PL208192B1 - Sposób detekcji elektrochemicznej w elektroforezie kapilarnej - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób detekcji elektrochemicznej w elektroforezie kapilarnej. Rozwiązanie jest przeznaczone zwłaszcza do stosowania w laboratoriach analitycznych różnych dziedzin nauki (chemia, biologia, medycyna, ochrona środowiska) i techniki, wykorzystujących elektroforezę kapilarną. Wynalazek może też być wykorzystany do detekcji analitów podczas przeprowadzania analizy w warunkach wstrzykowej analizy przepływowej (FIA) lub wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).

Detekcja elektrochemiczna w elektroforezie kapilarnej przeprowadzana jest najczęściej w warunkach kontrolowanego potencjału elektrody roboczej (amperometria, amperometria pulsowa lub woltamperometria cykliczna). Mikroelektroda robocza służąca jako detektor umieszczana jest w odległości od kilku do kilkudziesięciu mikrometrów od wylotu kapilary (tzw. „end-column detection) i jest polaryzowana potencjałem zmieniającym się okresowo w czasie we wstępnie zaprogramowany sposób. Prąd elektryczny o niewielkim natężeniu przepływający przez elektrodę zmienia się pod wpływem docierających analitów rozdzielanych w kapilarze w wyniku elektroforezy, co może zostać zarejestrowane w postaci pików, których wysokość i pole powierzchni zależą od stężenia. W warunkach elektroforezy kapilarnej niemożliwa jest jednak pełna kontrola potencjału elektrody. Potencjał na granicy elektroda/roztwór zależy nie tylko od nastawień potencjostatu, ale także od potencjału w polu elektrycznym wytworzonym na końcu kapilary przez prąd rozdziału, czyli tzw. „offsetu. Ten potencjał może przekraczać 1 V i zależy od wielu warunków doświadczalnych. Niezdolność do pełnej kontroli potencjału detektora przez potencjostat stwarza wiele problemów, takich jak: obniżenie stosunku sygnału do szumu, błędy systematyczne, możliwość zgubienia sygnału i w pewnych przypadkach tworzenie pęcherzyków H2 i O2 na elektrodzie. Pęcherzyki gazu drastycznie zwiększają poziom szumów w pomiarach, a w niektórych przypadkach mogą spowodować przerwę w układzie wysokiego napięcia stosowanym w elektroforezie, co może doprowadzić do wytworzenia iskry elektrycznej uszkadzającej elektrodę.

Klasyczna chronopotencjometria polega na pomiarze potencjału elektrody podczas procesów elektrodowych przebiegających przy stałym prądzie. W pewnym momencie (zwanym czasem przejścia), stężenie analitu przy powierzchni elektrody spada do zera powodując gwałtowną zmianę potencjału elektrody. Mierzonym parametrem analitycznym jest czas przejścia, który nie jest jednak wprost proporcjonalny do stężenia analitu i z tego powodu metoda ta jest stosunkowo rzadko używana w analizie elektrochemicznej.

Istota sposobu detekcji elektrochemicznej w elektroforezie kapilarnej według wynalazku, polega na współosiowym, optymalnym ustawieniu kapilary i mikroelektrody, a następnie polaryzowaniu cyklicznym mikroelektrody stałym prądem o naprzemiennie zmieniającym znak z ujemnego na dodatni stałym natężeniu. Następnie dokonywany jest pomiar, w cyklu katodowym lub anodowym, średniej różnicy potencjałów pomiędzy potencjałami rejestrowanymi dla elektrolitu podstawowego - buforu, a potencjał ami rejestrowanymi dla badanego analitu. Współ osiowe, optymalne ustawienie kapilary i mikroelektrody detekcyjnej korzystnie przeprowadzanie jest poprzez chronopotencjometryczny pomiar rozkładu potencjału „offset w polu elektrycznym wytworzonym na końcu kapilary podczas elektroforezy, a następnie ręcznym bądź automatycznym przesunięciu elektrody do punktu o najwyższym potencjale, który położony jest dokładnie naprzeciw środka kapilary.

Zastosowanie w detekcji sposobu według wynalazku eliminuje tworzenie na elektrodzie pęcherzyków gazu utrudniające otrzymanie prawidłowych wyników analizy. Przeprowadzone obliczenia uwzględniające odpowiednie rozpuszczalności w wodzie tlenu i wodoru oraz ich współczynniki dyfuzji wykazują że w detekcji według wynalazku można wykorzystywać gęstości prądu do 10 mA/cm² bez obawy o wydzielanie się na elektrodzie pęcherzyków tlenu lub wodoru. Metoda ta umożliwia również pomiar potencjału „offset i wykorzystanie go do mapowania pola elektrycznego na końcu kapilary elektroforetycznej. Chronopotencjometria jest techniką z kontrolowanym prądem, dlatego w tym przypadku potencjał „offset nie modyfikuje kontrolowanej wielkości. Również prąd rozdziału elektroforetycznego nie wpływa na prąd przepływający przez elektrodę. W oprzyrządowaniu elektrochemicznym prąd i potencjał mogą być różnie kontrolowane. Potencjał jest zawsze kontrolowany w sensie względnym (względem potencjału elektrody odniesienia), dlatego jest on modyfikowany przez potencjał „offset, który występuje pomiędzy elektrodą roboczą i odniesienia. Jednakże prąd w chronopotencjometrii cyklicznej jest kontrolowany w sensie absolutnym, dlatego nie jest modyfikowany przez prąd rozPL 208 192 B1 działu. W eksperymentach chronopotencjometrycznych potencjał „offset zmienia tylko mierzone wartości. Skutkiem tego odpowiedź elektrody przesuwa się pionowo o stałą wartość równą „offsetowi.

Przedstawiony sposób według wynalazku daje też możliwość wykorzystania pomiarów chronopotencjometrycznych do wyznaczenia „offsetu w dowolnym punkcie pola elektrycznego na końcu kapilary elektroforetycznej. Umożliwia to pomiar zmian średniego potencjału elektrody polaryzowanej większymi prądami (rzędu od około 50 do 100 nA) przed i po włączeniu wysokiego napięcia w eksperymentach elektroforezy kapilarnej. Liczbowa wielkość „offsetu zależy od usytuowania elektrody względem kapilary elektroforetycznej. Największa zmierzona wartość potencjału „offset w polu elektrycznym na końcu kapilary odpowiada położeniu mikroelektrody współosiowo z kapilarą dokładnie naprzeciw jej środka. Monitorowanie potencjału „offset jest bardzo pomocne w dokładnym ręcznym ustawianiu elektrody u wylotu kapilary, lecz można to również zastosować w automatycznym pozycjonowaniu mikroelektrody przez sterowany komputerowo wyposażony w silnik mikropozycjoner. W drugim przypadku, komputerowy program może wykorzystywać zmiany w potencjale „offset jako informację sprzężoną kierując mikroelektrodę na optymalną pozycję, współosiową z kapilarą.

Przedmiot wynalazku zostanie bliżej objaśniony w przykładzie wykonania, w oparciu o rysunek, na którym fig. 1 przedstawia zmiany potencjału mikroelektrody złotej umieszczonej w 0,1 M roztworze

NaOH podczas oznaczania metodą wstrzykowej analizy przepływowej jonów AsO2^- o stężeniu 10^-4 M, fig. 2 - krzywą kalibracyjną dla jonów AsO₂ ^- w 0,1 M NaOH na 12,5 μm elektrodzie Au, fig. 3 - elektroferogram uzyskany dla rozdziału mieszaniny 8 cukrów w warunkach elektroforezy kapilarnej z zastosowaniem detekcji chronopotencjometrycznej, a fig. 4 - rozkład potencjału „offset w odległości 10 μm od końca kapilary elektroforetycznej o długości 70 cm i średnicy wewnętrznej 50 μm.

Detekcję elektrochemiczną w elektroforezie kapilarnej z zastosowaniem sposobu według wynalazku przeprowadzono wykorzystując galwanostat z elektrodą roboczą połączoną z wejściem odwracającym wzmacniacza operacyjnego. Elektrodę roboczą stanowi dyskowa mikroelektroda złota o promieniu 12,5 μm. Możliwe jest zastosowanie elektrod z innych materiałów i o innych rozmiarach. Następnie dokonano współosiowego, optymalnego ustawienia kapilary i mikroelektrody detekcyjnej. Przeprowadzano to poprzez chronopotencjometryczny pomiar rozkładu potencjału „offset w polu elektrycznym wytworzonym na końcu kapilary podczas elektroforezy, a następnie ręcznym przesunięciu elektrody do punktu o najwyższym potencjale, który położony jest dokładnie naprzeciw środka kapilary.

W badaniach chronopotencjometrycznych, prąd przykładano do elektrody w formie fali prostokątnej, zmieniającej się kolejno pomiędzy dodatnimi i ujemnymi wartościami. Wielkość prądu ustalano w granicach od 5 nA i 200 nA co odpowiada gęstościom prądu od około 1 do 40 raA/cm². W chronopotencjometrii prąd potrzebny do polaryzacji elektrody może być w pełni kontrolowany przez zewnętrzny obwód elektroniczny i w konsekwencji problemy wywołane przez potencjał „offset na końcu kapilary elektroforetycznej mogą zostać w pełni wyeliminowane.

Potencjał elektrody roboczej próbkuje się w sposób ciągły z wybraną częstotliwością do 50 kHz i 128 punktów pomiarowych zbiera się podczas każdej połowy cyklu trwającego 300 ms. System gromadzenia danych pozwala na różny zakres próbkowania w katodowej i anodowej połowie cyklu. Odpowiedź elektrody może być prezentowana w różnych formach. Na przykład, na trójwymiarowych wykresach potencjał elektrody może być pokazany na jednej osi w funkcji czasu (mierzonego w milisekundach) od rozpoczęcia każdego cyklu fali kwadratowej, a na drugiej - w funkcji czasu od rozpoczęcia rozdziału elektroforetycznego lub chromatograficznego, a także eksperymentu przeprowadzanego w warunkach wstrzykowej analizy przepływowej (mierzonego w sekundach). Inne, prostsze przedstawienie odpowiedzi elektrody można otrzymać przez uśrednienie potencjału elektrody w każdej (anodowej lub katodowej) połowie cyklu i sporządzenie wykresu w funkcji czasu od rozpoczęcia rozdziału elektroforetycznego bądź chromatograficznego lub też oznaczania metodą wstrzykowaj analizy przepływowej. Drugi sposób nie dostarcza żadnych informacji o mechanizmie procesów elektrodowych, zawiera jednak dostateczną ilość informacji potrzebnych do wyznaczenia stężenia analitów biorących udział w procesach elektrodowych.

Na rysunku, fig. 1, przedstawiono zmiany potencjału mikroelektrody złotej polaryzowanej prądem ia = - ic = 10 nA spowodowane dotarciem do niej jonów ASO2^- o stężeniu 10^-4 M w 0,1 M roztworze NaOH. Linia ciągła reprezentuje odpowiedź elektrody dla samego elektrolitu podstawowego, linie przerywane reprezentują odpowiedź elektrody w obecności analitu. Pomiar średniej wartości zmian potencjału spowodowanych procesami elektrodowymi analitu w cyklu katodowym bądź anodowym

PL 208 192 B1 umożliwia uzyskanie pików będących sygnałem analitycznym wykorzystywanym w analizie ilościowej. Takie piki pokazano na fig. 1 przy odpowiednich częściach krzywych chronopotencjometrycznych.

Detekcyjna odpowiedź elektrody w przedstawionym sposobie może być wytwarzana przez bardzo różne procesy elektrodowe. Niektóre anality mogą ulegać procesom redukcji lub utlenienia, inne mogą adsorbować się na elektrodzie i wpływać na kinetykę jednego (lub więcej) procesów elektrodowych przebiegających na elektrodzie (tzn. wydzielania wodoru, tworzenia tlenku złota lub platyny, wydzielania tlenu, redukcji tlenku złota lub platyny oraz redukcji tlenu). Zaadsorbowane anality mogą również wpływać na pojemność podwójnej warstwy. Praktyka wykazuje, że sygnały analityczne spowodowane adsorpcją są najbardziej powszechne. Dlatego metoda przydatna jest do oznaczenia analitów, które nie muszą być elektroaktywne pod warunkiem, że adsorbują się na elektrodzie złotej lub platynowej. Znaczna liczba związków organicznych (i wiele nieorganicznych) zachowuje się w ten sposób. Otrzymane wyniki wskazują, że sygnał analityczny jest proporcjonalny do stężenia w zakresie stężeń obejmujących co najmniej 2 rzędy wielkości dla różnych analitów, a dla wielu z nich można uzyskać granicę wykrywalności wynoszącą około 0,1 μΜ. Sposób można stosować do oznaczania wielu anionów (np. AsO₂ ^-, SCN^-) oraz jonów metali (włączając Mn²⁺, Ni²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺, Pb²⁺, Tl⁺ i Hg²⁺), które dają sygnały analityczne w wyniku mechanizmu który obejmuje podpotencjałowe wydzielanie metali na złocie. Sposób jest też użyteczny w oznaczaniu wielu związków organicznych, jak np. cukrów, aminokwasów, flawonoidów, związków heterocyklicznych i aromatycznych. Jednakże należy zaznaczyć, że ten sposób detekcji nie jest selektywny, dlatego w praktycznym zastosowaniu w oznaczaniu mieszanin musi zostać połączony z dowolną metodą rozdziału.

Poniżej przedstawiono przykładowe badania przeprowadzone z zastosowaniem sposobu według wynalazku i ich wyniki.

P r z y k ł a d I. Przeprowadzono badania zależności wysokości pików otrzymanych podczas detekcji chronopotencjometrycznej jonów AsO₂ ^- w 0,1 M NaOH na 12,5 μm elektrodzie Au w warunkach przepływowej analizy wstrzykowej. Na rysunku, fig. 2, przedstawiono krzywą kalibracyjną otrzymaną dla stężeń AsO₂ ^- zmienianych w granicach od 0,2 do 1000 μM z zastosowaniem sposobu detekcji będącego przedmiotem wynalazku. Wysokość piku odpowiada maksymalnej zmianie średniego potencjału elektrody podczas katodowej połowy cyklu (do obliczenia każdego punktu danych użyto średniej z sześciu odtwarzalnych pomiarów). Prądy utlenienia i redukcji były odpowiednio równe 10 nA i -10 nA. Krzywa kalibracyjna jest liniowa w zakresie stężeń od 0,5 do 50 μM, z nachyleniem 1,56 mV/j.M i R² =0,9994. Dla wyższych stężeń odpowiedź elektrody staje się nieliniową funkcją stężenia i w końcu osiąga wartość stałą, ponieważ pokrycie elektrody zaadsorbowanymi jonami As(III) osiąga wysycenie. Podobne wyniki otrzymano również w warunkach rozdziału elektroforetycznego dla wielu innych analitów.

P r z y k ł a d II. Przeprowadzono rozdział elektroforetyczny mieszaniny ośmiu cukrów. Fig. 3 przedstawia elektroferogram uzyskany w wyniku rozdziału tej mieszaniny w warunkach elektroforezy kapilarnej z zastosowaniem będącego przedmiotem wynalazku chronopotencjometrycznego sposobu detekcji. Rozdzielane cukry to, w kolejności rozdzielania przedstawionym na rysunku: 1 - rafinoza, 2 sacharoza, 3 - laktoza, 4 - galaktoza, 5 - glukoza, 6 - mannoza, 7 - fruktoza, 8 - ryboza, każdy o stężeniu 10^-4 M. Buforem wypełniającym kapilarę był 0,1 M NaOH, a objętość wprowadzanej próbki wynosiła 10 μL. Kapilara o średnicy wewnętrznej 25 um miała długość 50 cm, a napięcie rozdziału wynosiło 12 kV. Detekcyjna mikroelektroda złota polaryzowana była przemiennie w sposób ciągły prądem 8 nA i -8 nA, a czas pełnego cyklu anodowo-katodowego wynosił 300 ms.

P r z y k ł a d III.

Przeprowadzono eksperyment polegający na chronopotencjometrycznym pomiarze potencjału „offset na końcu kapilary o długości 70 cm i średnicy wewnętrznej 50 um podczas prowadzenia elektroforezy kapilarnej. Pomiędzy końce kapilary przykładane było napięcie 12 kV. Skanująca mikroelektroda platynowa o średnicy na jej końcu równym 5 μm polaryzowana była naprzemiennie na sposób chronopotencjometryczny prądem o natężeniu 70 nA i poruszała się w obszarze xy o wymiarach 300 x 300 μm na końcu kapilary w zmieniającej się co 2 μm odległości od tego końca. Na rysunku, fig. 4, przedstawiono rozkład potencjału „offset w odległości 10 μm od końca kapilary. Skanowanie sterowane było za pomocą wyposażonego w silnik mikropozycjonera z wykorzystaniem programu komputerowego napisanego specjalnie w tym celu. Rejestrowany potencjał odpowiadający potencjałowi „offset jest średnim potencjałem pomiędzy potencjałem anodowego wydzielania tlenu a potencjałem katodowego wydzielania wodoru.

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób detekcji elektrochemicznej w elektroforezie kapilarnej polegający na wykorzystaniu polaryzowanej mikroelektrody umieszczonej w pobliżu kapilary i następnie rejestrowaniu uzyskanych sygnałów, znamienny tym, że polega na współosiowym, optymalnym ustawieniu kapilary i mikroelektrody, po czym polaryzowaniu cyklicznym mikroelektrody stałym prądem o naprzemiennie zmieniającym znak z ujemnego na dodatni stałym natężeniu, a następnie pomiarze w cyklu katodowym lub anodowym średniej różnicy potencjałów pomiędzy potencjałami rejestrowanymi dla elektrolitu podstawowego - buforu, a potencjałami rejestrowanymi dla badanego analitu.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że współosiowe, optymalne ustawienie kapilary i mikroelektrody detekcyjnej przeprowadzane jest poprzez chronopotencjometryczny pomiar rozkładu potencjału „offset w polu elektrycznym wytworzonym na końcu kapilary podczas elektroforezy, a następnie ręcznym bądź automatycznym przesunięciu elektrody do punktu o najwyższym potencjale, który położony jest dokładnie naprzeciw środka kapilary.