PL201546B1

PL201546B1 - Method of creation of transgenic mammal

Info

Publication number: PL201546B1
Application number: PL355353A
Authority: PL
Inventors: Leszek Kaczmarek; Marek Maleszewski; Witold Konopka
Original assignee: Leszek Kaczmarek; Witold Konopka; Marek Maleszewski
Priority date: 2002-08-05
Filing date: 2002-08-05
Publication date: 2009-04-30
Also published as: PL355353A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania transgenicznego ssaka nie będącego człowiekiem. Sposób jest wydajny i nie wymaga stosowania samic w ciąży urojonej jako matek zastępczych.The invention relates to a method for the preparation of a non-transgenic mammal human. The method is efficient and does not require the use of imaginary pregnant females as surrogate mothers.

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201546 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 355353 ^{(51) Int.Cl.} (12) PATENT DESCRIPTION (19) PL (11) 201546 (13) B1 (21) Application number: 355353 ^{(51) Int.Cl.}

C12N 15/06 (2006.01) A01K 67/027 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 05.08.2002 (54)C12N 15/06 (2006.01) A01K 67/027 (2006.01) (22) Filed on: 08/05/2002 (54)

Sposób otrzymywania transgenicznego ssakaA method of obtaining a transgenic mammal

(76) Uprawniony i twórca wynalazku: (76) Authorized and inventor: (43) Zgłoszenie ogłoszono: (43) Application was announced: Kaczmarek Leszek,Komorów,PL Kaczmarek Leszek, Komorów, PL 09.02.2004 BUP 03/04 February 9, 2004 BUP 03/04 Maleszewski Marek,Warszawa,PL Konopka Witold,Knurów,PL Maleszewski Marek, Warsaw, PL Konopka Witold, Knurów, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: (45) The grant of the patent was announced: 30.04.2009 WUP 04/09 April 30, 2009 WUP 04/09 (74) Pełnomocnik: Rafał Witek, WTS Rzecznicy Patentowi (74) Representative: Rafał Witek, WTS Patent Attorneys

⁽⁵⁷⁾ Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania transgenicznego ssaka nie będącego człowiekiem. Sposób jest wydajny i nie wymaga stosowania samic w ciąży urojonej jako matek zastępczych. ⁽⁵⁷⁾ The present invention relates to a method for the preparation of a transgenic non-human mammal. The method is efficient and does not require the use of imaginary pregnant females as surrogate mothers.

PL 201 546 B1PL 201 546 B1

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania transgenicznego ssaka niebędącego człowiekiem, przykładowo szczura.The invention relates to a method for the preparation of a transgenic non-human mammal, for example a rat.

Otrzymywanie transgenicznych gryzoni zostało najwcześniej opracowane dla myszy. Znana (tradycyjna) metoda otrzymywania transgenicznych ssaków, przykładowo szczurów jest adaptacją wcześniejszych metod opracowanych dla myszy i polega na izolowaniu zapłodnionych komórek jajowych (tzw. embrionów jednokomórkowych) z jajowodów samic po wywołanej superowulacji i odbytej kopulacji (Hogan, B., Beddington, R., Costantini, F., and Lacy, E. (1994). Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Second Edition. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor)) wprowadzaniu metodami in vitro obcego DNA do wyizolowanych embrionów jednokomórkowych, a następnie wprowadzeniu zmodyfikowanych embrionów doprowadzonych do stadium dwukomórkowego do jajowodów matek zastępczych, którymi są samice w ciąży urojonej (szczegółowy opis poszczególnych etapów: Methods in Molecular Biology, Vol. 18: Transgenesis Techniques: Principles and Protocols, D.Murphy i A. Carter, Humana Press Inc., Totowa, NJ). Matki zastępcze otrzymuje się wcześniej w wyniku odbytej kopulacji z bezpłodnymi (vasektomizowanymi) samcami.The production of transgenic rodents was first developed in mice. A known (traditional) method of obtaining transgenic mammals, for example rats, is an adaptation of earlier methods developed for mice and consists in isolating fertilized ova (so-called unicellular embryos) from the female fallopian tubes after induced superovulation and copulation (Hogan, B., Beddington, R. , Costantini, F., and Lacy, E. (1994). Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Second Edition. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor)) in vitro introduction of foreign DNA into isolated unicellular embryos, and then introducing the modified embryos brought to the two-cell stage into the fallopian tubes of surrogate mothers, who are imaginary females (detailed description of each stage: Methods in Molecular Biology, Vol. 18: Transgenesis Techniques: Principles and Protocols, D. Murphy and A. Carter, Humana Press Inc., Totowa, NJ). Foster mothers are obtained earlier as a result of copulation with infertile (vasectomized) males.

Patent US5489742 zastrzega szczurzy model reumatoidalnego zapalenia stawów. Wykorzystano tradycyjną metodę otrzymywania transgenicznych szczurów. Szczepy szczurów transgenizowanych to: LEW i F344 Superowulacja wywołana jest poprzez ciągły wlew hormonu FSH (patrz też Armstrong, D. T. and Opavsky, M. A. (1988). Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone. Biol. Reproduct. 39, 511-518). Embriony transferowano zaraz po mikroinjekcji (w stadium jednokomórkowym). Jako matki zastępcze wykorzystano samice rasy Sprague-Dawley (łączone z veaectomizowanymi samcami).Patent US5489742 claims a rat model of rheumatoid arthritis. The traditional method of obtaining transgenic rats was used. The transgenic rat strains are: LEW and F344 Superovulation is induced by continuous infusion of FSH (see also Armstrong, DT and Opavsky, MA (1988). Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone. Biol. Reproduct. 39, 511 -518). The embryos were transferred immediately after microinjection (single-celled stage). Sprague-Dawley females (mated with vectomized males) were used as surrogate dams.

Opis EP0683226 ujawnia jedynie transgenezę myszy. Wykorzystywana jest standardowa procedura stosująca samice w ciąży urojonej jako matki zastępcze.EP0683226 only discloses mouse transgenesis. The standard procedure is to use imaginary pregnant females as surrogate mothers.

Zgłoszenie WO9314200 opisuje zwierzęcy model choroby Alzheimera. Opisana została transgenizacja zarówno myszy jak i szczurów. W przypadku myszy ujawniona technika polega na modyfikowaniu embrionalnych komórek macierzystych (ES). Procedura transgenizacji szczurów przebiega zasadniczo metodą tradycyjną. Jako szczep szczurów transgenizowanych wykorzystano: Sprague-Dawley. Superowulacja była wywołana poprzez jednorazową podskórną iniekcję PMSG bez użycia hCG. Embriony transferowane zaraz po mikroinjekcji. Jako samice na matki zastępcze wykorzystano samice w ciąży urojonej rasy Sprague-Dawley. W treści opisu opisano procedurę otrzymywania szczurów ale jak się wydaje otrzymano tylko myszy.Application WO9314200 describes an animal model of Alzheimer's disease. Transgenization of both mice and rats has been described. In the case of mice, the disclosed technique is to modify embryonic stem (ES) cells. The rats transgenation procedure is essentially by the traditional method. As the strain of transgenized rats used: Sprague-Dawley. Superovulation was induced by a single subcutaneous injection of PMSG without the use of hCG. Embryos transferred immediately after microinjection. Expectant Sprague-Dawley females were used as surrogate females. The text describes the preparation of rats, but it seems that only mice were obtained.

Patent US6372956 dotyczy transgenicznych szczurów ekspresjonujących ludzki CD4 i ludzki receptor chemokin. Treść ujawnienia nie obejmuje szczegółowego opisu procedury transgenizacji szczurów. Ograniczono się zaledwie do stwierdzenia, że zostały one przygotowane na zamówienie na podstawie kontraktów m.in przez dr Mullinsa z Edinburga, prawdopodobnie procedurą tradycyjną.US6372956 relates to transgenic rats expressing human CD4 and the human chemokine receptor. The content of the disclosure does not include a detailed description of the rat transgenation procedure. It was limited to the statement that they were prepared to order on the basis of contracts, among others, by Dr. Mullins from Edinburg, probably by a traditional procedure.

Zgłoszenie WO9915640 opisuje jedynie otrzymywanie transgenicznych myszy.The application WO9915640 only describes the preparation of transgenic mice.

Również w opisie JP2001238681 nie ujawniono opisu metody transgenizacji innej niż tradycyjna. Podobna uwaga aktualna jest również w odniesieniu do treści zgłoszenia WO0160984. Zgłoszenie WO0160151 dotyczy szczurzego modelu ludzkiego raka prostaty. W treści opisu ujawniono, że wykorzystano szczep Sprague-Dawley, brak jednak szczegółowego opisu metody. Również w patencie US6235885 ujawniono jedynie tradycyjną metodę otrzymywania transgenicznych myszy.Also, JP2001238681 does not disclose any description of a transgenation method other than conventional. A similar remark also applies to the content of the application WO0160984. Application WO0160151 relates to a rat model of human prostate cancer. It is disclosed in the text that the Sprague-Dawley strain was used, but no detailed description of the method was provided. Also, the patent US6235885 discloses only the traditional method of making transgenic mice.

WO0184921 opisuje tradycyjną metodę produkcji transgenicznego szczura z użyciem szczepu Sprague-Dawley i samic w ciąży urojonej.WO0184921 describes a traditional method of producing a transgenic rat using the Sprague-Dawley strain and phantom pregnant females.

JP3219821 opisuje sposób otrzymywania transgenicznego szczura. W porównaniu do metody tradycyjnej, istota ujawnionej metody polega na zsynchronizowaniu podawania hormonów z cyklem naturalnym. Wykorzystano samice w ciąży urojonej.JP3219821 describes a method for the preparation of a transgenic rat. Compared to the traditional method, the essence of the disclosed method is to synchronize the administration of hormones with the natural cycle. Imaginary pregnant females were used.

Wspólnym elementem znanych metod otrzymywania transgenicznych szczurów jest wykorzystywanie samic w ciąży urojonej jako matek zastępczych dla transplantowanych embrionów transgenicznych gryzoni.A common element of the known methods of obtaining transgenic rats is the use of imaginary pregnant females as surrogate mothers for transplanted transgenic rodent embryos.

Powszechnie wiadomo jednak, że w odróżnieniu od myszy, otrzymywanie samic większych ssaków w ciąży urojonej wiąże się z problemami, które stanowią istotną przeszkodę w efektywnym wykorzystywaniu tradycyjnej metody produkowania transgenicznych ssaków, np. szczurów (porównaj Wells T., Carter D., Journal of Neuroscience Methods, 108 (2001) 111-130)). W przypadku myszy, o odbytej kopulacji z bezpłodnym samcem, ś wiadczy obecność czopa kopulacyjnego w pochwieIt is well known, however, that, unlike mice, obtaining larger female mammals during phantom pregnancy poses problems that constitute a significant obstacle to the effective use of the traditional method of producing transgenic mammals, e.g. rats (cf. Wells T., Carter D., Journal of Neuroscience Methods, 108 (2001) 111-130)). In the case of mice that have successfully copulated with an infertile male, it is evidenced by the presence of a mating plug in the vagina.

PL 201 546 B1 samicy. Natomiast u dorosłych ssaków większych niż myszy, np. szczurów, czop kopulacyjny występuje bardzo rzadko. Ponadto wykluczone jest badanie samic na obecność plemników w wymazie pochwowym, ze względu na użycie vasektomizowanych samców, które nie dostarczają plemników (Charreau B. i wsp. 1996, Transgenic Research 1996, vol. 5, 223-23). Trudności w identyfikowaniu samic znajdujących się w ciąży urojonej prowadzą do obniżenia wydajności tradycyjnej metody otrzymywania transgenicznych zwierząt, poprzez błędne wykorzystanie jako matki zastępczej samicy nie będącej w ciąży, co powoduje zmniejszenie lub całkowite wyeliminowanie szansy transferowanych embrionów na implantację. Prowadzi to do znacznego obniżenia liczby samic, u których ciążą przebiega normalnie i rodzi się zmienione genetycznie potomstwo. Podsumowując, można uznać tradycyjną metodę otrzymywania transgenicznych zwierząt za niedostatecznie wydajną i nadmiernie rozbudowaną.Female. In contrast, in adult mammals larger than mice, e.g. rats, the copulatory plug is very rare. Moreover, testing of females for the presence of sperm in a vaginal swab is excluded due to the use of vasectomized males that do not supply sperm (Charreau B. et al. 1996, Transgenic Research 1996, vol. 5, 223-23). Difficulties in identifying false pregnant females lead to a decrease in the efficiency of the traditional method of obtaining transgenic animals by misusing a non-pregnant female as a surrogate mother, reducing or completely eliminating the chance of transferred embryos for implantation. This leads to a significant reduction in the number of females in which pregnancy is normal and genetically altered offspring are born. In summary, the traditional method of obtaining transgenic animals can be considered insufficiently efficient and overly developed.

Celem wynalazku jest dostarczenie ulepszonej metody otrzymywania transgenicznych ssaków, cechującej się większą wydajnością i łatwością wykonania niż metody dotychczas znane. W szczególności taka metoda powinna rozwiązywać wszystkie problemy związane z uzyskaniem samic na matki zastępcze.The object of the invention is to provide an improved method for the preparation of transgenic mammals, which is more efficient and easier to perform than the methods known so far. In particular, such a method should solve all problems related to obtaining females as surrogate mothers.

Tak określony cel został nieoczekiwanie zrealizowany w niniejszym wynalazku.The objective thus defined was unexpectedly achieved in the present invention.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania transgenicznego ssaka innego niż człowiek charakteryzujący się tym, że: (a) izoluje się zarodek z zapłodnionej samicy, (b) uzyskuje się in vitro transgeniczny zarodek wprowadzając obce DNA do komórki zarodka prowadząc mikroiniekcję obcego DNA, korzystnie plazmidu pTRGFP, do wyizolowanego zarodka, przy czym przed mikroiniekcją zarodek izolowany z bańki jajowodu inkubuje się w roztworze hialuronidazy, a następnie w medium M2 w atmosferze CO2, natomiast mikroiniekcję obcego DNA prowadzi się do jednego z dwóch przedją drzy, a nastrzyknięty zarodek inkubuje się w medium M2 w atmosferze CO2, (c) transplantuje się transgeniczny zarodek do jajowodów drugiej samicy uprzednio zapłodnionej plemnikiem drugiego samca i uzyskuje transgenicznego potomka, przy czym transgenicznego potomka identyfikuje się poprzez stwierdzenie braku dominującej cechy fenotypowej kodowanej jedynie przez materiał genetyczny drugiego samca, a skuteczność transgenizacji potwierdza się stwierdzając obecność obcego DNA lub jego fragmentu w komórce potomka nieposiadającego dominującej cechy fenotypowej.The subject of the invention is a method for the preparation of a transgenic non-human mammal, characterized in that: (a) an embryo is isolated from a fertilized female, (b) a transgenic embryo is obtained in vitro by introducing foreign DNA into an embryo cell by microinjecting foreign DNA, preferably plasmid pTRGFP, into an isolated embryo, whereby, prior to microinjection, the embryo isolated from the tubal bulb is incubated in a hyaluronidase solution, and then in the M2 medium in a CO2 atmosphere, while the foreign DNA microinjection is carried out into one of the two aisles, and the injected embryo is incubated in the M2 medium in in a CO2 atmosphere, (c) the transgenic embryo is transplanted into the fallopian tubes of the second female previously fertilized with the sperm of the other male and a transgenic descendant is obtained, whereby the transgenic descendant is identified by stating the absence of a dominant phenotypic feature encoded only by the genetic material of the other male, and the effectiveness of the transgenation by Rust occurs when a foreign DNA or fragment is present in a cell of a descendant that does not have a dominant phenotypic trait.

Korzystnie, w etapie (a) pierwszą samicę kontaktuje się z pierwszym samcem, po czym izoluje się z jej jajowodów zarodek. Korzystnie ssakiem jest szczur, przy czym korzystnie jako pierwszą samicę stosuje się samicę rasy Wistar. Korzystnie jako pierwszego samca stosuje się samca rasy Wistar. Równie korzystnie przed krzyżowaniem pierwszej samicy podaje się pierwszą gonadotropinę, korzystnie PMSG, a następnie drugą gonadotropinę, korzystnie hCG. Korzystnie gonadotropinę PMSG podaje się dootrzewnowe w ilości 20 IU na 52-54 godziny przed podaniem drugiej gonadotropiny hCG, którą podaje się dootrzewnowo w ilości 25 IU w dniu kopulacji. Równie korzystnie w etapie (b) skuteczność transgenizacji potwierdza się stwierdzając obecność obcego DNA lub jego fragmentu w komórce potomka nieposiadają cego dominują cej cechy fenotypowej. Korzystnie bezpo ś rednio przed mikroiniekcją zarodek izolowany z bańki jajowodu inkubuje się w roztworze hialuronidazy przez 15 minut, następnie inkubuje się przez 2-3 godziny w medium M2 w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Korzystnie mikroiniekcję roztworu obcego DNA prowadzi się do jednego z dwóch przedjądrzy, a następnie nastrzyknięty zarodek inkubuje się w medium M2 w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 do dnia następnego. Korzystnie jako drugą samicę stosuje się samicę rasy Wistar. Korzystnie jako drugiego samca stosuje się samca rasy Brown Norway. Korzystnie dominującą cechą fenotypową jest brązowe ubarwienie. Korzystnie w etapie (c) przed transplantacją drugą samicę krzyżuje się z drugim samcem, a skuteczność kopulacji potwierdza się stwierdzając obecność plemników w wymazie z pochwy. Korzystnie w etapie (c) przenosi się dwukomórkowy zarodek transgeniczny do jajowodu znieczulonej samicy.Preferably, in step (a) the first female is contacted with the first male and the embryo is isolated from its fallopian tubes. Preferably the mammal is a rat, preferably a Wistar female is used as the first female. Preferably, a Wistar male is used as the first male. Equally preferably, a first gonadotropin, preferably PMSG, is administered prior to mating the first female, followed by a second gonadotropin, preferably hCG. Preferably, the PMSG gonadotropin is administered intraperitoneally in an amount of 20 IU 52-54 hours prior to the administration of the second hCG gonadotropin, which is administered intraperitoneally in an amount of 25 IU on the day of mating. Equally preferably, in step (b), the effectiveness of the transgenation is confirmed by the presence of the foreign DNA or fragment thereof in the cell of the descendant not having a dominant phenotypic trait. Preferably, just before microinjection, the embryo isolated from the tubal bulb is incubated in a hyaluronidase solution for 15 minutes, then incubated for 2-3 hours in M2 medium at 37 ° C under 5% CO2. Preferably, the microinjection of the foreign DNA solution is carried out into one of the two pronuclei, and then the injected embryo is incubated in M2 medium at 37 ° C in a 5% CO2 atmosphere until the next day. Preferably a Wistar female is used as the second female. Preferably a Brown Norway male is used as the second male. Preferably the brown color is the dominant phenotypic trait. Preferably, in step (c) prior to transplantation, the second female is mated with the second male, and the effectiveness of the copulation is confirmed by the presence of sperm in the vaginal swab. Preferably in step (c) the two-cell transgenic embryo is transferred into the fallopian tube of an anesthetized female.

Nieoczekiwanie, przełamując dotychczasowe schematy obowiązujące w metodach otrzymywania transgenicznych gryzoni, zrezygnowano ze stosowania samic w ciąży urojonej i jako matki zastępcze użyto samice w normalnej ciąży. Identyfikacja transgenicznego potomstwa jest możliwa dzięki odpowiedniemu doborowi genotypów wykorzystywanych w sposobie gamet, a w korzystnej realizacji sposobu poprzez odpowiedni dobór genotypów wykorzystywanych samców i samic. Jedynie plemnik, a tym samym samiec, wykorzystany do zapł odnienia matki zastępczej przenosi dominują c ą , ł atwą do stwierdzenia cechę fenotypową (np. kolor sierści).Unexpectedly, breaking the current schemes used in the methods of obtaining transgenic rodents, the use of phantom pregnant females was abandoned and females in normal pregnancy were used as surrogate mothers. The identification of the transgenic progeny is possible due to the appropriate selection of the genotypes used in the gamete method, and in a preferred embodiment of the method, by the appropriate selection of the male and female genotypes used. Only the sperm, and thus the male, used to fertilize the surrogate mother carries a dominant, easily identifiable phenotypic trait (e.g. coat color).

W korzystnej realizacji sposobu według wynalazku samice na matki zastępcze krzyżowane są z pł odnymi samcami, a obecność plemników (czyli stwierdzenie ciąży) ustalana jest poprzez wymazIn a preferred embodiment of the method according to the invention, female surrogate mothers are crossed with fertile males, and the presence of sperm (i.e. pregnancy determination) is determined by swabbing

PL 201 546 B1 pochwowy. W przypadku szczurów zastosowanie samców brązowych szczepu BN (gen koloru sierści - brą zowy - jest dominują cy) pozwala na odróż nienie potomstwa pochodzą cego z normalnej ciąży (kolor sierści brązowy) od potomstwa, które rozwinęło się z embrionów poddanych mikroiniekcji (kolor biały). Zmienione genetycznie embriony (mikroiniekcja) pochodzą z krzyżówki białej samicy Wistar i biał ego samca Wistar.Vaginal. In the case of rats, the use of brown male BN strain (the coat color gene - brown - is dominant) makes it possible to distinguish offspring from normal pregnancy (coat color brown) from progeny that developed from microinjected embryos (white color). The genetically altered embryos (microinjection) come from a cross between a white Wistar female and a white Wistar male.

Nieoczekiwanie, zaprezentowany sposób posiada liczne zalety w porównaniu z dotychczas znanymi metodami otrzymywania transgenicznych ssaków. Przede wszystkim jest on pozbawiony wszystkich wad związanych ze stosowaniem samic w ciąży urojonej jako matek zastępczych, gdzie ciąża indukowana jest sztucznie poprzez kopulację z bezpłodnym (vasectomizowanym) samcem. Nie ma już konieczności przeprowadzania trudnego identyfikowania samic w ciąży urojonej. W ten sposób wyeliminowano także możliwość pomyłki w identyfikowaniu transgenicznego potomstwa i pomylenia go z potomstwem zapłodnionej samicy mylnie uznanej za samicę w ciąży urojonej (gdyż istnieje ryzyko nie pełnej vasectomii).Surprisingly, the presented method has numerous advantages over the so far known methods of obtaining transgenic mammals. First of all, it is devoid of all the disadvantages associated with the use of imaginary pregnant females as surrogate mothers, where pregnancy is induced artificially by copulation with an infertile (vasectomized) male. It is no longer necessary to carry out the difficult identification of imaginary females. In this way, the possibility of a mistake in identifying the transgenic offspring and confusing it with the progeny of a fertilized female mistakenly considered to be a phantom pregnant female was eliminated (because there is a risk of incomplete vasectomy).

Zwiększa to istotnie wydajność metody, a także ułatwia jej realizację.This significantly increases the efficiency of the method, and also facilitates its implementation.

Przebieg ciąży naturalnej jest dużo korzystniejszy niż ciąży urojonej, co również poprawia wydajność i jakość uzyskiwanego potomstwa transgenicznego.The course of natural pregnancy is much more favorable than that of imaginary pregnancy, which also improves the efficiency and quality of the obtained transgenic offspring.

Opis wynalazku uzupełniono następującymi figurami:The description of the invention is supplemented by the following figures:

Figura 1 to mapa konstruktu genetycznego TR-GFP użytego do wytworzenia szczurów transgenicznych, PhCMV-1 - promotor tetracyklinowy (ref. Plazmid pUHD10-3, prof. Heramann Bujard, http://www.zmbh.uni-heidelberg.de/Bujard/default.html), EGFP-1 - wektor zawierający gen EGFP - zielone białko fluorescencyjne (Clontech) http://www.clontech.com;Figure 1 is a map of the TR-GFP genetic construct used to generate the transgenic rats, PhCMV-1 - tetracycline promoter (ref. Plasmid pUHD10-3, Prof. Heramann Bujard, http://www.zmbh.uni-heidelberg.de/Bujard/ default.html), EGFP-1 - vector containing the EGFP gene - green fluorescent protein (Clontech) http://www.clontech.com;

Figura 2 przedstawia wynik reakcji PCR genotypowania osobników założycielskich F0 szczurów transgenicznych TR-GFP, M - marker wielkości DNA, 4,5,7,8 - przykładowe negatywne osobniki, 9,13,20,22 - transgeniczne osobniki TR-GFP, (+), (-) - kontrola pozytywna i negatywna reakcji PCR. Dla lepszego zrozumienia istoty wynalazku została ona zilustrowana poniższymi przykładami. Błędne byłoby jednak ograniczanie zakresu wynalazku jedynie do tych przykładowych realizacji.Figure 2 shows the result of the PCR genotyping of the founder individuals F0 of TR-GFP transgenic rats, M - DNA size marker, 4,5,7,8 - exemplary negative individuals, 9,13,20,22 - TR-GFP transgenic individuals, (+ ), (-) - positive and negative control of the PCR reaction. For a better understanding of the essence of the invention, it has been illustrated by the following examples. It would be wrong, however, to limit the scope of the invention to only these exemplary implementations.

P r z y k ł a d 1. Procedura otrzymywania transgenicznych ssaków na przykładzie szczurówExample 1. Procedure for the preparation of transgenic mammals on the example of rats

W procedurze transgenizacji wykorzystuje się dwa rodzaje szczepów szczurów hodowlanych:Two types of breeding rat strains are used in the transgenation procedure:

1. Wistar - kolor sierści biały1. Wistar - white coat color

2. BN (ang. Brown Norway) - kolor sierści brązowy2. BN (Brown Norway) - the color of the coat is brown

Dzień 1.Day 1.

Siedem samic szczurzych szczepu hodowlanego Wistar nastrzyknąć dootrzewnowo 20 IU gonadotropiny PMSG. Użyć samic 5-6 tygodniowych. Iniekcję wykonać o godzinie 10.00.Seven female rats of the Wistar breeding strain inject 20 IU of PMSG gonadotropin i.p. Use females 5-6 weeks old. Perform the injection at 10.00.

Dzień 2.Day 2.

Umieścić 20 samic Wistar 8-15 tygodniowych, przeznaczonych na matki zastępcze w klatkach hodowlanych, w których wcześniej przebywały samce.Place 20 8-15 week old Wistar females intended for surrogate dams in breeding cages where the males were previously housed.

Dzień 3.Day 3.

Samice z dnia pierwszego nastrzyknąć dootrzewnowe(o) gonadotropiną hCG 25 IU o godzinie 15.00. Następnie umieścić samice w klatkach z dorosłymi płodnymi samcami Wistar (1 samiec + 1 samica).On day one, females inject 25 IU hCG intraperitoneal gonadotrophin at 15.00. Then place females in cages with adult fertile Wistar males (1 male + 1 female).

Dzień 4.Day 4.

Zrobić wymaz z pochwy samicom z dnia 3 i sprawdzić obecność w wymazie plemników, świadczących o odbytej w nocy kopulacji. Następnie samice pozytywne (takie, u których stwierdzono obecność plemników) znieczulić poprzez wstrzyknięcie 1 ml środka Nembutal w dawce 60 mg/ml, a następnie przerwać rdzeń kręgowy. Wyciąć jajowody każdej z samic i umieścić w medium M2. Następnie przenieść do roztworu hialuronidazy i wyizolować embriony jednokomórkowe z bańki jajowodu. Inkubować embriony w roztworze hialuronidazy przez 15 minut, w celu oddzielenia komórek pęcherzykowych od embrionów. Przenieść embriony do medium M2 i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Opisane czynności wykonać przed godziną 12.00. Mikroiniekcję roztworu DNA o stężeniu 2 ng/μΐ rozpocząć o godzinie 14.00 (przedjądrza są wtedy dobrze widoczne). Roztwór DNA przygotować w następujący sposób: liniowy fragment DNA wyizolować z żelu agarozowego, oczyścić przy pomocy zestawu Qiaex II (Qiagen), odsolić przy pomocy membranTake a vaginal swab of day 3 females and check the swab for sperm, indicative of night mating. Subsequently, positive females (those with sperm) should be anesthetized by injecting 1 ml of Nembutal at a dose of 60 mg / ml, and then disrupting the spinal cord. Cut the fallopian tubes of each female and place it in M2. Then transfer to hyaluronidase solution and isolate unicellular embryos from the oviduct follicle. Incubate the embryos in the hyaluronidase solution for 15 minutes to separate the follicular cells from the embryos. Transfer the embryos to M2 medium and incubate in an incubator at 37 ° C under 5% CO2. Perform the described activities before 12.00. Start microinjection of the DNA solution with a concentration of 2 ng / μΐ at 2 p.m. (the pronuclei are then clearly visible). Prepare the DNA solution as follows: isolate the linear DNA fragment from an agarose gel, purify using the Qiaex II kit (Qiagen), desalinate using membranes

Millepore, a następnie przefiltrować przez filtr o średnicy porów 0,22 μm. Mikroiniekcję wykonać do jednego z dwóch przedjądrzy każdego embrionu, a następnie nastrzyknięte embriony inkubować do następnego dnia. O godzinie 15.00 połączyć samice Wistar z dnia drugiego z samcami płodnymi BN (1 samiec + 2 samice).Millepore and then filter through a 0.22 μm filter. Make a microinjection into one of the two pronuclei of each embryo, and then incubate the injected embryos overnight. At 3 p.m. combine the Wistar females from the second day with the fertile BN males (1 male + 2 females).

PL 201 546 B1PL 201 546 B1

Dzień 5.Day 5.

Samicom Wistar połączonym z samcami BN dnia poprzedniego zrobić wymaz pochwowy na obecność plemników. Pozytywne samice użyć do transplantacji nastrzykniętych embrionów. Samice - matki zastępcze - znieczulić wodzianem chloralu w dawce 250 mg/kg masy ciała, a następnie 2-komórkowe, nastrzyknięte DNA embriony przetransferować do jajowodów samic.Vaginal smear tests for sperm cells from Wistar females with BN males from the previous day. Positive females should be used for transplantation of injected embryos. Females - surrogate mothers - anesthetize with chloral hydrate at a dose of 250 mg / kg body weight, and then transfer the 2-cell DNA-injected embryos to the female fallopian tubes.

Dzień 27-28. Narodziny potomstwa matek zastępczych:Day 27-28. Birth of the offspring of surrogate mothers:

1. koloru białego - potencjalnie transgeniczne, powstałe z nastrzykniętych embrionów - krzyż ówka Wistar x Wistar1.white color - potentially transgenic, resulting from injected embryos - cross Wistar x Wistar

2. koloru brązowego - z naturalnej ciąży samic Wistar - krzyżówka BN x Wistar2. brown color - from natural pregnancy of Wistar females - BN x Wistar cross

Dzień 48-49.Day 48-49.

Genotypowanie (stwierdzenie obecności transgenu) u białego potomstwa z wykorzystaniem metody PCR lub Southern blotting.Genotyping (determining the presence of a transgene) in white offspring using PCR or Southern blotting.

P r z y k ł a d 2. Otrzymywanie transgenicznych szczurów zawierających konstrukt TR-GFP.Example 2. Preparation of transgenic rats containing the TR-GFP construct.

Metodę opisaną w przykładzie 1 użyto do otrzymania szczurów transgenicznych zawierających konstrukt TR-GFP (gen reporterowy GFP - ang. Green Fluorescent Protein) patrz Figura 1. Nastrzyknięto 150 embrionów, z których do stadium 2-komórkowego rozwinęło się około 70. Dwukomórkowe embriony transplantowano do 5 matek zastępczych, które urodziły 23 białe osobniki. Następnie izolowano DNA z tkanek białego potomstwa i wykonano reakcję PCR na obecność transgenu w genomie zwierząt - patrz figura 2. Wśród 23 białych szczurów obecność transgenu stwierdzono u czterech. W porównaniu z danymi Iiteraturowymi (Charreau B. i wsp. 1996, supra) osią gnię to wię kszą wydajność procesu transgenizacji, wyniki przedstawiono w Tabeli 1.The method described in example 1 was used to obtain transgenic rats containing the TR-GFP construct (GFP reporter gene - Green Fluorescent Protein) see Figure 1. 150 embryos were injected and about 70 developed into the 2-cell stage. 5 foster mothers with 23 white individuals. DNA was then isolated from the tissues of the white offspring and PCR was performed for the presence of the transgene in the genome of the animals - see figure 2. Of the 23 white rats, four were found to have the transgene. Compared to literature data (Charreau B. et al. 1996, supra), it achieved greater efficiency of the transgenation process, the results are presented in Table 1.

T a b e l a 1T a b e l a 1

Porównanie wydajności poszczególnych metod transgenizacji szczurówComparison of the performance of individual rat transgenation methods

Wybrane grupy badawcze Selected research groups my we Charreau et al.. Charreau et al .. Hochi et al.. Hochi et al .. Mullins et al.. Mullins et al .. Liczba urodzonych osobników Number of individuals born 23 23 116 116 66 66 8 8 (% przetransferowanych embrionów) (% of transferred embryos) (32,9) (32.9) (17,4) (17.4) (22) (22) (brak danych) (no data) Liczba osobników transgenicznych Number of transgenic individuals 4 4 5 5 10 10 5 5 (% urodzonych) (% born) (17,3) (17.3) (4,3) (4.3) (15) (15) (62) (62) Liczba osobników transgenicznych (% embrionów poddanych mikroinjekcji) Number of transgenic individuals (% of microinjected embryos) 2,6 2.6 0,5 0.5 1,2 1.2 brak danych no data

Ponadto przeprowadzono eksperymenty mające potwierdzić funkcjonowanie zintegrowanego transgenu. Doświadczenia wykonane na hodowlach pierwotnych fibroblastów pobranych z uszu potwierdziły prawidłowy wzór ekspresji u wszystkich czterech osobników. Następnie skrzyżowano transgeniczne osobniki założycielskie z nietransgenicznymi szczurami Wistar i u otrzymanego potomstwa, przy pomocy reakcji PCR (figura 2.) przeprowadzono badania na obecność transgenu. Prawidłową transmisję płciową, czyli przekazywanie transgenu potomstwu stwierdzono we wszystkich czterech przypadkach. Wyniki gromadzi Tabela 2.In addition, experiments were conducted to confirm the functioning of the integrated transgene. The experiments performed on the primary fibroblast cultures collected from the ears confirmed the correct expression pattern in all four individuals. Subsequently, transgenic founder individuals were crossed with non-transgenic Wistar rats and the obtained offspring were tested for the presence of the transgene by PCR (Figure 2). Normal sexual transmission, i.e. transmission of transgene to offspring, was found in all four cases. The results are collected in Table 2.

T a b e l a 2T a b e l a 2

Wzór przekazywania transgenu TR-GFP w poszczególnych liniach szczurów transgenicznych TR-GFPTR-GFP transgene transmission pattern in individual TR-GFP transgenic rat lines

Linie szczurów transgenicznych Transgenic rat lines 9 9 13 13 20 twenty 22 22 Liczba osobników potomnych pokolenia F1 The number of descendants of the F1 generation 17 17 23 23 23 23 27 27 Liczba osobników transgenicznych potomstwa F1 The number of transgenic offspring F1 10 10 10 10 3 3 17 17 Procent osobników transgenicznych potomstwa F1 Percentage of F1 offspring transgenic 58% 58% 43% 43% 13% 13% 63% 63%

PL 201 546 B1PL 201 546 B1

Claims

Patent claims

A method for the preparation of a transgenic non-human mammal characterized by:

a.the embryo is isolated from the ignition of the female,

b. a transgenic embryo is obtained in vitro by introducing foreign DNA into an embryo cell by microinjecting foreign DNA, preferably pTRGFP plasmid, into an isolated embryo, whereby prior to microinjection the embryo isolated from the tubal bulb is incubated in a hyaluronidase solution and then in M2 medium in an atmosphere CO2, while the microinjection of foreign DNA is carried out into one of the two pronuclei, and the injected embryo is incubated in the M2 medium in a CO2 atmosphere,

c. the transgenic embryo is transplanted into the fallopian tubes of the second female, previously fertilized with the sperm of the second male, and a transgenic descendant is obtained, where the transgenic descendant is identified by stating the absence of a dominant phenotypic feature encoded only by the genetic material of the other male, and the effectiveness of transgenation is confirmed by stating the presence of foreign DNA or a fragment thereof in a cell of a descendant not having a dominant phenotypic trait.

2. The method according to p. The method of claim 1, wherein in step (a) the first female is contacted with the first male, followed by isolating the embryo from its fallopian tubes.

3. The method according to p. The method of claim 2, wherein the mammal is a rat, preferably a Wistar female is used as the first female.

4. The method according to p. The method of claim 2, wherein the mammal is a rat, preferably a male Wistar breed is used as the first male.

5. The method according to p. A method according to claim 2, characterized in that prior to mating the first female, a first gonadotropin, preferably PMSG, is administered, followed by a second gonadotropin, preferably hCG.

6. The method according to claim 5. The method of claim 5, wherein the mammal is a rat, wherein the PMSG gonadotropin is administered intraperitoneally in an amount of 20 IU 52-54 hours prior to the administration of the second hCG gonadotropin, which is administered intraperitoneally in an amount of 25 IU on the day of mating.

7. The method according to claim The method of claim 1, wherein in step (b) the effectiveness of the transgenation is confirmed by the presence of foreign DNA or a fragment thereof in the cell of the descendant not having a dominant phenotypic trait.

8. The method according to p. The method according to claim 7, characterized in that immediately before microinjection, the embryo isolated from the tubule of the fallopian tube is incubated in a hyaluronidase solution for 15 minutes, then incubated for 2-3 hours in M2 medium at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO2.

9. The method according to p. The method according to claim 7 or 8, characterized in that the microinjection of the foreign DNA solution is carried out into one of the two pronuclei, and then the injected embryo is incubated in M2 medium at 37 ° C in a 5% CO2 atmosphere until the next day.

10. The method according to p. The method of claim 1, wherein the mammal is a rat, preferably a Wistar female is used as the second female.

11. The method according to p. The method of claim 1, wherein the mammal is a rat, preferably a Brown Norway male is used as the second male.

12. The method according to p. The process of claim 11, characterized in that brown color is the dominant phenotypic trait.

13. The method according to p. The method of claim 1, wherein in step (c) prior to transplantation, the second female is mated with the second male, and the copulation efficiency is confirmed by the presence of sperm in the vaginal swab.

14. The method according to p. The process of claim 1, characterized in that in step (c) the two-cell transgenic embryo is transferred into the fallopian tube of an anesthetized female.