PL198175B1 - Polimer deoksyrybonukleotydowy oraz monomer wyjściowy tego polimeru o strukturze kwasu bis-(hydroksymetylo) fosfinowego - Google Patents

Abstract

Polimer deoksyrybonukleotydowy o ogólnym wzorze 2, w którym Np stanowi grupę o wzorze 3, gdzie B jest N-1 lub N-3 podstawioną tyminą, N-1- -cytozyną, N-9-adeniną lub N-9-guaniną, zaś X stanowi O, S lub Se, px stanowi grupę o wzorze 4, w której Y jest O lub NH, zaś R2 stanowi wodór, grupę alkilową, alkilopurynową lub alkilopirymidynową, wszystkie o 1 - 3 atomach węgla w łańcuchu alkilowym, ppx stanowi grupę o wzorze 5, w której X, Y i R2 mają wyżej podane znaczenie, pN stanowi grupę o wzorze 6, w której B i X mają wyżej podane znaczenie, zaś n są takie same lub różne i oznaczają liczby naturalne od 0 do trzydziestu, z tym, że wszystkie n nie oznaczają jednocześnie 0. 2. Monomer o ogólnym wzorze 1, w którym R1 stanowi grupę DMT, R2 stanowi grupę alkilową, alkilopirymidynową lub alkilopurynową, w których łańcuch alkilowy zawiera od 1 do 3 atomów węgla w łańcuchu alkilowym, Y stanowi atom tlenu lub grupę NH, zaś R3 stanowi grupę 2-cyjanoetylo- lub metylo-N,N-diizopropyloamidofosforynową, albo grupę acylową o 2 - 6 atomach węgla, zwłaszcza bursztynylową, oksalilową lub sarkozynylową, ewentualnie przyłączoną do złoża LCA-CPG

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy polimer deoksyrybonukleotydowy o ogólnym wzorze 2, w którym Np stanowi grupę o wzorze 3, gdzie B jest N-1-tyminą, N-1-cytozyną, N-9-adeniną lub N-9-guaniną, zaś X stanowi O, S lub Se, px stanowi grupę o wzorze 4, w której Y jest O lub NH, zaś R₂ stanowi wodór, grupę alkilową, zwłaszcza metylową, etylową lub propylową, alkilopurynową lub alkilopirymidynową, wszystkie o 1 - 3 atomach węgla w grupie alkilowej, ppx stanowi grupę o wzorze 5, w której X, Y i R2 mają wyżej podane znaczenie, pN stanowi grupę o wzorze 6, w której B i X mają wyżej podane znaczenie, zaś n są takie same lub różne i oznaczają liczby naturalne od 0 do trzydziestu, z tym, że wszystkie n nie oznaczają jednocześnie 0, będący lekiem nowej generacji o korzystnych właściwościach biofizycznych i biochemicznych oraz monomer o strukturze kwasu bis-(hydroksymetylo)fosfinowego o ogólnym wzorze 1, w którym R1 oznacza grupę dimetoksytrytylową, R2 stanowi wodór, grupę alkilową, alkilopirymidynową lub alkilopurynową, wszystkie o 1 - 3 atomach węgla w grupie alkilowej, Y stanowi atom tlenu lub grupę NH, zaś R3 stanowi wodór, grupę DMT, grupę acylową o 2 - 6 atomach węgla, zwłaszcza wybraną z grupy obejmującej grupę bursztynylową, oksalilową lub sarkozynylową, ewentualnie przyłączoną do złoża LCA CPG.

Oligodeoksyrybonukleotydy należą do leków nowej generacji. Mechanizm działania tej grupy leków opiera się na modulowaniu procesu ekspresji genów wirusowych i hamowaniu biosyntezy białek chorobotwórczych. Istnieje kilka możliwych strategii działania syntetycznych oligonukleotydów. Według strategii antysensowej komplementarne (zgodnie z regułami Watsona - Cricka) oligonukleotydy oddziaływują z jednoniciowym mRNA lub pre-mRNA tworząc heterodupleksy rozpoznawane przez białkowe enzymy degradujące (Uhlmann, E. & Peyman, A.,1990 Chem. Rev. 90, 544). Strategia rozpoznania sekwencyjnego typu antysensowego stosowana jest również w degradacji mRNA za pomocą enzymów oligonukleotydowych - rybozymów (Uhlenbeck, O. C. 1987, Naturę 328, 596) i deoksyrybozymów (Santoro, S.W., Joyce, G.F. 1997 Proc Natl Acad Sci USA 94: 4262-4266; Kuwabara, T., Warashina, M., Tanabe, T., Tani, K., Asano, S. & Taira, K. 1997 Nucleic Acids Res. 25, 3074). Innym podejściem jest tzw. terapia antygenowa, w której syntetyczne oligonukleotydy rozpoznają zgodnie z regułami Hoogsteena dwuniciowe sekwencje DNA i wpływają na proces transkrypcji genów (Giovannangeli, C. & Helene, C., 1997, Antisense Nucleic Acids Drug Dev, 7, 413). Kolejną strategią hamowania aktywności białek jest zastosowanie tzw. aptamerów białek - oligonukleotydów wyselekcjonowanych w procesie selekcji in vitro i tworzących z białkami trwałe kompleksy (Tuerk, C. & Gold, L., 1990, Science, 249, 505).

Poszukiwania nowych terapeutyków skupione są na badaniach analogów oligonukleotydów wykazujących bądź zwiększone powinowactwo do cząsteczek docelowych, bądź charakteryzujących się zwiększoną odpornością na działanie enzymów nukleolitycznych obecnych w procesach in vivo.

Syntetyczne oligonukleotydy stanowiące potencjalne terapeutyki są analogami oligonukleotydowymi zawierającymi różnorodnie modyfikowane elementy struktury naturalnych kwasów nukleinowych. Grupę analogów oligonukleotydowych zawierających modyfikowany szkielet fosforanowy stanowią oligonukleotydowe tiofosforany (Stec, W. J., Zon, G., Egan, W. & Stec, B., 1984, J. Am. Chem. Soc., 106, 6077), metanofosfoniany (Miller, P.S., Annan, N.D., McParland, S.M., 1980, J. Biol. Chem, 255, 9659, Miller, P.S., Annan, N.D., McParland, S.M., Pulford, K.B., 1982, Biochemistry, 21, 2507) i amidofosforany (Gryaznov, S. M., Skorski, T., Cucco, C., Nieborowska-Skorska, M., Chiu, C., Y., Lloyd, D. H., Chen, J., Koziołkiewicz, M. & Calabretta, B., 1996, Nucleic Acids Res., 24, 1508). Kolejną grupę modyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów stanowią połączenia zawierające modyfikowane nukleozydy [LNA - Locked Nucleic Acids (Koshkin, A. A., Singh, S. K., Nielsen, P., Rajwanshi, V. K., Kumar, R., Meldgaard, M., Olsen, C. E. & Wengel, J., 1998, Tetrahedron, 54, 3607), α-nukleozydy (Aramini, J. M., van de Sande, J. M. & Germann, M. W., 1997, Biochemistry, 36, 9715] a także związki polimeryczne oparte na innym niż fosforanowy szkielecie [PNA - Peptide Nucleic Acids (Nielsen, P. E., 1999, Curr. Opin. Struci Biol., 9, 353]. Większość tych połączeń wykazuje zwiększone powinowactwo do sekwencji docelowych oraz zwiększoną lub całkowitą odporność na działanie enzymów nukleolitycznych, zarówno endo- jak i egzonukleaz.

Zwiększoną odporność na działanie egzonukleaz uzyskano wprowadzając na 3'- i / lub 5'-końce oligonukleotydów glikole polietylenowe (Jaschke, A., Furste, J. P., Cech, D. & Erdmann, V.A., 1993, Tetrahedron Lett, 34, 301) lub modyfikowane monomery rybonukleozydowe takie jak pochodne 2'-O-alkilowe (Sproat, B. S., Lamond, A. l., Garcia, R. G., Beijer, B., Pieles, U., Douglas, M., Bohmann, K., Carmo-Fonseco, M., Weston, S. & O'Loughlin, S., 1991, Nucleic Acids Symp. Ser., 24, 59), 2'-aminowe

PL 198 175 B1 (Hobbs, J., Sternbach, H., Sprinzl, M. & Eckstein, F., 1973, Biochemistry, 12, 5138) lub 2'-fluorowe (Olsen, D. B., Benseler, F., Aurup, H., Pieken, W. A. & Eckstein, F., 1991, Biochemistry, 30, 9735). Efekt zwiększonej odporności na działanie egzonukleaz uzyskano także poprzez cyrkularyzację oligonukleotydów (Alazzouzi, E., Escaja, N., Grandas, A. & Pedroso, E., 1997, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 1506) lub tworzenie terminalnych struktur dupleksowych (Tang JY, Temsamani J, Agrawal S., 1993, Nucleic Acids Res, 21, 2729).

Dotychczas nie były znane ani polimer o wzorze 2, ani monomer o wzorze 1.

Polimer deoksyrybonukleotydowy o ogólnym wzorze 2, w którym Np stanowi grupę o wzorze 3, gdzie B jest N-1-tyminą, N-1-cytozyną, N-9-adeniną lub N-9-guaniną, zaś X stanowi O, S lub Se, px stanowi grupę o wzorze 4, w której Y oznacza O lub NH, zaś R₂ stanowi wodór, grupę alkilową zwłaszcza metylową, etylową lub propylową, alkilopurynową lub alkilopirymidynową, o 1 - 3 atomach węgla w łańcuchu alkilowym, ppx stanowi grupę o wzorze 5, w której X, Y i R2 mają wyżej podane znaczenie, pN stanowi grupę o wzorze 6, w której B i X mają wyżej podane znaczenie, zaś n są takie same lub różne i oznaczają liczby naturalne od 0 do trzydziestu, z tym, że wszystkie n nie oznaczają jednocześnie 0.

Polimer deoksyrybonukletydowy o wzorze 2, w którym wszystkie poszczególne oznaczenia mają podane wyżej znaczenie, można otrzymać metodą zautomatyzowanej syntezy amidofosforynowej z monomeru o ogólnym wzorze 1, gdzie R1 stanowi grupę DMT, R₂ stanowi grupę metylową, alkilopirymidynową lub alkilopurynową, Y stanowi atom tlenu lub grupę NH, zaś R3 stanowi grupę acylową o 2 - 6 atomach węgla, zwłaszcza grupę bursztynylową oksalilową lub sarkozynylową ewentualnie przyłączoną do złoża LCA CPG.

Monomer o ogólnym wzorze 1, w którym R1 stanowi grupę DMT, R₂ stanowi grupę alkilową, alkilopirymidynową lub alkilopurynową, w których łańcuch alkilowy zawiera 1 do 3 atomów węgla, Y stanowi atom tlenu lub grupę NH, zaś R3 stanowi grupę 2-cyjanoetylo- lub metylo-N,N-diizopropyloamidofosforynową, albo grupę acylową o 2 - 6 atomach węgla, zwłaszcza bursztynylową, oksalilową lub sarkozynylową, ewentualnie przyłączoną do złoża LCA CPG.

Związki o wzorze ogólnym 2, zawierające w swej strukturze reszty kwasu bis-(hydroksymetylo)fosfinowego, otrzymane z pochodnych kwasu bis(hydroksymetylo)fosfinowego - związków 1, wykorzystanych w charakterze monomerów do syntezy kwasów nukleinowych, mają bardzo korzystne właściwości biofizyczne i biochemiczne.

W połączeniach o wzorze ogólnym 2 monomer korzystnie px wbudowany jest na 5'- i/lub 3'-końcu oligomeru nukleotydowego, albo jako polimer monomeru px (łączonego za pomocą diestrowego wiązania fosforanowego, tiofosforanowego, lub selenofosforanowego) stanowi fragment zawarty pomiędzy sekwencjami oligonukleotydowymi, lub wbudowany jest w dowolnym miejscu łańcucha oligonukleotydowego.

Do wytwarzania związków o wzorze ogólnym 2, ze związków o wzorze 1, wykorzystuje się metody syntezy oligodeoksyrybonukleotydów na podłożu polimerowym, dobierając, według wynalazku, odpowiednio łącznik złoża LCA CPG (bursztynylowy, oksalilowy lub sarkozynylowy), czas kondensacji monomerów (od 300 do 600 s) oraz odpowiednie warunki usuwania grup ochronnych (przykładowo 28% wodny roztwór amoniaku, czas od 2 do 16 godzin, temperatury 25-55° C lub mieszanina tiofenolu, trietyloaminy i dioksanu 2/2/1 w czasie 1-10 minut), i usuwania oligomeru ze złoża LCA CPG (przykładowo 28% wodny roztwór amoniaku, czas 30-120 minut lub trietyloamina zawierająca 1% wody, 1-10 minut), a także sposób oczyszczania oligomeru według sposobu Zona i Steca metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej na odwróconej fazie - jednoetapowy, dla oligomeru nie zawierającego 5'-końcowej grupy DMT, DMT OFF, oraz dwuetapowy dla oligomeru zawierającego 5'-końcową grupę DMT, DMT ON (Zon, G. and Stec, W.J. Phosphorothioate oligonucleotides. In: Oligonucleotides and Analogues: A practical Approach., edited by Eckstein, F.Oxford:IRL Press, 1991,p. 87-108)).

Pochodne alkilopurynowe i alkilopirymidynowe kwasu bis-(hydroksymetylo)fosfinowego px, wprowadzone do łańcucha oligonukleotydowego 2 wykazują własności naturalnych kwasów nukleinowych, a poprzez zneutralizowanie ładunku kwasu fosfinowego zmniejszają jego własności jako polielektrolitu.

Na podstawie badań własnych, prowadzonych za pomocą spektrometrii masowej MALDI-TOF i elektroforezy żelowej, wykazano, że monomery px (Y=O, R₂=H) wprowadzone do łańcucha oligonukleotydowego są rozpoznawane przez, odpowiednio, 3'-egzonukleazy (PDE l z jadu węża, egzonukleaza z osocza ludzkiego) i 5'-egzonukleazy (PDE II ze śledziony cielęcej) i nie stanowią substratów dla wymienionych enzymów nukleolitycznych. Wprowadzenie terminalnych grup px do łańcucha oligonukleotydowego stanowi zabezpieczenie potencjalnych terapeutyków przed degradującym działaniem

PL 198 175 B1 egzonukleaz obecnych w medium komórkowym, przy nie zmienionym powinowactwie hybrydyzacyjnym do komplementarnej sekwencji kwasu nukleinowego. Różnica w temperaturach mięknięcia dupleksów utworzonych przez nonadekamery tymidyny i adenozyny po wprowadzeniu terminalnych monomerów px, gdzie Y=O i R₂=H, na 3'- i / lub 5'-koniec oligonukleotydu, wynosi nie więcej niż 2°C. Nonadekamery o wzorze ogólnym 2, gdzie Np oznacza grupę o wzorze ogólnym 3 (n₁=8 lub 9, B=N-1-tymina, X=O), px oznacza grupę o wzorze ogólnym 4 (Y=NH, R2=N-1-etylotymina), ppx oznacza grupę o wzorze ogólnym 5 (n2=0,1 lub 2, X=O, Y=NH, R2=N-1-etylotymina), pN oznacza grupę o wzorze ogólnym 6 (n1=8 lub 9, B=N-1-tymina, X=O) a n4=0, wykazują nieco zwiększone powinowactwo do dwuniciowego DNA d(A21C4T21). Temperatury mięknięcia odpowiednich trypleksów są średnio o 1°C wyższe na każdą wprowadzoną do nonadekameru cząsteczkę monomeru px w porównaniu do tryp^{leksu T}1^{9/ d(A}21^C4^T21⁾.

Sposób wytwarzania monomeru o ogólnym wzorze 1, gdzie R1 i R3 oznacza DMT, Y jest atomem tlenu, a R2 stanowi grupę metylową polega na tym, że ester metylowy kwasu bis(hydroksymetylo)fosfinowego poddaje się reakcji wyczerpującego alkilowania za pomocą chlorku 4,4'-dimetoksytrytylowego w aprotonowym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w pirydynie do wytworzenia związku o wzorze 1, gdzie R_1f R2 i R3, oraz Y mają wyżej podane znaczenie.

Sposób wytwarzania monomeru o wzorze 1, w którym R1 i R3 oznacza DMT, R2 stanowi grupę alkilopirymidynową lub alkilopurynową zaś Y jest atomem tlenu lub grupą NH, polega na usunięciu grupy metylowej z połączenia 1, w którym R1 i R3 oznacza DMT, Y jest tlenem, a R2 stanowi grupę metylową w środowisku alkalicznym, korzystnie wobec fe/Ybutyloaminy, po czym otrzymaną sól metylo-fe/Ybutyloamoniową kwasu bis(DMT-O-hydroksymetylo)fosfinowego poddaje się reakcji kondensacji z alkoholem lub aminą alkilopirymidynową lub alkilopurynową gdzie grupa alkilowa oznaczająca łańcuch węglowodorowy o C1 do C3, jest przyłączona do atomu azotu N-1 lub N-3 pirymidyny, zwłaszcza tyminy lub cytozyny lub N-9 puryny, zwłaszcza adeniny lub guaniny, w środowisku bezwodnym, korzystnie w pirydynie, wobec trifenylofosfiny i czterochlorku węgla, albo odpowiedniego alkoholu alkilopirymidynowego lub alkilopurynowego, wobec 1-mezytylenosulfonylo-3-nitro-1,2,4-triazolu. Z wyodrębnionego chromatograficznie związku o wzorze 1, w którym R1 i R3 oznacza DMT, a R2 stanowi grupę alkilopirymidynową lub alkilopurynową zaś Y stanowi atom tlenu lub grupę NH, usuwa się selektywnie jedną grupę ochronną w środowisku kwaśnym, korzystnie za pomocą kwasu p-toluenosulfonowego, korzystnie w bezwodnym metanolu, a otrzymany związek o wzorze 1, w którym R1 oznacza DMT, R2 stanowi grupę alkilopirymidynową lub alkilopurynową oraz Y oznacza atom tlenu lub grupę NH-, zaś R3 oznacza wodór, poddaje się albo reakcji fosfitylacji, korzystnie za pomocą chloro-2-cyjanoetylo- lub metylo-N,N-diizopropyloamidofosforynu w bezwodnym rozpuszczalniku aprotonowym z dodatkiem etylo-N,N-diizopropyloaminy, korzystnie w chlorku metylenu, do uzyskania związku o wzorze 1, w którym R1 stanowi grupę DMT, R2 stanowi grupę alkilopirymidynową lub alkilopurynową Y stanowi atom tlenu lub grupę NH, zaś R3 stanowi grupę 2-cyjanoetylo- lub metylo-N,N-diizopropyloamidofosforynową, albo reakcji kondensacji z bezwodnikiem kwasu bursztynowego, chlorkiem oksalilu lub odpowiednio zablokowaną pochodną sarkozyny, w bezwodnej pirydynie, do uzyskania związku o wzorze 1, gdzie R1 stanowi grupę DMT, R2 stanowi grupę alkilopirymidynową lub alkilopurynową, Y stanowi atom tlenu lub grupę NH, zaś R3 stanowi grupę bursztynylową, oksalilową lub sarkozynylową, który następnie poddaje się reakcji kondensacji ze zaktywowanym złożem LCA CPG wobec DCC w znany sposób.

Sposób wytwarzania monomeru o ogólnym wzorze 1, w którym R1 stanowi grupę DMT, R2 stanowi grupę metylową, Y stanowi atom tlenu, zaś R3 stanowi grupę 2-cyjanoetylo-N,N-diizopropyloamidofosforynową, lub grupę acylową wybraną z grupy obejmującej bursztynylową oksalilową lub sarkozynylową przyłączoną do złoża LCA CPG, polega według wynalazku na tym, że najpierw wytwarza się związek o wzorze ogólnym 1, gdzie R1 stanowi grupa DMT, Y stanowi atom tlenu, zaś R2 jest grupą metylową, przez selektywne alkilowanie jednej funkcji hydroksylowej estru metylowego kwasu bis(hydroksymetylo)fosfinowego, korzystnie za pomocą równomolowej ilości chlorku 4,4'-dimetoksytrytylowego, w rozpuszczalniku aprotonowym, korzystnie w pirydynie, w temperaturze pokojowej otrzymując związek 1, gdzie R1 oznacza DMT, R2 jest grupą metylową, R3 = H i Y = O, który poddaje się reakcji fosfitylacji, korzystnie za pomocą chloro-2-cyjanoetylo- lub metylo-N,N-diizopropyloamidofosforynu w bezwodnym rozpuszczalniku aprotonowym z dodatkiem etylo-N,N-diizopropyloaminy, korzystnie w chlorku metylenu do uzyskania związku o wzorze 1, w którym R1 stanowi grupę DMT, R2 stanowi grupę metylową, Y stanowi atom tlenu, zaś R3 stanowi grupę 2-cyjanoetylo lub metylo-N,N-diizopropyloamidofosforynową albo kondensacji z bezwodnikiem kwasu bursztynowego, chlorkiem oksalilu lub odpowiednio zablokowaną pochodną sarkozyny, w bezwodnej pirydynie do uzyskania

PL 198 175 B1 związku o wzorze 1, gdzie R₁ stanowi grupę DMT, R2 stanowi grupę metylową, Y stanowi atom tlenu, zaś R3 stanowi grupę bursztynylową, oksalilową lub sarkozynylową, który następnie poddaje się reakcji kondensacji ze zaktywowanym złożem LCA CPG wobec DCC w znany sposób.

Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku.

P r z y k ł a d I

Synteza związku 1, gdzie R1 i R3 stanowi grupa DMT, R2 stanowi grupa Me a Y stanowi atom tlenu.

Do roztworu estru metylowego kwasu bis(hydroksymetylo)fosfinowego (1 mmol) w bezwodnej pirydynie (10 ml) dodano chlorek 4,4'-dimetoksytrytylowy (2.5 mmol). Po 20 godzinach mieszania, roztwór reakcyjny zatężono do gęstego oleju, pozostałość koewaporowano kilkakrotnie z bezwodnym etanolem, i następnie z bezwodnym toluenem. Produkt oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, stosując gradient chloroform-metanol (0-3% metanolu) jako eluent.

Wydajno^ść 72%^{, 1}H N^MR (CDCh): 7.41-6.71 ^ppm (m, ²⁶ H, ^proton^y aromatycznej ³.78 ^{i 3}.77 ppm (dwa s, 12 H, 4 x O-CH3), 3.57 (d, J_P-h = 10.5 Hz,3 H, OCH3), 3.68 (dd, Jh-h = 12.9 Hz, J_P-h = 9.0 Hz, 2H, CH2-P), 3.44 (dd, Jh-h = 12.8 Hz, J_P-h = 9.9 Hz, 2H, CH2-P), ³¹P NMR 48.91 ppm, MS FAB ⁽m/^z): 744 ⁽M)+.

P r z y k ł a d II

Synteza soli metylo-tert-butyloamoniowej kwasu bis-(DMT-hydroksymetylo)fosfinowego 1, gdzie R1 i R3 stanowi grupa DMT, R2 stanowi wodór, a Y stanowi atom tlenu.

Roztwór estru metylowego kwasu bis(DMT-O-hydroksymetylo)fosfinowego (5 mmol) w tert-butyloaminie (10 ml) umieszczono w zamkniętej szklanej ampule i ogrzewano w 100 stopniach Celsjusza przez 6 godzin, po czym roztwór oziębiono i odsączono wytrącony osad soli. Wydajność produktu w^yniosła 90%. ^{31 p NMR} (CDCh): 2⁷.^{7 FA}B ^MS m^/z: ⁷²⁹ [^M-^H-⁸⁶(^kation metyb-ferf-butyloamoniowy)].

P r z y k ł a d III

Synteza związku 1, gdzie R2 stanowi grupa N-1- etylotyminowa, a Y stanowi atom tlenu.

Do roztworu soli metylo-tert-butyloamoniowej kwasu bis(hydroksymetylo) fosfinowego (1 mmol) i N-1(2-hydroksyetylo)tyminy (1 mmol) w bezwodnej pirydynie (20 ml) dodano roztwór MSNT (1.1 mmol) w bezwodnej pirydynie (5 ml). Po 20 godzinach mieszania dodano następną porcję MSNT (0.75 mmol) i mieszano dalsze 120 godzin. Po oddestylowaniu rozpuszczalnika produkt oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, stosując chloroform-metanol (0-3% metanolu) jako eluent.

Wydajność 60%, ¹H NMR (CDCI3): 7.38 - 6.71 (m, 27 H, 2 x DMT, H-6), 4.09-4.00 (m, 2 H, CH2-O-P), 3.81 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2 -N), 3.78 i 3.77 (dwa s, 12 H, 4 x O-CH3), 3.69 (dd, Jh-h = 13.0 Hz, Jh-p = 8.5 Hz, 2 H, CH2-P), ), 3.41 (dd, Jh-h= 12.8 Hz, Jh-p = 9.7 Hz, 2 H, CH2-P), 1.64 (d, J = 1.1 Hz, 3 H, CH3-T), 3¹p NMR 49.13 ppm, MS FAB (m/z): 882 M+, 881 (M-H)+.

P r z y k ł a d IV

Synteza związku 1, gdzie R1 jest grupa DMT, R2 stanowi grupę N-1-etylotyminową, R3 jest wodorem a Y stanowi atom tlenu.

Do roztworu bis-4,4'-dimetoksytrytylowej pochodnej estru etylotyminowego kwasu bis(hydroksymetylo)fosfinowego (produktu opisanego w przykładzie III) (1 mmol) w bezwodnym toluenie (20 ml) dodano kwas p-toluenosulfonowy (2.5 mmol). Po 5 minutach mieszania, roztwór reakcyjny zobojętniono pirydyną (1 ml), a następnie zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt wyodrębniano za pomocą cienkowarstwowej chromatografii płytkowej na żelu krzemionkowym, stosując chloroform-metanol (⁰-¹⁰% metanol) jako efoent. ^Wydajno^{ść 64}%^{,:31 p NMR}: ^{48.75 MS F}AB (m^/z): ⁵⁷⁹ (^M-^H)+.

P r z y k ł a d V

Synteza związku 2, gdzie Np: n1=1, B=A X=O; px: Y=O, R2=H; pN: n3=1, B=C, X=O; n2=n4=0.

Syntezę przeprowadzono według standardowej procedury syntezy DNA metodą amidofosforynową na aparacie firmy Applied Biosystem Model 394 (DNA/RNA Synthesizer). Standard oznacza syntezę oligomerów na tzw. Etapie DMT OFF i jednostopniowe oczyszczanie chromatograficzne. Odpowiednio przygotowane złoże LCA CPG, zawierające na łączniku bursztynylowym standardowo chroniony monomer (5'-DMT 2'-deoksycytydynę) poddano reakcji detrytylacji w środowisku kwaśnym, reakcji kondensacji (coupling) z 2-cyjanoetylo-N,N-diizopropyloamidofosforynem monomeru 1 (gdzie R1 stanowi grupa DMT, R2 stanowi grupa metylowa, Y stanowi atom tlenu) w obecności tetrazolu w acetonitrylu (stosując wydłużony czas reakcji kondensacji 600 s zamiast typowego czasu kondensacji w syntezie DNA - 60 s), reakcji acylowania (capping) oraz reakcji utleniania jodem w mieszaninie rozpuszczalników pirydyna /woda/ THF. Następny cykl syntezy polegał kolejno na reakcji detrytylacji

PL 198 175 B1 produktu przyłączonego do złoża i kondensacji z 2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylo amidofosforynem standardowo chronionego nukleozydu (w tym przykładzie 5'-DMT-N-benzoilo-2'-deoksyadenozyny). Pozostałe parametry typowej procedury reakcji acylowania i utleniania nie uległy zmianie. Produkt wyodrębniona i oczyszczano metodą DMT OFF. Po usunięciu 5'-końcowej grupy DMT produkt hydrolizowano ze złoża CPG w obecności 28% wodnego roztworu amoniaku i poddawano jednoetapowej procedurze oczyszczania za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej na odwróconej fazie (RP HPLC) w gradiencie acetonitrylu w 0.1 M roztworze wodorowęglanu trietyloaminy o pH 7,5. Wydajność syntezy w skali 1 umola - 1.6 jednostek optycznych (A260), MALDI-TOF: 727.59 (M-H)+.

P r z y k ł a d VI

Synteza związku 2, gdzie n1=n2=o; px: Y=O, R2=H; pN: n₃=2o, B według sekwencji

5'-GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA-3', X=S; ppx: n₄=1 X=S, Y=O, R₃=H;

Syntezę związku 2, gdzie n1=n2=o; px: Y=O, R2=H; pN: n₃=2o, B według sekwencji

5'-GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA-3' X=S; ppx: n₄=1 X=S, Y=O, R₃=H; na złożu LCA CPG 1, w którym

R2 jest grupą metylową i Y jest atomem tlenu, przeprowadzono według typowej procedury amidofosforynowej. Syntezę przeprowadzono według standardowej procedury syntezy DNA na aparacie firmy Applied Biosystem Model 394 (DNA/RNA Synthesizer). Standard oznacza zakończenie syntezy na DMT ON i dwustopniową procedurę oczyszczania i usuwania grupy DMT). Odpowiednio przygotowane złoże LCA CPG, zawierające monomer 1, gdzie R1= DMT, R2 jest grupą metylową, Y stanowi tlen, zaś R3 jest grupą bursztynylową poddano reakcji detrytylacji w środowisku kwaśnym, reakcji kondensacji (coupling) z monomerem, 2-cyjanoetylo-N,N-diizopropyloamidofosforynem standardowo chronionej 2'-deoksyadenozyny, w obecności tetrazolu w acetonitrylu, reakcji acylowania (capping) oraz reakcji usiarczania za pomocą S-tetry. Następne cykle syntezy polegały kolejno na reakcji detrytylacji produktu przyłączonego do złoża polimerowego, kondensacji z 2-cyjanoetylo-N,N-diizopropyloamidofosforynem standardowo chronionego kolejnego monomeru (T, dC, dA i dG oraz związku 1, w którym R2 jest grupą metylową, Y stanowi atom tlenu) według podanej sekwencji. W procesie kondensacji (coupling) modyfikowanych monomerów stosowano wydłużony czas reakcji (do 6oo s). Pozostałe parametry typowej procedury (acylowania i usiarczania) nie uległy zmianie. Produkt wyodrębniano i oczyszczano metodą DMT ON. Produkt zawierający 5'-terminalną grupę DMT usuwano ze złoża za pomocą stężonego wodnego roztworu amoniaku (2h, temperatura pokojowa) i oczyszczano dwustopniowo metodą RP-HPLC według procedury Zona i Steca. Pozostałe parametry procedury syntezy nie odbiegały od warunków standardowych. Wydajność syntezy w skali 1 umola - 14.9 jednostek optycznych (A26o), MALDI-TOF: 6842 (M.cz. 6841).

P r z y k ł a d VII

Synteza związku 2, gdzie Np: n1=8, B=T, X=O; px: Y=O, R2=H; ppx: n2=1 X=O, Y=O, R2=H; pN: n3=9, B=T, X=O; n4=o.

Syntezę związku 2, gdzie Np: n1=8, B=7, X=O; px: Y=O, R2=H; ppx: n2=1 X=O, Y=O, R2=H; pN: n3=9, B=T, X=O; n4=o przeprowadzono według typowej procedury amidofosforynowej (jak w przykładzie V), wykorzystując odpowiednio chronioną tymidyne przyłączoną do złoża LCA CPG. W etapie kondensacji użyto 2-cyjanoetylo-N,N-diizopropyloamidofosforyn odpowiednio chronionej tymidyny i związku 1, w którym R1 stanowi grupę DMT, R2 stanowi grupę metylową lub etylotyminową i Y jest atomem tlenu. W procesie kondensacji (coupling) modyfikowanych monomerów stosowano wydłużony czas reakcji (do 6oo s). Pozostałe parametry procedury syntezy nie odbiegały od warunków standardowych. Produkt wyodrębniano i oczyszczano metodą DMT ON. Produkt zawierający 5'-terminalną grupę DMT usuwano ze złoża za pomocą stężonego wodnego roztworu amoniaku (2h, temperatura pokojowa) i oczyszczano dwustopniowo metodą RP-HPLC według procedury Zona i Steca.

Wydajność syntezy w skali 1 umola - 16.o jednostek optycznych (A26o), MALDI-TOF: 5485 (M.cz. 5484).

P r z y k ł a d VIII

Synteza związku 2, gdzie n1=n2=o; px: Y=O, R2=H; pN: n3=2o, B według sekwencji: 5'-TCCAGCTCCTCATGGGAGAG-3', X=O; ppx: n₄=1, X=O, Y=O, R₃=H.

Syntezę związku 2, gdzie n1=n2=o; px: Y=o, R2=H; pN: n3=2o, B według sekwencji: 5'-TCCAGCTCCTCATGGGAGAG-3', X=O; ppx: n4=1, X=O, Y=O, R2=H przeprowadzono według typowej procedury amidofosforynowej (jak w przykładzie VII), wykorzystując odpowiednio chroniony monomer 1 (R1 stanowi grupę DMT, R2 stanowi grupę alkilową) przyłączony do złoża LCA CPG. W etapie kondensacji użyto odpowiednio chronionych nukleozydów T, dC, dA i dG i związek 1, w którym R2 jest grupą metylową a Y atomem tlenu. W procesie kondensacji (coupling) modyfikowanego

PL 198 175 B1 monomeru stosowano wydłużony czas reakcji (do 600 s). Pozostałe parametry procedury syntezy nie odbiegały od warunków standardowych (jak w przykładzie VI).

Wydajność syntezy w skali 1 urno I a - 13.7 jednostek optycznych (A260). MALDI-TOF: 6493 (M.cz. 6493).

P r z y k ł a d IX.

Synteza związku 2, gdzie Np: ni=1 B=C, X=O; px: Y=O, R₂=H; ppx: n₂=16 X=O, Y=O, R₂=H; pN: n3=1 B=C X=O; n4=0;

Syntezę przeprowadzono według typowej procedury amidofosforynowej, wykorzystując do kondensacji 2-cyjanoetylo-N,N-diizopropyloamidofosforyn odpowiednio chronionej dC i związku 1, w którym R1 = DMT, R2 = Me i Y = O. W procesie kondensacji modyfikowanych monomerów stosowano wydłużony czas reakcji (do 600 s). Pozostałe parametry procedury syntezy nie odbiegały od warunków standardowych (jak w przykładzie V).

Wydajność syntezy w skali 1 umola - 1.5 jednostek optycznych (A260), MALDI-TOF: 3709 (M.cz. 3711).

P r z y k ł a d X

Degradacja związku 2, gdzie Np: n1=9 B=T, X=O; px: Y=O, R2=H, n2=n4=0; pN: n3=9 B=T, X=O, za pomocą 3'-egzonukleaz.

Enzymatyczną degradację związku 2, gdzie Np: n1=9 B=T, X=O; px: Y=O, R2=H, n2=n4=0; pN: n3=9, B=T, X=O, przeprowadzono za pomocą fosfodiesterazy z jadu węża (sv PDE l) lub za pomocą 3'-egzonukleazy z osocza ludzkiego (50% roztwór osocza). Roztwór związku 2 (0.02 jednostki optyczne) w 100 mM buforze Tris / HCI o pH 7.2, zawierającym 1 mM jonów Zn+2 inkubowano z 0.5 mU enzymu. Analizę produktów reakcji prowadzono za pomocą spektrometrii masowej MALDI-TOF lub za pomocą elektroforezy żelowej na 20% denaturującym żelu poliakryloamidowym. Po odpowiednio 3 lub 6 godzinach inkubacji w medium reakcyjnym stwierdzono jedynie obecność oligonukleotydu 2, gdzie Np: n1=9 B=T, X=O; px: Y=O, R₂=H; n₂=n3=n4=0.

P r z y k ł a d XI

Synteza związku 2, gdzie Np: n1=1, B=C, X=O; px: Y=NH, R₂=N-1-etylotymina; pN: n3=1, B=Ą X=O; n₂=n4=0.

Syntezę przeprowadzono według standardowej procedury jak w przykładzie V. Odpowiednio przygotowane złoże LCA CPG, zawierające na łączniku bursztynylowym standardowo chroniony monomer (5'-DMT N-benzoilo-2'-deoksyadenozynę) poddano reakcji detrytylacji w środowisku kwaśnym, reakcji kondensacji (coupling) z 2-cyjanoetylo-N,N-diizopropyloamidofosforynem monomeru 1 (gdzie R1 stanowi grupa DMT, R₂ stanowi N-1-etylotymina, Y stanowi grupa NH) w obecności tetrazolu w acetonitrylu (stosując wydłużony czas reakcji kondensacji 600 s), reakcji acylowania (capping) oraz reakcji utleniania jodem w mieszaninie rozpuszczalników pirydyna / woda / THF. Następny cykl syntezy polegał kolejno na reakcji detrytylacji produktu przyłączonego do złoża i kondensacji z 2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylo amidofosforynem standardowo chronionego nukleozydu (w tym przykładzie 5'-DMT-N-benzoilo-2'-deoksycytydyny), Pozostałe parametry typowej procedury reakcji acylowania i utleniania nie uległy zmianie. Po usunięciu 5'-końcowej grupy DMT produkt hydrolizowano ze złoża CPG w obecności 28% wodnego roztworu amoniaku i poddawano jednoetapowej procedurze oczyszczania za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej na odwróconej fazie (RP HPLC) w gradiencie acetonitrylu w 0.1 M roztworze wodorowęglanu trietyloaminy o pH 7,5. Wydajność syntezy w skali 1 łomota - ¹.⁵ je^dnoste^k o^ptyczn^yc^h (^A26o). ^MALDI-^TOF: ⁸⁷⁹ (^M)+.

P r z y k ł a d XII

Synteza związku 2, gdzie Np: n1=8, B=T, X=O; px: Y=O, R₂=N-1-etylotymina; ppx: n₂=1 X=O, Y=O, R₂=N-1-etylotymina; pN: n3=9, B=T, X=O; n4=0.

Syntezę związku 2, gdzie Np: n1=8, B=T, X=O; px: Y=O, R₂= N-1-etylotymina; ppx: n₂=1 X=O, Y=O, R₂= N-1-etylotymina; pN: n3=9, B=T, X=O; n4=0 przeprowadzono według standardowej procedury amidofosforynowej, wykorzystując odpowiednio chronioną tymidyne przyłączoną łącznikiem oksalilowym do złoża LCA CPG. W etapie kondensacji użyto metylo-N,N-diizopropyloamidofosforyn odpowiednio chronionej tymidyny i związku 1, w którym R1 stanowi grupę DMT, R₂ stanowi grupę N-1-etylotyminową i Y jest atomem tlenu. W procesie kondensacji modyfikowanego monomeru 1 stosowano wydłużony czas reakcji (600 s). 5'-Końcową grupę DMT oraz zasadowo-labilne grupy ochronne usunięto poddając oligomer na złożu standardowej deprotekcji w warunkach kwasowych (3% TCA w chlorku metylenu), a następnie działając mieszaniną tiofenolu, trietyloaminy i dioksanu (2/2/1) w czasie 5 minut. Oligomer usunięto ze złoża za pomocą 1% wodnej trietyloaminy, w temperaturze

PL 198 175 B1 pokojowej w czasie 3 minut i poddano jednoetapowej procedurze oczyszczania za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej na odwróconej fazie (RP HPLC) w gradiencie acetonitrylu w 0.1 M roztworze wodorowęglanu trietyloaminy o pH 7,5.

Wydajność syntezy w skali 1 pmola - 14.0 jednostek optycznych (A260), MALDITOF: 5789

Claims (2)

1. Polimer deoksyrybonukleotydowy o ogólnym wzorze 2, w którym Np stanowi grupę o wzorze 3, gdzie B jest N-1 lub N-3 podstawioną tyminą, N-1-cytozyną, N-9-adeniną lub N-9-guaniną, zaś X stanowi O, S lub Se, px stanowi grupę o wzorze 4, w której Y jest O lub NH, zaś R2 stanowi wodór, grupę alkilową, alkilopurynową lub alkilopirymidynową, wszystkie o 1 - 3 atomach węgla w łańcuchu alkilowym, ppx stanowi grupę o wzorze 5, w której X, Y i R2 mają wyżej podane znaczenie, pN stanowi grupę o wzorze 6, w której B i X mają wyżej podane znaczenie, zaś n są takie same lub różne i oznaczają liczby naturalne od 0 do trzydziestu, z tym, że wszystkie n nie oznaczają jednocześnie 0.

2. Monomer o ogólnym wzorze 1, w którym Ri stanowi grupę DMT, R2 stanowi grupę alkilową, alkilopirymidynową lub alkilopurynową, w których łańcuch alkilowy zawiera od 1 do 3 atomów węgla w łańcuchu alkilowym, Y stanowi atom tlenu lub grupę NH, zaś R3 stanowi grupę 2-cyjanoetylo- lub metylo-N,N-diizopropyloamidofosforynową, albo grupę acylową o 2 - 6 atomach węgla, zwłaszcza bursztynylową, oksalilową lub sarkozynylową, ewentualnie przyłączoną do złoża LCA-CPG