkowej 300-800.Preferably, the microcapsules of the invention contain as separating liquid glycerin and polyethylene glycols with a molecular weight of 300-800.
Mikrokapsułki według wynalazku, korzystnie jako ciecz rdzeniową zawierają wodne roztwory polisacharydów naturalnych jak: alginiany, pektynę niskometoksylowaną, agarozę, propoksycelulozę, metoksycelulozę, chitozan oraz ich pochodne, a także roztwory soli fizjologicznej lub podłoża hodowlane z dodatkiem surowicy lub bez, korzystnie nie zawierające fosforanów, zwłaszcza podłoże DMEM buforowane HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy).The microcapsules according to the invention, preferably contain as the core liquid, aqueous solutions of natural polysaccharides, such as: alginates, low-methoxylated pectin, agarose, propoxycellulose, methoxycellulose, chitosan and their derivatives, as well as saline solutions or culture media with or without the addition of serum, preferably without phosphates, especially HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid) buffered DMEM medium.
Mikrokapsułki według wynalazku, jako materiał biologicznie aktywny, korzystnie zawierają żywe komórki, ich zbiory, bakterie, genetycznie modyfikowane bakterie, grzyby, mikroorganizmy, ewentualnie genetycznie modyfikowane, enzymy, hormony, białka oraz naturalne i syntetyczne substancje lecznicze.As biologically active material, the microcapsules according to the invention preferably contain live cells, their crops, bacteria, genetically modified bacteria, fungi, microorganisms, possibly genetically modified, enzymes, hormones, proteins and natural and synthetic medicinal substances.
Sposób wytwarzania mikrokapsułek zawierających substancje biologicznie aktywne, zwłaszcza żywe komórki i/lub mikroorganizmy, ewentualnie genetycznie modyfikowane albo naturalne lub syntetyczne substancje do zastosowań biomedycznych, według wynalazku polega na tym, że wytwarza się potrójny strumień cieczy, umieszczonych jedna wewnątrz drugiej i wewnątrz trzeciej, z których ciecz wewnętrzna zawiera materiał biologiczny, zawieszony lub rozpuszczony w wodzie, podłożu hodowlanym lub wodnym roztworze polisacharydu, ta wewnętrzna ciecz otoczona jest warstwą cieczy separującej, która otoczona jest warstwą roztworu polimeru syntetycznego, korzystnie przy pomocy głowicy w postaci potrójnej dyszy, przykładając jednocześnie pole elektrostatyczne dzielące strumień na krople, których powłokę polimerową następnie żeluje się metodą inwersji faz, poprzez umieszczenie ich w odpowiedniej łaźni żelującej, ewentualnie zawierającej wielowartościowe kationy oraz alkohol o C1-^C6 atomach węgla i/lub odpowiedni znany surfaktant.The method of producing microcapsules containing biologically active substances, especially living cells and / or microorganisms, possibly genetically modified or natural or synthetic substances for biomedical use, according to the invention consists in producing a triple stream of liquids, one inside the other and inside the third, with whose inner liquid contains biological material suspended or dissolved in water, a culture medium or an aqueous polysaccharide solution, this inner liquid is surrounded by a layer of separating liquid which is surrounded by a layer of a synthetic polymer solution, preferably by means of a triple nozzle head, simultaneously applying an electrostatic field dividing the stream into droplets, the polymer coating of which is then gelled by the phase inversion method, by placing them in a suitable gelling bath, optionally containing multivalent cations and alcohol with C 1 - C 6 carbon atoms and / or responding to one known surfactant.
W sposobie według wynalazku, korzystnie, przykłada się jednocześnie pole elektrostatyczne stałe, impulsowe lub zmienne o napięciu od 1 kV do 55 kV powodujące odrywanie się trójwarstwowych kropli.In the method according to the invention, it is advantageous to simultaneously apply a constant, pulsed or alternating electrostatic field with a voltage of 1 kV to 55 kV causing the detachment of the three-layer droplets.
Sposobem według wynalazku, korzystnie, wytwarza się mikrokapsułki o rozmiarach od 0,01 do 8,0 mm, zwłaszcza od 0,17 mm do 5,31 mm.The process according to the invention preferably produces microcapsules with a size of 0.01 to 8.0 mm, in particular 0.17 mm to 5.31 mm.
Sposobem według wynalazku, korzystnie, wytwarza się membranę polimerową o strukturze porowatej, a ilość i wielkość porów membrany reguluje się składem roztworu membranotwórczego.The method of the invention preferably produces a polymeric membrane with a porous structure, and the number and size of the pores of the membrane are controlled by the composition of the membrane dope solution.
W sposobie według wynalazku jako polimery membranotwórcze stosuje się polieterosulfony, polisulfony, poliamidy, poliuretany, poliiminy w stężeniu od 0,5 % do 26% wagowych rozpuszczone w rozpuszczalnikach organicznych wybranych z grupy obejmującej dimetyloformamid, acetamid, N-metylopirolidon, dimetylosulfotlenek, 1,1,1-trichloroetan.In the process according to the invention, polyethersulfones, polysulfones, polyamides, polyurethanes, polyimines in a concentration from 0.5% to 26% by weight, dissolved in organic solvents selected from the group consisting of dimethylformamide, acetamide, N-methylpyrrolidone, dimethyl sulfoxide, 1.1 are used as membrane-forming polymers. , 1-trichloroethane.
W sposobie według wynalazku jako substancje porotwórczą stosuje się poliwinylopirolidony, korzystnie o masach cząsteczkowych 10'000, 40'000, 55'000 i 360'000 w ilości od 0,2% do 48% wagowych.In the process of the invention, polyvinylpyrrolidones, preferably having molecular weights of 10'000, 40'000, 55'000 and 360'000, are used as blowing agent in amounts ranging from 0.2% to 48% by weight.
PL 208 383 B1PL 208 383 B1
Sposobem według wynalazku, korzystnie, wytwarza się membrany z polimerów syntetycznych o grubości od 10 μm do 930 μm, o gładkiej powierzchni i porowatej strukturze, typowej dla membran syntetycznych otrzymywanych metodą inwersji faz.The method according to the invention preferably produces synthetic polymer membranes with a thickness of 10 μm to 930 μm, with a smooth surface and a porous structure typical of synthetic membranes obtained by the phase inversion method.
W sposobie według wynalazku, korzystnie, jako ciecz separującą stosuje się glicerynę oraz glikole polietylenowe korzystnie o masie cząsteczkowej 300-800.In the process according to the invention, glycerin is preferably used as the separating liquid and polyethylene glycols, preferably with a molecular weight of 300-800, are used.
W sposobie według wynalazku, korzystnie, jako ciecz rdzeniową stosuje się wodne roztwory polisacharydów naturalnych jak: alginiany, pektynę niskometoksylowaną, agarozę, propoksycelulozę, metoksycelulozę, chitozan oraz ich pochodne, a także roztwór soli fizjologicznej lub podłoża hodowlane z dodatkiem surowicy lub bez, korzystnie nie zawierające fosforanów, zwłaszcza podłoże DIEI buforowane HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosuIfonowy).In the method according to the invention, preferably aqueous solutions of natural polysaccharides, such as alginates, low methoxylated pectin, agarose, propoxycellulose, methoxycellulose, chitosan and their derivatives, as well as physiological saline or culture media with or without the addition of serum, are used as the core liquid, preferably not phosphate-containing, especially HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethane sulfonic acid) buffered DIEI medium.
W sposobie według wynalazku jako materiał biologicznie aktywny, korzystnie stosuje się żywe komórki, ich zbiory, bakterie, genetycznie modyfikowane bakterie, grzyby, mikroorganizmy, enzymy, hormony, białka oraz naturalne i syntetyczne substancje lecznicze.In the method according to the invention, as biologically active material, preferably living cells, their crops, bacteria, genetically modified bacteria, fungi, microorganisms, enzymes, hormones, proteins and natural and synthetic medicinal substances are used.
W sposobie według wynalazku, korzystnie, żeluje się powłokę polimerową kropel metodą inwersji faz, poprzez bezpośrednie wkraplanie kropel do łaźni żelującej.In the process according to the invention, it is advantageous to gel the polymer coating of the droplets by the phase inversion method by directly dropping the droplets into the gelling bath.
W sposobie według wynalazku, korzystnie, jako łaźnię żelującą stosuje się wodę, ewentualnie zawierającą roztwory soli metali dwuwartościowych, korzystnie jonów wapnia Ca+2 baru Ba+2 lub żelaza Fe+2 w 0,9% wodnym roztworze chlorku sodu NaCI o stężeniu od 0,5% do 3,5% wagowych, korzystnie buforowanym za pomocą HEPES, w stężeniu od 0,05% do 0,55% (w/w) z dodatkiem surfaktantów, korzystnie Tween 80, 65, 20, albuminy z jaja kurzego w stężeniu od 0,01% do 8% w/w lub świeżego żółtka jaja kurzego w stężeniu 0,02% do 12% (v/v).In the process according to the invention, water is preferably used as the gelling bath, optionally containing solutions of divalent metal salts, preferably calcium ions Ca +2 barium Ba +2 or iron Fe +2 in 0.9% aqueous sodium chloride NaCl solution with a concentration of 0 , 5% to 3.5% by weight, preferably HEPES-buffered, at a concentration of 0.05% to 0.55% (w / w) with the addition of surfactants, preferably Tween 80, 65, 20, ovalbumin in a concentration of 0.01% to 8% w / w or fresh egg yolk at a concentration of 0.02% to 12% (v / v).
W sposobie według wynalazku, korzystnie, jako łaźnię żelującą stosuje się wodny roztwór alkoholu Ci—C6 w wodzie lub roztworach soli metali wielowartościowych w ilości od 10% do 70% (v/v).In the present invention, preferably, the gelling bath is an aqueous solution of alcohol CrC6 in water or salt solutions of polyvalent metals in an amount of from 10% to 70% (v / v).
Nieoczekiwanie okazało się, że sposobem według wynalazku można opłaszczać hydrożelowy, sferyczny rdzeń mikrokapsułki membranami z wysokocząsteczkowych polimerów syntetycznych, takich jak polisulfony, polieterosulfon, poliamid-6, poliamid-66, poliimidy, poliuretany, rozpuszczonymi w typowych dla polimerów syntetycznych rozpuszczalnikach jak: dimetyloformamid, N-metylopirolidon, dimetyloacetamid, dimetylosulfotlenek, bez zniszczenia materiału biologicznego, zwłaszcza żywych komórek.Unexpectedly, it turned out that the method according to the invention can coat the hydrogel, spherical core of the microcapsule with membranes made of high molecular weight synthetic polymers, such as polysulfones, polyethersulfone, polyamide-6, polyamide-66, polyimides, polyurethanes, dissolved in solvents typical for synthetic polymers, such as dimethylformamide, N-methylpyrrolidone, dimethylacetamide, dimethylsulfoxide, no destruction of biological material, especially living cells.
Zastosowanie w sposobie według wynalazku pola elektrostatycznego stałego, impulsowego lub zmiennego do generowania potrójnych kropli umożliwia jednoetapowe wytworzenie mikrokapsułek typu hydrożel-polimer syntetyczny o średnicach znacznie mniejszych od wielkości zewnętrznej średnicy zewnętrznej dyszy głowicy. Rozwiązanie według wynalazku ma charakter nowatorski i nie było jak dotąd prezentowane światowej literaturze naukowej.The use of a constant, pulsed or alternating electrostatic field in the method according to the invention to generate triple drops allows one-step production of microcapsules of the hydrogel-synthetic polymer type with diameters significantly smaller than the outer diameter of the head nozzle. The solution according to the invention is innovative and has not been presented to world scientific literature so far.
Przedmiotem wynalazku jest także urządzenie do jednoetapowego wytwarzania mikrokapsułek zawierających substancje biologicznie aktywne.The subject of the invention is also a device for the one-step production of microcapsules containing biologically active substances.
Urządzenie do jednoetapowego wytwarzania mikrokapsułek zawierających substancje biologicznie aktywne, zwłaszcza żywe komórki i/lub mikroorganizmy, ewentualnie genetycznie modyfikowane albo naturalne lub syntetyczne substancje do zastosowań biomedycznych, według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera specjalną głowicę, wyposażoną w trzy współosiowe dysze, umożliwiające jednoczesne tłoczenie trzech cieczy, generator pola elektrycznego stałego, impulsowego lub zmiennego, który podłączony jest przewodem wysokiego napięcia do metalowej części głowicy, a przewodem niskiego potencjału do łaźni żelującej, kolekcjonującej gotowe mikrokapsułki.The device for one-step production of microcapsules containing biologically active substances, especially living cells and / or microorganisms, possibly genetically modified or natural or synthetic substances for biomedical applications, according to the invention, is characterized by the fact that it includes a special head equipped with three coaxial nozzles, enabling simultaneous pressing three liquids, a generator of a constant, impulse or alternating electric field, which is connected with a high-voltage cable to the metal part of the head, and with a low-potential cable to a gelling bath collecting ready-made microcapsules.
Wytworzone w urządzeniu według wynalazku kapsułki składają się z hydrożelowego lub wodnego rdzenia zawierającego materiał biologicznie aktywny, otoczonego membraną półprzepuszczalna o utrwalonej strukturze, wytworzoną z wysokocząsteczkowego polimeru syntetycznego.Capsules produced in the device according to the invention consist of a hydrogel or aqueous core containing biologically active material, surrounded by a structured semipermeable membrane made of high molecular weight synthetic polymer.
Urządzenie według wynalazku, korzystnie wyposażone jest w mieszadło, zwłaszcza magnetyczne, przy pomocy którego miesza się zawartość łaźni żelującej, gdzie mikrokapsułki żelują w obecności cieczy.The device according to the invention is preferably equipped with a stirrer, especially a magnetic one, with which the contents of the gelling bath are stirred, the microcapsules gelling in the presence of a liquid.
Urządzenie według wynalazku, korzystnie wyposażone jest w skalowane zbiorniki podłączone do wlotów wszystkich trzech dyszy głowicy. Do wlotu dyszy wewnętrznej zbiornik zawierający ciecz lub zawiesinę rdzeniową, do wlotu dyszy środkowej zbiornik zawierający ciecz separującą i do wlotu dyszy zewnętrznej zbiornik zawierający roztwór błonotwórczy.The device according to the invention preferably has graduated tanks connected to the inlets of all three nozzles of the head. To the inlet of the internal nozzle a tank containing a core liquid or slurry, to the inlet of the central nozzle a tank containing the separation liquid, and to the inlet of the external nozzle a tank containing a film-forming solution.
Wszystkie ciecze wypychane są ze zbiorników do odpowiednich dysz za pomocą sprężonego powietrza lub pomp. Nadciśnienia gazów wypychających wszystkie trzy ciecze są regulowane za pomocą regulatorów oraz mierzone za pomocą manometrów.All liquids are pushed from the tanks to the appropriate nozzles by means of compressed air or pumps. The overpressures of the gases propelling all three liquids are regulated with regulators and measured with pressure gauges.
PL 208 383 B1PL 208 383 B1
W celu technicznej realizacji pomysłu wytwarzania mikrokapsułek typu hydrożel-polimer syntetyczny w procesie jednoetapowym skonstruowano głowicę według wynalazku, zawierającą trzy dysze, umożliwiające jednoczesne, współosiowe tłoczenie trzech cieczy.In order to technically implement the idea of producing microcapsules of the hydrogel-synthetic polymer type in a one-step process, a head according to the invention was constructed, containing three nozzles, enabling simultaneous, coaxial pumping of three liquids.
Konstrukcję urządzenia do jednoetapowego wytwarzania mikrokapsułek, typu hydrożel-polimer syntetyczny, według wynalazku, przedstawiono na załączonych rysunkach, na których fig. 1 przedstawia całość urządzenia, a fig. 2 przedstawia schemat konstrukcji potrójnej dyszy, umożliwiającej jednoetapowe wytwarzanie mikrokapsułek według wynalazku.The construction of the device for the single-step production of microcapsules of the hydrogel-synthetic polymer type according to the invention is illustrated in the accompanying drawings, in which Fig. 1 shows the whole device and Fig. 2 shows a schematic diagram of the construction of a triple nozzle allowing one-step production of microcapsules according to the invention.
Urządzenie według wynalazku składa się z potrójnej głowicy typu dysza w dyszy 1, zbiornika na ciecz wewnętrzną 2, zbiornika na ciecz separującą 3, zbiornika na ciecz membranotwórczą 4, łaźni żelującej 5, zawierającej wytworzone mikrokapsułki 6, które składają się z ciekłego lub hydrożelowego rdzenia 7, otoczonego półprzepuszczalna membraną z polimeru syntetycznego 8. Łaźnia żelująca mieszana jest za pomocą mieszadła magnetycznego 9. Ponadto, urządzenie zawiera generator wysokiego napięcia 10, który podłączony jest przewodem wysokiego potencjału 11 do metalowej głowicy 1, a przewodem niskiego potencjału 12 do łaźni żelującej 5.The device according to the invention consists of a triple nozzle head in the nozzle 1, internal liquid tank 2, separating liquid tank 3, membrane dope tank 4, gelling bath 5 containing microcapsules 6 produced, which consist of a liquid or hydrogel core 7 surrounded by a semipermeable synthetic polymer membrane 8. The gelling bath is stirred by a magnetic stirrer 9. Furthermore, the device comprises a high voltage generator 10 which is connected via a high potential line 11 to the metal head 1, and a low potential line 12 to the gelling bath 5.
W skład urządzenia według wynalazku wchodzą także regulatory ciśnień R1, R2 i R3, manometry do pomiaru ciśnienia M1, M2 i M3 oraz butle ze sprężonymi gazami (powietrzem lub azotem) G1, G2 i G3 lub sprężarka. Opcjonalnie, korzystnie stosuje się pompy.The device of the invention also includes the pressure regulators R1, R2 and R3, pressure gauges M1, M2 and M3, and compressed gas cylinders (air or nitrogen) G1, G2 and G3 or compressor. Optionally, pumps are preferably used.
Głowica przedstawiona na fig. 2, zastosowana w urządzeniu według wynalazku składa się z trzech współosiowo, centrycznie i szczelnie zmontowanych kapilar metalowych: 13 - dysza wewnętrzna, 14 - dysza środkowa i 15 - dysza zewnętrzna, zaopatrzonych we wloty 16, 17 i 18 umożliwiające podłączenie zbiorników na odpowiednie ciecze: 16 - wlot zbiornika cieczy rdzeniowej, 17 wlot zbiornika cieczy membranotwórczej i 18 - wlot zbiornika cieczy separującej. Wlot zbiornika cieczy separującej 18 połączony jest szczelnym drenem 20 z dyszą środkową 14, a wlot zbiornika cieczy membranotwórczej 17 połączony jest szczelnym drenem 19 z dyszą zewnętrzna potrójnej głowicy 15. W konstrukcyjnie istotnych miejscach połączenia między dyszami są uszczelnione uszczelkami 21, a całość znajduje się w obudowie 22. Dysza wewnętrzna, korzystnie ma średnicę zewnętrzną φ1 od 0,20 mm do 1,20 mm, dysza środkowa ma średnicę zewnętrzna φ2 od 0,50 mm do 2,60 mm, a dysza zewnętrzna ma średnicę zewnętrzną φ3 od 0,70 mm do 5,00 mm.The head shown in Fig. 2, used in the device according to the invention, consists of three coaxial, centrically and tightly assembled metal capillaries: 13 - internal nozzle, 14 - central nozzle and 15 - external nozzle, equipped with inlets 16, 17 and 18 enabling connection tanks for appropriate fluids: 16 - core fluid reservoir inlet, 17 - diaphragm fluid reservoir inlet, and 18 - separation fluid reservoir inlet. The inlet of the separating liquid tank 18 is connected by a tight drain 20 with the central nozzle 14, and the inlet of the membrane tank 17 is connected by a tight drain 19 with the external nozzle of the triple head 15. In structurally important places, the connections between the nozzles are sealed with gaskets 21, and the whole is housing 22. The inner nozzle preferably has an outer diameter φ 1 of 0.20 mm to 1.20 mm, the central nozzle has an outer diameter φ 2 of 0.50 mm to 2.60 mm and the outer nozzle has an outer diameter φ3 of 0 , 70mm to 5.00mm.
Urządzenie według wynalazku pozwala na opłaszczanie materiału biologicznie aktywnego półprzepuszczalnymi membranami z wysokocząsteczkowych polimerów syntetycznych w procesie jednoetapowym.The device according to the invention allows for the coating of biologically active material with semipermeable membranes made of high molecular weight synthetic polymers in a one-step process.
Nieoczekiwanie okazało się, że przy pomocy urządzenia według wynalazku, zawierającego trzy współosiowo usytuowane dysze, podłączone do generatora napięcia elektrycznego, możliwe jest wytworzenie kropli z organicznego roztworu polimeru syntetycznego, wewnątrz której znajduje się warstwa z cieczy separującej, a wewnątrz niej kropla z wodnego roztworu polisacharydu (z zolu), zawierająca żywe komórki. Po wytrąceniu (precypitacji) polimeru syntetycznego metodą inwersji faz, a w razie potrzeby utrwaleniu struktury hydrożelowej w odpowiedniej łaźni żelującej, efektem końcowym jest gotowa mikrokapsułka, zawierająca opłaszczony materiał biologiczny.Surprisingly, it turned out that by means of the device according to the invention, comprising three coaxial nozzles connected to an electric voltage generator, it is possible to produce a drop of an organic synthetic polymer solution, inside which there is a layer of separating liquid and inside it a drop of an aqueous polysaccharide solution (from sol) containing living cells. After the synthetic polymer is precipitated (precipitated) by the phase inversion method and, if necessary, the hydrogel structure is fixed in a suitable gelling bath, the end result is a ready-made microcapsule containing encapsulated biological material.
Mikrokapsułki wytworzone tą metodą zawierają żywe komórki otoczone cienką warstwą cieczy separującej oraz błoną z wysokocząsteczkowego polimeru syntetycznego, nie rozpuszczającego się w wodzie i płynach fizjologicznych.Microcapsules produced by this method contain living cells surrounded by a thin layer of a separating liquid and a membrane made of high molecular weight synthetic polymer that is insoluble in water and physiological fluids.
Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku.Embodiments of the invention are illustrated below.
P r z y k ł a d IP r z k ł a d I
Przy pomocy urządzenia i potrójnej głowicy według wynalazku przeprowadzono proces, w którym jako ciecz rdzeniową zastosowano wodny roztwór pektyny niskometoksylowanej o stężeniu 1,3%, glikol polietylenowy jako ciecz separującą oraz roztwór membranotwórczy o składzie: polisulfony UDEL 1700 - 5% (w/v), poliwinylopirolidon K10 - 7,3% (w/v) w dimetyloformamidzie. Zastosowano następującą procedurę: przygotowano urządzenie, za pomocą regulatorów R1, R2 i R3 nastawiono założone wartości nadciśnień gazów wypychających odpowiednie ciecze - dla cieczy rdzeniowej nadciśnienie P1 = 0,12 atm, dla cieczy separującej P2 = 0,60 atm i dla cieczy membranotwórczej P3 = 0,10 atm. Do naczynia z łaźnią żelującą wlano 60 ml mieszaniny 1,1% (w/w) wodnego CaCl2 zmieszany z metanolem w stosunku objętościowym 2:1. Naczynie z łaźnią umieszczono na mieszadle magnetycznym. Zbiorniki napełniono odpowiednimi cieczami i podłączono dopływ gazów. Na generatorze napięcia ustawiono parametry:Using the device and the triple head according to the invention, a process was carried out in which an aqueous solution of low-methoxylated pectin with a concentration of 1.3% was used as the core liquid, polyethylene glycol as a separating liquid and a membrane-doping solution composed of: polysulfones UDEL 1700 - 5% (w / v) , polyvinylpyrrolidone K10 - 7.3% (w / v) in dimethylformamide. The following procedure: Prepare the device by the regulators R1, R2 and R3 are adjusted to target values appropriate overpressure gas ejecting liquid - liquid core pressure P1 = 0.12 atm, the liquid separator P2 = 0.60 atm and a liquid membranotwórczej P3 = 0.10 atm. 60 ml of a mixture of 1.1% (w / w) aqueous CaCl2 mixed with methanol in a 2: 1 volume ratio was poured into a vessel with a gelling bath. The vessel with the bath was placed on a magnetic stirrer. The tanks were filled with the appropriate liquids and the gas supply was connected. The following parameters were set on the voltage generator:
- tryb pracy: napięcie impulsowe,- operating mode: impulse voltage,
- wartość napięcia U = 8 kV,- voltage value U = 8 kV,
PL 208 383 B1PL 208 383 B1
- czas trwania impulsów elektrycznych 8 ms,- duration of electric pulses 8 ms,
- czę stotliwo ść impulsów 60 Hz.- pulse frequency 60 Hz.
Włączono generator, włączono przepływ gazów wypychających poszczególne ciecze. W czasie procesu na końcu głowicy formowały się potrójne krople (typu kropla w kropli), które wpadały do łaźni żelującej, gdzie pod wpływem jonów Ca+2 i wody (nierozpuszczalnik polimeru syntetycznego) następowało żelowanie pektynowego rdzenia mikrokapsułek i polimeru syntetycznego, tworzącego półprzepuszczalna membranę. Po zakończeniu procesu 30 mikrokapsułek zmierzono za pomocą mikroskopu krystalograficznego i na tej podstawie wyliczono ich średnią średnicę Dśr oraz wyliczono współczynnik zmienności średnicy VC (VC = (SD x 100%) / Dśr). Wytworzona szarża miała średnią średnicę Dśr = 1,50 mm, a VC = 4%.The generator was turned on, the flow of gases pushing individual liquids was turned on. During the process, triple drops (drop-in-drop) formed at the end of the head, which fell into the gelling bath, where, under the influence of Ca +2 ions and water (synthetic polymer non-solvent), gelation of the pectin core of the microcapsules and the synthetic polymer forming a semipermeable membrane took place. After the end of the process, 30 microcapsules were measured by means of a crystallographic microscope and on this basis their mean diameter Dav was calculated and the coefficient of variation of the diameter VC was calculated (VC = (SD x 100%) / Dav). The produced batch had an average diameter Dav = 1.50 mm, and VC = 4%.
Za pomocą mikroskopu biologicznego zaopatrzonego w aparat cyfrowy wykonano zdjęcia wytworzonej szarży mikrokapsułek w świetle przechodzącym, widoczne na rysunku fig. 3a, gdzie pokazano ogólny wygląd szarży mikrokapsułek powiększony 20 razy.Photographs of the produced batch of microcapsules in transmitted light were taken using a biological microscope equipped with a digital camera, shown in Figure 3a, showing the general appearance of the batch of microcapsules enlarged 20 times.
W celu zbadania wewnę trznej struktury membrany polimerowej, z losowo wybranych mikrokapsułek wykonano dwa rodzaje preparatów. Preparaty zatapiane w komercyjnie dostępnej żywicy metakrylanowej (Historesin Embedding Kit 7022 3173), które następnie pocięto na plastry o grubości 25 μm za pomocą mikrotomu i wykonano ich zdjęcia pod mikroskopem optycznym - widoczne na fig. 3b, gdzie pokazano wygląd preparatu otrzymanego po przecięciu mikrokapsułek powiększony 20 razy. Na podstawie tych zdjęć stwierdzono, że grubość błony polimerowej wynosi od 78 μm do 220 μm.In order to study the internal structure of the polymer membrane, two types of preparations were made from randomly selected microcapsules. Preparations embedded in a commercially available methacrylate resin (Historesin Embedding Kit 7022 3173), which were then cut into 25 μm thick slices using a microtome and photographed under an optical microscope - shown in Fig. 3b, where the appearance of the preparation obtained after cutting the microcapsules in magnified form is shown. 20 times. On the basis of these photos, the thickness of the polymer film was found to be between 78 µm and 220 µm.
Drugi rodzaj preparatów otrzymano po schłodzeniu mikrokapsułek i przełamaniu ich w połowie średnicy. Preparaty te poddano obserwacjom za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego. Jak pokazano na zdjęciach - fig. 4a, b, c, d, e i f, membrana polimerowa ma wysoce porowatą strukturę, typową dla membran polimerowych, wytwarzanych metodą inwersji faz.The second type of preparations was obtained after cooling the microcapsules and breaking them in the middle of the diameter. These preparations were observed using a scanning electron microscope. As shown in the pictures - Figs. 4a, b, c, d, e and f, the polymer membrane has a highly porous structure typical of polymer membranes produced by the phase inversion method.
P r z y k ł a d IIP r z x l a d II
W celu sprawdzenia możliwości wytwarzania mikrokapsułek metodą według wynalazku, przy zastosowaniu pola stałego, wykonano doświadczenie sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie I. Jako ciecz wewnętrzną zastosowano 1,2% (w/w) wodny roztwór alginianu sodu oraz glikol polietylenowy o masie 600 jako ciecz separującą. Roztwór membranotwórczy składał się z: 8% (w/v) poliamidu-6 i 1,6% (w/v) poliwinylopirolidonu PVP360 rozpuszczonych w diacetyloamidzie. Jako łaźnię żelującą zastosowano wodny roztwór CaCl2 o stężeniu 2% (w/w) z 1%-owym (w/w) dodatkiem surfaktanta Tween 65. Wartości nadciśnień gazów wypychających poszczególne ciecze to: P1 = 0,25 atm; P2 = 0,75 atm i P3 = 0,3 atm. Parametry elektryczne procesu to:In order to check the possibility of producing microcapsules by the method according to the invention, using a solid field, an experiment was carried out in a manner analogous to that described in Example I. As the internal liquid, 1.2% (w / w) aqueous sodium alginate solution and polyethylene glycol with the weight of 600 as the liquid were used. separating. The membrane dope solution consisted of: 8% (w / v) polyamide-6 and 1.6% (w / v) polyvinylpyrrolidone PVP360 dissolved in diacetylamide. A 2% (w / w) water solution of CaCl2 with a 1% (w / w) addition of Tween 65 surfactant was used as a gelling bath. The values of overpressure of gases pushing individual liquids out are: P1 = 0.25 atm; P2 = 0.75 atm and P3 = 0.3 atm. The electrical parameters of the process are:
- tryb pracy: napięcie stałe,- operating mode: constant voltage,
- wartość napięcia U= 21 kV,- voltage value U = 21 kV,
- czas trwania impulsów elektrycznych 5 ms,- duration of electric pulses 5 ms,
- częstotliwość impulsów 80 Hz.- pulse frequency 80 Hz.
Otrzymano szarżę okrągłych mikrokapsułek o gładkiej powierzchni o średniej średnicy Dśr = 0,84 mm i VC = 18%A batch of round microcapsules with a smooth surface with an average diameter of Dav = 0.84 mm and VC = 18% was obtained
P r z y k ł a d IIIP r z x l a d III
W celu sprawdzenia możliwości wytwarzania mikrokapsułek metodą według wynalazku, z polieterosulfonu, wykonano doświadczenie sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie I. Jako ciecz wewnętrzną zastosowano 1,4% (w/w) wodny roztwór alginianu sodu oraz glicerynę jako ciecz separującą.In order to check the possibility of producing microcapsules from polyethersulfone using the method according to the invention, an experiment was carried out in a manner analogous to that described in Example 1. 1.4% (w / w) aqueous sodium alginate solution and glycerin as a separating liquid were used as the internal liquid.
Roztwór membranotwórczy składał się z: 11% (w/v) polieterosulfonu Ultrasom E 6020 i 6% (w/v) poliwinylopirolidonu PVP 55, rozpuszczonych w N-metylopirolidonie.The membrane dope solution consisted of: 11% (w / v) polyethersulfone Ultrasom E 6020 and 6% (w / v) polyvinylpyrrolidone PVP 55, dissolved in N-methylpyrrolidone.
Jako łaźnię żelującą zastosowano wodny roztwór CaCl2 o stężeniu 1,1% (w/w) z 1%-owym (w/w) dodatkiem surfaktanta Tween 80.1.1% (w / w) aqueous CaCl2 solution with 1% (w / w) addition of Tween 80 surfactant was used as the gelling bath.
Wartości nadciśnień gazów wypychających poszczególne ciecze to: P1 = 0,1 atm; P2 = 0,7 atm i P3 = 0,1 atm.The values of overpressure of gases pushing out individual liquids are: P1 = 0.1 atm; P2 = 0.7 atm and P3 = 0.1 atm.
Parametry elektryczne procesu to:The electrical parameters of the process are:
- tryb pracy: napięcie impulsowe,- operating mode: impulse voltage,
- wartość napięcia U = 8 kV,- voltage value U = 8 kV,
- czas trwania impulsów elektrycznych 5 ms,- duration of electric pulses 5 ms,
- częstotliwość impulsów 50 Hz.- pulse frequency 50 Hz.
Otrzymano szarżę okrągłych mikrokapsułek o gładkiej powierzchni o średniej średnicy Dśr = 1,69 mm o VC = 5%.A batch of round microcapsules with a smooth surface with an average diameter of Dav = 1.69 mm and VC = 5% was obtained.
PL 208 383 B1PL 208 383 B1
P r z y k ł a d IVP r x l a d IV
W celu sprawdzenia możliwości enkapsulacji żywych komórek w mikrokapsułkach typu hydrożel-polimer syntetyczny metodą według wynalazku wykonano doświadczenie sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie I. Jako ciecz wewnętrzną zastosowano zawiesinę drożdży piekarniczych o stężeniu 2 x 107 komórek/ml w 1,4% (w/w) roztworze alginianu sodu w 0,9% wodnym roztworze NaCI oraz glicerynę jako ciecz separującą. Roztwór membranotwórczy składał się z: 15,5% (w/v) polieterosulfonu o masie cząsteczkowej 42000 i 8% (w/v) poliwinylopirolidonu o m. cz. 40000 rozpuszczonych w N-metylopirolidonie. Jako łaźnię żelującą zastosowano wodny roztwór CaCl2 o stężeniu 1,1% (w/w) z 1%-owym (w/w) dodatkiem surfaktanta Tween 80. Wartości nadciśnienia gazów wypychających poszczególne ciecze to: P1 = 0,1 atm; P2 = 0,7 atm i P3 = 0,1 atm. Parametry elektryczne procesu to:In order to check the possibility of encapsulating live cells in microcapsules of the hydrogel-synthetic polymer type, by the method according to the invention, an experiment was carried out in a manner analogous to that described in example I. A baker's yeast suspension with a concentration of 2 x 10 7 cells / ml at 1.4% (in / w) sodium alginate solution in 0.9% NaCl aqueous solution and glycerin as a separating liquid. The membrane dope solution consisted of: 15.5% (w / v) polyethersulfone with molecular weight 42,000 and 8% (w / v) polyvinylpyrrolidone with MW 40,000 dissolved in N-methylpyrrolidone. As a gelling bath an aqueous CaCl2 solution with a concentration of 1.1% (w / w) with a 1% (w / w) addition of Tween 80 surfactant was used. The values of the excess pressure of the gases pushing the individual liquids out are: P1 = 0.1 atm; P2 = 0.7 atm and P3 = 0.1 atm. The electrical parameters of the process are:
- tryb pracy: napięcie impulsowe,- operating mode: impulse voltage,
- wartość napięcia U = 11 kV,- voltage value U = 11 kV,
- czas trwania impulsów elektrycznych 2 ms,- duration of electric pulses 2 ms,
- częstotliwość impulsów 50 Hz.- pulse frequency 50 Hz.
Otrzymano szarżę okrągłych mikrokapsułek o cienkiej, przezroczystej membranie polieterosulfonowej, o średniej średnicy Dśr = 1,59 mm i VC = 15%, o grubości membrany 10 μm.A batch of round microcapsules with a thin, transparent polyethersulfone membrane, with an average diameter D d = 1.59 mm and VC = 15%, with a membrane thickness of 10 μm was obtained.
W celu sprawdzenia, czy komórki przeżyły proces enkapsulacji i czy membrana ma dostatecznie duże pory, aby produkty odżywcze mogły przedostawać się przez nią do wnętrza mikrokapsułki, otrzymane kapsułki umieszczono w pożywce hodowlanej DMEM suplementowanej glukozą. Hodowlę prowadzono 72 godziny. Mikrokapsułki zawierające drożdże sfotografowano przed i po hodowli. Jak pokazano na fig. 5b i 5c, po hodowli ilość komórek była znacząco większa niż bezpośrednio po enkapsulacji - fig. 5a.In order to check that the cells survived the encapsulation process and that the membrane has large enough pores for nutrients to pass through it into the microcapsule, the capsules obtained were placed in DMEM culture medium supplemented with glucose. The cultivation was performed for 72 hours. The yeast containing microcapsules were photographed before and after culturing. As shown in Figs. 5b and 5c, after culturing the number of cells was significantly greater than immediately after encapsulation - Fig. 5a.
P r z y k ł a d VP r z k ł a d V
Wykonano doświadczenie sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie IV, ale w łaźni żelującej zamiast Tween zastosowano albuminę w stężeniu 3,6% (w/v).The experiment was carried out in a similar manner to that described in Example 4, but in the gelling bath, albumin at a concentration of 3.6% (w / v) was used instead of Tween.
P r z y k ł a d VIP r x l a d VI
Wykonano doświadczenie sposobem analogicznym do opisanego w przykładzie IV, ale w łaźni żelującej zamiast Tween zastosowano świeże żółtko jaja kurzego w stężeniu 6% v/v.The experiment was carried out in a manner analogous to that described in Example 4, but in the gelling bath, fresh egg yolk at a concentration of 6% v / v was used instead of Tween.
Claims (32)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL383775A PL208383B1 (en) | 2007-11-15 | 2007-11-15 | Microcapsules containing active biological substances, especially live cells and/or microorganisms, possibly genetically modified or natural or synthetic substances for biomedical application, their production method and device for application of this meth |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL383775A PL208383B1 (en) | 2007-11-15 | 2007-11-15 | Microcapsules containing active biological substances, especially live cells and/or microorganisms, possibly genetically modified or natural or synthetic substances for biomedical application, their production method and device for application of this meth |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL383775A1 PL383775A1 (en) | 2009-05-25 |
| PL208383B1 true PL208383B1 (en) | 2011-04-29 |
Family
ID=42986121
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL383775A PL208383B1 (en) | 2007-11-15 | 2007-11-15 | Microcapsules containing active biological substances, especially live cells and/or microorganisms, possibly genetically modified or natural or synthetic substances for biomedical application, their production method and device for application of this meth |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL208383B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220016043A1 (en) * | 2018-11-23 | 2022-01-20 | University-Industry Foundation, Yonsei University | Method for manufacturing red blood cell-shaped nanostructure using multi-fluid electrospray method including multiple nozzles |
-
2007
- 2007-11-15 PL PL383775A patent/PL208383B1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220016043A1 (en) * | 2018-11-23 | 2022-01-20 | University-Industry Foundation, Yonsei University | Method for manufacturing red blood cell-shaped nanostructure using multi-fluid electrospray method including multiple nozzles |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL383775A1 (en) | 2009-05-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Haque et al. | In vitro study of alginate–chitosan microcapsules: an alternative to liver cell transplants for the treatment of liver failure | |
| US4673566A (en) | Microencapsulation of living tissue and cells | |
| US7101575B2 (en) | Production of nanocapsules and microcapsules by layer-wise polyelectrolyte self-assembly | |
| US8241652B2 (en) | Porous gelatin material, gelatin structures, methods for preparation of the same and uses thereof | |
| Zimmermann et al. | Alginate-based encapsulation of cells: past, present, and future | |
| CA1215922A (en) | Microencapsulation of living tissue and cells | |
| CA1174600A (en) | Encapsulation of live animal cells | |
| US5656469A (en) | Method of encapsulating biological substances in microspheres | |
| JP3007144B2 (en) | Cell capsule extrusion molding system | |
| US4689293A (en) | Microencapsulation of living tissue and cells | |
| KR101772642B1 (en) | Hybrid hollow microcapsule, scaffold comprising the same, and preparation method thereof | |
| WO1994023832A1 (en) | Use of a transacylation reaction between an esterified polysaccharide and a polyamine to form a membrane at least on the surface of gelled particles in an aqueous medium, resulting particles, preparation methods therefor and compositions containing same | |
| Morelli et al. | Microparticles for cell encapsulation and colonic delivery produced by membrane emulsification | |
| WO1989001034A1 (en) | Encapsulation of biological materials in semi-permeable membranes | |
| JP7260563B2 (en) | Cell transplantation kit, method for producing bag-like structure, and antidiabetic agent | |
| PL208383B1 (en) | Microcapsules containing active biological substances, especially live cells and/or microorganisms, possibly genetically modified or natural or synthetic substances for biomedical application, their production method and device for application of this meth | |
| Kang et al. | Morphology and metabolism of Ba-alginate encapsulated hepatocytes with galactosylated poly (allyl amine) and poly (vinyl alcohol) as extracellular matrices | |
| Sefton et al. | Hydrophilic polyacrylates for the microencapsulation of fibroblasts or pancreatic islets | |
| RU2641034C1 (en) | Method for polyelectrolite microcapsules preparation | |
| Moon et al. | Morphology and metabolism of hepatocytes microencapsulated with acrylic terpolymer-alginate using gelatin and poly (vinyl alcohol) as extracellular matrices | |
| Tsoy et al. | Microencapsulated multicellular tumor spheroids as a novel in vitro model for drug screening | |
| Wen et al. | Microcapsules through polymer complexation: Part 3: Encapsulation and culture of human burkitt lymphoma cells in vitro | |
| Xuan et al. | Microgels for Cell Delivery in Tissue Engineering and Regenerative Medicine | |
| Corrreia | Multifunctional and liquified capsules for tissue regeneration | |
| da Luz Mano | Maria Clara Rosa da Silva Correia |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20131115 |