PL204965B1 - Preparat mineralno-proteinowy do zapobiegania rozwojowi neuropatii u chorych na cukrzycę - Google Patents

Description

DZIEDZINA, KTÓREJ DOTYCZY WYNALAZEK

Wynalazek dotyczy preparatu składającego się z syntetycznego zeolitu i wybranych roślinnych białek (MPP), który zastosowano w zapobieganiu rozwoju neuropatii u osób cierpiących na cukrzycę. Prezentowany MPP zatrzymuje proces apoptozy spowodowany przez gromadzenie się jonów Ca ²⁺ w cytoplazmie komórek nerwowych.

WYNALAZEK

Techniczny problem, który został postawiony przed wynalazcą i rozwiązanie, które jest prezentowane w tym zgłoszeniu patentowym składa się z MPP, który zastosowano w zapobieganiu rozwoju neuropatii u osób cierpiących na cukrzycę, i charakteryzuje się następującymi cechami:

1) składa się z roślinnych białek

2) redukuje stężenie glukozy

3) umoż liwia zatrzymanie procesu gromadzenia się jonów Ca²⁺ w komórkach nerwowych

4) zatrzymuje proces apoptozy w komórkach nerwowych stymulowany przez gromadzenie się jonów Ca²⁺

5) nie zachodzi proces fagocytozy w ciałach apoptycznych

6) zatrzymuje proces wytwarzania immuglobulin we włóknach mielinowych nerwów

7) redukuje odkładanie się immuglobulin we włóknach nerwowych

8) redukuje niszczenie immunologiczne włókien nerwowych pośredniczone przez komplement

9) eliminuje ból spowodowany przez neuropatię cukrzycową

10) zawiera substancje eliminujące problemy sercowe

11) zawiera substancje eliminujące problemy trawienne

12) zawiera substancje eliminujące wolne rodniki tlenowe

13) zawiera dzienną dawkę kompleksu witaminy B

14) ma wyraźną zdolność wymiany jonowej

15) nie przechodzi przez kosmki jelitowe

16) ma wyraźną zdolność jonowej wymiany przez barierę jelitowo - naczyniową

17) jego cząstki mają rozmiar mikrona i submikrona

18) jest poddawany chemicznemu działaniu

19) redukuje stężenie jonów Na⁺

20) jest wzbogacony jonami Ca²⁺

21) dawka jest zredukowana w porównaniu z naturalnym zeolitem

22) nadaje się do doustnego podawania

23) nie zanotowano efektów szkodliwych, nie pojawiających się nawet przy dużej dziennej dawce i w przypadku dł ugotrwał ego uż ywania

24) nie jest toksyczny

STAN TECHNIKI

Cukrzyca jest zespołem chorobowym naruszającym metabolizm glukozy, który powstaje z powodu hiperglikemii odpowiedzialnej za większość objawów. Insulina jest faktycznie kluczem regulującym metabolizm węglowodanów, białek i tłuszczy, a względny lub całkowity niedobór insuliny daje efekt zaburzenia metabolizmu. Przypuszcza się, że zakłócenia biochemiczne są przede wszystkim determinowane przez niedobór insuliny. Cukrzyca Typu I, np. IDDM (cukrzyca insulinozależna) charakteryzuje się postępującym autoimmunologicznym procesem niszczenia β komórek wysp Langerhansa przez T limfocyty (Eisenbach, GS, New Engl. J. Med. 314:1360-1368, 1986). Dokładniej IDDM jest rezultatem niszczenia β komórek spowodowanym przez mediatory CD4+ i CD8+, a komórka prezentuje w ten sposób antygen (APC) (Frque F., Hadzija M., et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 91:3936-3940, 1994).

NOD myszy (nieotyłe cukrzycowe) wykazują klasyczny obraz cukrzycy, który jest całkowicie identyczny jak IDDM u ludzi (Makino S., et al., Expl. Anim. 29:1 (1980)). Ponadto chemicznie spowodowana cukrzyca przez Alloxan u myszy również wykazuje obraz cukrzycy z wszystkimi towarzyszącymi identycznymi objawami cukrzycy Typu I u ludzi (Dunn J.S., et al., Lancet II: 384-387, 1943).

Celem terapii cukrzycowej jest normalizacja następujących parametrów: stężenia glukozy we krwi, stężenia tłuszczy, braku glukozy i acetonu w moczu.

PL 204 965 B1

W terapii cukrzycowej zastosowano 2 metody leczenia: po pierwsze generalną a po drugie specjalne metody leczenia cukrzycy.

GENERALNE METODY LECZENIA CUKRZYCY

Przez leczenie cukrzycy dąży się do osiągnięcia stanu normoglikemii i w ten sposób do zapobiegania późniejszym powikłaniom. Ogólne zasady leczenia obejmują bez względu na typ cukrzycy: dietę, aktywność fizyczną edukację i samokontrolę. Pożywienie musi być w ten sposób skomponowane, że zaspokaja dzienne zapotrzebowanie na substancje odżywcze zależnie od wieku, płci, aktywności, wzrostu i wagi. Zaleca się, żeby dieta składała się z: 15 - 20% białek, 25 - 30% tłuszczy, 55 - 60% węglowodanów. Całkowita dzienna ilość substancji musi być podzielona na większą liczbę mniejszych posiłków (5 - 6 w ciągu dnia), aby nie było większych wahań w stężeniu glukozy we krwi. Aktywność fizyczna jest ważna, ponieważ wzrasta możliwość spalania glukozy w obwodowych komórkach mięśniowych z proporcjonalnie zmniejszonym zapotrzebowaniem insuliny. Edukacja i samokontrola są istotne dla zrozumienia rzeczywistych zakłóceń, i dla dziennej samokontroli stężenia glukozy we krwi.

SPECJALNE METODY LECZENIA CUKRZYCY

Leczenie zewnątrzpochodną insuliną stosuje się w przypadku cukrzycy Typu I, gdzie ponad 80% komórek β części endokrynnej trzustki jest uszkodzonych. Popularność tej metody jest duża, ponieważ przed odkryciem insuliny takie osoby umierały po 1,5 roku, a dziś żyją nawet do 50 lat od pojawienia się choroby. Doustne leki hypoglikemizujące nie stanowią zastępstwa dla insuliny, ale pobudzają wydzielanie endogennej insuliny i mogą wywołać hipoglikemię. Osoby z cukrzycą Typu II powinny przyjmować doustne leki hypoglikemizujące tylko w przypadku, jeśli prawidłowe żywienie i towarzysząca aktywność fizyczna nie dały pożądanego rezultatu. Transplantacja trzustki, wysp Lagerhansa, jest jedną ze specjalnych metod leczenia cukrzycy Typu I, ale wciąż są prowadzone badania nad tą metodą. Jednak sukces transplantacji zależy od ilości przeszczepionych wysp. Problemem jest izolacja komórek β, jak również immunologiczna reakcja odrzucenia, z powodu której muszą być stosowane różne leki immunosupresywnych.

EFEKTY METABOLICZNE INSULINY

Insulina jest białkiem o masie molekularnej 5734 Da. Składa się z łańcucha A i B, które są połączone dwoma mostkami dwusiarczkowymi, podczas gdy trzeci mostek dwusiarczkowy jest wewnątrz łańcucha A. Łańcuch A składa się z 21 aminokwasów, a łańcuch B - z 30 aminokwasów.

Insulina jest syntetyzowana przez komórki β wysp Lagerhansa trzustki. Podstawowa fizjologiczna funkcja insuliny polega na utrzymywaniu normoglikemii. Tak więc, insulina reguluje metabolizm węglowodanów, dlatego że po pierwsze hamuje wytwarzanie glukozy w wątrobie, a tak dzieje się jeśli stężenie insuliny w krążeniu równa się w przybliżeniu 30 mU/L, a po drugie stymuluje wnikanie glukozy do tkanek obwodowych (poprzez przyspieszenie translokacji transportera glukozy GLUT-4 na powierzchnię komórek mięśni szkieletowych i komórek tkanki tłuszczowej, oraz przez aktywację wewnątrzkomórkowych enzymów, takich jak np. syntetaza glikogenu). Tak dzieje się, jeśli stężenie insuliny w obiegu równa się w przybliżeniu 100 mU/L, co zazwyczaj ma miejsce po posiłku. Insulina jest także bardzo silnym inhibitorem lipolizy, i tym samym również ketogenezy. Antylipolityczny efekt insuliny ujawnia się już w momencie stężenia insuliny w przybliżeniu 10 mU/L. Insulina powstrzymuje również proteolizę, jeśli jej stężenie we krwi jest między 10-30 mU/L.

Następstwem związania się insuliny z zewnątrzbłonową regulatorową podjednostką α receptora jest autofosforylacja reszt tyrozynowych wewnątrzbłonowej podjednostki β. W następstwie autofosforylacji podjednostka β nabiera właściwości aktywnej kinazy tyrozynowej. Związanie insuliny z receptorem błonowym powoduje aktywację swoistej lipazy C hydrolizującej fosfatydyloinozytologlikan do diacyloglicerolu i fosfoinozytologlikanu. Diacyglicerol aktywuje kinazę białkową C, zmniejsza stężenie cAMP wewnątrz komórki. Fosfatydyloinozytologlikonian jako „drugi przekaźnik reguluje kaskady kolejnych fosforylacji w przekazywaniu sygnału z aktywnego receptora insulinowego na układy efektorowe komórki.

Podczas testowania cukrzycy Typu I insuliną wolna absorpcja insuliny z tkanki podskórnej podana powoduje nieodpowiednie stężenie glukozy w czasie i po posiłku z hiperglikemią między dwoma posiłkami (z powodu niskiego stężenia insuliny w układzie żyły wrotnej). Niedobór insuliny prowadzi do wzrastającego uwolnienia glukozy przez wątrobę i to jest przyczyną hiperglikemii w pustym żołądku, tzw. poposiłkowa hiperglikemia. Konsekwencją niskiego stężenia insuliny jest wzrost wydzielania glucagonu z α komórek wysp Langerhansa trzustki.

PL 204 965 B1

Oporność na insulinę jest często związana z pojawieniem się otyłości, nietolerancją glukozy, nadciśnieniem, dislipidemią zaburzeniami krzepliwości krwi i przyspieszoną miażdżycą i określane są także jako Syndrom X.

ROLA ROŚLINNYCH BIAŁEK W LECZENIU CUKRZYCY

Rezultaty ustalania ludzkiego genomu dokładnie publikują prace naukowe o roli małych molekuł oraz białek związanych z chorobą (Engl. Target).

Kompletne ustalenie ludzkiego genomu odsłoniło liczbę szkodliwych genów we wszystkich chromosomach. Te rezultaty wyznaczają i odsłaniają ilość celów określonych dla leków. W tym kontekście zaczęto nową strategię badań dla otrzymania nowego leku. Ta strategia po pierwsze obejmuje docelowe miejsca (w pierwszym rzędzie są to białka, ale również kwasy nukleinowe), a po drugie, ligand, np. małe molekuły białek jako substytuty do chorych miejsc docelowych.

Rośliny składają się z czterech głównych typów molekuł: węglowodanów, białek, kwasów nukleinowych oraz lipidów. Poza tym rośliny składają się z innych typów związków w małych ilościach, np.: alkaloidów, terpentoidów, fenoli, steroli inaczej nazywanych wtórnymi metabolitami.

Węglowodany w roślinach zawierają monomery zwane monosacharydami i polimery nazywane polisacharydami. Polisacharydy, które są zawarte w konstrukcji komórki rośliny są nazywane strukturalnymi polisacharydami. Najbardziej poznanym strukturalnym polisacharydem w roślinach jest celuloza (tworzy ona od 40 do 60% ściany komórki). Rezerwa polisacharydów służy jako zapas pożywienia, a najbardziej znaną w roś linach jest skrobia.

Po celulozie, białka stanowią największą część biomasy żyjącej komórki rośliny. Białka w komórkach rośliny składają się z 20 różnych aminokwasów budujących polipeptydy. Tak jak w przypadku węglowodanów, białka także pełnią ważną rolę w konstrukcji komórki (strukturalne białka), i służą one także jako rezerwa. W przeciwieństwie do węglowodanów, białka mogą być także enzymami. Strukturalne białka ściany komórkowej są nazywane białkami rozciągliwymi i pełnią ważną rolę w rozszerzalności podczas wzrostu rośliny. Białka rozciągliwe są białkami bogatymi w hydroksyproliny, serynę, treoninę, kwas asparaginowy. Komórki roślin składają się z różnego rodzaju membran - błon, każda ma odmienny układ białek. Np. wewnętrzna błona mitochondriów i chloroplastów składa się w około 75% z białek, podczas gdy błona, która otacza komórkę rośliny ma około 50% białek. Większość niebiałkowej części błony, która otacza komórkę rośliny składa się z lipidów. Zapasy białek w roślinach są często obecne w nasionach i służą one jako źródło wartości odżywczych podczas kiełkowania. Zawartość białek w nasionach zależy od gatunków roślin. Niektórymi zapasami białek w roślinach są: zeina, gliadyna, rycyna D, abryna etc. Wiele roślinnych białek pełni funkcję enzymów i katalizuje reakcje biochemiczne. Jednym z przykładów jest α-amylaza, enzym, który rozdrabnia amylozę.

ROŚLINNE PEPTYDY ORAZ AMINOKWASY

W 1981 roku Khanna et al opublikował wyniki badań o izolacji polipeptydów p z owocu i nasion rośliny Moomornica charantia L. (Cucurbitaceae). Polipeptydy p składają się z 17 różnych aminokwasów i mają molekularną masę 11000. Kiedy s.c. zastosowano u gryzoni, naczelnych i ludzi, odnotowano jego insulinomimetyczne efekty w dawce 0,5 jednostek/ kg (1,8 mg/ml = 40 jednostek).

Sulfotlenki aminokwasów: sulfotlenek s-methylocysteiny (SMCS) i sulfotlenek s-allycysteiny izolowane z roślin Allium cepa L. i Allium sativum L. spowodowały utratę masy ciała i zawartości glikogenu w wątrobie po miesiącu per oral aplikacji u szczura z eksperymentalnie wywołaną cukrzycą. (Sheela et al., 1995).

W 1998 Sauvaire et I., a w 1989 Broca et al. opisał in vivo efekt 4-hydroxyisoleucine jako nowego stymulatora wydzielania insuliny z nasion Trigonella foenum graecum L. 4-hydroxyisoleucine wspomaga glukuzę wywołaną wydzielaniem się insuliny w obu modelach izolowanych wysp Lagerhansa, także u ludzi. Ten stymulowany efekt w dawce od 100 μmola/L do 1 mol/L był zależny wyłącznie od stymulacji wydzielania insuliny przez glukozę, np. nie wykazywał aktywności przy niskim stężeniu glukozy (3 mmol/L) lub podstawowym stężeniu glukozy (5 mmol/L).

Owoc rośliny Blighia sapida Koenig (Sapindaceae) zawiera składniki wywołujące wymioty: hipoglicynę A I jej γ-L-glutamyl dipeptyd, hipoglicynę B, która wyznacza hipoglikemiczną aktywność. Działają one w ten sposób, że zahamowują utlenianie długich łańcuchów kwasów tłuszczowych. Hipoglicyna A jest dwukrotnie silniejszym hipoglikemicznym związkiem chemicznym niż hipoglicyna B, która również jest teratogenem, i dlatego zbyt toksycznym do terapeutycznego użycia (Tanaka et. Al., 1972; Oliver-Bever i Zahnd 1979).

PL 204 965 B1

ROZWÓJ NEUROPATII W CUKRZYCY

Neuropatia jest powszechnym powikłaniem cukrzycowym, które atakuje somatyczne i autonomiczne obwodowe nerwy. Neuropatia występuje w pewnym procencie w Typie I i Typie II cukrzycy (Greene, DA, et al., Diabetes Care. 15:1902-6, 1992). Anomalie w obwodowym nerwie ludzkim i zwierzęcym modelu cukrzycy są manifestowane jako spadek przewodnictwa nerwów, aksjonalna redukcja, oraz utrata włókien nerwowych (Behse, FF, et al., J. Neurol.Neurosurg.Psych.40:1072-82, 1977; Brismar, T. Metab.Clin.Exp. 32:112117,1983; Sima, AAF, et al., Ann.Neurol. 18:21-29, 1985)), w powiązaniu z metabolicznymi zmianami (Green, DA, et al., Diabetes 37:688-693, 1988), włączając zmienioną sygnalizację wapnia (Levy, J, et. Al., Am. J. Med. 96:260-273, 1994). Istniejące studia wskazują że zmieniona homeostaza jonów wapnia jest powszechnie występującym zjawiskiem w IDDM i NIDDM. W obu przypadkach: u ludzi cierpiących na cukrzycę oraz w zwierzęcych modelach cukrzycy, zaobserwowano identyczną zmianę, która jest wzrostem jonów Ca²⁺ w cytozolu (Hall, KE, et al., J. Physiol. 486:313-322, 1995; Nobe, S, et al., Cardiovas. Res. 24:381, 1994: White, RE, J. Pharmacol. Exp. Ther.253:1057-1067, 1993; Kapelle, AC, et al., Br. J. Pharmacol 111:887-893,1992). Wzrost stężenia jonów wapnia wspomaga proces naturalnej atrofii (apoptozy) komórek nerwowych, ale jednocześnie ten proces został przedstawiony w wielu innych eksperymentalnych modelach (Trump, BF, et al., FASEB J. 9:219-228, 1995; Down, D., Phosphoprotein Res. 30:255-280, 1995; Joseph, R, et al., Mol.Brain.Res. 17:70-76, 1993). Ostatnie badania wskazują że czynniki surowicy pełnią ważną rolę w patogenezie neuropatii cukrzycowej u pacjentów z Typem I cukrzycy. Poprzez inkubację komórek β wysp Langerhansa w warunkach ogólnej hodowli tkanki, kiedy surowicę pacjentów z Typem I lub Typem II cukrzycy dodano do medium (Hadzija. M. et al. Period. Bio 1.97:313-317, 1995), apoptoza w komórkach β wysp Langerhansa jest połączona ze wzrostem stężenia L-typu jonów wapnia (JunttiBerggren, L.Science 261: 86-89, 1993). Pokazano, że komórki neuroblastoma wykazywały zredukowany wzrost pod wpływem wzrastającego wnikania jonów Ca²⁺, poza tym nasiloną apoptozę, jeśli były wystawiane na działanie surowicy u pacjentów z cukrzycą Typu I i z neuropatią (Pittinger, GL, et al., Diabetic.Med. 10:925-932, 1993; Pittinger, GL, et al., Diabetic.Med. 12:380-386, 1995; Pitinger, GL, et al., J. Neuroimmunol. 76: 153-160, 1997; Migdalis, IN, et al., Diabetes. Res. Blin. Pract. 49:113-118, 2000). Komplement niezależny, Ca²⁺ - zależny wywołuje apoptozę komórek nerwowych, które wspomagają pojawienie się autoimmuglobulin w cukrzycy na włóknach nerwowych (Srinivasan, SM, J. Clin.Invest. 102:1454-1469,1998). Właściwości zeolitów takie jak możliwość wymiany jonowej, istnienie interkrystalicznych otworów, które dopuszczają poprzez molekuły różnorodne rozmiary, istnienie mocnych kwasotwórczych miejsc i miejsc aktywnych dla reakcji katalizowanych przez metale, etc. czyni je bardzo interesującymi dla szerokiego przemysłowego zastosowania, jak również dla podstawy do badań (Flanigen, E. M. in: Proc. Fifth. Int. Conf. Zeolites (Ed. L. V. C. Rees), Heyden, London Philadelphia - Rheine, 1980, p. 760; Vaughan, D. E. W., Chem. Eng. Prog., 25, 1988; Cornier, J. Popa, J.M., Gubelman, M., L'actualitee, 405, 1992; Subotić, B., Bronić, J., Cizmek, A.,Antonić, T., Kosanović, C, Kem. Ind. 43:475, 1994). Zainteresowanie używaniem zeolitów jako katalizatorów, adsorbentów i środków do zmiękczania wody w detergentach bardzo wzrosło w ostatnich trzech dekadach (Cornier, J., Popa J. M., Gubelman, M., L'acualite, 405). Rocznie miliony ton zeolitów używanych jest w produkcji środków piorących (Cornier, J., Popa J. M., Gubelman, M., L'actualite, 405), tysiące ton w procesach przetwarzania oleju i w przemyśle petrochemicznym (Naber, J. E., de Jong, K. P., Stork, W. H. J., Kuipers, H. P. C. E, Post M. F. M., Stud. Surf. Sci. Catal., 84C:2197, 1994), oraz wzrasta również stosowanie w innych dziedzinach ((Flanigen, E. N. in: Porc. Fifth. Int. Conf. Zeolites (Ed. L. V. C. Rees), Heyden, London-Philadelphia-Rheine, 1980, p.760; Waughan, D.E.W., Chem. Eng. Prog., 25, 1988: Cornier J., Popa, J. M., Gubelman, M., L'actualite, 405; Naber, J. E., de Jong, K. P., Stork, W. H. J., Kuipers, H. P. C. E, Post M. F. M., Stud. Surf. Sci. Catal., 84C:2197, 1994.;Breck. D.W. in: The properties and Application of Zeolites, Special Publication (Ed. R.P. Towsand), 33:391, 1980.; Vaughan, D.E.W. in: The properties and Application of Zeolites, Special Publication (Ed. R.P. Towsand), 33:294, 1980.; Flanigen, E.M. Pure Appl. Chem., 52:2191, 1980.), włączając zastosowanie zeolitów w medycynie, rolnictwie oraz hodowli bydła (Ramos, A.J., Hernandez, E., Animal Feed Sci.Technol., 65:197, 1997; Eriksson, H., Biotechnology Techniques, 12:329, 1998.; Mumpton, F.A.,J. Nat. Acad. Sci., 96:3463, 1999.).

Zeolity lub sito molekularne są uwodnionym naturalnym i syntetycznym glinokrzemianem składającym się z wyjątkowego przestrzennego układu struktury składającej się z SiO4 i AIO4 tetraedrów połączonych poprzez zwykłe atomy tlenu (Breck, D. W., J. Chem. Educ. 41:678,1964), jak jest to schematycznie pokazane na figurze 1.

PL 204 965 B1

Figura 1. Schematyczna prezentacja wzajemnych połączeń SiO4 oraz AIO4 tetraedrów w siatce krystalicznej zeolitu

Negatywna cecha struktury glinokrzemianu jest spowodowana przez izomorficzną zamianę krzemu z wartościowością cztery przez glin z wartościowością trzy neutralizowany przez uwodniony kation (Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺ etc). W rzeczywistości SiO4 i AIO4 nie tworzą jednowymiarowego łańcucha struktur w strukturze zeolitów, jak to przedstawiono w uproszczony sposób na figurze 1, ale tworzą one dwuwymiarowe i trójwymiarowe podstawowe strukturalne jednostki, kombinacja których daje wzrost do trójwymiarowych przestrzennych sieciowych struktur charakterystycznych dla zeolitów (figury 2-5). Specyficzna, jedyna struktura zeolitu, jedyna w relacji z innymi glinokrzemianami oraz w relacji z innymi krystalicznymi materiałami odzwierciedla się w istnieniu strukturalnych otworów wzajemnie powiązanych przez kanały pewnych form i rozmiarów (figury 2-5). Odmiennie porowate materiały charakteryzują się sprecyzowanym układem porów, które statystycznie rozchodzą się w różnych kierunkach, formach i rozmiarach otworów i kanałów, jak również ich wzajemne związki są niezmienne i dokładnie określone jako strukturalne parametry specyficznych typów zeolitów (Barrer, R.M., Zeolites and Clay Minerals as Sorbents and Molecular Sieves, Academic Pres, London, 1978, p. 23) jak można zobaczyć w przedstawionych przykładach struktury pojedynczej sieci przestrzennej zeolitu A (figura 2), faujasitu (zeolity X i Y, figura 3), modernitu (figura 4) i zeolit ZSM-5 oraz silikalit (figura 5).

Figura 2. Schematyczne przedstawienie przekroju kubooktaedru (jednostka sodalitu) jako trójwymiarowej jednostki struktury zeolitu A (po lewej) i struktury jednostkowej komórki zeolitu A (po prawej). Atomy glinu i krzemu są usytuowane na przecięciu się krawędzi, np. na wierzchołku kubooktaedrów, podczas gdy atomy tlenu występują między nimi, w połowie krawędzi. SI i SII reprezentują pozycję uwodnionych jonów Na⁺ w strukturze zeolitu A.

Figura 3. Schematyczne przedstawienie zeolitów X i Y (faujasitu) z przynależnymi pozycjami SI,

Sn, S|·, S_II· i Sm. Atomy glinu i krzemu są usytuowane na skrzyżowaniu krawędzi, np. na wierzchołku kubooktaedrów, podczas gdy atomy tlenu mieszczą się pomiędzy nimi, w połowie krawędzi. Różnica pomiędzy zeolitem X i Y przejawia się w kierunku Si/ Al, atomów krzemu i glinu (Si/Al = 1-2 w zeolicie X; Si/Al = 1,5-3 w zeolicie Y).

Figura 4. (a) 5-1 dodatkowa jednostka struktury modernitu. (b) Rzut przekroju krystalicznej siatki modernitu wzdłuż osi głównego łańcucha, (c) Schematyczne przedstawienie krystalicznej sieci modernitu.

Figura 5. (a) Charakterystyczna struktura łańcucha zbudowanego z 5-1 dodatkowej jednostki struktury, (b) Krystaliczny obraz (100) jednostki siatki zeolitu ZSM-5 oraz silikalitu. 10 członowe pierścienie przedstawiają otwory sinusoidalne kanalików równoległych (ool) do krystalicznych płaszczyzn zeolitu ZSM-5 i silicalitu (c) Schematyczne przedstawienie strukturalnych kanałów w zeolicie ZSM-% (Si/Al = 20-200) oraz silikalitu (Si/Al = 20-200) oraz silikalitu (Si/Al = <»)

Chemiczna kompozycja zeolitów jest zwykle przedstawiona przez ogólną formułę w formach tlenkowych:

M_2/n • Al₂O₃ • y SiO₂-z H₂O gdzie n jest liczbą kationów M, podczas gdy y > 2, a z zależy od typu zeolitu. Woda zeolitu jest rezultatem hydratacji membran - błon kompensacji kationów M. Dlatego też wartość z zależy od typu kompensacji kationów, liczby M kationów w jednostce sieci krystalicznej oraz poziomu hydratacji kationów M w sieci krystalicznej zeolitu. Poprzez podgrzewanie zeolitu powyżej około 600°C, woda zeolitu może być usunięta z zeolitu bez zmiany struktury. Przez schłodzenie do temperatury pokojowej, ta sama ilość wody jest granicą dla zeolitu, na przykład procesy desorpcji i adsorpcji wody zeolitu są ściśle odwracalne.

W kontakcie z roztworami elektrolitu kationy z zeolitu mogą być odwracalnie zastępowane przez kationy z zeolitu (Breck, D.W., J. Chem. Educ.,41:678,1964; Fedorov, V.A., Tomalchev, A.M., Panchenkov, G. M., Zh. Fiz. Khim., 38:1248, 1964; Wolf, F., Foertig, H., Kolloid Z.-Z. Polymere, 206:48, 1965, Sherry, H.S., Adv. Chem. Ser., 101:350, 1971, Brooke, N.M., Rees, L.V.C., Adv.Chem. Ser., 101:405, 1971; Barrer, R.M., Klinowski, J., Phil. Trans. 285:637, 1977.). W warunkach równowagi następujące zastosowania: (Schwuger, M.J., Smolka H.G., Tenside detergents, 13:305, 1976):

zB x A^zA (aq)+zA x B^zB (s) » zB x A^zA (s) + zA x B^zB (aq) gdzie zA i zB są liczbami ładunkowymi („wartościowościami) zamiennych kationów A i B, podczas gdy aq i s oznaczają roztwór, np. zwartą fazę (zeolit).

PL 204 965 B1

Naturalne zeolity są nieoczyszczone z różnymi domieszkami, dlatego w preparacie tego wynalazku używamy syntetyczny zeolit z dokładnie określoną charakterystyką.

POMOCNICZE SUBSTANCJE

W produkcji pigułek i kapsułek, poza MPP, które jest przedmiotem wynalazku, zwykle używanymi substancjami pomocniczymi, będącymi nośnikami pewnych funkcji są: Substancje uzupełniające, np. najlepiej laktoza, mikrokrystaliczna celuloza, sorbitol, manitol, skrobia, etc.

Substancje wiążące, np. najlepiej żelatyna, celuloza, poliwinylopirolidon, metyl celuloza, etc.

Substancje rozkładające, np. najlepiej skrobia, skrobia sodowo - hydroksymetylowa, mikrokrystaliczna celuloza, etc.

Substancje poślizgowe, np. najlepiej stearynian magnezu, talk, kwas stearynowy, uwodniony olej roślinny.

Produkcja pigułek i kapsułek jest przeprowadzana w oparciu o suchą procedurę.

CHARAKTERYSTYKA FORM WAPNIOWYCH SYNTETYCZNEGO ZEOLITU (Ca-zeolit(S))

Formy wapniowe syntetycznego zeolitu Ca-zeolitu (S), które ujawniają się w formach czystego proszku są opisywane przez metody dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego, podczerwonej spektroskopii, badania elektronicznym mikroskopem, dyferencjalnej termograwimetrii i rozkładu rozmiaru cząstek.

PRZYKŁAD WYKONANIA 1: ANALIZA DYFRAKCJĄ PROMIENIOWANIA RENTGENOWSKIEGO

Dyfraktogramy promieniowania rentgenowskiego Ca-zeolitu (S) otrzymywane przez dyfraktometr Philipsa z CuK promieniowania α wewnątrz pola Bragga kąt 20 = 10° - 46° pokazują, że wszystkie analizowane próbki były 95-100% krystaliczne i bez domieszek innych nie-zeolitowych krystalicznych faz.

PRZYKŁAD WYKONANIA 2: ANALIZA PODCZERWONĄ SPEKTROSKOPIĄ

Podczerwone widmo Ca-zeolitu (S) zostało zapisane techniką pastylek KBr na Perkin-Elmer podczerwonym spektrometrze System 2000 FT-IR, który pokazał, że wszystkie próbki mają widmo charakterystyczne dla zeolitu, bez domieszek innych nie-zeolitowych krystalicznych faz.

PRZYKŁAD WYKONANIA 3: SYMULTANICZNA ANALIZA TERMICZNA

Symultaniczna analiza termiczna Ca-zeolitu (S) została wykonana za pomocą urządzenia TA 4000 System (Mettler - toledo). Prędkość podgrzewania w atmosferze azotu wynosiła 10 K/min. Rezultaty analizy pokazały, że analizowane próbki zawierają 12,5 - 22,6% H2O.

PRZYKŁAD WYKONANIA 4: MIERZENIE ROZMIARÓW CZĄSTEK

Rozkład rozmiaru cząstek Ca-zeolitu (S) był mierzony przez metodę dynamicznego rozpraszania światłem lasera przez urządzenie Mastersize X (Malvern). Rezultat analiz pokazuje, że rozmiar cząstek analizowanych próbek wynosi do 0,5-20 mikrometrów.

PRZYKŁAD WYKONANIA 5: ANALIZA CHEMICZNA

Analiza chemiczna Ca-zeolitu (S) została przeprowadzona w następujący sposób: pewna ilość zeolitu była rozpuszczona w rozcieńczonym roztworze kwasu azotowego. Roztwory otrzymane w ten sposób były rozcieńczane destylowaną wodą do poziomu odpowiedniego dla oznaczenia stężenia sodu, glinu i krzemu metodą spektroskopii absorpcji atomowej (AAS). Kwasy mocne zeolitów były topione z mieszaniną węglanu sodu i tetraboranu sodu. Materiał roztopiony został rozłożony w rozcieńczonym roztworze HCl i rozcieńczony destylowaną wodą do poziomu odpowiedniego do odmierzenia stężenia sodu, glinu i krzemu metodą AAS. Stężenie sodu, glinu i krzemu w przedstawionych roztworach było oznaczone za pomocą atomowej absorpcji spektrofotometrem 3030B (Perkin-Elmer). Rezultat chemicznej analizy pokazuje, że analizowane próbki składają się z 6,5 - 15,6% CaO, 11,8-28,4% Al2O3, 33,5 - 69,3% SiO2.

PRZYGOTOWANIE OLIGOPEPTYDÓW

PRZYKŁAD WYKONANIA 6: WYODRĘBNIENIE BIAŁEK Z KORZENI, ŁODYGI I LIŚCIA POKRZYWY

URTICAE RADIX, HERBA ET FLOS

URTICA DIOICA L., URTICACEAE-NETTLE - POKRZYWA

Z 1 kilograma korzenia, łodyg i liści pociętych na małe kawałki wykonano alkoholowy ekstrakt w cią gu 5 dni. Przez zimną destylację alkohol został usunię ty z ekstraktu. Dla uł atwienia procesu oligopeptydy pokrzywy były zmrożone i liofilizowane. W celu usunięcia zanieczyszczeń zawartych

PL 204 965 B1 w roślinnym ekstrakcie liofilizowany ekstrakt pokrzywy został oczyszczony na kolumnie Sephadex G-25. Komponenty białek były wymywane z kolumny przez użycie mieszaniny buforowej Tris-HCl jako frakcja 12. Absorpcja białka została oznaczona na 280 nm. Zebrane frakcje z 1 ml każda były poddawane dializie i liofilizowane. Jakościowy układ aminokwasów został określony na cienkiej warstwie celulozy (Merck), w mieszaninie rozpuszczalnika: n-butanol : kwas acetonowo-octowy : woda.

PRZYKŁAD WYKONANIA 7: WYODRĘBNIENIE BIAŁEK Z KORZENI TRAGANKA BŁONIASTEGO

ASTRAGALI RADIX

ASTRAGALUS MEMEBRANACEUS (FISCH. EX LINK) FABACEAE - TRAGANEK BŁONIASTY

Z 1 kilograma korzenia traganka bł oniastego pocię tego na mał e kawałki wykonano alkoholowy ekstrakt w ciągu 5 dni. Poprzez zimną destylację alkohol usunięto z ekstraktu. Dla ułatwienia procesu oligopeptydy traganka błoniastego zostały zmrożone i liofilizowane. W celu usunięcia zanieczyszczeń zawartych w roślinnym ekstrakcie liofilizowany ekstrakt traganka błoniastego został oczyszczony na kolumnie Sephadex G-25. Komponenty białek były wymywane z kolumny przez użycie mieszaniny buforowej Tris HCl jako frakcja 11. Absorpcja białka została odmierzona na 280 nm. Zebrane frakcje z 1 ml każda były poddawane dializie i liofilizowane. Jakościowy układ aminokwasów został określony na cienkiej warstwie celulozy (Merck), w mieszaninie rozpuszczalnika: n-butanol : kwas acetonowo-octowy : woda.

PRZYKŁAD WYKONANIA 8: WYODRĘBNIENIE BIAŁEK Z MELISY

MELISSA OFFICINALIS L. - Melisa

Z 1 kilograma ł odygi i liś ci melisy, pocię tych na mał e kawał ki wykonano alkoholowy ekstrakt w cią gu 5 dni. Przez zimną destylację alkohol usunię to z ekstraktu. Dla uł atwienia procesu oligopeptydy melisy były zmrożone i liofilizowane. W celu usunięcia zanieczyszczeń zawartych w roślinnym ekstrakcie liofilizowany ekstrakt melisy został oczyszczony na kolumnie Sephadex G-25. Komponenty białek były wymywane z kolumny przez użycie mieszaniny buforowej Tris HCl jako frakcja 10. Absorpcja białka została odmierzona na 280 nm. Zebrane frakcje z 1 ml każda były poddawane dializie i liofilizowane. Jakościowy układ aminokwasów został określony na cienkiej warstwie celulozy (Merck), w mieszaninie rozpuszczalnika: n-butanol : kwas acetonowo-octowy : woda.

PRZYKŁAD WYKONANIA 9: WYODRĘBNIENIE BIAŁEK Z CHMIELU

HUMULUS LUPULUS L. - CHMIEL

Z 1 kilograma szyszek chmielu, pocię tych na mał e kawał ki wykonano alkoholowy ekstrakt w cią gu 5 dni. Przez zimną destylację alkohol usunię to z ekstraktu. Dla uł atwienia procesu oligopeptydy chmielu były zmrożone i liofilizowane. W celu usunięcia zanieczyszczeń zawartych w roślinnym ekstrakcie liofilizowany ekstrakt chmielu został oczyszczony na kolumnie Sephadex G-25. Komponenty białek były wymywane z kolumny przez użycie mieszaniny buforowej Tris HCl jako frakcja 12. Absorpcja białka została odmierzono na 280 nm. Zebrane frakcje z 1 ml każda były poddawane dializie i liofilizowane. Jakościowy układ aminokwasów został określony na cienkiej warstwie celulozy (Merck), w mieszaninie rozpuszczalnika: n-butanol : kwas acetonowo-octowy : woda.

PREPARATY WITAMINOWE

PRZYKŁAD WYKONANIA 10: PREPARAT KOMPLEKSU B

Jako bazowe źródło witamin kompleksu B został użyty obojętny preparat drożdżowy bogaty w biał ka, wę glowodany, tł uszcze, minerał y, witaminy i podstawowe aminokwasy. Ten preparat został użyty jako bazowe źródło kompleksu witaminy B w MPP.

PRZYKŁAD WYKONANIA 11: PREPARAT MPP

MPP jest przygotowany przez mieszanie form wapniowych syntetycznego zeolitu, białek z: pokrzywy, traganka błoniastego, melisy, chmielu oraz witamin kompleksu B. MPP przygotowany w ten sposób zawiera: 10 do 50% (m/m) wapniowych form zeolitu. (CaO * Al2O3 * y * SiO2 * z' * H2O), 0,5 do 20% (m/m) białek korzenia traganka błoniastego, 0,5 do 20% (m/m) białek melisy, 0,5 do 20% (m/m) białek chmielu, 0,5 do 17,5% (m/m) białek pokrzywy oraz 0,5 do 12,5 % (m/m) kompleksu B.

PRZYKŁAD WYKONANIA 12: EKSPERYMENTALNA CUKRZYCA

Testy zostały wykonane na dwóch modelach eksperymentalnej cukrzycy.

Eksperymentalna cukrzyca spowodowana była przez Alloxan u CBA myszy, w dawce 75 mg/kg wagi ciała. Po pojawieniu się symptomów cukrzycy 3 myszy były trzymane w klatkach.

PL 204 965 B1

Do eksperymentu wzięto NOD myszy, które rozwinęły wszystkie symptomy cukrzycy.

W testach farmakologicznych mineralno - zioł owy preparat zosta ł domieszany do standardowego pożywienia dla laboratoryjnych myszy.

Wynalazek będzie prezentował w szczegółowych przykładach, że w przypadku cukrzycy i dla udanego leczenia cukrzycy Typu I lub II nie jest wystarczające zastosowanie znanych leków, które charakteryzują się jedynie silną hypoglikemiczną skutecznością, ale ten mineralno - ziołowy preparat z wynalazku powinien być stosowany jako pomocny w zwalczaniu zaburzeń metabolizmu.

PRZYKŁAD WYKONANIA 13: OKREŚLENIE POZIOMU APOPTOZY

Poziom apoptozy był określony po cięciu próbek nerwu w kriostacie. Na odciętych próbkach wielkości 4 μm dodano propidium jod, a próbka była analizowana pod mikroskopem fluorescencyjnym.

PRZYKŁAD WYKONANIA 14: Obecność IgG w nerwach

Obecność IgG w nerwach została stwierdzona przez zabarwienie nerwów przez peroxidazę antiperoxidazy i analizowana pod mikroskopem.

PRZYKŁAD WYKONANIA 15

Zwierzęta z cukrzycą otrzymywały MPP z kompozycją minerałów od 0,5 do 10 mg, białek traganka błoniastego od 0,1 do 2 mg, białek pokrzywy od 0,1 do 1,5 mg, białek melisy od 0,1 do 0,2 mg, białek chmielu od 0,1 do 2,0 mg, witaminy B1 od 0,5 do 10 μg, B2 od 2 do 10 μg, B6 od 0,5 do 1,25 μg, B12 od 0,3 do 1 μg, z wszystkimi symptomami cukrzycy, z ponad 19,0 mmol/L glukozy we krwi. Myszy umieszczono w metabolicznych klatkach i przez 6 dni mierzono ilość wypitej wody, masę zjedzonego pożywienia, ilość wydalanego moczu i kału. Przez pierwsze trzy dni podawania MPP zwierzęta nie wykazywały zmniejszenia symptomów cukrzycy. To samo zostało powtórzone w następnych trzech dniach. Stężenie glukozy we krwi wynosiło ponad 16 mmol/L, a zwierzęta piły ponad 25 ml wody dziennie. Dalsza terapia dawała pozytywne efekty na symptomy cukrzycy u CBA i NOD myszy. Podczas testu myszy były umiarkowanie aktywne.

PRZYKŁAD WYKONANIA 16

Zwierzęta z cukrzycą otrzymywały MPP z kompozycją minerałów od 10 do 50 mg, białek traganka błoniastego od 1 do 10 mg, białek pokrzywy od 1 do 12 mg, białek melisy od 0 do 10 mg, białek chmielu od 0 do 10 mg, witaminy B1 25 μg, B2 18 μg, B6 2,5 μg, B12 0,7 μg, z wszystkimi symptomami cukrzycy, z ponad 14,5 mmol/L glukozy we krwi. Myszy umieszczono w metabolicznych klatkach i przez 6 dni mierzono ilość wypitej wody, masę zjedzonego pożywienia, ilość wydalanego moczu i kału. Przez pierwsze trzy dni podawania MPP zwierzęta znacznie zredukowały symptomy cukrzycy. To samo zostało powtórzone w następnych trzech dniach, tak że ilość wypitej wody oraz wydalonego moczu była zredukowana o 60%. W teście efektywności MPP na stężenie glukozy w obwodowej krwi u myszy z cukrzycą, preparat wykazał efekt hipoglikemiczny. Poza tym krzywa asymilacji glukozy była znacznie bardziej korzystna w porównaniu z nieleczonymi kontrolnymi grupami, co jest ważne zarówno dla cukrzycowych myszy CBA, jak i NOD myszy. Podczas dalszej terapii, przez 6 miesięcy, symptomy cukrzycy nie były całkowicie usunięte, ale znacznie zredukowane. Należy szczególnie wskazać, że w porównaniu z redukcją stężenia glukozy we krwi, nastąpiła znaczna redukcja późniejszych powikłań cukrzycy, np. neuropatia, skleroza. Podczas testu myszy były umiarkowanie aktywne.

PRZYKŁAD WYKONANIA 17

Zwierzęta z cukrzycą otrzymywały MPP z kompozycją minerałów od 50 do 500 mg, białek traganka błoniastego od 10 do 100 mg, białek pokrzywy od 10 do 87,5 mg, białek melisy od 0 do 100 mg, białek chmielu od 0 do 100 mg, witaminy B1 od 0,5 do 10 μg, B2 od 2 do 10 μg, B6 od 0,5 do 1,25 μg, B12 od 0,3 do 1 μg, z wszystkimi symptomami cukrzycy, z ponad 16 mmol/L glukozy we krwi. Myszy umieszczono w metabolicznych klatkach i przez 6 dni mierzono ilość wypitej wody, masę zjedzonego pożywienia, ilość wydalanego moczu i kału. Przez pierwsze trzy dni podawania MPP zwierzęta znacznie zredukowały symptomy cukrzycy. To samo zostało powtórzone w następnych trzech dniach, tak że ilość wypitej wody oraz wydalonego moczu była zredukowana o 70%. W teście efektywności MPP na stężenie glukozy w obwodowej krwi myszy z cukrzycą, preparat wykazał efekt hipoglikemiczny. Jednakże test obciążenia glukozą nie wykazywał pozytywnych efektów preparatu, a krzywa asymilacji glukozy nie była znacznie korzystniejsza w relacji z nieleczonymi kontrolnymi grupami, co jest ważne zarówno dla cukrzycowych myszy CBA, jak i NOD myszy. Podczas dalszej terapii, przez 6 miesięcy, symptomy cukrzycy nie były całkowicie usunięte, ale znacznie zredukowane. Należy szczególnie

PL 204 965 B1 wskazać, że w porównaniu z redukcją stężenia glukozy we krwi wystąpiło znaczne przesunięcie, ponadto objawy cukrzycy były znacznie zmniejszone. Podczas testu, myszy były umiarkowanie aktywne.

DANE FARMAKOLOGICZNE

Efektywność MPP na stężenie glukozy we krwi była testowana na kontrolnych myszach z cukrzycą CBA i NOD. Rezultaty były porównywane z kontrolną grupą cukrzycowych myszy CBA, które nie otrzymywa ł y MPP.

Zwierzętom podawano MPP przez sondę przez 14 dni. 14-tego dnia pobrano zerową próbkę krwi (25 μL) z żyły ogonowej. Po pierwsze myszy były poddawane testowaniu efektywności MPP mineralnego preparatu (przykład wykonania od 1 do 3), po drugie efektywności mineralnego preparatu plus roślinnych białek (przykład wykonania od 4 do 15)

Figura 6. Krzywa asymilacji glukozy u cukrzycowych myszy CBA, gdzie była podawana mineralna część MPP [Napis w pionie: glukoza we krwi (mmol/L); Napis w poziomie: czas (min.)]

Figura 7. Krzywa asymilacji glukozy u cukrzycowych myszy NOD, gdzie była podawana mineralna część MPP [Napis w pionie: glukoza we krwi (mmol/L); Napis w poziomie: czas (min.)]

Rezultaty obciążenia przez glukozę przedstawiono na figurach 6 i 7.

Stężenie glukozy we krwi u cukrzycowych myszy CBA (10 myszy na grupę), gdzie nie podawano mineralnej części MPP przeciętnie wynosiło do 19,8 ± 3,2 mmol/L (figura 6). Po 10, np. 30 minutach od rozpoczęcia wprowadzenia glukozy (1 g/kg masy ciała) stężenie glukozy w obwodowej krwi u cukrzycowych myszy było wysoce wzrastające w ilości powyżej 30 mmol/L. Podczas następnej pół godziny stężenie glukozy zaczęło się zmniejszać, ale po godzinie nie osiągnęło początkowej ilości stężenia glukozy we krwi (figura 6).

W grupie cukrzycowych myszy, gdzie była podawana mineralna część MPP stężenie glukozy we krwi po wprowadzeniu glukozy „per os silnie wzrastało od 18 mmol/L do 27 mmol/L po 10 minutach. Podczas następnych 50 minut stężenie glukozy w obwodowej krwi u cukrzycowych myszy ciągle zmniejszało się (figura 6).

W grupie cukrzycowych myszy NOD, test obciążenia glukozą pokazywał, że stężenie glukozy powróciło do początkowego poziomu po 60 min. Można wnioskować, że cukrzycowe myszy NOD, które przez 14 dni otrzymywały mineralną część MPP przez sondę asymilowały wprowadzoną glukozę lepiej (figura 7). Preparat mineralny MPP nie wykazywał bezpośrednich efektów hipoglikemicznych.

Jeśli cukrzycowe myszy otrzymywały MPP przez 14 dni stężenie glukozy we krwi tych myszy pokazano na figurze 8. Przed badaniem z MPP pobrano próbkę krwi i określono zerową wartość stężenia glukozy. Podczas następnych 4 godzin badania w pewnych okresach czasu pobierano próbkę krwi. Stężenie glukozy u cukrzycowych myszy stale spadało i po 4 godzinach wynosiło tylko około 20% początkowej wartości (figura 8).

Preparat mineralno-proteinowy według przykładu wykonania 16 pokazał silny efekt hipoglikemiczny podczas 4 godzin testowania.

Figura 8. Stężenie glukozy we krwi kontrolnej grupy myszy (1) i cukrzycowych myszy leczonych MPP (przykład wykonania 16) [Napis w pionie: glukoza we krwi (%); Napis w poziomie: czas (min.)]

Figura 9. Stężenie glukozy we krwi u cukrzycowych myszy CBA nieleczonych MPP (kontrolna) i leczonych MPP (przykład wykonania 17) [Napis w pionie: glukoza we krwi (%); Napis w poziomie: czas (min.)]

U cukrzycowych myszy, gdzie podawano MPP przez 14 dni (według przykładu wykonania 17) stężenie glukozy we krwi przez 4 godziny po podaniu MPP nie zmieniło się w porównaniu z kontrolnymi wartościami (Figura 9)

Figura 10. Ilość wypitej wody podczas 6 dni podawania MPP (3 myszy na grupę) [Napis w pionie: wypita woda (mL); Napis w poziomie: dni]

Figura 11. Ilość wydalanego moczu u cukrzycowych myszy, które otrzymywały MPP (3 myszy na grupę) przez 6 dni [Napis pionowy: wydalany mocz (mL); Napis poziomy: dni]

U cukrzycowych myszy CBA, które otrzymywały MPP przez 6 dni znacznie zredukowała się ilość wypitej wody (p < 0,001) (figura 10).

U cukrzycowych myszy CBA, które otrzymywały MPP przez 6 dni, znacznie zredukowała się ilość wydzielanego moczu (p < 0,001) (figura 11).

Przez 6 miesięcy myszom codziennie podawano MPP razem z żywnością. Z tabeli 1 widać, że MPP nie wykazuje szkodliwych efektów, ponieważ masa ciała kontrolnych zdrowych myszy nie zmniejszała się, ale wzrastała podczas eksperymentu. Tak więc waga ciała średnio wzrastała począwszy od 25 gram do 39 gram.

PL 204 965 B1

Ale w grupie cukrzycowych myszy CBA nie nastąpił wzrost wagi ciała, a wynosiła ona przeciętnie 26 gram (tabela 1). Podczas całego eksperymentu, nie nastąpił wzrost masy ciała od początkowej wartości (tabela 1), co jest zwykłym następstwem w cukrzycy.

T a b e l a 1. Masa ciała kontrolnych i cukrzycowych myszy CBA, które otrzymywały MPP

Grupy	Miesiące
0	1	2	3	4	5	6
Kontrolna	24,3±1,3	26,9±2,1	29,7±2,3	32,5±2,8	33,6±2,5	36,3±2,2	39,3±2,8
Cukrzycowa CBA	27,7±2,2	26,1±1,2	26,2±3,2	25,9±3,7	25,7±3,3	26,6±2,8	26,5±2,2

Podczas eksperymentu spadek masy ciała został zanotowany w grupie cukrzycowych myszy NOD (tabela 2).

Na początku eksperymentu masa ciała wynosiła około 35 gram, podczas gdy myszy średnio ważyły 30 gram (tabela 2).

W grupie kontrolnej, nie-cukrzycowych myszy NOD, masa ciał a podczas eksperymentu stale wzrastała (Tabela 2).

Figura 12. Stężenie fruktozaminy w surowicy kontrolnych, cukrzycowych (Cukrzycowa Grupa) i cukrzycowych myszy leczonych MPP (Diab+) (wedł ug przykł adu wykonania 16) [Napis pionowy: wydalany mocz (mL); Napis poziomy: dni]

Stężenie fruktozaminy w surowicy cukrzycowych myszy NOD określono w celu monitorowania skuteczności leczenia cukrzycy za pomocą MPP. Rezultaty pokazały, że stężenie fruktozaminy w grupie kontrolnych myszy NOD wynosi do 219 μ mol/L W surowicy cukrzycowych myszy NOD stę żenie fruktozaminy znacząco wzrasta. Figura 12 (p< 0,001). W grupie cukrzycowych myszy NOD leczonych MPP mierzone stężenie fruktozaminy wynosiło przeciętnie 240 μmol/L, co jest znacznie wyższe w stosunku do cukrzycowych grup (p<0,001) (figura 12).

Określono cytozol w wątrobie eksperymentalnych grup, efekt mineralno - roślinnego preparatu na katalityczne stężenie glutationu S-transferazy (GST).

GST jest enzymem Fazy II metabolizmu ksenobiotyków i uczestniczy w ich detoksykacji i w ten sposób chroni miejsce przed efektem toksycznym elektrofilnych substancji. To katalizuje reakcję koniugacji glutationów z dużą ilością elektrofilnych komponentów powstających w komórce.

Figura 13. Katalityczne stężenie GST w grupie zdrowych, kontrolnych i cukrzycowych myszy CBA leczonych MPP (Diab + MPP) (według przykładu wykonania 16) [Napis w pionie: fruktozamina (nmol/L); Napisy w poziomie: kontrolne/ cukrzycowe/ cukrzycowe + MPP/ kontrolne + MPP, poniżej: grupy]

Kataliczne stężenie GST w grupie zdrowych, kontrolnych i cukrzycowych myszy CBA wynosiło przeciętnie do 17,19 nmol/min/mg (Figura 13). W grupie zdrowych myszy CBA leczonych MPP, kataliczne stężenie GST wynosiło przeciętnie do 16,42 nmol/min/mg. Znaczny wzrost katalicznego stężenia GST powstał w grupie cukrzycowych myszy CBA (p < 0,05). Po 6 miesiącach leczenia cukrzycowych myszy CBA MPP znacznie obniżyło się kataliczne stężenie GST w wątrobie przeciętnie do 12,23 nmol/min./mg, które jest na poziomie p < 0,01 - znaczna różnica w porównaniu z cukrzycową grupą (figura 13). Podczas 6 miesięcy testowania efektów MPP na stan cukrzycy kontrolowano poziom stężenia jonów wapnia (Ca²⁺) w surowicy kontrolnych i cukrzycowych myszy (tabela 3). Stężenie jonów Ca²⁺ przez 6 miesięcy było niezmienione we krwi cukrzycowych myszy CBA, które otrzymywały MPP codziennie (według przykładu wykonania 16). Ale w grupie Ca²⁺ cukrzycowych myszy CBA nastąpiło znaczne obniżenie stężenia jonów Ca²⁺ w surowicy występowało (p < 0,05) po 6 miesiącach trwania choroby. Podobne rezultaty pokazano u myszy z samoistną cukrzycą (tabela 4). Stężenie jonów Ca²⁺ nie zmieniało się w grupie cukrzycowych myszy NOD, które otrzymywały MPP codziennie. Znaczna redukcja stężenia jonów wapnia została zaobserwowana w grupie cukrzycowych myszy NOD, które nie otrzymywały MPP (tabela 4).

T a b e l a 2. Masa ciała kontrolnych i cukrzycowych myszy NOD, które otrzymywały MPP.

Grupy	Miesiące
0	1	2	3	4	5	6
NOD	34,3 ± 3,8	33,7 ± 3,3	31,1 ± 4,1	30,5 ± 4,1	31,2 ± 4,4	30,9 ± 3,6	30,5 ± 3,2
NOD niecukrzycowe	30,4 ± 2,6	32,8 ± 3,4	35,6 ± 1,0	36,5 ± 2,3	37,8 ± 2,3	38,1 ± 2,6	39,4 ± 3,4

PL 204 965 B1

T a b e l a 3. Stężenie Ca²⁺ w surowicy kontrolnych i cukrzycowych myszy CBA, które otrzymywały MPP przez 180 dni

Grupy	Dni
7	90	180
Cukrzyca	2,2 ± 0,05	2,0 ± 0,06	1,92 ± 0,12*
Cukrzyca + MPP	2,17 ± 0,03	2,19 ± 0,05	2,23 ± 0,2

T a b e l a 4. Stężenie Ca²⁺ w surowicy kontrolnych i cukrzycowych myszy NOD, które otrzymywały MPP przez 180 dni

Grupy	Dni
7	90	180
NOD	2,2 ± 0,08	2,01 ± 0,08	1,90 ± 0,04
NOD + MPP	2,2 ± 0,09	2,15 ± 0,03	2,16 ± 0,07

Uśmiercano zwierzęta z poszczególnych grup po 7, 90 i 180 dniach. Przy badaniu histopatologicznym badano poziom neuropatii w przewodzie trawiennym (tabela 5 i 6). Po 180 dniach u cukrzycowych myszy CBA, które nie otrzymywały MPP, rozwinęła się cukrzycowa neuropatia w 100% przypadków. Jednakże u cukrzycowych myszy CBA, które otrzymywały MPP codziennie, nie zaobserwowano neuropatii cukrzycowej. (tabela 5).

T a b e l a 5. Obecność neuropatii w przewodzie żołądkowo - jelitowym u cukrzycowych myszy CBA podczas 180 dni trwania eksperymentu.

Grupy	Dni
7	90	180
Cukrzyca	-	+	+++
Cukrzyca + MPP	-	+	+

Ten sam eksperyment również wykonano z cukrzycowymi myszami NOD. U cukrzycowych myszy NOD rozwija się neuropatia cukrzycowa w 100% przypadków podczas 6 miesięcy (tabela 6). U cukrzycowych myszy NOD, które otrzymywały MPP podczas 180 dni codziennie, nie rozwinęła się neuropatia cukrzycowa (tabela 7).

T a b e l a 6. Obecność neuropatii w przewodzie żołądkowo - jelitowym u cukrzycowych myszy NOD podczas 180 dni trwania eksperymentu.

Grupy	Dni
7	90	180
NOD	+	++	+++
NOD + MPP	++	++	++

Aby sprawdzić rozmiar uszkodzenia nerwów, np. sprawdzić obecność ciał apoptycznych badano próbki nerwu kulszowego pobrane od myszy. Otrzymane rezultaty pokazują, że długotrwała cukrzyca ma znaczący wpływ na wzrost liczby ciał apoptycznych. W grupie cukrzycowych myszy liczba ciał apoptycznych wynosiła około 67% (tabela 7). U kontrolnych (zdrowych myszy) liczba ciał apoptycznych wynosiła około 9%. Cukrzycowe myszy leczone MPP nie wykazały znacznego wzrostu liczby ciał apoptycznych w nerwie kulszowym (16%). (Tabela 7).

Obecność przeciwciał (IgG) w nerwie kulszowym testowano poprzez zabarwienie peroksydazę antyperoksydazy. Cukrzycowe myszy, które rozwinęły wszystkie symptomy cukrzycowej neuropatii podczas eksperymentu, wykazały silną obecność IgG w nerwie kulszowym. Figura 14 to przekrój poprzeczny przez nerw kulszowy myszy cukrzycowych po 180 dniach trwania choroby. Przeciwnie do tego, myszy, które otrzymywały MPP przez 6 miesięcy, nie miały autoprzeciwciał we włóknach nerwowych nerwu kulszowego. Figura 15 to Przekrój poprzeczny przez nerw kulszowy cukrzycowych myszy leczonych MPP po 180 dniach trwania choroby.

PL 204 965 B1

Procent ciał apoptycznych jest statystycznie znacznie mniejszy w grupie myszy (CBA i NOD) leczonych przez MPP (tabela 7 i 8). Dodatkowo po zabarwieniu anty IgG sprzężonym peroksydazą antyperoksydazy procent pozytywnych neuronów w grupie myszy leczonych MPP wynosił pomiędzy 6 a 9% (tabela 7 i 8).

T a b e l a 7. Procent ciał apoptycznych, i procent IgG pozytywnych włókien nerwowych u myszy CBA po 6 miesiącach (180 dniach) testowania

Grupy	Dni
Apoptoza (%)	IgG (%)
Cukrzyca	67	86
Cukrzyca + MPP	16	9

T a b e l a 8. Procent ciał apoptycznych i procent IgG pozytywnych włókien nerwowych u myszy NOD po 6 miesiącach testowania

Grupy	Dni
Apoptoza (%)	IgG (%)
NOD	78	91
NOD + MPP	12	6

Nie stwierdzono żadnych szkodliwe toksycznych efektów, jeśli zwierzęta otrzymywały MPP przez 6 miesięcy.

WNIOSEK

Skoro neuropatia jest późnym powikłaniem często obecnym w cukrzycy, koniecznym było znalezienie dodatkowego „sposobu terapii, który poprawiłby ogólny stan pacjenta. Z tej przyczyny techniczny problem, który był postawiony przed wynalazcę i ostatecznie rozwiązany z sukcesem w niniejszym wynalazku polega na opracowaniu mineralno - proteinowego preparatu w zapobieganiu neuropatii cukrzycowej z następującymi cechami charakterystycznymi:

1) redukuje stężenie glukozy przez jej absorpcję na MPP, co jest dowiedzione przez figury pokazujące asymilację glukozy

2) zatrzymuje proces gromadzenia się jonów Ca²⁺ w komórkach nerwowych

3) redukuje proces apoptozy w komórkach nerwowych stymulowany przez osadzanie się jonów Ca²⁺

4) nie występuje proces fagocytozy ciał apoptycznych

5) zatrzymuje proces wytwarzania immunoglobulin na włóknach mielinowych nerwów

6) redukuje odkładanie się immunoglobulin na włóknach nerwowych

7) redukuje immunologiczne niszczenie włókien nerwowych przez komplement

8) nie występuje ból spowodowany przez neuropatię cukrzycową

9) zawiera niezbędne aktywne substancje do eliminacji neurotycznych problemów trawiennych

10) zawiera niezbędne aktywne substancje do eliminacji neurotycznych problemów sercowych

11) zawiera niezbędne aktywne substancje do eliminacji wolnych rodników tlenowych

12) zawiera niezbędny kompleks witaminy B naturalnego źródła

13) mineralne części nie przenikają przez kosmki jelitowe

14) mineralne części nie przechodzą przez barierę naczyń krwionośnych

15) mineralne części nie przechodzą przez barierę jelitowo - naczyniową

16) istotą materiału jest zdolność wymiany jonowej

17) jest odpowiedni do doustnego dawkowania i nie wykazywał szkodliwych efektów podczas testowania

18) nie odnotowano szkodliwych efektów nawet przy dużych dziennych dawkach, ani w przypadku długotrwałego używania

19) nie jest szkodliwy w przypadku jego długotrwałego używania.

Przykłady wykonania podano tylko jako objaśnienie i nie reprezentują one ograniczenia MPP, którego zakres jest określony przez istotę zgłoszenia wynalazku.

Claims (16)

1. Preparat mineralno - proteinowy, znamienny tym, że preparat składa się z:

Formy wapniowej syntetycznego zeolitu

Białkowej frakcji ekstraktu pokrzywy

Białkowej frakcji ekstraktu traganka błoniastego

Białkowej frakcji ekstraktu melisy

Białkowej frakcji ekstraktu szyszek chmielu

Źródła kompleksu witaminy B

2. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że części szczegółowych komponentów są następujące:

Forma wapniowa syntetycznego zeolitu od 10-50 m/m %

Białkowa frakcja ekstraktu pokrzywy od 0,5 - 17,5 m/m %

Białkowa frakcja ekstraktu traganka błoniastego od 0,5 - 20 m/m %

Białkowa frakcja ekstraktu melisy od 0,5 - 20 m/m %

Białkowa frakcja ekstraktu szyszek chmielu od 0,5 - 20 m/m %

Źródło kompleksu witaminy B od 0,5 - 12,5 m/m %

3. Preparat według zastrz. 2, znamienny tym, że części szczegółowych komponentów są następujące:

Forma wapniowa syntetycznego zeolitu 40 m/m %

Białkowa frakcja ekstraktu pokrzywy 15 m/m %

Białkowa frakcja ekstraktu traganka błoniastego 15 m/m %

Białkowa frakcja ekstraktu melisy 10 m/m %

Białkowa frakcja ekstraktu szyszek chmielu 10 m/m %

Źródło kompleksu witaminy B 10 m/m %

4. Preparat według zastrz. 2 i 3, znamienny tym, że syntetyczny zeolit został przygotowany przez krystalizację glinokrzemianowego hydrożelu otrzymanego przez mieszanie roztworu zasadowego glinianu sodu i roztworu zasadowego krzemianu sodu, gdzie przeprowadzono wymianę jonową syntetycznego zeolitu, podczas której jony Na⁺ były zamienione przez jony Ca^2+.

5. Preparat według zastrz. 4, znamienny tym, że syntetyczny zeolit zmodyfikowany przez proces wymiany jonowej w miejsce 7,2% - 17,2% jonów Na⁺, przeliczonych na Na2O, zawiera 6,5 - 15,6% jonów Ca²⁺ przeliczonych na CaO.

6. Preparat według zastrz. 5, znamienny tym, że syntetyczny zeolit zmodyfikowany przez proces wymiany jonowej zawiera:

6.5- 15,6% CaO

11,8-28,4% Al2O3

33,5 - 69,3% SiO2 oraz

12.5- 22,6% H2O

7. Preparat według zastrz. 6, znamienny tym, że wapniowy syntetyczny zeolit jest 95-100% krystaliczny oraz bez żadnych domieszek nie-zeolitowych krystalicznych faz.

8. Preparat według zastrz. 6, znamienny tym, że rozmiar cząstek wapniowego syntetycznego zeolitu wynosi od 0,5 do 20 mikrometrów.

9. Mineralno - proteinowy preparat według zastrz. 6, znamienny tym, że powierzchnia właściwa wapniowego syntetycznego zeolitu wynosi od 0,15 do 6 m²/g.

10. Preparat według zastrz. 2 i 3, znamienny tym, że zawiera białkowe frakcje ekstraktu roślin otrzymane przez oczyszczenie liofilizowanych alkoholowych ekstraktów każdego z roślinnych komponentów z preparatu na Sphadex G-25.

11. Preparat według zastrz. 2 i 3, znamienny tym, że źródłem kompleksu witaminy B zawartego w preparacie są obojętne drożdże.

12. Preparat według zastrz. 11, znamienny tym, że obojętnymi drożdżami są faktycznie Saccharomyces Sp.

13. Preparat według zastrz. 2 i 3, znamienny tym, że jest przygotowany do doustnego podawania.

14. Preparat według zastrz. 2 i 3, znamienny tym, że jest używany do leczenia chorych stanów połączonych z cukrzycą.

PL 204 965 B1

15. Preparat według zastrz. 14 znamienny tym, że jest używany w zapobieganiu neuropatii u ssaków cierpią cych na cukrzycę , łącznie z czł owiekiem.

16. Preparat według zastrz. 14, znamienny tym, że redukuje stężenie GUK, redukuje pobieranie płynów do organizmu, jak również ilość wydalanego moczu, hamuje proces apoptozy w komórkach nerwowych oraz zatrzymuje proces wytwarzania IgG na włóknach mielinowych nerwów, i eliminuje proces fagocytozy w ciałach apoptycznych.

Rysunki

Fig. 1

Figura 1. Schematyczna prezentacja wzajemnych połączeń S1O4 oraz AIO4 tetraedrów w siatce krystalicznej zeolitu