PL199481B1

PL199481B1 - Sposób wytwarzania trifosforanów i difosforanów alkoholi oraz ich analogów

Info

Publication number: PL199481B1
Application number: PL370998A
Authority: PL
Inventors: Wojciech J. Stec; Konrad Misiura
Original assignee: Ct Bada & Nacute Molekularnych
Priority date: 2004-11-03
Filing date: 2004-11-03
Publication date: 2008-09-30
Also published as: PL370998A1

Abstract

Sposób wytwarzania trifosforanów lub difosforanów alkoholi o wzorze ogólnym 1, gdzie X i Y stanowią atomy tlenu, siarki, selenu lub grupę borowodorową, Z oznacza resztę kwasu pirofosforowego lub ortofosforowego lub ich pochodnych, a R resztę alkoholu a szczególności nukleozydów takich jak adenozyna, 3'-O-deoxyadenozyna, cytydyna, 3'-O-deoxycytydyna, guanozyna, 3'-O-deoxyguanozyna, urydyna, lub tymidyna, polega na tym, że związki te otrzymuje się wychodząc z fosfolanów o wzorze ogólnym 2, gdzie X, Y i R mają podane wyżej znaczenie, a R' i R" oznaczają atomy wodoru lub reszty alkilowe lub cykloalkilowe o od 1 do 6 atomach węgla. Jeśli X i Y są różne od siebie to związki 1 otrzymuje się w postaci mieszanin distereomerów w stosunku ok. 1:1. Związki 1 wyodrębnia się przy zastosowaniu standardowych metod bądź też utlenia się całkowicie lub częściowo na α atomie fosforu i wtedy izoluje.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania trifosforanów lub difosforanów alkoholi o wzorze ogólnym 1, gdzie X i Y stanowią atomy tlenu, siarki lub selenu, Z reszt ę kwasu pirofosforowego lub ortofosforowego lub ich pochodnych, a R resztę alkoholu, a w szczególności nukleozydów takich jak adenozyna, 3'-O-deoxyadenozyna, cytydyna, 3'-O-deoxycytydyna, guanozyna, 3'-Odeoxyguanozyna, urydyna lub tymidyna, z wykorzystaniem jako substratów fosfolanów o wzorze ogólnym 2, gdzie X, Y i R mają podane wyżej znaczenie, a R' i R oznaczają atomy wodoru lub reszty alkilowe lub cykloalkilowe o 1 do 6 atomach węgla. Jeśli X i Y są różne od siebie to związki 1 otrzymuje się w postaci mieszanin distereomerów w stosunku około 1:1. Związki 1 są wyodrębniane z mieszanin poreakcyjnych przy zastosowaniu standardowych metod bą dź też utleniane cał kowicie lub częściowo na α atomie fosforu i wtedy izolowane.

Tri- i difosforany nukleozydów, a przede wszystkim trifosforan adenozyny (ATP), spełniają wiele istotnych funkcji biologicznych. Związki te są na przykład substratami dla biosyntezy kwasów nukleinowych, fosforylacji biomolekuł oraz źródłem energii w metabolicznych procesach komórkowych. Trifosforany oraz ich liczne analogi są wykorzystywane w szeregu typach badań biomedycznych. Dotychczas opracowano wiele metod syntezy tri- i difosforanów nukleozydów i ich analogów [Burgess K., Cook D., Chem. Rev. 100, 2047-2059 (2000)]. Podstawowe metody otrzymywania tych związków polegają na fosforylacji bądź pirofosforylacji nukleozydów aktywowanych za pomocą POCl3 lub mieszaniny POCl3/H2O (metoda Ichikawy), nukleozydo-5'-fosfomorfolidów (metoda Khorany), bądź też cyklicznego chlorobezwodnika kwasu salicylofosforawego (metoda Ludwiga-Ecksteina). Lektura przedmiotu wskazuje jednak, iż ciągle aktualne jest poszukiwanie wydajnych metod syntezy o charakterze ogólnym. 5'-O-(a-Tiotrifosforany) rybonukleozydów i 2'-deoksyrybonukleozydów (NTPaS i dNTPaS) znalazły szerokie zastosowanie w biochemii [Eckstein F.; Ann. Rev. Biochem. 54, 367-402 (1985)] i biologii molekularnej [Verma S., Eckstein F., Ann. Rev. Biochem. 67, 99-134 (1998); Eckstein F., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10, 117-121 (2000)] a ostatnio również w medycynie [Fischer B., Chulkin A., Boyer J.L., Harden K.T., Gendron F.P., Beaudoin R.A., Chapal J., Hillaire-Boys D., Petit P., J. Med. Chem. 42, 3636-3646 (1999)]. Związki te są wykorzystywane na przykład do syntezy fragmentów DNA i RNA z wiązaniami tiofosforanowymi poprzez zastosowanie odpowiednich polimeraz DNA i RNA.

Sposób syntezy NTPaS i dNTPaS znany jest z opisów patentowych, niemieckiego DE 3 802 367 i amerykańskiego US 4 728 730. Tworzenie się w reakcji 5'-imidazolotiofosforanów z pirofosforanem a-tiotrifosforanu adenozyny i urydyny zostało opisane przez Ecksteina i Gindla [Gindl H., Eckstein F., Eur. J. Biochem. 13, 558-564, (1970)] już w 1970 r. Metoda ta posiada szereg ograniczeń i próby zastosowania jej w do rutynowej syntezy a-tiotrifosforanów nie powiodły się. Goody i Isakov zaproponowali [Goody R.S., Isakov M., Tetrahedron Lett. 27, 3599-3602 (1986)] otrzymanie 5'-O-a-tiotrifosforanów nukleozydów wychodząc z nieblokowanych nukleozydów i bez wydzielania produktów pośrednich. Pierwszym etapem tej metody była selektywna tiofosforylacja funkcji 5'-OH nukleozydu za pomocą tionochlorku fosforu prowadzona w warunkach odpowiednio dobranych dla poszczególnych substratów. Otrzymywane 5'-dichlorotiofosforany ulegały in situ reakcji z pirofosforanem, a uzyskane produkty były następnie hydrolizowane dając pożądane atiotrifosforany. Ludwig i Eckstein [Ludwig J., Eckstein F., J. Org. Chem. 54, 631-635 (1989)] zaproponowali nową metodę syntezy a-tiotri-fosforanów nukleozydów z wykorzystaniem związków trójwiązalnego fosforu jako odczynników fosfitylujacych. Wychodząc z odpowiednio blokowanych pochodnych deoksy i rybonukleozydów i 2-chloro-4N-1,3,2-benzodioksafosforynu (chlorofosforyn kwasu salicylowego) uzyskiwano odpowiednie 5'-fosforyny. Związki te poddane działaniu bis(tri-nbutyloamoniowego) pirofosforanu, utlenianiu za pomocą siarki elementarnej a następnie hydrolitycznemu usunięciu grup blokujących przekształcają się w 5'-O-(a-tiotrifosforany) nukleozydów. Ta metoda została również wykorzystana do uzyskania innych analogów trifosforanów {ditio [Ludwig J., Eckstein F., J. Org. Chem. 56,1777-1783 (1991)], borowodoro [Krzyżanowska B.K., He K., Hasan

A. , Shaw B.R., Tetrahedron 54, 5119-5128 (1998) & He K., Hasan A., Krzyżanowska B.K., Shaw

B. R., J. Org. Chem. 63, 5769-5773 (1998)] i seleno [Carrasco N., Huang Z., J. Am. Chem. Soc.126, 448-449 (2004)]}.

Związki fosfolanowe o wzorze ogólnym 2 były dotychczas stosowane do syntezy tio-, ditioi selenofosforanów alkoholi będących przede wszystkim analogami oligonukleotydów [Grajkowski A., Uznański B., Stec W.J., Patent RP 166079; Stec W.J., Grajkowski A., Uznański B.,

PL 199 481 B1

Patent US 5,359,052 & Stec W.J., Grajkowski A., Uznański B., Patent US 5,646,267]. Dotychczas do wytwarzania tri- i difosforanów alkoholi i ich analogów nie wykorzystywano, z wyjątkiem ditiafosfolanów [Okruszek A., Olesiak M., J. Med. Chem. 37, 3850-3854 (1994)], związków fosfolanowych.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że sposobem według wynalazku możliwe jest otrzymanie, w nieskomplikowanym chemicznie procesie, z wykorzystaniem jako substratów fosfolanów o wzorze ogólnym 2, z wysoką wydajnością i bez konieczności wyodrębniania produktów pośrednich, trifosforanów lub difosforanów alkoholi o wzorze ogólnym 1. Metoda ta, w przeciwieństwie do kilku wcześniej stosowanych procesów, ma charakter ogólny i może być używana do otrzymywania pochodnych szeregu typów alkoholi.

Sposób wytwarzania trifosforanów lub difosforanów alkoholi o wzorze ogólnym 1, gdzie X i Y stanowią atomy tlenu, siarki lub selenu, Z oznacza resztę kwasu pirofosforowego lub ortofosforowego lub ich pochodnych, a R resztę alkoholu, a w szczególności nukleozydu takiego jak adenozyna, 3'-O-deoxyadenozyna, cytydyna, 3'-O-deoxycytydyna, guanozyna, 3'-O-deoxyguanozyna, urydyna lub tymidyna, który według wynalazku polega na tym, że prowadzi się reakcję fosfolanów o wzorze ogólnym 2, w którym X, Y i R mają podane wyżej znaczenie, a R' i R oznaczają atomy wodoru lub reszty alkilowe lub cykloalkilowe o od 1 do 6 atomach węgla, z solami kwasu pirofosforowego lub ortofosforowego, lub ich analogami, ewentualnie w obecności aktywatora, a wytworzone związki o ogólnym wzorze 1, wyodrębnia się z mieszaniny reakcyjnej w znany sposób.

W sposobie wedł ug wynalazku, korzystnie, jako aktywatory stosuje się zwią zki zasadowe wybrane z grupy obejmującej diazabicyklo-[5.4.0]-undek-7-en (DBU), tert-butanolan potasu, trietyloamina lub imidazol.

W sposobie wedł ug wynalazku, korzystnie, jako środowisko reakcji stosuje się bezwodne, polarne rozpuszczalniki aprotonowe wybrane z grupy obejmującej jak acetonitryl, pirydyna, dimetyloformamid lub dimetylosulfotlenek.

Tworzące się w sposobie według wynalazku analogi trifosforanów lub difosforanów alkoholi o wzorze ogólnym 1, ewentualnie częściowo lub całkowicie utlenia się do innych pochodnych, również o wzorze ogólnym 1, stosują c odczynniki utleniają ce takie jak nadtlenek wodoru, nadsiarczan potasu, wodoronadtlenek tert-butylowy lub kwas meta-chloronadbenzoesowy. W sposobie według wynalazku, ewentualnie obecne grupy ochronne w związkach 1, usuwa się, korzystnie, poprzez zasadową hydrolizę, za pomocą wodnych roztworów amoniaku, albo wodorotlenku sodu lub potasu. W sposobie według wynalazku, korzystnie, związki 1 wyodrębnia się z mieszaniny reakcyjnej w standardowy sposób, a w szczególności wykorzystując chromatografię na złoż ach jonowymiennych, silikażelu i modyfikowanym silikażelu.

Jeśli używany alkohol zawiera w swojej strukturze jeszcze inne grupy hydroksylowe lub pierwszorzędowe aminowe to korzystnie jest poddać je blokowaniu używając jako grupy ochronne takie, które są usuwane poprzez hydrolizę w warunkach zasadowych. W metodzie według tego wynalazku jako reagenty stosuje się sole kwasu pirofosforowego lub ortofosforowego lub ich pochodnych, najkorzystniej dobrze rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych takie jak tri-nbutyloamoniowe, tetra-n-butyloamoniowe lub tri-n-oktyloamoniowe. W sposobie według tego wynalazku wskazane jest używanie aktywatorów zasadowych najkorzystniej DBU. Jako rozpuszczalniki w opisywanej metodzie stosuje się bezwodne, polarne rozpuszczalniki aprotonowe, najkorzystniej acetonitryl. Tworzące się trifosforany lub difosforany alkoholi o wzorze ogólnym 1, mogą być dalej przekształcane w inne analogi o wzorze ogólnym 1 poprzez ich częściowe lub całkowite utlenienie. Jako reagent utleniający stosuje się najkorzystniej nadtlenek wodoru lub Oxone®. Otrzymane produkty izoluje się z mieszaniny reakcyjnej najkorzystniej stosując techniki chromatograficzne, takie jak chromatografia cieczowa lub wysokosprawna chromatografia cieczowa na różnych złożach, z których najlepsze rezultaty osiąga się używając zł oż a DEAE-Sephadex® A-25 lub Econoshere® C-18 5 mikron.

Poniższej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku, nieograniczające jego zakresu.

P r z y k ł a d I.

5'-O-(a-tiotrifosforan) adenozyny (ATPaS)

Do roztworu 2',3'-O,O-diacetylo-5'-O-(2-tio-1,3,2-oksatiafosfolanu) adenozyny (70 mg, 0,2 mmol) w suchym acetonitrylu (2 ml) dodano w równomolowej ilości suszony sitami molekularnymi 3A roztwór pirofosforanu tris(tetra-n-butyloamoniowego) w acetonitrylu a następnie DBU (35 mg, 0,22 mmol).

Po 2 godzinach mieszaninę reakcyjną zatężono do objętości ok. 1 ml i do otrzymanego roztworu dodano 30% roztwór amoniaku (5 ml) i pozostawiono w szczelnym naczyniu w temperaturze 55°C przez

PL 199 481 B1 godz. Następnie mieszaninę reakcyjną zatężono i izolowano produkt wykorzystując chromatografię jonowymienną na nośniku DEAE Sephadex® A-25. Jako eluent używano wodny roztwór wodorowęglanu trietyloamoniowego (TEAB) w gradiencie stężeń od 0,4 do 0,8 molowego. Odpowiednie frakcje zatężono i przeprowadzono w sól sodową poprzez wymianę jonów na złożu Dowex®. Po odparowaniu wody z odpowiednich frakcji otrzymano pożądany produkt ATPaS z 27% końcową wydajnością. W analogiczny sposób wychodząc z 2',3'-O,O-diacetylo-5'-O-(2-tio-spiro-4,4-pentametyleno-1,3,2-oksatiafosfolanu) adenozyny uzyskano ATPaS z 42% wydajnością. Czystość produktu określono na większą niż 97% za pomocą analizy HPLC a jego strukturę potwierdzono za pomocą analizy widm ³¹P-NMR i MALDI-TOF MS.

P r z y k ł a d II.

5'-O-(a-tiotrifosforany) rybonukleozydów i 2'-deoksyrybonukleozydów (NTPaS i dNTPaS)

Wychodząc z 5'-O-(2-tio-1,3,2-oksatiafosfolanów) O-blokowanych rybo i 2'-deoksyrybonukleozydów i postępując wg sposobu opisanego w przykładzie I otrzymano z wydajnościami od 20 do 54% NTPaS i dNTPaS. Dane fizykochemiczne zsyntetyzowanych NTPaS i dNTPaS przedstawiono w tabeli 1.

P r z y k ł a d III.

5'-O-trifosforan adenozyny (ATP)

Do mieszaniny poreakcyjnej otrzymanej według przykładu I dodano 0,1 M roztwór Oxone® (3 ml, 0,3 mmol) i pozostawiono na 16 godz. Produkt izolowano wykorzystując chromatografię jonowymienną na nośniku DEAE Sephadex A-25. Jako eluent używano wodny roztwór wodorowęglanu trietyloamoniowego (TEAB) w gradiencie stężeń od 0,1 do 0,6 molowego. Odpowiednie frakcje zatężono i przeprowadzono w sól sodową poprzez wymianę jonów na złożu Dowex®. Po odparowaniu wody z odpowiednich frakcji otrzymano ATP z 35% końcową wydajnością. Czystość produktu określono na większą niż 97% za pomocą analizy HPLC a jego strukturę potwierdzono za pomocą analizy widm ³¹P-NMR i MALDI-TOF MS.

P r z y k ł a d IV.

5'-O-trifosforan 2'-deoxytymidyny (dTTP)

Do mieszaniny poreakcyjnej otrzymanej według przykładu II dodano 0,2 M roztwór nadtlenku wodoru (5 ml, 1 mmol) i pozostawiono na 16 godz. Produkt izolowano wykorzystując chromatografię jonowymienną na nośniku DEAE Sephadex A-25. Jako eluent używano wodny roztwór wodorowęglanu trietyloamoniowego (TEAB) w gradiencie stężeń od 0,1 do 0,6 molowego. Odpowiednie frakcje zatężono i przeprowadzono w sól sodową poprzez wymianę jonów na złożu Dowex®. Po odparowaniu wody z odpowiednich frakcji otrzymano dTTP z 28% końcową wydajnością. Czystość produktu określono na większą niż 97% za pomocą analizy HPLC a jego strukturę potwierdzono za pomocą analizy widm ³¹P-NMR i MALDI-TOF MS.

P r z y k ł a d V.

5'-O-(a-tiodifosforan) adenozyny (ADPaS)

Postępując sposobem opisanym w przykładzie I i używając fosforanu bis(tetra-n-butyloamoniowego) zamiast pirofosforanu otrzymano ADPaS z wydajnością 48%. Czystość produktu określono na większą niż 98% za pomocą analizy HPLC a jego strukturę potwierdzono za pomocą analizy widm ³¹P-NMR i MALDI-TOF MS.

P r z y k ł a d VI.

5'-O-(a-selenotrifosforan) adenozyny (ATPaSe)

Postępując sposobem opisanym w przykładzie I i wychodząc z 2',3'-O,O-diacetylo-5'-O-(2-seleno-1,3,2-oksatiafosfolanu) adenozyny otrzymano pożądany produkt ATPaSe z 34% końcową wydajnością. Czystość produktu określono na większą niż 95% za pomocą analizy HPLC a jego strukturę potwierdzono za pomocą analizy widm ³¹P-NMR i MALDI-TOF MS.

PL 199 481 B1

T a b e l a 1

Charakterystyka chromatograficzna (HPLC) spektroskopowa dNTPaS i NTPaS

Związek	Tr*	MS	³¹P-NMR^b	Jpa-Ρβ	Jpp-Ργ
(min)	MALDI	δ(ρρπι)	(Hz)	(Hz)
dTTPctS	7.16	497	Sp 44-O7(d), -23.07 (m), -9.5i(d) Rp 43.68(d), -23.07(111), -9.51 (d)	32.4	17.7
	7-55	30.0	17-7
	8.07		Sp 45-o8(d), -20.53 (m), -5-O3(d)	26.7	17.0
dATPaS	506	RP 44-75(d), - 20.65(10), -5.03 (d)
	8.30	25-9	17.0
	5-85		Sp 44-37(d), -22.14 (m), -7.80 (d)	26.5	18.4
dCTPaS	482	RP 44-O5(d), -22.42 (m), -7.8o(d)
	6.23	26.6	18.4
	7.20		Sp 44-78(d), -21.53 (m), -7-55(d)	24.1	16.4
dGTPaS	522	RP 44-52(d), -21.80(01), -7-55(d)
	7-39	24.8	16.4
	7-36		Sp 43-29(d), -23.17(01), -8.44(d)	27-4	19.6
UTPaS	499	Rp 42-95(d), -23.64(01), -8.44W)
	7.82	27.8	19.6
	8.02		Sp 43.67(d), -23.80 (m), -io.s6(d)	27.2	19-7
ATPaS		522	RP 43-32(d), -24.25(10), -io.56(d)
	8-45	27.9	19-7
	7-35		Sp 43-6o(d), -23.65(01),-io.39(d)	27-5	19-5
CTPaS	498	Rp 43-25(d),-24.07 (m),-io.39(d)
	7-75	27-9	20.4
	6-95		Sp 43-77(d), -22.08(01), -5,24(d)	311	20.4
GTPaS	538	RP 43-48(d), -22.20 (m),-5,24(d)
	7-40	29.8	20.4

^a - HPLC, w ciągu 20 minut stężenie acetonitrylu wzrasta od 0% do 60% ^b - widma wykonane w D2O

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania trifosforanów lub difosforanów alkoholi o wzorze ogólnym 1, gdzie X i Y stanowią atomy tlenu, siarki lub selenu, Z oznacza resztę kwasu pirofosforowego lub ortofosforowego lub ich pochodnych, a R resztę alkoholu, a w szczególności nukleozydu takiego jak adenozyna, 3'-O-deoxyadenozyna, cytydyna, 3'-O-deoxycytydyna, guanozyna, 3'-O-deoxyguanozyna, urydyna lub tymidyna, znamienny tym, że prowadzi się reakcję fosfolanów o wzorze ogólnym 2, w którym X, Y i R mają podane wyżej znaczenie, R' i R oznaczają atomy wodoru lub reszty alkilowe lub cykloalkilowe o od 1 do 6 atomach węgla, z solami kwasu pirofosforowego lub ortofosforowego, lub ich analogami, ewentualnie w obecności aktywatora, a wytworzone związki o ogólnym wzorze 1, wyodrębnia z mieszaniny reakcyjnej w znany sposób.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako aktywatory stosuje się związki zasadowe wybrane z grupy obejmującej diazabicyklo-[5.4.0]-undek-7-en (DBU), tert-butanolan potasu, trietyloamina lub imidazol.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako środowisko reakcji stosuje się bezwodne, polarne rozpuszczalniki aprotonowe wybrane z grupy obejmującej jak acetonitryl, pirydyna, dimetyloformamid lub dimetylosulfotlenek.

PL 199 481 B1
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obecne grupy ochronne w związkach o ogólnym wzorze 1, usuwa się , poprzez zasadową hydrolizę , za pomocą wodnych roztworów amoniaku, albo wodorotlenku sodu lub potasu.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że związki o ogólnym wzorze 1 wyodrębnia się z mieszaniny reakcyjnej w standardowy sposób, korzystnie wykorzystują c chromatografię na zł o ż ach jonowymiennych, silikażelu i modyfikowanym silikażelu.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że otrzymane sposobem według wynalazku, analogi trifosforanów lub difosforanów alkoholi o wzorze ogólnym 1, częściowo lub całkowicie utlenia się do innych pochodnych, również o wzorze ogólnym 1, stosując odczynniki utleniające takie jak nadtlenek wodoru, nadsiarczan potasu, wodoronadtlenek tert-butylowy lub kwas meta-chloronadbenzoesowy.