PL205547B1 - Kompozycja adiuwantowa, kompozycja szczepionki, szczepionka oraz zastosowanie - Google Patents

Kompozycja adiuwantowa, kompozycja szczepionki, szczepionka oraz zastosowanie

Info

Publication number
PL205547B1
PL205547B1 PL384582A PL38458200A PL205547B1 PL 205547 B1 PL205547 B1 PL 205547B1 PL 384582 A PL384582 A PL 384582A PL 38458200 A PL38458200 A PL 38458200A PL 205547 B1 PL205547 B1 PL 205547B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
vaccine
antigen
cpg
adjuvant
virus
Prior art date
Application number
PL384582A
Other languages
English (en)
Inventor
Martin Friede
Nathalie Garcon
Philippe Hermand
Original Assignee
Smithkline Beecham Biolog
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/301,829 external-priority patent/US6558670B1/en
Application filed by Smithkline Beecham Biolog filed Critical Smithkline Beecham Biolog
Publication of PL205547B1 publication Critical patent/PL205547B1/pl

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005Vertebrate antigens
    • A61K39/0011Cancer antigens
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002Protozoa antigens
    • A61K39/015Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04Antibacterial agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00Antiparasitic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00Antiparasitic agents
    • A61P33/02Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02Immunomodulators
    • A61P37/04Immunostimulants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08Antiallergic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505Inorganic adjuvants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55555Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55561CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55566Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55577Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja adiuwantowa, kompozycja szczepionki, szczepionka oraz zastosowanie.
Niniejszy wynalazek dotyczy w ogólności nowych kompozycji adiuwantowych do zastosowania w szczepionkach. Ujawnione niniejszym kompozycje adiuwantowe zawierają kombinację saponiny i immunostymuluj ą cego oligonukleotydu sformuł owane z noś nikiem. Niniejszy wynalazek dostarcza również szczepionek zawierających takie kompozycje adiuwantowe i co najmniej jeden antygen. Ponadto dostarczone są zastosowania szczepionek jako leków. Rozwiązania według wynalazku umożliwiają leczenie osobników podatnych albo cierpiących na choroby przez pozajelitowe albo śluzówkowe podawanie szczepionek według wynalazku.
Immunostymulujące oligonukleotydy zawierające niemetylowane dinukleotydy CpG („CpG'') są znane w dziedzinie jako adiuwanty przy podawaniu zarówno drogami ogólnoustrojowymi, jak i śluzówkowymi (WO 96/02555, EP 468520, Davis i wsp., J. Immunol, 1998, 160(2):870-876; McCluskie i Davis, J. Immunol., 1998, 161(9):4463-6). CpG jest skrótem dla dinukleotydowego motywu cytozyna-guanozyna obecnego w DNA. Historycznie zaobserwowano, że frakcja BCG DNA może wykazywać efekt przeciwnowotworowy. W dalszych badaniach pokazano, że syntetyczne oligonukleotydy pochodzące z sekwencji genu BCG mają zdolność do indukowania efektu immunostymulatorowego (zarówno in vitro, jak i in vivo). Autorzy tych badań wyciągnęli wniosek, że niektóre sekwencje palindromiczne, włączając w to centralny motyw CG niosą tę aktywność. Centralna rola motywu CG w immunostymulacji została dalej wyjaśniona w publikacji Krieg, Nature 374, str. 546, 1995. Szczegółowa analiza pokazała, że motyw CG musi być w pewnym kontekście sekwencji i takie sekwencje są powszechne w bakteryjnym DNA, ale rzadkie w DNA kręgowców. Sekwencją o właściwościach immunostymulujących jest często: puryna, puryna, C, G, pirymidyna, pirymidyna; przy czym motyw dinukleotydu CG jest niemetylowany, ale wiadomo, że również inne niemetylowane sekwencje CpG są immunostymulatorami i mogą być stosowane w niniejszym wynalazku.
W pewnych kombinacjach sześ ciu nukleotydów wystę puje sekwencja palindromiczna. Kilka z tych motywów, bądź jako powtórzenia jednego motywu, bądź kombinacja różnych motywów, może być obecna w tym samym oligonukleotydzie. Obecność jednej albo większej liczby oligonukleotydów zawierających te sekwencje o właściwościach immunostymulujących może aktywować różne podzestawy immunologiczne, włączając w to komórki-naturalnych zabójców (tzw. komórki NK) (które wytwarzają interferon γ i mają aktywność cytolityczną) i makrofagi (Wooldrige i wsp., tom 89 (nr 8), 1977. Jednakże wykazano obecnie, że czynnikami immunostymulującymi są także inne sekwencje zawierające niemetylowane CpG, a niemające takiej zgodnej sekwencji.
Kiedy CpG wchodzi w skład szczepionek, podaje się go zazwyczaj w postaci wolnego roztworu razem z wolnym antygenem (WO 96/02555; McCluskie i Davis, jak wyżej) lub kowalencyjnie skoniugowany z antygenem (publikacja PCT nr WO 98/16247) albo formułowany z nośnikiem, takim jak wodorotlenek glinu ((powierzchniowy antygen wirusa zapalenia wątroby) Davis i wsp., jak wyżej; Brazolot-Millan i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8).
Saponiny są omówione w Lacaille-Dubois, M i Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine tom 2 str. 363-386). Saponiny są glikozydami steroidowymi albo triterpenowymi szeroko rozpowszechnionymi w królestwach roślin i morskich zwierząt. Saponiny w charakterystyczny sposób tworzą koloidalne roztwory w wodzie, które pienią się w czasie wytrząsania, oraz powodują wytrącanie cholesterolu. Kiedy saponiny znajdują się w pobliżu błon komórkowych, tworzą struktury typu porów w błonie, które powodują rozerwanie błon. Hemoliza erytrocytów stanowiąca przykład tego zjawiska, jest właściwością niektórych, ale nie wszystkich saponin.
Saponiny są znane jako adiuwanty w szczepionkach do podawania ogólnoustrojowego. Aktywność adiuwantowa i hemolityczna poszczególnych saponin była intensywnie badana w stanie techniki (Lacaille-Dubois i Wagner, jak wyżej). Przykładowo, Quil-A (pochodząca z kory południowoamerykańskiego drzewa Quillaja Saponaria Molina) i jego frakcje są opisane w US 5,057,540 oraz „Saponins as vaccine adjuvants Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (l-2):l-55; oraz EP 0362279 B1.
Struktury w postaci cząstek, nazwane kompleksami stymulującymi układ immunologiczny (ang. Immune Stimulating Complexes, ISCOM), zawierające frakcje Quil-A są hemolityczne i zostały zastoPL 205 547 B1 sowane do wytwarzania szczepionek (Morein, B., EP 0 109 942 B1). Istnieją doniesienia o aktywności adiuwantowej tych struktur (EP 0 109 942 B1; WO 96/11711).
Saponiny hemolityczne QS21 i QS17 (frakcje Quil-A oczyszczone przez HPLC) opisano jako silne adiuwanty ogólnoustrojowe, a sposób ich wytwarzania jest ujawniony w patentach USA nr 5,057,540 i EP 0 362 279 B1. W tych pozycjach literaturowych opisane jest również zastosowanie QS7 (niehemolityczna frakcja Quil-A), która działa jako silny adiuwant w szczepionkach ogólnoustrojowych. Zastosowanie QS21 jest dalej opisane w Kensil i wsp. (1991, J. Immunology tom 146, 431437). Znane są również kombinacje QS21 i polisorbatu albo cyklodekstryny (WO 99/10008). Cząstkowe systemy adiuwantowe zawierające frakcje Quil-A, takie jak QS21 i QS7 są opisane w WO 96/33739 i WO 96/11711.
Inne saponiny, które zostały zastosowane w badaniach nad szczepionkami ogólnoustrojowymi obejmują te pochodzące z innych gatunków roślin, takich jak Gypsophila i Saponaria (Bomford i wsp., Vaccine, 10(9):572-577, 1992).
Wiadomo, że saponiny stosowano również w badaniach nad szczepionkami stosowanymi przezśluzówkowo, które uwieńczone zostały w różnym stopniu sukcesem w indukowaniu odpowiedzi immunologicznej. Wykazano uprzednio, że saponina Quil-A nie ma wpływu na indukcję odpowiedzi immunologicznej, kiedy antygen jest podawany donosowo (Gizurarson i wsp., 1994. Vaccine Research 3, 23-29). Jednakże inni autorzy stosowali ten adiuwant z sukcesem (Maharaj i wsp., Can. J. Microbiol, 1986, 32 (5):414-20; Chavali i Campbell, Immunobiology, 174 (3):347-59). ISCOM zawierające saponinę Quil-A zastosowano w preparatach dojelitowych oraz donosowych szczepionki i wykazywały one aktywność adiuwantową (McI Mowat i wsp., 1991, Immunology, 72, 317-322; McI Mowat i Donachie, Immunology Today, 12, 383-385).
QS21, nietoksyczna frakcja Quil-A została również opisana jako adiuwant doustny albo donosowy (Sumino i wsp., J. Virol, 1998, 72 (6):4931-9; WO 98/56415).
Opisano zastosowanie innych saponin w badaniach nad szczepieniem donosowym. Przykładowo, saponiny Chenopodium quinoa zostały zastosowane zarówno w szczepionkach donosowych, jak i dojelitowych (Estrada i wsp., Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 1998, 21(3):225-36).
Niniejszy wynalazek dotyczy zaskakującego ujawnienia, że kombinacje immunostymulujących oligonukleotydów (CpG) i saponiny są wyjątkowo silnymi adiuwantami. Przedmiotem wynalazku jest zatem kompozycja adiuwantowa zawierająca saponinę, immunostymulujący oligonukleotyd obejmujący niemetylowany motyw CpG oraz dodatkowy adiuwant, którym jest monofosforylolipid A lub 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A. Saponina i oligonukleotyd w kompozycjach adiuwantowych działają synergistycznie przy indukowaniu przeciwciała swoistego wobec antygenu i mają zdolność indukowania odpowiedzi immunologicznych zwykle związanych z układem immunologicznym typu Th1. A zatem, kombinacja adiuwantowa według wynalazku jest odpowiednia nie tylko w immunoprofilaktyce chorób, ale również, ku zaskoczeniu, w immunoterapii chorób, takich jak utrzymujące się infekcje wirusowe, bakteryjne i pasożytnicze, a także chorób przewlekłych, takich jak nowotwory.
Korzystnie immunostymulujący oligonukleotyd w kompozycji adiuwantowej według wynalazku zawiera sekwencję puryna, puryna, C, G, pirymidyna, pirymidyna. Również korzystnie immunostymulujący oligonukleotyd w kompozycji według wynalazku zawiera co najmniej dwa niemetylowane powtórzenia CG oddzielone przez co najmniej 3 nukleotydy, a korzystniej co najmniej dwa niemetylowane powtórzenia CG oddzielone przez 6 nukleotydów.
Niniejszym opisane oligonukleotydy są typowo deoksynukleotydami, a nukleotydy rozdzielające w oligonukleotydzie to fosforoditionian, a korzystniej wi ą zanie fosforotionianowe, jakkolwiek wią zanie fosfodiestrowe i inne wiązania międzynukleotydowe są również możliwe, w tym również oligonukleotydy z mieszanymi wiązaniami międzynukleotydowymi. Sposoby wytwarzania oligonukleotydów fosforotionianowych albo fosforoditionianowych są opisane w US 5,666,153, US 5,278,302 i WO95/26204.
Korzystnie w kompozycji według wynalazku immunostymulujący oligonukleotyd jest wybrany z grupy obejmują cej:
OLIGO 1 (SEK NR ID: 1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)
OLIGO 2 (SEK NR ID: 2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)
OLIGO 3 (SEK NR ID: 3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
OLIGO 4 (SEK NR ID: 4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)
OLIGO 5 (SEK NR ID: 5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)
Możliwe jest też zastosowanie oligonukleotydów CpG zawierających powyższe sekwencje z mało znaczącymi delecjami albo addycjami. Oligonukleotydy CpG zastosowane w rozwiązaniach
PL 205 547 B1 według wynalazku można zsyntetyzować dowolną ze znanych w tej dziedzinie metod (np. EP 468520). Oligonukleotydy takie można zsyntetyzować przy zastosowaniu automatycznego syntetyzatora.
Oligonukleotydy są typowo deoksyrybonukleotydami. Wiązanie międzynukleotydowe w oligonukleotydzie jest wiązaniem fosforoditionianowym lub wiązaniem fosforotionianowym, jakkolwiek fosfodiestry również mogą znaleźć zastosowanie. Rozważane są również odmienne połączenia międzynukleotydowe, np. mieszane fosforotionianowe fosforodiestry. Można zastosować też inne wiązania międzynukleotydowe, które stabilizują oligonukleotyd.
Korzystnie saponiny stosowane w kompozycji adiuwantowej według wynalazku obejmują te pochodzące z kory Quillaja Saponaria Molina, nazywane Quil A oraz jego frakcje opisane w US 5,057,540 i „Saponins as vaccine adjuvants, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55; oraz EP 0362 279 B1. Korzystniej pochodną QuilA w kompozycji adiuwantowej jest QS21.
Innymi istotnymi frakcjami Quil A są QS7 iQS17.
β-escyna jest inną hemolityczną saponiną która może być stosowana w kompozycjach adiuwantowych. Escyna jest opisana w indeksie Mercka (wyd. 12: pozycja 3737) jako mieszanina saponin występująca w nasionach kasztanowca (łac. Aesculus hippocastanum). Opisano jej wydzielenie przez chromatografię oraz oczyszczanie (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4,213 (1953)) oraz przez zastosowanie żywic jonowymiennych (Erbring i wsp., US 3,238,190). Frakcje escyny, α i β, oczyszczono i pokazano, że są aktywne biologicznie (Yoshikawa M, i wsp. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 Sierpień; 44(8): 1454-1464). W języku angielskim β-escyna (β-escin) jest również znana pod nazwą „aescin.
Kolejną hemolityczną saponiną która może znaleźć zastosowanie w rozwiązaniach według wynalazku jest digitonina. Digitonina jest opisana w indeksie Mercka (wyd. 12: pozycja 3704) jako saponina pochodząca z nasion Digitalis purpurea i oczyszczana zgodnie z procedurą opisaną w Gisvold i wsp., J. Am. Pharm. Assoc, 1934, 23, 664; oraz Ruhenstroth-Bauer, Physiol.Chem., 1955, 301, 621. Opisano jej zastosowanie jako odczynnika chemicznego do oznaczania cholesterolu.
Korzystnie kompozycja adiuwantowa według wynalazku ponadto zawiera nośnik. Tak więc saponina lub CpG, albo obydwa mogą być w kompozycji adiuwantowej według wynalazku związane z nośnikiem w postaci cząstek w celu zwiększenia właściwości adiuwantowych kombinacji. W szczególności szczepionki ogólnoustrojowe mogą zawierać cząsteczkę nośnika. Korzystniej nośnik w kompozycji adiuwantowej według wynalazku jest nośnikiem w postaci cząstek wybranym z grupy obejmującej sole mineralne, emulsje, polimery, liposomy i ISCOM.
Jak opisano niniejszym CpG zastosowane w kombinacjach adiuwantowych mogą być w wolnym roztworze albo w kompleksie z nośnikiem w postaci cząstek, takim jak sole mineralne (na przykład, nieograniczająco, sole glinu albo wapnia), liposomy, ISCOM, emulsje (olej w wodzie, woda w oleju, woda w oleju w wodzie), polimery (na przykład, nieograniczająco, polikwas mlekowy, polikwas glikolowy, polifosfazyna, poliaminokwas, alginian, chitozan) albo mikrocząstki. W szczególności mogą być stosowane nośniki kationowe.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja szczepionki zawierająca kompozycję adiuwantowa według wynalazku i ponadto zawierająca antygen.
Antygen w opisanych niniejszym szczepionkach może być związany z kompleksem CpG-nośnik, albo może nie być związany z kompleksem CpG-nośnik. W tym przypadku, antygen może być wolną zawiesiną albo może być związany z odrębnym nośnikiem.
Antygen w kompozycji szczepionki według wynalazku pochodzi z organizmu wybranego z grupy obejmującej ludzkiego wirusa niedoboru odporności, wirusa ospy wietrznej i półpaśca, wirusa opryszczki zwykłej typu 1, wirusa opryszczki zwykłej typu 2, ludzkiego wirusa cytomegalii, wirusa dengi, wirusa zapalenia wątroby A, B, C lub E, syncytialnego wirusa oddechowego, ludzkiego papillomawirusa, wirusa grypy, Hib, wirusa wywołującego zapalenie opon, Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Bordetella, Streptococcus, Mycoplasma, Mycobacteria, Haemophilus, zarodźca lub toksoplazmy; antygen stanowi dekapeptyd Stanworth'a, albo antygeny związane z nowotworem (TAA), MAGE, BAGE, GAGE, MUC-1, Her-2-neu, CEA, PSA, KSA lub PRAME, albo własny hormon peptydowy, GnRH. Korzystnie w kompozycji szczepionki według wynalazku antygen ten pochodzi z grupy obejmującej (a) antygeny związane z nowotworem, PSMA, PSCA, tyrozynazę, surwiwinę, NY-ESOl, prostazę, PS108, RAGE, LAGE, HAGE; albo (b) N-końcowy 39-43 aminokwasowy fragment (Ae) prekursorowego białka amyloidowego; albo (c) antygeny związane z miażdżycą tętnic.
Saponiny w opisanych niniejszym kompozycjach mogą być wyodrębnione w postaci miceli albo mogą być w postaci dużych uporządkowanych struktur, takich jak ISCOM (EP 0 109 942 B1) albo
PL 205 547 B1 liposomy (WO 96/33739), kiedy zostaną zmieszane z cholesterolem i lipidem, albo w postaci emulsji olej w wodzie (WO 95/17210). Korzystne jest, jeżeli saponiny są związane z solami metali, takimi jak wodorotlenek glinu albo fosforan glinu (WO 98/15287). Alternatywnie saponina może być połączona z noś nikiem w postaci czą stek, takim jak chitozan. Saponina mo ż e być również w postaci suchej, takiej jak proszek. Korzystnie końcowe preparaty szczepionki w postaci, w której są one podawane na powierzchnię śluzówki, mają właściwości hemolityczne. Saponina może być albo nie być związana fizycznie z antygenem przez bezpośrednie wiązanie, bądź współoddziaływanie z tą samą cząsteczką nośnika będącego w postaci cząstek (GB 9822712.7; WO 98/16247). CpG i saponina w adiuwantach albo szczepionkach mogą występować oddzielnie albo w postaci asocjatów. Przykładowo, CpG i saponina mogą być w wolnej zawiesinie albo mogą być połączone za pośrednictwem nośnika, przykładowo nośnika w postaci cząstek, takiego jak wodorotlenek glinu albo przez kationowy liposom albo ISCOM.
Opisana niniejszym kombinacja adiuwantowa składa się z jednego lub większej liczby oligonukleotydów CpG zawierających co najmniej 3, korzystnie co najmniej 6 nukleotydów pomiędzy dwoma sąsiednimi motywami CG, łącznie z QS21 i nośnikiem w postaci cząstek wybranym z grupy obejmującej emulsję oleju w wodzie lub DQ. Kompozycja adiuwantowa może zawierać CpG 2006 (SEK NR ID: 4), lub CpG 1758 (SEK NR ID: 2) lub CpG 1826 (SEK Nr ID: 1) zmieszane z QS21 oraz nośnikiem w postaci czą stek wybranym z grupy obejmują cej emulsję oleju w wodzie lub DQ. A zatem szczepionki mogą zawierać taką kompozycję adiuwantową i antygen. Szczepionka podawana danemu osobnikowi drogą ogólnoustrojową jest przeznaczona do wytworzenia ogólnoustrojowych odpowiedzi immunologicznych.
Opisane niniejszym kombinacje adiuwantowe można zastosować zarówno jako adiuwanty ogólnoustrojowe, jak i śluzówkowe. Ogólnoustrojowa szczepionka może być podawana drogą ogólnoustrojową albo pozajelitową taką jak podawanie domięśniowe, doskórne, przezskórne, podskórne, dootrzewnowe i dożylne. Przykładem przezskórnej drogi podawania są plastry skórne.
Rozwiązania według wynalazku można stosować do ochrony albo leczenia ssaka podatnego albo cierpiącego na chorobę, przez podawanie szczepionki ogólnoustrojowej drogą domięśniową dootrzewnową doskórną przezskórną, dożylną lub podskórną. Sposoby podawania ogólnoustrojowego preparatów szczepionek mogą obejmować konwencjonalne strzykawki i igły albo urządzenia zaprojektowane do podawania balistycznego szczepionek stałych (WO 99/27961) albo urządzenia do bezigłowego wstrzykiwania płynu pod ciśnieniem (US 4,596,556; US 5,993,412) albo plastrów skórnych (WO 97/48440; WO 98/28037). Rozwiązania według wynalazku można również zastosować do wzmacniania immunogenności antygenów stosowanych na skórę (podawanie przezskórne albo przez naskórkowe WO 98/20734; WO 98/28037). Zatem niniejszym opisano urządzenia do dostarczania ogólnoustrojowego, wstępnie wypełnionych kompozycją szczepionki albo kompozycją adiuwantową według wynalazku. Zatem rozwiązania według wynalazku umożliwiają indukowanie odpowiedzi immunologicznej u osobnika przez podawanie osobnikowi szczepionki zawierającej antygen i immunostymulujący oligonukleotyd, saponinę oraz nośnik, przy czym szczepionka jest podawana drogą pozajelitową albo ogólnoustrojową. Niniejszym opisano sposoby indukowania odpowiedzi immunologicznej obejmujące podawanie szczepionki zawierającej oligonukleotyd o SEK NR ID: 1, 2, 3, 4, lub 5 z saponiną pochodzącą z Quil A, taką jak QS21, oraz nośnik taki, jak emulsja oleju w wodzie, liposom zawierający cholesterol albo alum.
Alternatywnie, rozwiązania według wynalazku można stosować do ochrony albo leczenia ssaka podatnego albo cierpiącego na chorobę, przez podawanie szczepionki drogą śluzówkową, taką jak droga doustna/pokarmowa albo donosowa. Alternatywnymi drogami śluzówkowymi są droga dopochwowa i doodbytnicza. Sluzówkową drogą podawania jest droga donosowa, nazywaną szczepieniem donosowym. Sposoby szczepienia donosowego są dobrze znane w dziedzinie, włączając w to podawanie szczepionki w kroplach, rozpylaczu albo w postaci suchego proszku do nosogardzieli osobnika, który ma być immunizowany. Kompozycje według wynalazku mogą być rozpylane albo formułowane w aerozolu, albo w postaci kompozycji dojelitowych, takich jak oporne na soki żołądkowe kapsułki i granulki do podawania doustnego, oraz czopków do podawania doodbytniczego albo dopochwowego.
Ujawnione niniejszym kombinacje adiuwantowe reprezentują klasę adiuwantów śluzówkowych odpowiednich do podawania ludziom w celu zastąpienia szczepienia ogólnoustrojowego przez szczepienie śluzówkowe. Tak więc czyste saponiny, takie jak Quil A i ich pochodne, włączając w to QS21, escynę, digitoninę lub saponiny z Gypsophila i Chenopodium quinoa w kombinacji z immunostymulu6
PL 205 547 B1 jącymi oligonukleotydami można zastosować jako adiuwanty do podawania śluzówkowego antygenów w celu uzyskania ogólnoustrojowej odpowiedzi immunologicznej.
Kombinacja adiuwantowa według wynalazku jest stosowana w kompozycjach szczepionek, przy czym szczepionki są podawane drogą ogólnoustrojową albo śluzówkową. Korzystne jest, jeżeli szczepionki stosowane do podawania kompozycji adiuwantowych drogą śluzówkową zawierają saponinę hemolityczną.
Korzystne jest, jeżeli kompozycja według wynalazku do podawania śluzówkowego zawiera saponinę hemolityczną. Hemolityczność saponiny albo preparatu saponiny w znaczeniu tego wynalazku ustala się na podstawie następującego testu.
1. Świeżą krew od świnki morskiej przepłukuje się trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) w wirówce stołowej. Po ponownym zawieszeniu w wyjściowej objętości krew rozcieńcza się 10-krotnie w PBS.
2. 50 μΐ zawiesiny krwi dodaje się do 800 μΐ PBS zawierającego dwukrotne rozcieńczenia związku powierzchniowo czynnego albo saponiny.
3. Po 8 godzinach hemolizę ocenia się wizualnie albo przez pomiar gęstości optycznej supernatantu. Obecność czerwonego supernatantu, który adsorbuje światło o długości 570 nm wskazuje na obecność hemolizy.
4. Wyniki wyraża się jako stężenie pierwszego rozcieńczenia saponiny, przy którym hemoliza już nie następuje.
Dla celów niniejszego wynalazku preparat adiuwantowy saponiny jest hemolityczny, jeżeli lizie poddawane są erytrocyty w stężeniu mniejszym niż 0,1%. Jako przykłady, zasadniczo czyste próbki QuilA, QS21, QS7, digitoniny oraz β-escyny wszystkie są hemolitycznymi saponinami jak zdefiniowano w tym teście. Uwzględniając nieodłączną zmienność eksperymentalną takiego testu biologicznego, saponiny według niniejszego wynalazku mają korzystnie aktywność hemolityczną wynoszącą w przybliżeniu pomiędzy 0,5-0,00001%, korzystniej pomiędzy 0,05-0,00001%, jeszcze korzystniej pomiędzy 0,005-0,00001%, a najkorzystniej pomiędzy 0,001-0,0004%. Idealnie, takie saponiny będą miały aktywność hemolityczną podobną (tj. w zakresie 10-krotnej różnicy) do aktywności hemolitycznej QS21.
Ujawnione niniejszym szczepionki można również podawać drogą doustną. W takich przypadkach farmaceutycznie dopuszczalna zaróbka może również obejmować bufory alkaliczne albo kapsułki lub mikrogranulki jelitowe. Szczepionki można również podawać drogą dopochwową. W takich przypadkach farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki mogą również obejmować emulgatory, polimery takie jak CARBOPOL® i inne znane stabilizatory kremów i czopków dopochwowych. Szczepionki można również podawać drogą doodbytniczą. W takich przypadkach farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki mogą również obejmować woski i polimery znane w tej dziedzinie do formowania czopków doodbytniczych.
Preparaty więcej niż jednej saponiny w kombinacjach adiuwantowych również zostały niniejszym ujawnione. Przykładem jest tu kombinacja co najmniej dwóch z następującej grupy obejmującej QS21, QS7, Quil A, β-escynę i digitoninę. Dodatkowo, kompozycje adiuwantowe mogą zawierać kombinację więcej niż jednego immunostymulującego oligonukleotydu.
Kombinacja CpG/saponina do podawania ogólnoustrojowego i śluzówkowego może być ponadto łączona z innymi adiuwantami obejmującymi monofosforylolipid A i jego nietoksyczną pochodną 3de-O-acylowany monofosforylolipid A. Alternatywne preparaty saponin można łączyć z nośnikami szczepionkowymi składającymi się z chitozanu lub innych polimerów polikationowych, cząstek polilaktydowych i kopolimeru polilaktydu i glikolidu, podłóż polimerowych z poli-N-acetyloglukozaminy, cząstek składających się z polisacharydów albo chemicznie modyfikowanych polisacharydów, liposomów i cząstek wytworzonych z lipidów, cząstek składających się z monoestrów glicerolowych itd. Saponiny można również przygotowywać w obecności cholesterolu w celu wytworzenia struktur cząstkowych, takich jak liposomy albo ISCOM. Ponadto, saponiny można preparować z eterem lub estrem polioksyetylenowym zarówno w roztworze niecząstkowym, jak i zawiesinie, albo strukturami w postaci cząstek, takimi jak liposomy paucilamelarne lub ISCOM. Ponadto saponiny można również preparować z zaróbkami, takimi jak Carbopol® w celu zwiększenia lepkości albo można wytwarzać jako suchy proszek z zaróbką w proszku, taką jak laktoza.
3-de-O-acylowany monofosforylolipid A jest dobrze znanym adiuwantem wytwarzanym przez Ribi Immunochem, Montana. Można go wytworzyć przy zastosowaniu metody przedstawionej w GB 2122204B. Korzystną postacią 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A jest postać emulsji o niewielkich rozmiarach cząstek i średnicach mniejszych niż 0,2 Lim (EP 0 689 454 B1). Szczególnie koPL 205 547 B1 rzystnymi adiuwantami są kombinacje 3D-MPL i QS21 (EP 0 671 948 B1), emulsje olej w wodzie zawierające 3D-MPL i QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414) lub 3D-MPL spreparowany z innymi nośnikami (EP 0 689 454 B1).
W ogólnoś ci preparaty szczepionki zawierają antygen albo kompozycję antygenową zdolną do wywoływania odpowiedzi immunologicznej przeciw ludzkiemu patogenowi, przy czym antygen albo kompozycja antygenowa pochodzi z HIV-1 (przykładowo tat, nef, gp120 lub gp160), wirusa ludzkiej opryszczki, przykładowo gD lub jego pochodne albo najwcześniejsze białko, takie jak ICP27 z HSV1 lub HSV2, wirusa cytomegalii (w szczególności ludzkiego) (przykładowo gB lub jego pochodne), rotawirusa (przykładowo żywe, osłabione wirusy), wirusa Epsteina-Barra (przykładowo gp350 lub jego pochodne), wirusa ospy wietrznej i półpaśca (przykładowo gp1, II i IE63) lub z wirusa zapalenia wątroby, takiego jak zapalenie wątroby B (przykładowo antygen powierzchniowy zapalenia wątroby B lub jego pochodne), z wirusa zapalenia wątroby A, wirusa zapalenia wątroby C i wirusa zapalenia wątroby E albo z innych patogenów wirusowych, takich jak paramyksowirusy: syncytialny wirus oskrzelowy (przykładowo białka F i G lub ich pochodne), wirus parainfluenzy, wirus odry, wirus świnki, ludzki papillomawirus (na przykład HPV6, 11, 16, 18,..), flawiwirusy (np. wirus żółtej febry, wirus dengi, wirus kleszczowego zapalenia mózgu, wirus japońskiego zapalenia mózgu) albo wirus grypy (cały żywy albo inaktywowany, podzielony wirus grypy, hodowany w jajach albo komórkach MDCK lub całe wirusomy grypy (jak opisano przez R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) albo jego oczyszczone lub zrekombinowane białka, takie jak białko HA, NP, NA lub M albo ich kombinacja), albo pochodzące z bakteryjnych patogenów takich jak Neisseria spp. włączając w to N. gonorrhea i N. meningitidis (na przykład polisacharydy kapsularne i ich koniugaty, białka wiążące transferynę, białka wiążące laktoferynę, PilC, adhezyny); S. pyogenes (na przykład białka M lub ich fragmenty, proteaza C5A, kwasy lipotejchojowe), S. agalactiae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp, włączając w to M. catarrhalis, znaną także jako Branhamella catarrhalis (na przykład adhezyny o wysokiej i niskiej masie cząsteczkowej i inwazyny); Bordetella spp, łącznie z B. pertussis (na przykład pertaktyna, toksyna krztuśca lub jej pochodne, filamentarna hemaglutynina, cyklaza adenylanowa, fimbrie), B. parapertussis i B. bronchiseptica: Mycobacterium spp., łącznie z M. tuberculosis (na przykład ESAT6, antygen 85A, -B lub -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, łącznie z L. pneumophila; Escherichia spp, łącznie z enterotoksyczną E. coli (na przykład czynniki kolonizacji, toksyna wrażliwa na wysoką temperaturę lub jej pochodne, toksyna stabilna w wysokiej temperaturze lub jej pochodne), E. coli wywołującą krwawienie przewodu pokarmowego, enteropatogenna E. coli (na przykład toksyna podobna do toksyny shiga lub jej pochodne); Vibrio spp, łącznie z V. cholera (na przykład toksyna cholery lub jej pochodne); Shigella spp, łącznie z S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp., łącznie z Y. enterocolitica (na przykład białko Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp., łącznie z C. jejuni (na przykład toksyny, adhezyny i inwazyny) i C. coli; Salmonella spp., włączając w to S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis, Listeria spp., łącznie z L. monocytogenes; Helicobacter spp., łącznie z H. pylori (na przykład ureaza, katalaza toksyna wakuolizująca); Pseudomonas spp., łącznie z P. aeruginosa; Staphylococcus spp., łącznie z S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., łącznie z E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., łącznie z C. tetani (na przykład toksyna tężca i jej pochodne), C. botulinum (na przykład toksyna jadu kiełbasianego i jej pochodne), C. difficile (na przykład toksyny klostridium A lub B i ich pochodne); Bacillus spp., łącznie z B. anthracis (na przykład jadu kiełbasianego i jego pochodne); Corynebacterium spp., łącznie z C. diphtheriae (na przykład toksyna błonnicy i jej pochodne); Borrelia spp., łącznie z B. burgdorferi (na przykład OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (na przykład OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (na przykład OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (na przykład OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., łącznie z E. equi oraz czynnik ludzkiej granulocytarnej ehrlichiozy; Rickettsia spp, łącznie z R. rickettsii; Chlamydia spp., łącznie z C. trachomatis (na przykład MOMP, białka wiążące heparynę), C. pneumoniae (na przykład MOMP, białka wiążące heparynę), C. psittaci; Leptospira spp., łącznie z L. interrogans, Treponema spp., łącznie z T. pallidum (na przykład rzadkie biała błony zewnętrznej); T. denticola, T. hyodysenteriae; albo pochodzące z pasożytów, takich jak Plasmodium spp., łącznie z P. falciparum; Toxoplasma spp., łącznie z T. gondii (na przykład SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., łącznie z E. histolytica; Babesia spp., włączając w to B. microti; Trypanosoma spp., łącznie z T. cruzi; Giardia spp., łącznie z G. lamblia; Leshmania spp., łącznie z L. major; Pneumocystis spp., łącznie z P. carinii; Trichomonas spp., łącznie z T. vaginalis; Schisostoma spp., łącznie z S. mansoni albo pochodzące z drożdży, takich jak Candida spp., łącznie z C. albicans; Cryptococcus spp., łącznie z C. neoformans.
PL 205 547 B1
Innymi korzystnymi swoistymi antygenami dla M. tuberculosis są na przykład Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 i hTCCl (WO 99/51748). Białka dla M. tuberculosis obejmują również białka fuzyjne i ich warianty, przy czym co najmniej dwa, korzystnie trzy polipeptydy M. tuberculosis są połączone w większe białko. Korzystne fuzje obejmują Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSLmTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748).
Najkorzystniejsze antygeny dla Chlamydia obejmują na przykład białko o wysokiej masie cząsteczkowej (ang. High Molecular Weight Protein, HWMP) (WO 99/17741), ORF3 (EP 366 412) i przypuszczalne białka błonowe (ang. putative membrane proteins, Pmps). Inne antygeny Chlamydia do preparatów szczepionki można wybrać z grupy opisanej w WO 99/28475.
Korzystne szczepionki bakteryjne zawierają antygen pochodzący ze Streptococcus spp., łącznie z S. pneumoniae (na przykład polisacharydy kapsularne i ich koniugaty, PsaA, PspA, streptolizyna, białka wiążące cholinę) oraz antygen białkowy pneumolizynę (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins i wsp., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342) oraz ich zmutowane detoksyfikowane pochodne (WO 90/06951; WO 99/03884). Inne korzystne szczepionki bakteryjne zawierają antygeny pochodzące z Haemophilus spp., łącznie z H. influenzae typ B (na przykład PRP i jego koniugaty), nie podlegającą typowaniu H. influenzae, na przykład OMP26, adhezyny o wysokiej masie cząsteczkowej, P5, P6, białko D i lipoproteina D oraz fimbryna i peptydy pochodzące z fimbryny (US 5,843,464) lub ich wielo-kopiowe warianty albo ich białka fuzyjne.
Pochodne powierzchniowego antygenu zapalenia wątroby B są dobrze znane w dziedzinie i obejmuj ą mię dzy innymi, antygeny PreS1, PreS2 S opisane w europejskich zgł oszeniach patentowych EP-A-414 374; EP-A-0304 578 i EP 198-474. W jednym z korzystnych aspektów kompozycja szczepionki zawiera antygen HIV-1, gp120, szczególnie, kiedy jest wyrażany w komórkach CHO. Preparat szczepionki może też zawierać gD2t jak zdefiniowano powyżej.
W skład szczepionki zawierającej adiuwant moż e wchodzić antygen pochodzący z ludzkiego papillomawirusa (ang. Human Papilloma Virus, HPV) uważanego za odpowiedzialny za kłykciny genitalne (HpV 6 lub HPV 11 i inne) oraz wirusy HPV odpowiedzialne za raka szyjki macicy (HPV 16, HPV 18 i inne).
Szczególnie korzystne postacie profilaktycznych albo leczniczych szczepionek przeciw kłykcinom genitalnym zawierają cząstki L1 lub kapsomery i białka fuzyjne zawierające jeden albo większą liczbę antygenów wybranych spośród białek HPV 6 i HPV 11: E6, E7,L1 i L2.
Najkorzystniejszymi białkami fuzyjnymi są: L2E7 jak ujawniono w WO 96/26277 i białko D(1/3)-E7 ujawnione w GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285).
W przypadku korzystnej profilaktycznej albo leczniczej szczepionki przeciw infekcjom lub nowotworowi szyjki macicy kompozycja może zawierać antygeny HPV 16 i 18. Przykładowo, antygenowe monomery, L1 lub L2, albo antygeny L1 lub L2 prezentowane razem jako cząstka wirusopodobna (ang. virus like particie, VLP) albo samo białko L1 prezentowane samodzielnie w VLP lub strukturze kapsomeru. Takie antygeny, cząsteczki wirusopodobne i kapsomery jako takie są znane. Patrz na przykład WO94/00152, WO94/20137, WO94/05792 i WO93/02184.
Dodatkowe wczesne białka mogą być zawarte w kompozycjach same albo jako białka fuzyjne, takie jak na przykład E7, E2 lub korzystnie E5; szczególnie korzystne postacie tego wykonania obejmują VLP zawierające fuzyjne białka L1E7 (WO 96/11272).
Szczególnie korzystne antygeny HPV 16 obejmują wczesne białka E6 lub E7 jako fuzje z nośnikiem - białkiem D - z wytworzeniem fuzji Białko D - E6 lub E7 z HPV 16, albo ich kombinacje; albo kombinacje E6 lub E7 z L2 (WO 96/26277).
Alternatywnie, wczesne białka E6 lub E7 z HPV 16 albo 18 mogą być prezentowane jako pojedyncza cząsteczka, korzystnie fuzja Białko D - E6/E7. Takie szczepionki zawierają ewentualnie jedno albo obydwa białka E6 i E7 z HPV 18, korzystnie w postaci białka fuzyjnego Białko D - E6 lub Białko D - E7 albo biał ka fuzyjnego Biał ko D E6/E7.
Szczepionka może dodatkowo zawierać antygeny z innych szczepów HPV, korzystnie ze szczepów HPV 31 lub 33.
Szczepionki mogą zawierać ponadto antygeny pochodzące z pasożytów, które wywołują malarię. Przykładowo, korzystne antygeny z Plasmodia falciparum obejmują RTS,S i TRAP. RTS jest hybrydowym białkiem zawierającym zasadniczo całą C-końcową cześć białka circumsporozoitu (CS) P. falciparum połączoną za pośrednictwem czterech aminokwasów części preS2 antygenu powierzchniowego zapalenia wątroby B z antygenem powierzchniowym wirusa zapalenia wątroby B (S). Jego
PL 205 547 B1 pełna struktura jest ujawniona w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT/EP92/02591, opublikowanym pod numerem WO 93/10152 zastrzegającym pierwszeństwo ze zgłoszenia patentowego UK Nr 9124390.7. Kiedy wyrażane w drożdżach, RTS jest wytwarzane jako cząstka lipoproteinowa, a kiedy wyraż ane jest wspólnie z antygenem S z HBV to wytwarzane jest jako czą stki mieszane znane jako RTS,S. Antygeny TRAP są opisane w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT/GB89/00895, opublikowanym jako WO 90/01496. Szczepionka przeciwko malarii może obejmować preparat antygenowy zawierający kombinację antygenów RTS,S i TRAP. Inne antygeny Plasmodium, które są dobrymi kandydatami na składniki szczepionki przeciwko malarii w różnych jej stadiach to MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, sekwestryna, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 z P. faciparum i ich analogi z Plasmodium spp.
Preparaty mogą również zawierać antygen przeciwnowotworowy i mogą być przydatne do immunoterapeutycznego traktowania nowotworów. Przykładowo, kompozycje adiuwantowe znajdują zastosowanie z antygenami odrzucania nowotworów, takich jak nowotwory prostaty, sutka, okrężnicy i odbytnicy, płuc, trzustki, nerki i czerniaka. Przykładowe antygeny obejmują antygeny MAGE 1 i MAGE 3 lub inne antygeny MAGE (do leczenia czerniaka), PRAME, BAGE lub GAGE (Robbins i Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, str. 628-636; Van den Eynde i wsp., International Journal of Clinical & Laboratory Research (wysłany do druku 1997);
Correale i wsp., (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, str. 293). Rzeczywiście, antygeny te są wyrażane w znacznej liczbie nowotworów, takich jak czerniak, rak płuc, mięsak i mię sak pę cherza. Inne antygeny swoiste wobec nowotworów, odpowiednie do użycia z kompozycją adiuwantową według wynalazku, obejmują między innymi swoiste wobec nowotworu gangliozydy, antygen swoisty wobec prostaty (PSA) lub Her-2/neu, KSA (GA733), PAP, mammaglobinę, MUC-1, antygen kanceroembrionalny (ang. carcinoembryonic antigen, CEA). Tak więc dostarczona szczepionka może zawierać kompozycję adiuwantową według wynalazku i antygen odrzucania nowotworu.
Szczepionki zawierające antygen nowotworowy są zaskakująco silne w terapii nowotworów, takich jak nowotwory prostaty, sutka, okrężnicy i odbytnicy, płuc, trzustki, nerek, jajników i czerniaka. Zatem preparaty mogą zawierać antygen związany z nowotworem, jak również antygeny związane z mechanizmami podtrzymującymi nowotwory (np. angiogenezą inwazją nowotworu). Dodatkowo, antygeny szczególnie odpowiednie do szczepionek w terapii nowotworu zawierają również antygen błonowy swoisty dla prostaty (ang. Prostate-specific membranę antigen, PSMA), antygen komórek macierzystych prostaty (ang. Prostate Stem Cell Antigen, PSCA), tyrozynazę, surwiwinę, NY-ESO1, prostazę, PS108 (WO 98/50567), RAGE, LAGE, HAGE. Dodatkowo, taki antygen może być własnym hormonem białkowym, takim jak pełnej długości hormon uwalniający gonadotropinę (ang. Gonadotrophin hormone releasing hormon, GnRH, WO 95/20600), krótki 10 aminokwasowy peptyd przydatny w leczeniu wielu nowotworów albo immunokastracji.
Przewiduje się, że kompozycje według niniejszego wynalazku będą używane do wytwarzania szczepionek zawierających antygeny pochodzące z Borrelia spp. Przykładowo, antygeny mogą obejmować kwas nukleinowy, antygen albo preparaty antygenowe pochodzące z patogenu, białka i peptydy wytwarzane przez rekombinowanie DNA oraz chimerowe białka fuzyjne. W szczególności antygenem jest OspA. OspA może być całym dojrzałym białkiem w postaci lipidowanej za pośrednictwem komórki gospodarza (E. coli), nazwanym Lipo-OspA, albo pochodną nielipidowaną. Takie nielipidowane pochodne obejmują nielipidowane białko fuzyjne NS1-OspA, które ma pierwsze 81 N-końcowych aminokwasów niestrukturalnego białka (NS1) wirusa grypy i kompletne białko OspA, a inne, MDP-OspA jest nielipidowaną postacią OspA zawierającą 3 dodatkowe N-końcowe aminokwasy.
Szczepionki według niniejszego wynalazku mogą być przydatne w profilaktyce albo terapii alergii. Takie szczepionki będą zawierały antygeny swoiste wobec alergenu (na przykład Der p1) i nieswoiste wobec alergenu (na przykład peptydy pochodzące z ludzkiej IgE, łącznie z, ale nie ograniczając się do dekapeptydu Stanworth (EP 0 477 231 B1)).
Szczepionki według niniejszego wynalazku mogą być również przydatne w profilaktyce lub terapii przewlekłych chorób, takich jak choroby alergiczne, nowotworowe i zakaźne. Takimi chorobami przewlekłymi są choroby takie, jak miażdżyca tętnic i choroba Alzheimera.
Antygenami do profilaktyki i leczenia pacjentów podatnych albo cierpiących na neurodegeneracyjną chorobę Alzheimera są w szczególności N-końcowy 39-43 aminokwasowy fragment (Αβ) pre10
PL 205 547 B1 kursorowego białka amyloidowego i mniejsze fragmenty. Antygen ten jest ujawniony w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 99/27944 - (Athena Neurosciences).
Ilość białka w każdej dawce szczepionki jest wybrana z ilości, która w typowych szczepionkach indukuje ochronną odpowiedź immunologiczną bez znaczących szkodliwych skutków ubocznych. Takie ilości będą różnić się zależnie od tego, który konkretny immunogen został użyty i jak jest on prezentowany. Ogólnie oczekuje się, że każda dawka będzie zawierała 1-1000 μg białka, korzystnie 1-500 μg, korzystniej 1-100 μg, najkorzystniej 1 do 50 μg. Optymalna ilość dla konkretnej szczepionki może zostać ustalona przez standardowe badania obejmujące obserwacje odpowiednich odpowiedzi immunologicznych w szczepionych osobnikach. Po wstępnym szczepieniu, osobnik może otrzymać jedną albo większą liczbę immunizacji przypominających w odpowiednich odstępach czasowych. Taka kompozycja szczepionki może być podawana na powierzchnię śluzówkową ssaka zarówno w przypadku pierwszego, jak i przypominającego szczepienia, albo alternatywnie może być podawana ogólnoustrojowo, na przykład drogą przezskórną podskórną albo domięśniową.
Ilość CpG albo immunostymulujących oligonukleotydów w kompozycji adiuwantowej albo kompozycji szczepionki według niniejszego wynalazku jest generalnie bardzo mała, ale w zależności od preparatu szczepionki może być w zakresie 1-1000 μg na dawkę, korzystnie 1-500 μg na dawkę, a korzystniej między 1-100 μg na dawkę.
Ilość saponiny do zastosowania w adiuwantach według niniejszego wynalazku może być w zakresie 1-1000 μg na dawkę, korzystnie 1-500 μg na dawkę, korzystniej 1-250 μg na dawkę, a najkorzystniej pomiędzy 1 a 100 μg na dawkę. Proporcja CpG:saponina (wag./wag.) będzie zatem w zakresie od 1:1000 do 1000:1, a typowo będzie w zakresie od 1:100 do 100:1, a korzystnie w zakresie 1:10 do 1:1 lub 1:1 do 10:1, a najkorzystniej 1:1,4:1 lub 10:1.
Kompozycje według wynalazku można stosować zarówno w celach profilaktycznych jak i leczniczych. Przedmiotem wynalazku jest zatem zastosowanie kombinacji QS21, 3D-MPL i immunostymulującego oligonukleotydu zawierającego niemetylowany motyw CpG do wytwarzania szczepionki do zapobiegania i leczenia zakażeń wirusowych, bakteryjnych i pasożytniczych, alergii, nowotworów lub innych chorób przewlekłych. Możliwe jest również stosowanie rozwiązań według wynalazku do leczenia innych chorób nieprzewlekłych. Niniejszym opisane zostały sposoby leczenia ssaka podatnego na albo cierpiącego na chorobę zakaźną albo nowotworową albo alergię albo chorobę autoimmunologiczną. W dalszym aspekcie niniejszego wynalazku dostarczona jest szczepionka do zastosowania jako lek. Wytwarzanie szczepionki jest generalnie opisane w New Trends and Developments in Vaccines, pod red. Voller i wsp., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA 1978.
Przewiduje się, że kompozycje według wynalazku będą stosowane do wytwarzania szczepionek zawierających antygeny pochodzące z rozmaitych źródeł. Przykładowo, antygeny mogą obejmować ludzki, bakteryjny, albo wirusowy kwas nukleinowy, antygen albo preparaty antygenowe pochodzące z patogenu, antygen albo preparaty antygenowe pochodzące z nowotworu, antygeny pochodzące z gospodarza, włączając w to peptydy pochodzące z IgE, takie jak dekapeptyd IgE uwalniający histaminę (znany jako dekapeptyd Stanworth), białka i peptydy wytwarzane przez rekombinowanie DNA oraz chimerowe białka fuzyjne.
Niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję szczepionki ogólnoustrojowej zawierającej antygen, saponinę i immunostymulujący oligonukleotyd. A zatem rozwiązania według wynalazku umożliwiają leczenie osobnika podatnego na albo cierpiącego na chorobę przez podawanie osobnikowi kompozycji zasadniczo tu opisanej drogą ogólnoustrojową. Możliwe jest również zapobieganie nabywaniu przez osobnika choroby wybranej z grupy obejmującej bakteryjne i wirusowe choroby zakaźne, choroby pasożytnicze, nowotwory prostaty, sutka, okrężnicy i odbytnicy, płuc, trzustki, nerek, jajników i czerniaka, nienowotworowe choroby przewlekłe, alergię, chorobę Alzheimera, miażdżycę tętnic, obejmujące podawanie osobnikowi kompozycji zasadniczo tu opisanej drogą ogólnoustrojową.
Alternatywnie, niniejszy wynalazek dostarcza dośluzówkowej kompozycji szczepionki zawierającej antygen i hemolityczną saponinę. A zatem rozwiązania według wynalazku umożliwiają leczenie osobnika podatnego albo cierpiącego na chorobę przez podawanie osobnikowi kompozycji zasadniczo tu opisanej na powierzchnię śluzówkową tego osobnika.
PL 205 547 B1
Niniejszym opisany jest sposób indukowania ogólnoustrojowej, swoistej wobec antygenu odpowiedzi immunologicznej u ssaka, obejmujący podawanie na powierzchnią śluzówkową tego osobnika kompozycji szczepionki zawierającej antygen i hemolityczną saponinę.
Kompozycja szczepionki według wynalazku jest wytwarzana przez zmieszanie saponiny i cząsteczki CpG z antygenem.
Przykłady odpowiednich farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek do zastosowania w rozwiązaniach według wynalazku obejmują wodę, buforowaną fosforanem sól fizjologiczną i buforowane roztwory izotoniczne.
Opis figur
Fig. 1: Miana IgG swoistych wobec OspA 14 dni po donosowym szczepieniu przypominającym.
Fig. 2: Miana LA2 swoistych wobec OspA 14 dni po donosowym szczepieniu przypominającym.
Fig. 3: Miana IgG swoistych wobec szczepu wirusa grypy w surowicy 14 dni po donosowym szczepieniu przypominającym.
Fig. 4: Miana HAI (hamowania hemaglutynacji) w surowicy swoistego wobec szczepu wirusa grypy 14 dni po donosowym szczepieniu przypominającym.
Fig. 5: Miana LA2 swoistych wobec OspA u myszy
Fig. 6: Aktywność komórek śledziony powodująca proliferację limfocytów swoista wobec gp120 u immunizowanych myszy. Aktywność swoista wobec antygenu wyrażono jako SI dla różnych stężeń antygenów we wszystkich 4 grupach eksperymentalnych.
Fig. 7: Aktywność CTL komórek śledziony swoista wobec HBsAg u immunizowanych myszy. Aktywność komórek efektorowych badano w teście wykorzystującym uwalnianie 51Cr w komórkach P815 (pokazane jako niewypełnione kółka) oraz w s-transfekowanych komórkach P815 (pokazane jako zaciemnione kółka).
Fig. 8: Odpowiedzi przeciwciał swoiste wobec HBsAg u immunizowanych myszy. Miana swoistych przeciwciał (wyrażone jako EU/ml) oraz profile izotypowe określono w testach ELISA. Wartości dla zlanych surowic pokazano w tabeli; rozkład izotypów przedstawiono również w postaci graficznej.
Fig. 9: Aktywność komórek śledziony powodująca proliferację limfocytów swoista wobec gp120 i HBsAg u immunizowanych myszy. Aktywność swoista wobec antygenów wyrażono jako SI dla różnych ich stężeń antygenu we wszystkich 4 grupach eksperymentalnych.
Fig. 10: Aktywność CTL komórek śledziony swoista wobec HBsAg i gp120 u immunizowanych myszy. Aktywność komórek efektorowych badano w teście wykorzystującym uwalnianie 51Cr w kontrolnych komórkach P815 (pokazane jako niewypełnione symbole) lub w komórkach P815 prezentujących epitopy dla HBsAg i gp120 (pokazane jako wypełnione symbole).
Fig. 11: Odpowiedzi przeciwciał swoiste wobec HBsAg i gpl20 u immunizowanych myszy. Miana swoistych przeciwciał (wyrażone jako μg/ml) (Fig. 11 A) oraz profile izotypowe określono w testach ELISA. Wartości dla zlanych surowic pokazano w tabeli; rozkład izotypów przedstawiono również w postaci graficznej. Fig 11B przedstawia wzór izotypowy przeciwciał swoistych dla gp120.
Fig. 12: Rozwój średniego wzrostu nowotworu w czasie w grupie 10 zwierząt.
Niniejszy wynalazek będzie zilustrowany nieograniczająco przez następujące przykłady.
P r z y k ł a d 1
Zastosowanie QS21 oraz CpG do donosowego szczepienia pobudzającego ogólnoustrojowe przeciwciała skierowane przeciw Lipo-OspA
W niniejszym przykładzie badano, czy lityczne saponiny, takie jak QS21, oraz czynniki immunostymulujące takie, jak CpG, są zdolne do wzmocnienia w sposób synergiczny ogólnoustrojowych odpowiedzi immunologiczych na donosowe szczepienie przypominające u myszy. Samice myszy Balb/c (po 5 zwierząt w grupie) w wieku 8 tygodni, immunizowano domięśniowo lipo-OspA (1 μg) przygotowanym w alumie (50 μg). Po 3 miesiącach myszy poddawano donosowemu szczepieniu przypominającemu (pod narkozą) 10 μl roztworu (po 5 μl na nozdrze, podawane kropelkowo pipetą), zawierającego 5 μg lipo-OspA w A: PBS; B: 20 μg CpG 1001 (TCC ATG AGC TTC CTG ACG TT, Krieg 1826); C: 5 μg QS21 (otrzymane z Cambridge Biotech, USA); D: 20 μg CpG 1001 + 5 μg QS21 lub E: domięśniowemu zastrzykowi 1 μg lipo-OspA zaadsorbowanemu na alumie (50 μg). Fig. 1 i Fig. 2 przedstawiają miana IgG swoistych wobec OspA oraz miana LA2 14 dni po donosowym szczepieniu przypominającym.
PL 205 547 B1
Sposoby
Test ELISA do pomiaru IgG swoistych wobec OspA w surowicy myszy
Płytki immunologiczne Maxisorp Nunc opłaszczono przez noc w 4°C, 50 μΐ na studzienkę, roztworu 1 μg/ml OspA rozcieńczonego w PBS (w rzędach od B do H płytki) lub 50 μl roztworu 5 μg/ml oczyszczonych kozich anty-mysich Ig (Boerhinger) w PBS (rząd A). Wolne miejsca tych płytek blokowano (1 godzina, 37°C) wykorzystując roztwór nasycający: PBS zawierający 1% BSA, 0,1% TWEEN 20 oraz 4% normalnej surowicy bydlęcej (NBS). Następnie, seryjne dwukrotne rozcieńczenia mieszaniny izotypowej IgG, rozcieńczonej w buforze nasycającym (50 μl na studzienkę), stosując je jako krzywą standardową (mieszanina mysich monoklonalnych przeciwciał IgG1, IgG2a i IgG2b z Sigma, począwszy od 200 ng/ml - rząd A) oraz próbki surowicy (począwszy od rozcieńczenia 1:100 - rzędy od B do H) inkubowano przez godzinę i 30 minut w 37°C. Następnie płytki przemywano (trzy razy) w roztworze do płukania (PBS, 0,1% TWEEN 20). Po czym inkubowano z biotynylowanymi kozimi przeciwciałami anty-mysimi IgG (Amersham), rozcieńczonymi 1:5000 w buforze nasycającym (50 μl na studzienkę) przez jedną godzinę i 30 minut w 37°C. Następnie po trzech płukaniach oraz dodaniu koniugatu streptawidyny z peroksydazą chrzanową (Amersham), płytki płukano pięciokrotnie i inkubowano przez 20 minut w temperaturze pokojowej z 50 gl na studzienkę buforu do wywoływania o składzie: OPDA 0,4 mg/ml (Sigma) i H2O2 0,03% w 50 mM pH 4,5 buforze cytrynianowym. Wywoływanie zatrzymywano przez dodanie 50 μl na studzienkę 2N H2SO4. Gęstość optyczną odczytywano przy 492 i 630 nm przy zastosowaniu immunoczytnika Biorad 3550. Miana przeciwciał obliczano metodą matematyczną z 4 parametrami, stosując oprogramowanie SoftMaxPro.
Test hamowania do pomiaru miana przeciwciał LA2-podobnych przeciw lipo-OspA w surowicy
Miana przeciwciał w szczepionkach badano pod kątem ich swoistości do przeciwciał LA2-podobnych. LA2 jest monoklonalnym mysim przeciwciałem, które rozpoznaje konformacyjny epitop OspA na powierzchni bakterii. Przeciwciało to ma zdolność do zabijania B. burgdorferi in vitro, jak również do ochrony myszy przed prowokowaniem laboratoryjnymi krętkami (Schaible UE i wsp. 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87:3768-3772). Dodatkowo, udowodniono, że monoklonalne przeciwciała LA2 korelują z bakteriobójczymi przeciwciałami, poza tym w badaniach ludzkich surowic wykazano korelacje pomiędzy mianami IgG anty OspA oraz mianami LA2 (w testach ELISA).
Płytki immunologiczne Maxisorp Nunc opłaszczano przez noc w 4°C 50 μl na studzienkę 0,5 μg/ml lipo OspA w PBS. Wolne miejsca płytek blokowano buforem nasycającym (100 gl/ studzienkę) przez 1 godzinę, w 37°C (bufor nasycający: PBS zawierający 1% BSA, 0,1% TWEEN 20 oraz 4% normalnej surowicy bydlęcej (NBS)). Następnie seryjne dwukrotne rozcieńczenia monoklonalnych przeciwciał LA2, począwszy od stężenia 4 gg/gl przygotowano w buforze nasycającym (50 gl na studzienkę), aby uzyskać krzywą standardową. Następnie dodano rozcieńczenia próbek surowicy ze szczepionych zwierząt (począwszy od rozcieńczenia 1:10) i inkubowano przez 2 godziny w 37°C. Po inkubacji płytki płukano trzykrotnie w PBS/TWEEN 20 (0,1%). Następnie do każdej studzienki dodano koniugat monoklonalnego przeciwciała LA2 z peroksydazą rozcieńczone (1:10000) w roztworze nasycającym (50 gl na studzienkę) i inkubowano przez godzinę w 37°C. Po pięciu płukaniach płytki inkubowano przez 20 minut w temperaturze pokojowej (w ciemności) z 50 gl na studzienkę buforu do wywoływania o składzie: OPDA 0,4 mg/ml (Sigma) i H2O2 0,03% w 50 mM bufor cytrynianowy pH 4,5. Wywoływanie zatrzymywano przez dodanie 50 gl na studzienkę 2N H2SO4. Gęstość optyczną odczytywano przy 492 i 630 nm przy zastosowaniu immunoczytnika Biorad 3550. Miana LA-podobnych monoklonalnych przeciwciał obliczano metodą matematyczną z 4 parametrami stosując oprogramowanie SoftMaxPro, porównując z krzywą standardową.
Wyniki
Zarówno CpG, jak i QS21 w znaczący sposób poprawiały doszczepianie w przypadku ogólnoustrojowych przeciwciał przeciw Lipo-IspA przy szczepieniu donosowym. Dodatkowo przy zastosowaniu obu adiuwantów obserwowano efekt synergiczny, w szczególności w przypadku odpowiedzi przeciwciał LA2. Odpowiedzi humoralne wywołane w obecności QS21 i CpG były znacząco wyższe niż te indukowane przez rodzicielskie szczepienie przypominające. Podsumowując, uzyskane wyniki pokazują możliwości donosowych mieszanin zawierających lityczną saponinę oraz czynnik immunostymulujący.
P r z y k ł a d 2
Synergiczna kombinacja QS21 i CpG, wspomagająca donosowe szczepienie pobudzające ogólnoustrojowe przeciwciała skierowane przeciwko wirusowi grypy
PL 205 547 B1
W niniejszym przykł adzie badano, czy hemolityczne saponiny, takie jak QS21, oraz czynniki immunostymulujące, takie jak CpG, są zdolne do wzmocnienia w sposób synergiczny (współdziałający) donosowego szczepienia przypominającego w przypadku ogólnoustrojowych przeciwciał u myszy traktowanych donosowo całym, nieaktywnym wirusem grypy.
Samice myszy Balb/c (po 10 zwierząt w grupie) w wieku 8 tygodni, immunizowano donosowo nieaktywnym (traktowanym β-propiolaktonem) wirusem grypy (A/Beijing/262/95; A/Johannesburg/33/94; B/Panama/45/90; 5 μg HA/szczep) w celu naśladowania naturalnego występowania u ludzi. Po 28 dniach myszy poddawano donosowemu szczepieniu przypominającemu (pod narkozą) 20 μl roztworu (po 10 μl na nozdrze, podawane kropelkowo pipetą) zawierającego 1,5 μg HA/nieaktywnego, całego wirusa grypy (te same szczepy, co w pierwotnych immunizacjach) w: A. PBS; B. 50 μg CpG (TCG TCG TTT TGT CGT TTT, GTC, GTT Krieg 2006); C. 4,5 μg QS21 (otrzymane z Cambridge Biotech, USA); D. 50 μg CpG 1001 + 4,5 μg QS21 lub E. oraz domięśniowy zastrzyk 1,5 μg HA/szczep nieaktywnego, rozdzielonego wirusa grypy (te same szczepy, co w immunizacjach pierwotnych). Antygeny grypy otrzymano z SSD GmBH (Drezno, Niemcy).
Fig. 3 i Fig. 4 przedstawiają miana IgG swoistych wobec szczepów wirusa grypy oraz miana HAI (hamowanie hemaglutynacji) 14 dni po donosowym szczepieniu przypominającym.
Sposoby
Test ELISA do pomiaru miana IgG skierowanych przeciw wirusowi grypy u myszy
Płytki immunologiczne Maxisorp Nunc opłaszczano przez noc w 4°C, 50 μl na studzienkę antygenem całego wirusa grypy (1 μg/ml) w PBS (w rzędach od B do H płytki) oraz 50 μl roztworu 5 μg/ml oczyszczonych kozich anty-mysich Ig (Boerhinger) w PBS (rząd A). Wolne miejsca tych płytek blokowano (1 godzina, 37°C) wykorzystując roztwór nasycający: PBS zawierający 1% BSA, 0,1% TWEEN 20 oraz 4% normalnej surowicy bydlęcej (NBS). Następnie, seryjne dwukrotne rozcieńczenia mieszaniny izotypowej IgG, rozcieńczone w buforze nasycającym (50 μl na studzienkę) - stosowane jako krzywa standardowa (mieszanina mysich monoklonalnych przeciwciał IgG1, IgG2a i IgG2b z Sigma, począwszy od 200 ng/ml - rząd A) oraz próbki surowicy (począwszy od rozcieńczenia 1:100 - rzędy od B do H) inkubowano przez godzinę i 30 minut w 37°C. Następnie płytki przemywano (trzy razy) w buforze do płukania (PBS, 0,1% TWEEN 20). Po czym inkubowano z biotynylowanymi kozimi przeciwciałami anty-mysimi IgG (Amersham) rozcieńczonymi 1:5000 w buforze nasycającym (50 μl na studzienkę) przez godzinę i 30 minut w 37°C. Następnie, po trzech płukaniach oraz dodaniu koniugatu streptawidyny z peroksydazą chrzanową (Amersham), płytki płukano pięciokrotnie i inkubowano przez 20 minut w temperaturze pokojowej z 50 μl na studzienkę buforu do wywoływania o składzie: OPDA 0,4 mg/ml (Sigma) i H2O2 0,03% w 50 mM buforze cytrynianowym pH 4,5. Wywoływanie zatrzymywano przez dodanie 50 μl na studzienkę 2N H2SO4. Gęstość optyczną odczytywano w 492 i 630 nm przy zastosowaniu immunoczytnika Biorad 3550. Miana przeciwciał obliczano metodą matematyczną z 4 parametrami stosując oprogramowanie SoftMaxPro. Całe wirusy grypy zastosowane do pokrycia płytek (szczep A/Beijing/262/95), nieaktywny - po traktowaniu β-propiolaktonem (BPL) otrzymano z SSD GmBH (Drezno, Niemcy).
Aktywność hamowania hemaglutynacji (HAI) przeciwciał przeciw wirusowi grypy w surowicy myszy
Surowicę (25 μθ początkowo traktowano w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut 100 μl buforu boranowego 0,5 M (pH 9) oraz 125 μl koalinu, zakupionej w Dade Behring. Po odwirowaniu (30 minut, 3000 RPM lub 860 g), 100 μl supernatantu (odpowiadającego 1:10 rozcieńczenia surowicy) pobrano i inkubowano przez 1 godzinę w 4°C w 0,5% czerwonych krwinkach kurczaka. Następnie, pobrano supernatant po uprzednim wirowaniu przez 10 minut przy 3200 RPM (970 g). Obie procedury stosowano w celu wyeliminowania naturalnych czynników hemaglutynujących zawartych w surowicach. Następnie, 25 μl tak traktowanych surowic rozcieńczano w 25 μl PBS (seryjne dwukrotne rozcieńczenia począwszy od 1:20) na 96-studzienkowych płytkach Greiner. W następnym etapie dodano cały wirus grypy zinaktywowany BPL (25 μl na studzienkę) w stężeniu 4 jednostki hemaglutynacji (tj. w rozcieńczeniu 4-krotnie niższym niż ostatnie wywołujące aglutynację czerwonych krwinek) i inkubowano wytrząsając przez 30 minut w RT. W kolejnym kroku, dodawano czerwone krwinki kurczęcia (25 μl na studzienkę) i inkubowano godzinę w temperaturze pokojowej. Ostatecznie, płytki przed odczytaniem trzymano przez noc w 4°C. Miano HAI odpowiadało ostatniemu rozcieńczeniu surowicy, które hamowało indukowaną przez wirus hemaglutynację.
PL 205 547 B1
Wyniki
Zarówno CpG, jak i QS21 nie poprawiały przypominania w przypadku IgG oraz przeciwciał HAI przeciw szczepom grypy przy szczepieniu donosowym. Jednakże, przy zastosowaniu obu adiuwantów obserwowano efekt synergiczny, wywołujący powyższe odpowiedzi przeciwciał. Odpowiedzi HAI wywołane w obecności QS21 i CpG były podobne do tych indukowanych przez rodzicielskie szczepienie. Podsumowując, uzyskane wyniki pokazują możliwości donosowych mieszanin zawierających lityczną saponinę oraz czynnik immunostymulujący. Pokazują one również, że różne sekwencje CpG mogą być wydajne w tym zastosowaniu (Krieg 2006 w niniejszym przykładzie oraz Krieg 1826 w przykładach 3 i 5).
P r z y k ł a d 3
Synergiczna kombinacja β-escyny i CpG do wzmacniania donosowego szczepienia pobudzającego ogólnoustrojowe przeciwciała przeciw Lipo-OspA
W niniejszym przykładzie zbadano, czy współdziałanie podobne do zaobserwowanego pomiędzy QS21 i CpG może zachodzić z innymi saponinami hemolitycznymi (patrz przykład) takimi jak β-escyna. Badane są również niehemolityczne saponiny, takie jak kwas glicyryzynowy.
Samice myszy Balb/c (po 6 zwierząt w grupie) w wieku 8 tygodni, immunizowano domięśniowo lipo-OspA (1 Lg) przygotowanym w alumie (50 Lg). Po 3 miesiącach myszy poddawano donosowemu szczepieniu przypominającemu (pod narkozą) 10 l1 roztworu (po 5 l1 na nozdrze, podawane kropelkowo pipetą) zawierającego 5 Lg lipo-OspA w: A. PBS; B. 50 Lg CpG 1001 (TCC ATG AGC TTC CTG ACG TT, Krieg 1826); C. 5 Lg β-escyny (otrzymane z Sigma); D. 50 Lg CpG 1001 + 5 Lg β-escyny; E. 5 Lg kwasu glicyryzynowego (zakupione z Sigma); F. 50 Lg CpG 1001 + 5 Lg kwasu glicyryzynowego i G. domięśniowemu zastrzykowi 1 Lg lipo-OspA zaadsorbowanemu na alumie (50 Lg). Fig. 5 przedstawia miana LA2 swoistych wobec OspA w 14 dni po donosowym szczepieniu przypominającym.
Sposoby
W niniejszym przykładzie stosowano sposoby takie same, jak w przykładzie 1.
Wyniki β-Escyna i CpG działają synergicznie przy wzmacnianiu donosowego szczepienia przypominającego w przypadku ogólnoustrojowych przeciwciał LA2. Odpowiedzi przeciwciał wywołane w obecności βescyny i CpG są znacząco wyższe niż te indukowane przez rodzicielskie szczepienie przypominające. Jednocześnie, nie zaobserwowano współdziałania w przypadku kombinacji CpG i kwasu glicyryzynowego.
Powyższe wyniki, jak i przedstawione wcześniej w ramach patentu, pokazują zdolność CpG oraz różnych saponin hemolitycznych do wzmacniania odpowiedzi immunologicznych w sposób synergiczny.
P r z y k ł a d 4
Badanie immunogenności przy zastosowaniu P. falciparum RTS,S i HIV-1 gp120 przygotowanym z CpG i/lub DQS21
1. Plan eksperymentu
Przeprowadzono dwa badania immunogenności myszy w celu ustalenia potencjalnego addytywnego lub synergicznego efektu oligonukleotydów CpG i QS21. Grupy mysz immunizowano RTS,S oraz gp120, przygotowanymi z CpG lub QS21 oddzielnie lub w kombinacji. Wymienione adiuwanty badano również w obecności nośnika Al(OH)3 lub emulsji olej-woda (emulsja o/w).
Immunogenność powyższych kompozycji badano po dwóch immunizacjach pozajelitowych. Surowice analizowano pod kątem obecności przeciwciał swoistych wobec antygenu oraz pod kątem rozkładu izotypów przeciwciał. Komórek śledziony używano do określenia komórkowych odpowiedzi immunologicznych. Te komórki badano pod kątem obecności cytotoksycznych limfocytów T (CTL) i komórek limfoproliferacyjnych (proliferacja limfocytów).
T a b e l a 1. Grupy myszy w eksperymencie 1
Grupa Antygen Adiuwant
1 RTS,S/gp120 CpG/DQS21
2 RTS,S/gp120 DQS21
3 RTS,S/gp120 CpG/DQS21/Al(OH)3
4 RTS,S/gp120 CpG/Al(OH)3
PL 205 547 B1
T a b e l a 2 Grupy myszy w eksperymencie 2
Grupa Antygen Adiuwant
1 RTS,S/gp120 CpG
2 RTS,S/gp120 CpG/DQS21
3 RTS,S/gp120 CpG/QS21 /emulsja o/w
2. Przygotowanie próbek
2.1 Eksperyment 1
Proces przygotowywania próbek:
Próbki przygotowywano na 3 dni przed wstrzyknięciem. W razie konieczności RTS,S (10 μg) oraz gp120 (10 μg) adsorbowano na 100 μg Al(OH)3. W razie konieczności, dodawano MPL (5 pg) i inkubowano 30 minut przed dodaniem roztworu w postaci 10-krotnie stężonego PBS pH 7,4 i H2O, z wyjątkiem grup bez DQ, dla których roztworem był PO4, NaCl 10:150 pH 6,8. Po 30 minutach, w razie konieczności, mieszano QS21 (5 μg) z liposomami w stosunku wagowym QS21 :cholesterol wynoszącym 1:5 (zwanym DQ) i dodawano do przygotowanej próbki. 30 minut później, dla próbek zawierających oligonukleotyd, dodawano 100 μg CpG, a następnie po 30 minutach dodawano tiomersal do stężenia 50 μg/ml - środek konserwujący.
| Al(OH)3+RTSS+gp120-1h-MPL-30min-premix-30min-DQ-30min-CpG-30min-Thio |
Wszystkie inkubacje przeprowadzono w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
2.2. Eksperyment 2
Proces przygotowania próbek:
Próbki przygotowywano jednocześnie dla dwóch zastrzyków. Zastrzyki podawane jednej myszy miały objętość 100 pl. Do próbek dodawano tiomersal do stężenia 50 μg/ml -środek konserwujący.
Grupa 1: RTS,S (10 μg) i gp120 (10 μg) rozcieńczano w H2O i PBS pH 6,8, aby osiągnąć izotoniczność. Po 5 minutach próbkę adsorbowano na CpG 1856 (100 μg).
Grupa 2: RTS,S (10 μg) i gp120 (10 μg) rozcieńczano w H2O i PBS pH 7,4, aby osiągnąć izotoniczność. Po 30 minutach RTS,S i gp120 adsorbowano na DQ (5 μg). Następnie, po 30 minutach adsorpcji, próbkę adsorbowano na CpG 1856 (100 μg).
Grupa 3: RTS,S (10 μg) i gp120 (10 μg) rozcieńczano w H2O i PBS pH 6,8, aby osiągnąć izotoniczność. Po 5 minutach próbkę adsorbowano na emulsji o/w. Po 5 minutach adsorpcji próbkę adsorbowano na QS21 (5 μg) przed dodaniem CpG (100 μg).
3. Sposoby immunologiczne myszy (pokolenie F1 krzyżówki Balb/C x C57B1/6) w grupie otrzymało w tyle łapy po 2 zastrzyki (2 x 50 μθ w odstępach dwu tygodniowych. Po dwóch tygodniach pobrano próbki surowicy w celu określenia odpowiedzi przeciwciał, pobrano również komórki śledziony w celu określenia immunologicznej odpowiedzi komórkowej.
W celu przeprowadzenia analizy proliferacji limocytów, komórki wysiano w 4-krotnych powtórzeniach w 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania ze studzienkami o okrągłych dnach w zagęszczeniu 2x106/ml. Komórki hodowano przez 72 lub 96 godzin w pożywce RPMI1640, uzupełnionej antybiotykami, glutaminą oraz 1% (obj./obj.) zwykłą surowicą mysią w obecności różnych stężeń RTS,S lub antygenu gp120. Komórki kontrolne hodowano bez antygenu.
3
Następnie, komórkom podano przez noc 1 μCi/studzienkę [ H]-tymidynę, zebrano je i obliczono włączenie radioaktywności odpowiednim licznikiem. Wyniki przedstawiono jako średnią zliczeń na minutę (cpm).
W celu przeprowadzenia analizy CTL, komórki hodowano przez 7 dni na 6-studzienkowych płytkach, w obecności 10 pg/pl sztucznego peptydu pCMI003 (IPQSLDSWWTSL), który odpowiadał epitopowi HbsAg CTL (Schirmbeck i wsp., 1995), lub peptydu pCMI007 (GIHIGPGRAFYAARK), odpowiadającemu epitopowi gp120 CTL (Casement i wsp., 1995). Po hodowli, komórki efektorowe badano (w dwóch powtórzeniach) pod kątem aktywności cytolitycznej, swoistej dla HBsAg, w standardowym teście wykorzystującym uwalnianie [51Cr], wykorzystując komórki kontrolne i S-transfekowane komórki P815. Cytotoksyczność swoistą wobec gp120 mierzono wykorzystując komórki docelowe P815, nie traktowane oraz traktowane przez jedną godzinę peptydem pCMI007. Minimalne i maksymalne uwalnianie określano odpowiednio dla komórek docelowych bez komórek efektorowych oraz przez dodanie 3% (obj./obj.) Triton X-100. Wyniki przedstawiono jako % uwolnionego [51Cr] (cpm dla
PL 205 547 B1 hodowli - cpm uwalniania spontanicznego / cpm uwalniania maksymalnego - cpm uwalniania spontanicznego).
Miareczkowanie oraz określanie izotypów zlanych surowic przeprowadzano w standardowym teście ELISA, wykorzystując płytki pokryte HBsAg. Surowice rozcieńczano w PBS/BSA począwszy od 1:400. Biotynylowane przeciwciała drugorzędowe swoiste Ig lub izotypów IgG1, IgG2a i IgG2b oraz koniugatu streptawidyny z peroksydazą chrzanową używano przy wykrywaniu związanych przeciwciał. Miana ELISA obliczano względem standardu, wykorzystując SoftmaxPro, i wyrażano w jednostkach ELISA (EU/ml). Miana przeciwciał swoistych wobec gp120 określano w standardowym teście ELISA, wykorzystując płytki pokryte białkiem gp120. Surowice rozcieńczano w PBS/TWEEN20/BSA począwszy od 1:100. Biotynylowane przeciwciała drugorzędowe swoiste wobec Ig lub izotypów IgG1, IgG2a i IgG2b oraz koniugatu streptawidyny z peroksydazą chrzanową używano przy wykrywaniu związanych przeciwciał. Miana obliczano odnosząc się do standardu mysich Ig i wyrażano jako μg/ml.
4. Wyniki
Eksperyment 1
Analiza odpowiedzi powodującej proliferację limfocytów nie wykazała znaczących różnic w reaktywności na RTS,S pomiędzy grupami. Jednakże, grupy 1 i 3, zawierające zarówno CpG jak i DQ21, wykazywały lepszą odpowiedź limfoproliferacyjną swoistą wobec gp120 w porównaniu z grupami, zawierającymi oddzielnie CpG i DQS21 (Fig. 6).
W opisywanym eksperymencie mierzono tylko CTL swoiste wobec HBsAg. Nie zaobserwowano znaczącej różnicy w indukcji CTL pomiędzy grupami 1 i 3, które otrzymały CpG i DQS21 w kombinacji, a grupami 2 i 4, immunizowanymi tylko jednym z dwóch adiuwantów, podczas gdy obecność Al(OH)3 obniżyła aktywność CTL zaobserwowanej w przypadku kombinacji CpG i DQS21 w grupie pierwszej (Fig. 7). Jednakże, zaobserwowano tendencję polegającą na tym, że CpG i DQS21 działało lepiej niż samo DQS21, oraz fakt, że kombinacja indukowała więcej CTL w obecności Al(OH)3, w porównaniu z samym CpG (Fig. 7).
Humoralną odpowiedź immunologiczną myszy badano tylko pod kątem obecności przeciwciał swoistych wobec HBsAg. Miana były takie same we wszystkich grupach, z wyjątkiem grupy trzeciej, gdzie zaobserwowano około 3-krotny wzrost, co świadczyło o tym, że w obecności Al(OH)3, kombinacja DQS21 i CpG jest bardziej immunogenna niż samo CpG (Fig. 8). Rozkład izotypów był taki sam dla grup 3 i 4 (zawierających Al(OH)3), podczas gdy przy braku Al(OH)3 kombinacja CpG i DQS21 powodowała lepszy wzór charakterystyczny dla izotypu TH1 niż samo DQS21 (Fig. 8).
Eksperyment 2
Odpowiedzi polegające na proliferacji limfocytów swoiste wobec RTS,S i gp120 były bardzo podobne w opisywanym eksperymencie. Wyniki pokazują, że dodanie DQS21 (zarówno same, jak i z emulsją o/w) powoduje wzmocnione odpowiedzi limfoproliferacyjnej na oba antygeny (Fig. 9).
Odpowiedzi CTL badano wykorzystując zarówno HBsAg, jak i gp120 peptydy epitopów CTL. W obu przypadkach wykryto odpowiedź CTL po immunizacji grupy 1 samym CpG (Fig. 10). Jednakże, dodanie DQS21 powodowało znaczny wzrost odpowiedzi CTL dla obu antygenów (Fig. 10). Obecność emulsji o/w neutralizowała pozytywny efekt DQS21 (gp120) lub zwiększała tło testu in vitro (HBsAg).
Odpowiedź przeciwciałowa na HBsAg i gp120 była wzmożona przez dodanie DQS21 do adiuwanta CpG (Fig. 11 A). Dodatkowy wzrost obserwowano po dodaniu emulsji o/w do badanej próbki (Fig. 11A). Dodanie DQS21 do CpG powodowało przesunięcie profili izotypu gp120 w stronę bardziej widocznego TH1 (Fig. 11B), podczas gdy wpływ na profile izotypu HBsAg był mniej widoczny w niniejszym eksperymencie.
5. Wnioski
Immunizacja RTS,S i gp120 przygotowanym z kombinacją CpG i DQS21 powodowała silną odpowiedź immunologiczną swoistą wobec antygenu. Kombinacja adiuwantów CpG i DQS21:
- wzmacnia odpowiedzi limfoproliferacyjne
- wzmacnia aktywność CTL
- podnosi miana przeciwciał i wzór izotypu TH1 w porównaniu z zastosowaniem pojedynczych związków.
P r z y k ł a d 5
Potencjał terapeutyczny CpG i/lub DQS21 w modelu nowotworu TC1
1. Plan eksperymentu
PL 205 547 B1 grupy po 10 myszy C57b1/6 w dniu 0 otrzymały podskórnie w bok 106 (200 μθ komórek TC1 (komórki nowotworowe wyrażające E7).
Następnie myszy szczepiono dwukrotnie, w dniu 14 i 21 po prowokacji nowotworem, 5 μg PD1/3E7 HPV16, przez zastrzyk w poduszkę łapy. Rozwój nowotworu mierzono indywidualnie dwa razy w tygodniu.
Grupy myszy:
1. Nie szczepione
2. PD1/3E7 + CpG(10 μg ODN 2006)
3. PD1/3E7 + DQS21 (0,5 pg)
4. PD1/3E7 + CpG + DQS21
Rozwój nowotworu mierzono indywidualnie dwa razy w tygodniu.
2. Przygotowanie próbek
Próbki przygotowywano w dniu szczepienia. Objętość zastrzyku dla jednej myszy wynosiła 100 pl. W razie konieczności, PD1/3E7 (5 pg) rozcieńczano w H2O i PBS pH 7,4, w celu osiągnięcia izotoniczności. Po 5 minutach, w razie konieczności, QS21 (0,5 pg) mieszano z liposomami w stosunku wagowym QS21:cholesterol wynoszącym 1:5 (zwane DQ) i dodawano do próbki. Po 30 minutach w przypadku próbek z oligonukleotydami dodawano 10 pg CpG (ODN 2006), a następnie po 30 minutach dodawano tiomersal do stężenia 1 pg/ml jako środek konserwujący.
H2Q + PBS pH7,4 + PD1/3E7 - 5min + DQ - 30min + CpG - 30min - Thio
3. Wyniki
Średni wzrost nowotworu w grupach złożonych z 10 zwierząt w czasie jest pokazany na Fig. 12. U 100% zwierząt, które prowokowano nowotworem (106 komórek TC1), nastąpił postępujący rozwój nowotworu.
70-80% nieszczepionych zwierząt lub zwierząt szczepionych białkiem E7 w DQS21 zdechło przed 35 dniem eksperymentu.
Podwójne szczepienie białkiem E7 z DQS21 prawie nie miało wpływu na rozwój nowotworu. Z drugiej strony, 2 szczepienia (IFP, w dniach 14 i 21) 5 pg ProtD 1/3 E7 HPV16 z adiuwantem CpG powodowały regresję nowotworów i chroniły przed śmiercią: 70-80% myszy pozostało przy życiu w 35 dniu. Kombinacja dwóch czynników immunostymulujących (CpG i DQS21) w niewielkim stopniu poprawiała efekt działania samego CpG.
PL 205 547 B1
<130> Β45181 <160> 5 <170> FastSEQ dla Windows wersja 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> ludzkie <400> 1 tccatgacgt tcctgacgtt <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> ludzkie <400> 2 tctcccagcg tgcgccat
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> ludzkie
<400> 3
accgatgacg tcgccggtga cagcaccacg
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> ludzkie
<400> 4
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> ludzkie
<400> 5
tccatgacgt tcctgatgct

Claims (15)

1. Kompozycja adiuwantowa, znamienna tym, że zawiera saponinę, immunostymulujący oligonukleotyd obejmujący niemetylowany motyw CpG oraz dodatkowy adiuwant, którym jest monofosforylolipid A lub 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A.
2. Kompozycja adiuwantowa według zastrz. 1, znamienna tym, że immunostymulujący oligonukleotyd zawiera sekwencję puryna, puryna, C, G, pirymidyna, pirymidyna.
3. Kompozycja adiuwantowa według zastrz. 1, znamienna tym, że immunostymulujący oligonukleotyd jest wybrany z grupy obejmującej: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (SEK NR ID: 1); TCT CCC AGC GTG CGC CAT (SEK NR ID: 2); ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG (SEK NR ID: 3); TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (SEK NR ID: 4); TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (SEK NR ID: 5).
4. Kompozycja adiuwantowa według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienna tym, że immunostymulujący oligonukleotyd zawiera co najmniej dwa niemetylowane powtórzenia CG oddzielone przez co najmniej 3 nukleotydy.
5. Kompozycja adiuwantowa według zastrz. 4, znamienna tym, że immunostymulujący oligonukleotyd zawiera co najmniej dwa niemetylowane powtórzenia CG oddzielone przez 6 nukleotydów.
6. Kompozycja adiuwantowa według zastrz. 1 do 5, znamienna tym, że saponina jest otrzymana z QuilA.
7. Kompozycja adiuwantowa według zastrz. 1 do 6, znamienna tym, że pochodną QuilA jest
QS21.
8. Kompozycja adiuwantowa według zastrz. 1 do 7, znamienna tym, że dodatkowym adiuwantem jest 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A.
9. Kompozycja adiuwantowa według zastrz. 1 do 8, znamienna tym, że ponadto zawiera nośnik.
10. Kompozycja adiuwantowa według zastrz. 9, znamienna tym, że nośnik jest nośnikiem w postaci cząstek wybranym z grupy obejmującej sole mineralne, emulsje, polimery, liposomy i ISCOM.
11. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że zawiera adiuwantową kompozycję określoną w zastrz. 1 do 10, a ponadto zawiera antygen.
12. Kompozycja szczepionki według zastrz. 11, znamienna tym, że antygen pochodzi z organizmu wybranego z grupy obejmującej ludzkiego wirusa niedoboru odporności, wirusa ospy wietrznej i półpaśca, wirusa opryszczki zwykłej typu 1, wirusa opryszczki zwykłej typu 2, ludzkiego wirusa cytomegalii, wirusa dengi, wirusa zapalenia wątroby A, B, C lub E, syncytialnego wirusa oddechowego, ludzkiego papillomawirusa, wirusa grypy, Hib, wirusa wywołującego zapalenie opon, Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Bordetella, Streptococcus, Mycoplasma, Mycobacteria, Haemophilus, zarodźca lub toksoplazmy; antygen stanowi dekapeptyd Stanworth'a, albo antygeny związane z nowotworem (TAA), MAGE, BAGE, GAGE, MUC-1, Her-2 neu, CEA, PSA, KSA lub PRAME, albo własny hormon peptydowy, GnRH.
13. Kompozycja szczepionki według zastrz. 11, znamienna tym, że antygen pochodzi z grupy obejmującej (a) antygeny związane z nowotworem, PSMA, PSCA, tyrozynazę, surwiwinę, NY-ESO1, prostazę, PS108, RAGE, LAGE, HAGE; albo (b) N-końcowy 39-43 aminokwasowy fragment (Ae) prekursorowego białka amyloidowego; albo (c) antygeny związane z miażdżycą tętnic.
14. Szczepionka według zastrz. 12 albo 13 do zastosowania jako lek.
15. Zastosowanie kombinacji QS21, 3D-MPL i immunostymulującego oligonukleotydu zawierającego niemetylowany motyw CpG do wytwarzania szczepionki do zapobiegania i leczenia zakażeń wirusowych, bakteryjnych i pasożytniczych, alergii, nowotworów lub innych chorób przewlekłych.
PL384582A 1999-04-19 2000-04-04 Kompozycja adiuwantowa, kompozycja szczepionki, szczepionka oraz zastosowanie PL205547B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9908885.8A GB9908885D0 (en) 1999-04-19 1999-04-19 Vccine
US09/301,829 US6558670B1 (en) 1999-04-19 1999-04-29 Vaccine adjuvants

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL205547B1 true PL205547B1 (pl) 2010-04-30

Family

ID=10851789

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL384582A PL205547B1 (pl) 1999-04-19 2000-04-04 Kompozycja adiuwantowa, kompozycja szczepionki, szczepionka oraz zastosowanie
PL384581A PL203894B1 (pl) 1999-04-19 2000-04-04 Kompozycja szczepionki i sposób jej wytwarzania, oraz zastosowanie

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL384581A PL203894B1 (pl) 1999-04-19 2000-04-04 Kompozycja szczepionki i sposób jej wytwarzania, oraz zastosowanie

Country Status (13)

Country Link
EP (2) EP1905449A3 (pl)
JP (1) JP5307859B2 (pl)
KR (1) KR20020067617A (pl)
CN (2) CN1911443A (pl)
AR (1) AR023536A1 (pl)
CO (1) CO5241279A1 (pl)
GB (1) GB9908885D0 (pl)
IL (2) IL145982A (pl)
MY (1) MY127452A (pl)
NO (1) NO20110994L (pl)
PL (2) PL205547B1 (pl)
SI (1) SI1187629T1 (pl)
ZA (1) ZA200108619B (pl)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112012022896A2 (pt) * 2010-03-18 2018-03-27 Novartis Ag vacinas adjuvantes para meningococos do sorogrupo b
WO2012038801A1 (en) 2010-09-21 2012-03-29 National Institute Of Immunology A spray dried powder formulation for vaccines entrapping alum and the antigen in biodegradable polymer particles
SG11201506727RA (en) * 2013-03-01 2015-09-29 Astex Pharmaceuticals Inc Drug combinations
EP3078381A1 (en) * 2015-04-10 2016-10-12 Warszawski Uniwersytet Medyczny Horse chestnut extract or escins for the treatment of alzheimer's disease
US11918646B2 (en) 2017-12-11 2024-03-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Dry adjuvanted immune stimulating compositions and use thereof for mucosal administration
CN114767844A (zh) * 2022-04-28 2022-07-22 泰州拜奥生物技术有限公司 一种水痘-带状疱疹病毒疫苗及其应用
CN116159134A (zh) * 2023-01-31 2023-05-26 四川大学 七叶皂苷和/或其盐化合物作为佐剂在疫苗中的应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4806350A (en) * 1986-04-18 1989-02-21 Norden Laboratories, Inc. Vaccine formulation
GB9326253D0 (en) * 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
UA56132C2 (uk) * 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
GB9513261D0 (en) * 1995-06-29 1995-09-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
EP0855184A1 (en) * 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
CA2281838A1 (en) * 1997-02-28 1998-09-03 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated cpg dinucleotide in the treatment of lps-associated disorders
WO1998056415A1 (en) * 1997-06-11 1998-12-17 Aquila Biopharmaceuticals, Inc. Purified saponins as oral adjuvants
GB9718901D0 (en) * 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
BR9907691B1 (pt) * 1998-02-05 2011-05-31 derivado de antìgeno e antìgeno da famìlia mage associado a tumor, seqüência de ácido nucléico, codificando os mesmos, seus usos na preparação de vacina, processo para produção de vacina e vacina.
IL139813A0 (en) * 1998-05-22 2002-02-10 Loeb Health Res Inst At The Ot Methods and products for inducing mucosal immunity
WO2000009159A1 (en) * 1998-08-10 2000-02-24 Aquila Biopharmaceuticals, Inc. Compositions of cpg and saponin adjuvants and methods thereof
GB9915204D0 (en) * 1999-06-29 1999-09-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
JP2003527352A (ja) * 2000-01-13 2003-09-16 アンティジェニクス インコーポレーテッド Cpgおよびサポニンの自然免疫刺激化合物、ならびにそれらの方法
CA2396871A1 (en) * 2000-01-20 2001-12-20 Ottawa Health Research Institute Immunostimulatory nucleic acids for inducing a th2 immune response

Also Published As

Publication number Publication date
CN1739800A (zh) 2006-03-01
MY127452A (en) 2006-12-29
GB9908885D0 (en) 1999-06-16
EP1541170A1 (en) 2005-06-15
PL203894B1 (pl) 2009-11-30
CN100542606C (zh) 2009-09-23
EP1905449A2 (en) 2008-04-02
NO20110994L (no) 2001-11-22
IL145982A (en) 2009-12-24
ZA200108619B (en) 2002-11-27
JP2011241222A (ja) 2011-12-01
CO5241279A1 (es) 2003-01-31
EP1905449A3 (en) 2009-03-25
CN1911443A (zh) 2007-02-14
KR20020067617A (ko) 2002-08-23
SI1187629T1 (en) 2005-04-30
AR023536A1 (es) 2002-09-04
JP5307859B2 (ja) 2013-10-02
IL189736A0 (en) 2008-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU764969B2 (en) Vaccines
US6558670B1 (en) Vaccine adjuvants
EP1432442B1 (en) The use of liposomes containing saponins and sterols in the manufacture of intradermal vaccines
US20040047869A1 (en) Adjuvant composition comprising an immunostimulatory oligonucleotide and a tocol
AU3419799A (en) Adjuvant compositions
JP5307859B2 (ja) ワクチン
MXPA01010654A (en) Vaccines
MXPA00009887A (en) Adjuvant compositions