PL197939B1

PL197939B1 - Anti-cancer liposome preparation, method for its manufacture and compound pharmaceutical containing such preparation

Info

Publication number: PL197939B1
Application number: PL364657A
Authority: PL
Inventors: Arkadiusz Kozubek; Grzegorz Grynkiewicz; Wieslaw Szelejewski; Piotr Slifirski; Jerzy Gubernator; Krzysztof Wisniewski; Maria Stasiuk
Original assignee: Inst Farmaceutyczny
Priority date: 2004-01-30
Filing date: 2004-01-30
Publication date: 2008-05-30
Also published as: PL364657A1

Abstract

1. Liposomowy preparat zawierający przeciwnowotoworową substancję aktywną zamkniętą w pęcherzykach liposomowych stanowiących kompozycję składników lipidowych w proporcji 1 część wagowa substancji aktywnej na 10 do 30 części wagowych składników lipidowych, korzystnie 1 część wagowa substancji aktywnej na 20 części wagowych składników lipidowych, znamienny tym, że kompozycja składników lipidowych obejmuje co najmniej jedną pochodną fosfolipidu i co najmniej jedną modyfikowaną pochodną fitolipidu przedstawioną wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę -CH2-(R2)-(R3), gdzie R2 stanowi grupę alkilową CmH2m+1, przy czym m = 1-15, a R3 stanowi grupę metylową lub karboksylową; n = 1-17; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę karboksylową. 7. Sposób wytwarzania liposomowego preparatu przeciwnowotworowej substancji aktywnej, znamienny tym, że a) roztwór substancji aktywnej w rozpuszczalniku, korzystnie alkanolu, łączy się z roztworem składników lipidowych w rozpuszczalniku organicznym, przy czym składniki lipidowe stanowią mieszaninę co najmniej jednej pochodnej fosfolipidu i co najmniej jednej modyfikowanej pochodnej fitolipidu przedstawionej wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę -CH2-(R2)-(R3), gdzie R2 stanowi grupę alkilową CmH2m+1 przy czym m = 1-15, a R3 stanowi grupę metylową lub karboksylową; n = 1-17; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę karboksylową,................... 9. Kompozycja farmaceutyczna do podawania pozajelitowego obejmująca farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i/lub substancje pomocnicze i terapeutycznie skuteczną ilość przeciwnowotworowej substancji aktywnej, znamienna tym, że zawiera liposomowy preparat substancji aktywnej zamkniętej w pęcherzykach liposomowych stanowiących kompozycję składników lipidowych w proporcji 1.....1. Liposomal preparation containing an anticancer active substance enclosed in liposome vesicles constituting a composition of lipid components in a proportion of 1 part by weight of the active substance per 10 to 30 parts by weight of lipid components, preferably 1 part by weight of the active substance per 20 parts by weight of lipid components, characterized in that the composition of lipid components comprises at least one phospholipid derivative and at least one modified phytolipid derivative represented by the general formula I, wherein R1 is a hydrogen atom or a -CH2-(R2)-(R3) group, wherein R2 is an alkyl group CmH2m+1, wherein m = 1-15, and R3 is a methyl or carboxyl group; n = 1-17; and R4 is a hydrogen atom or a carboxyl group. 7. A method for producing a liposomal preparation of an anticancer active substance, characterized in that a) a solution of the active substance in a solvent, preferably an alkanol, is combined with a solution of lipid components in an organic solvent, wherein the lipid components constitute a mixture of at least one phospholipid derivative and at least one modified phytolipid derivative represented by the general formula I, wherein R1 is a hydrogen atom or a -CH2-(R2)-(R3) group, wherein R2 is an alkyl group CmH2m+1, wherein m = 1-15, and R3 is a methyl or carboxyl group; n = 1-17; and R4 represents a hydrogen atom or a carboxyl group,................... 9. A pharmaceutical composition for parenteral administration comprising pharmaceutically acceptable carriers and/or excipients and a therapeutically effective amount of an anticancer active substance, characterized in that it comprises a liposomal preparation of the active substance encapsulated in liposomal vesicles constituting a composition of lipid components in a ratio of 1.....

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest liposomowy preparat zawierający przeciwnowotworową substancję aktywną, sposób jego wytwarzania i zawierająca go kompozycja farmaceutyczna.The subject of the invention is a liposome preparation containing an anticancer active substance, a method for its preparation and a pharmaceutical composition containing it.

Użyteczność liposomów w farmacji i medycynie, jako nośników substancji leczniczych, była postulowana od wczesnych lat sześćdziesiątych, kiedy poznano zjawisko zamykania niektórych związków chemicznych w mikropęcherzykach lipidowych. Jednak dopiero w ostatnich kilku latach uzyskano obiektywne dowody terapeutycznej skuteczności tego sposobu podawania substancji farmaceutycznych i wprowadzono do lecznictwa pierwsze liposomowe formy leków.The usefulness of liposomes in pharmacy and medicine as carriers of therapeutic substances has been postulated since the early 1960s, when the phenomenon of encapsulating certain chemical compounds in lipid microvesicles was recognized. However, it is only in the last few years that objective evidence of the therapeutic effectiveness of this method of delivering pharmaceuticals has been obtained, and the first liposomal drug formulations have been introduced into medicine.

Korzystne skutki podawania substancji aktywnych farmakologicznie w postaci liposomów polegają na podwyższeniu biodostępności, obniżeniu toksyczności układowej i/lub narządowej, ukierunkowaniu działania do konkretnych obszarów, np. tkanki nowotworowej, wydłużeniu okresu półtrwania, czyli w sumie na polepszeniu selektywności działania i indeksu terapeutycznego.The beneficial effects of administering pharmacologically active substances in the form of liposomes include increased bioavailability, reduced systemic and/or organ toxicity, targeting specific areas, e.g. cancer tissue, and extending the half-life, i.e. overall, improved selectivity of action and therapeutic index.

Aktualny stan wiedzy na temat liposomów, szczególnie ich zastosowań farmaceutycznych, znany jest z opracowań literaturowych, m.in. D. D. Lasic, Liposomes: from physics to applications, Elsevier, Amsterdam 1995; D. D. Lasic, F. Martin Stealth liposomes CRC Press Boca Raton 1995, D. D. Lasic, D. Papahadjopoulos, „Medical applications of liposomes, Elsevier, Amsterdam 1998, Lian T., Ho R. J. Y. „Trends and developments in liposome drug delivery systems, J. Pharm.Sci. 90(6), 667-680, 2001.The current state of knowledge about liposomes, especially their pharmaceutical applications, is known from literature studies, including D. D. Lasic, Liposomes: from physics to applications, Elsevier, Amsterdam 1995; D. D. Lasic, F. Martin Stealth liposomes CRC Press Boca Raton 1995, D. D. Lasic, D. Papahadjopoulos, "Medical applications of liposomes, Elsevier, Amsterdam 1998, Lian T., Ho R. J. Y. "Trends and developments in liposome drug delivery systems, J. Pharm. Sci. 90(6), 667-680, 2001.

Liposomy stanowią zamknięte struktury, jedno- lub wielowarstwowe, w których podwójna warstwa amfifilowego lipidu stanowi otoczkę mikrokropelki wody (liposomy jednowarstwowe) lub też błony lipidowe układają się koncentrycznie na przemian z warstwami wody (liposomy wielowarstwowe). Amfifilowe lipidy tworzące dwuwarstwę posiadają polarną grupę hydrofilową i jeden lub więcej hydrofobowych prostych łańcuchów wielowęglowych (>C8). Grupy polarne mogą stanowić pochodne fosforanów, siarczanów i związków azotu, ale najczęściej stosowane są fosfolipidy, zwłaszcza pochodzenia naturalnego, jak na przykład fosfatydylocholiny będące wynikiem rafinacji tłuszczów roślinnych, fosfolipidy syntetyczne, dostępne handlowo preparaty fosfolipidowe, w tym fosfolipidy modyfikowane chemicznie przy zastosowaniu pochodnych glikolu etylenowego i pochodne cholesterolu. Substancja lecznicza, zależnie od rozpuszczalności, umiejscowiona jest w warstwie wodnej lub w warstwie lipidowej liposomu.Liposomes are closed, single- or multilayer structures in which a bilayer of amphiphilic lipid encapsulates a microdroplet of water (single-layer liposomes) or lipid membranes are arranged concentrically with alternating water layers (multilayer liposomes). The amphiphilic lipids forming the bilayer possess a polar hydrophilic group and one or more hydrophobic, straight multi-carbon chains (>C8). Polar groups can be derived from phosphates, sulfates, and nitrogen compounds, but the most commonly used are phospholipids, especially those of natural origin, such as phosphatidylcholines obtained by refining vegetable fats, synthetic phospholipids, and commercially available phospholipid preparations, including phospholipids chemically modified using ethylene glycol derivatives and cholesterol derivatives. The drug substance, depending on its solubility, is located in the aqueous layer or the lipid layer of the liposome.

Znanych jest szereg sposobów otrzymywania liposomów. Klasyczna metoda wytwarzania liposomów wielowarstwowych polega na odparowaniu roztworu lipid - rozpuszczalnik organiczny i rehydratacji filmu lipidowego wodnym roztworem substancji leczniczej (J. Mol. Biol. 13 (1965), 238-252). Inne techniki obejmują emulgowanie lipidu w dwufazowej mieszaninie fazy wodnej i organicznej zawierającej lipid, przy jednoczesnym odparowywaniu rozpuszczalnika organicznego (np. opisy patentowe US 4,522,803, 5,030,453 i 5,169,637), tworzenie emulsji woda w oleju, z której odparowywana jest faza organiczna do uzyskania żelu, następnie mieszanego do otrzymania liposomów oligowarstwowych (US 4,235,871) oraz wielokrotnie powtarzanych cykli zamrażania i rozmrażania (US 5,008,050). Liposomy jednowarstwowe otrzymuje się z liposomów wielowarstwowych działaniem ultradźwięków, metodą ekstruzji (np. US 4,975,282), homogenizacji, jak również wstrzykiwania eterowych lub etanolowych roztworów lipidów do fazy wodnej (Deamer R., Uster, P. „Liposome preparation; Methods and Mechanisms , w: „Liposomes, wyd. M. Ostro, Marcel Dekker, New York, 1987).A number of methods for obtaining liposomes are known. The classic method for preparing multilamellar liposomes involves evaporation of a lipid-organic solvent solution and rehydration of the lipid film with an aqueous solution of the drug substance (J. Mol. Biol. 13 (1965), 238-252). Other techniques include emulsification of the lipid in a biphasic mixture of an aqueous and organic phase containing the lipid, with simultaneous evaporation of the organic solvent (e.g., U.S. Patents 4,522,803, 5,030,453, and 5,169,637), formation of a water-in-oil emulsion from which the organic phase is evaporated to obtain a gel, which is then mixed to obtain oligolamellar liposomes (U.S. Patent 4,235,871), and repeated freeze-thaw cycles (U.S. Patent 5,008,050). Unilamellar liposomes are obtained from multilamellar liposomes by ultrasonication, extrusion (e.g. US 4,975,282), homogenization, as well as injection of ether or ethanolic lipid solutions into the aqueous phase (Deamer R., Uster, P. "Liposome preparation; Methods and Mechanisms", in: "Liposomes, ed. M. Ostro, Marcel Dekker, New York, 1987).

W przypadku wielu grup terapeutyków zarówno wydajność zamykania substancji czynnej w pęcherzykach jak i trwałość liposomów (in vitro i in vivo) stanowią poważny problem techniczny. W szczególności klasyczne preparaty liposomowe trudno rozpuszczalnych w wodzie taksoidów na bazie lecytyny sojowej lub syntetycznego analogu fosfolipidowego (Bartoli i in. J. Microencapsulation 7, 1990, 191-197, Riondel i in. In Vivo 6, 1992, 23-28), wykazują tendencję do agregowania, a także niestabilność, powodującą „wyciekanie substancji aktywnej z liposomu i jej krystalizację.For many therapeutic groups, both the efficiency of encapsulating the active substance in vesicles and the stability of liposomes (in vitro and in vivo) pose a serious technical problem. In particular, classical liposome preparations of sparingly water-soluble taxoids based on soy lecithin or a synthetic phospholipid analogue (Bartoli et al. J. Microencapsulation 7, 1990, 191-197, Riondel et al. In Vivo 6, 1992, 23-28) tend to aggregate and exhibit instability, resulting in "leakage of the active substance from the liposome and its crystallization."

W wielu przypadkach sporządzenie liposomowych preparatów substancji przeciwnowotworowych o efektywnym stosunku lipid/lek wymaga stosowania specjalnych zabiegów, takich jak na przykład opisany w publikacji WO 9202208 i zgłoszeniu patentowym EP 546951 A1 dodatek ujemnie naładowanych fosfolipidów lub ujawnione w japońskim opisie patentowym JP 06254379 dodawanie alkoholu wielowodorotlenowego i czwartorzędowych soli amoniowych.In many cases, the preparation of liposomal preparations of anticancer substances with an effective lipid/drug ratio requires the use of special procedures, such as, for example, the addition of negatively charged phospholipids described in publication WO 9202208 and patent application EP 546951 A1 or the addition of polyhydric alcohol and quaternary ammonium salts disclosed in Japanese patent specification JP 06254379.

Udoskonalone postaci liposomowe, zapewniające większą trwałość poprzez steryczną stabilizację powierzchni sfery lipidowej, stanowią tzw. liposomy Stealth (D. D. Lasic, F.Martin „Stealth liposomes, CRC Press Boca Raton, 1995). Jedną z metod zmierzających do opracowania bardziej trwaPL 197 939 B1 łych form liposomowych stało się użycie do opłaszczania liposomów hydrofilowego glikolu polietylenowego, opisane m.in. w publikacji zgłoszenia międzynarodowego WO 9422429. Do lecznictwa została wprowadzona liposomowa postać doksorubicyny powlekanej glikolem polietylenowym pod nazwą handlową Doxil®. Preparat Doxil® zawiera doksorubicynę zamkniętą w liposomowych nośnikach Stealth, składających się z trzech składników lipidowych - uwodornionej lecytyny z soi, cholesterolu i karbaminianowego konjugatu distearynylofosfatydyloetanoloaminy z metoksylową pochodną glikolu polietylenowego 2000 w odpowiednim stosunku molowym.Improved liposome forms, ensuring greater stability through steric stabilization of the lipid sphere surface, constitute the so-called Stealth liposomes (D. D. Lasic, F. Martin "Stealth liposomes", CRC Press Boca Raton, 1995). One of the methods aimed at developing more stable liposome forms was the use of hydrophilic polyethylene glycol to coat liposomes, described, among others, in the publication of international application WO 9422429. A liposomal form of doxorubicin coated with polyethylene glycol has been introduced into therapy under the trade name Doxil®. Doxil® contains doxorubicin encapsulated in Stealth liposome carriers, consisting of three lipid components - hydrogenated soy lecithin, cholesterol, and a carbamate conjugate of distearynylphosphatidylethanolamine with a methoxy derivative of polyethylene glycol 2000 in an appropriate molar ratio.

Długi czas półtrwania liposomów Stealth, związany także z niskim wyciekiem leku, uzyskuje się stosując unikalne metody ładowania, które zapewniają wysoką wydajność ładowania i utrzymywanie leku we wnętrzu przez dłuższy czas. Metody te obejmują ładowanie gradientem elektrolitu (zgłoszenie EP 361894 A1) lub gradientem pH (publikacja WO 8806442).The long half-life of Stealth liposomes, also associated with low drug leakage, is achieved using unique loading methods that ensure high loading efficiency and prolonged drug retention. These methods include electrolyte gradient loading (application EP 361894 A1) or pH gradient loading (publication WO 8806442).

W publikacji WO 8806442 składniki warstwy lipidowej stanowią klasyczne związki lipidowe, takie jak fosfatydylocholiny naturalne i syntetyczne, z ewentualnym dodatkiem cholesterolu, a w procesie enkapsulacji wykorzystuje się gradient pH. Zgodnie z opisem, ograniczona szybkość wyciekania zamkniętego składnika biologicznie aktywnego jest wynikiem różnic pH po dwu stronach błony lipidowej.In WO 8806442, the lipid layer components are classical lipid compounds, such as natural and synthetic phosphatidylcholines, with the optional addition of cholesterol, and the encapsulation process utilizes a pH gradient. According to the description, the limited leakage rate of the encapsulated biologically active ingredient is a result of the pH differences on both sides of the lipid membrane.

Metoda ładowania gradientem pH ograniczona jest jednak tylko do leków rozpuszczających się w fazie wodnej, będących słabymi kwasami lub zasadami.However, the pH gradient loading method is limited only to drugs that dissolve in the aqueous phase and are weak acids or bases.

Preparaty liposomowe zawierające topotekan i lipidy w proporcji 0,05:0,2, ładowane metodą gradientu pH lub jonoforetyczną, opisane są w publikacji WO 0202078. W skład warstwy lipidowej wchodzą sfingomielina i cholesterol.Liposomal preparations containing topotecan and lipids in a ratio of 0.05:0.2, loaded by a pH gradient or iontophoretic method, are described in WO 0202078. The lipid layer consists of sphingomyelin and cholesterol.

W opisie zgłoszenia międzynarodowego WO 9915153 ujawnione są m.in. liposomy taksolu, charakteryzujące się stężeniem substancji aktywnej w liposomie nie wyższym niż 5 mg/ml i zawierające jako lipid syntetyczną lecytynę-dilauroilofosfatydylocholinę. Autorzy deklarują, że stosunek lek : lipid mieści się w zakresie od 1:1 do 1:2000, korzystnie 1 : 30, nie przedstawiają jednak informacji na temat trwałości tych preparatów liposomowych, przeznaczonych do podawania substancji przeciwnowotworowych drogą wziewną.International application WO 9915153 discloses, among other things, Taxol liposomes characterized by an active substance concentration in the liposome of no more than 5 mg/ml and containing synthetic lecithin-dilauroylphosphatidylcholine as the lipid. The authors declare that the drug:lipid ratio is in the range of 1:1 to 1:2000, preferably 1:30; however, they do not provide information on the stability of these liposome formulations intended for the administration of anticancer substances by inhalation.

Stabilne preparaty liposomowe uzyskiwano dotychczas głównie dzięki stosowaniu specjalnych zabiegów bądź modyfikacji cząsteczek substancji aktywnej, np. przez dołączanie łańcuchów węglowodorowych, polimerycznych lub peptydowych.Stable liposome preparations have so far been obtained mainly by applying special treatments or modifying the active substance molecules, e.g. by attaching hydrocarbon, polymeric or peptide chains.

W polskich patentach nr 190 077 i 190 078 wysoki poziom enkapsulacji doksorubicyny lub mitoksantronu przy korzystnym stosunku lek : lipid w preparacie liposomowym uzyskano w wyniku modyfikacji składu warstwy lipidowej, która zawiera oprócz klasycznych składników, lecytyny jajecznej i uwodornionej lecytyny jajecznej, wodorosiarczanową pochodną acylową rezorcyny.In Polish patents No. 190 077 and 190 078, a high level of doxorubicin or mitoxantrone encapsulation at a favorable drug:lipid ratio in a liposomal preparation was achieved by modifying the composition of the lipid layer, which, in addition to the classic ingredients, egg lecithin and hydrogenated egg lecithin, contains a resorcinol hydrosulfate acyl derivative.

Stabilne preparaty liposomowe paklitakselu uzyskano przez dodatek do kompozycji lipidowej kardiolipiny (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych nr 5,424,073, 5,648,090, 5,939,567 i 6,146,659). Z opisu patentowego US 6,146,659 wynika, że w tym przypadku wydajność zamykania paklitakselu w pęcherzykach liposomowych przekracza 90%, przy stosunku wagowym substancji aktywnej do nośnika lipidowego około 7%. Generalnie, możliwość inkorporowania paklitakselu do liposomów, wskutek jego wysokiej hydrofobowości, ograniczona jest do 1-10% (w/w), najczęściej 2-8% (w/w) w stosunku do nośnika lipidowego. Współczynnik ten tylko nieznacznie udaje się poprawić (do 12-14% w/w) w wyniku modyfikacji cząsteczki paklitakselu, np. przez dołączenie łańcuchów węglowodorowych (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych nr 5,919,815, 5,939,567, 6,118,011).Stable liposome formulations of paclitaxel have been obtained by adding cardiolipin to the lipid composition (United States Patent Nos. 5,424,073, 5,648,090, 5,939,567 and 6,146,659). US Patent No. 6,146,659 indicates that in this case the efficiency of paclitaxel encapsulation in liposome vesicles exceeds 90%, at a weight ratio of the active substance to the lipid carrier of approximately 7%. Generally, the possibility of incorporating paclitaxel into liposomes, due to its high hydrophobicity, is limited to 1-10% (w/w), most often 2-8% (w/w) in relation to the lipid carrier. This coefficient can be improved only slightly (up to 12-14% w/w) by modifying the paclitaxel molecule, e.g. by adding hydrocarbon chains (U.S. Patent Nos. 5,919,815, 5,939,567, 6,118,011).

W dalszym ciągu istnieje zatem potrzeba opracowania liposomowych preparatów farmaceutycznych, zwłaszcza liposomowych preparatów zawierających hydrofobowe substancje przeciwnowotworowe, o korzystnym stosunku lipid/substancja aktywna, czyli umożliwiających przenoszenie takiej samej ilości substancji aktywnej przez mniejszą ilość lipidowego nośnika. W szczególności istnieje potrzeba opracowania liposomowych preparatów substancji przeciwnowotworowych, które mogłyby zostać użyte do wytwarzania leku podawanego drogą pozajelitową, charakteryzujących się wysoką wydajnością zamykania (stopniem enkapsulacji) substancji aktywnej i odpowiednią trwałością.Therefore, there is still a need to develop liposomal pharmaceutical preparations, especially liposomal preparations containing hydrophobic anticancer substances with a favorable lipid/active substance ratio, enabling the same amount of active substance to be carried by a smaller amount of lipid carrier. In particular, there is a need to develop liposomal preparations of anticancer substances that could be used to produce parenterally administered drugs, characterized by high efficiency of encapsulation of the active substance and adequate stability.

Nieoczekiwanie okazało się, że potrzebę tę zaspokaja preparat liposomowy substancji hydrofobowych, w którym wysoką wydajność zamykania substancji aktywnej i trwałość uzyskuje się w wyniku modyfikacji składu klasycznego nośnika lipidowego, polegającej na wprowadzeniu do kompozycji fosfolipidu modyfikowanych pochodnych naturalnych fitolipidów zawierających w cząsteczce nasycone łańcuchy węglowodorowe i grupy karboksylowe.Unexpectedly, it turned out that this need is met by a liposome preparation of hydrophobic substances, in which high efficiency of encapsulation of the active substance and durability are achieved as a result of modification of the composition of the classical lipid carrier, consisting in introducing modified derivatives of natural phytolipids containing saturated hydrocarbon chains and carboxyl groups in the molecule into the phospholipid composition.

Istotę wynalazku stanowi liposomowy preparat zawierający przeciwnowotoworową substancję aktywną zamkniętą w pęcherzykach liposomowych stanowiących kompozycję składników lipidowychThe essence of the invention is a liposomal preparation containing an active anticancer substance enclosed in liposomal vesicles constituting a composition of lipid components

PL 197 939 B1 w proporcji 1 część wagowa substancji aktywnej na 10 do 30 części wagowych składników lipidowych, korzystnie 1 część wagowa substancji aktywnej na 20 części wagowych składników lipidowych, charakteryzujący się tym, że kompozycja składników lipidowych obejmuje co najmniej jedną pochodną fosfolipidu i co najmniej jedną modyfikowaną pochodną fitolipidu przedstawioną wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę -CH2-(R2)-(R3), gdzie R2 stanowi grupę alkilową C_mH2m+1, przy czym m = 1-15, a R3 stanowi grupę metylową lub karboksylową; n = 1-17; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę karboksylową.PL 197 939 B1 in a proportion of 1 part by weight of the active substance to 10 to 30 parts by weight of lipid components, preferably 1 part by weight of the active substance to 20 parts by weight of lipid components, characterized in that the composition of lipid components comprises at least one phospholipid derivative and at least one modified phytolipid derivative represented by the general formula I, wherein R1 is a hydrogen atom or a -CH2-(R2)-(R3) group, wherein R2 is an alkyl group _Cm H2m+1, wherein m = 1-15, and R3 is a methyl or carboxyl group; n = 1-17; and R4 is a hydrogen atom or a carboxyl group.

Pochodne fitolipidu o wzorze 1 otrzymać można w wyniku przekształceń chemicznych naturalnych alkilofenoli, poprzez uwodornianie łańcucha węglowego, alkilowanie i karboksylację. Pochodne o wzorze I, w wyniku derywatyzacji naturalnych struktur, mogą różnić się charakterem chemicznym, jak również właściwościami fizykochemicznymi, na przykład rozpuszczalnością i lipofilowością.Phytolipid derivatives of formula 1 can be obtained by chemical transformations of natural alkylphenols, via hydrogenation of the carbon chain, alkylation, and carboxylation. Derivatives of formula I, as a result of derivatization of natural structures, may differ in their chemical nature as well as physicochemical properties, for example, solubility and lipophilicity.

Szczególnie korzystne pochodne mające zastosowanie zgodnie z wynalazkiem stanowią te, w których R3 w podstawniku R1 stanowi grupę karboksylową, n = 15, m = 1, a R₄ stanowi atom wodoru, czyli kwas 2-(3-pentadecyloofenoksy)octowy.Particularly preferred derivatives for use in accordance with the invention are those in which R3 in the R1 substituent is a carboxyl group, n = 15, m = 1 and _R4 is a hydrogen atom, i.e. 2-(3-pentadecylphenoxy)acetic acid.

Korzystnie fosfolipid i pochodna fitoplipidu o wzorze I występują w kompozycji składników lipidowych w stosunku molowym około 9:1.Preferably, the phospholipid and the phytoplipid derivative of formula I are present in the lipid component composition in a molar ratio of about 9:1.

Substancję aktywną wchodzącą w skład preparatu liposomowego według wynalazku może stanowić dowolna substancja terapeutyczna wykazująca skuteczność i bezpieczeństwo przy podaniu ssakom, zwłaszcza ludziom. W szczególności należy rozważyć możliwość użycia trudno rozpuszczalnych substancji o aktywności przeciwnowotworowej, wybranych spośród antybiotyków antracyklinowych takich jak mitoksantron, daunomycyna, doksorubicyna, epirubicyna czy idarubicyna, związków alkilujących, pochodnych kamptotecyny takich jak irinotekan i kamptotekan, lignanów takich jak etopozyd oraz taksoidów takich jak paklitaksel i docetaksel, przy czym wymienione przykłady nie stanowią w żadnym stopniu ograniczenia wynalazku.The active substance included in the liposome formulation of the invention may be any therapeutic substance demonstrating efficacy and safety when administered to mammals, particularly humans. In particular, the possibility of using sparingly soluble substances with anticancer activity, selected from anthracycline antibiotics such as mitoxantrone, daunomycin, doxorubicin, epirubicin, or idarubicin, alkylating agents, camptothecin derivatives such as irinotecan and camptothecan, lignans such as etoposide, and taxoids such as paclitaxel and docetaxel, should be considered. These examples are not intended to limit the invention in any way.

Preparat liposomowy według wynalazku oprócz substancji aktywnej i składników lipidowych może zawierać dodatkowe stabilizatory struktury pęcherzyka i ewentualnie inne dopuszczalne farmaceutycznie środki pomocnicze, wpływające na zwiększenie jego trwałości.The liposome preparation according to the invention, in addition to the active substance and lipid components, may contain additional stabilizers of the vesicle structure and optionally other pharmaceutically acceptable auxiliary agents that increase its stability.

Kompozycja składników lipidowych według wynalazku zapewnia wysoki stopień zamykania substancji aktywnej w pęcherzykach lipidowych. Szczególnie korzystne rezultaty uzyskuje się w przypadku paklitakselu, gdzie stopień enkapsulacji wynosi ponad 95%.The lipid component composition of the invention ensures a high degree of encapsulation of the active substance within lipid vesicles. Particularly favorable results are achieved with paclitaxel, where the degree of encapsulation is over 95%.

Wynalazek obejmuje ponadto sposób wytwarzania preparatu liposomowego substancji przeciwnowotworowej o wysokim stopniu zamykania substancji aktywnej.The invention further includes a method for producing a liposome preparation of an anticancer substance with a high degree of encapsulation of the active substance.

Zgodnie z tym sposobem:According to this method:

a) roztwór substancji aktywnej w rozpuszczalniku, korzystnie alkanolu, łączy się z roztworem składników lipidowych w rozpuszczalniku organicznym, przy czym składniki lipidowe stanowią mieszaninę co najmniej jednej pochodnej fosfolipidu i co najmniej jednej modyfikowanej pochodnej fitolipidu przedstawionej wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę -CH2-(R2)-(R3), gdzie R2 stanowi grupę alkilową C_mH2m+1, przy czym m = 1-15, a R3 stanowi grupę metylową lub karboksylową; n = 1-17; a R₄ oznacza atom wodoru lub grupę karboksylową,a) a solution of the active substance in a solvent, preferably an alkanol, is combined with a solution of lipid components in an organic solvent, wherein the lipid components constitute a mixture of at least one phospholipid derivative and at least one modified phytolipid derivative represented by the general formula I, wherein R1 is a hydrogen atom or a -CH2-(R2)-(R3) group, wherein R2 is an alkyl group _CmH2m +1, wherein m = 1-15, and R3 is a methyl or carboxyl group; n = 1-17; and _R4 is a hydrogen atom or a carboxyl group,

b) odpędza się rozpuszczalniki,b) the solvents are removed,

c) film lipidowy otrzymany w etapie b) rozprowadza się w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie alkanolu, i poddaje liofilizacji,c) the lipid film obtained in step b) is dispersed in an organic solvent, preferably an alkanol, and subjected to lyophilization,

d) IlofHlzat z etapuc) hydratyzuje się wodą, otrzymując pierwotny preparat widowarstwowych llposomów,d) The 10-hydroxylate from step c) is hydrated with water to obtain the primary preparation of polyposomes,

e) preparat pierwotny poddajesię dodatkowymprocesom fizycznym. otι^^'^rm^u^cz^\^i^^i(^^ kantowanych liposomów dwuwarstwowych o wielkości 50-200 nm, korzystnie 100 nm, a następniee) the primary preparation is subjected to additional physical processes. otι^^'^rm^u^cz^\^i^^i(^^ canted bilayer liposomes of size 50-200 nm, preferably 100 nm, and then

f) zawiesinę liposomową z ewentualnym dodatkiem substancji pomocniczych, takich jak substancje krioochronne, poddaje się liofilizacji.f) the liposomal suspension with the optional addition of auxiliary substances, such as cryoprotective substances, is freeze-dried.

Zawiesinę w etapie c) zamraża się przez zanurzenie kolby z zawiesiną, ewentualnie z dodatkiem substancji krioochronnych, w ciekłym azocie, a następnie rozmrażanie w temperaturze 40°C. Czynności te powtarza się 7 do 10 razy. Badania przy użyciu elektronowego mikroskopu transmisyjnego Jeol 100C, przy powiększeniach 5.000-100.000x wykazują, że wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie zawiesiny liposomowej powoduje dwie istotne z punktu widzenia zastosowań farmaceutycznych zmiany: zmniejszenie warstwowości liposomów oraz ujednolicenie ich rozmiarów.The suspension in step c) is frozen by immersing the flask containing the suspension, optionally with the addition of cryoprotectants, in liquid nitrogen and then thawing at 40°C. This process is repeated 7 to 10 times. Studies using a Jeol 100C transmission electron microscope at magnifications of 5,000-100,000x show that repeated freezing and thawing of a liposome suspension causes two changes important from the perspective of pharmaceutical applications: a reduction in liposome layering and a uniformity in their size.

Podobne zadanie spełnia poddawanie zawiesiny liposomów krótkotrwałemu działaniu ultradźwięków, czyli sonikacja.A similar task is performed by exposing a suspension of liposomes to short-term ultrasound, i.e. sonication.

PL 197 939 B1PL 197 939 B1

Właściwy liposomowy preparat substancji aktywnej otrzymuje się przez hydratację preparatu pierwotnego, polegającą na wytrząsaniu, mieszaniu mechanicznym, lub poddaniu preparatu działaniu ultradźwięków (sonikacji) w obecności wody, roztworu soli fizjologicznej, buforu i ewentualnie roztworu innych farmaceutycznie dopuszczalnych substancji.The actual liposomal preparation of the active substance is obtained by hydration of the primary preparation, which involves shaking, mechanical mixing, or exposing the preparation to ultrasound (sonication) in the presence of water, physiological saline solution, buffer and optionally a solution of other pharmaceutically acceptable substances.

Otrzymany w etapie d) hydratyzowany preparat liposomowy składa się z liposomów wielo- i jednowarstwowych o średniej wielkości 80-1500 nm. Dwuwarstwowe liposomy o korzystnej wielkości 100-200 nm można uzyskać poddając zawiesinę liposomową odpowiednim procesom fizycznym, takim jak wymrażanie, ekstruzja, homogenizacja wysokociśnieniowa lub sonikacja.The hydrated liposome preparation obtained in step d) consists of multi- and unilamellar liposomes with an average size of 80-1500 nm. Bilamellar liposomes with a preferred size of 100-200 nm can be obtained by subjecting the liposome suspension to appropriate physical processes, such as freezing, extrusion, high-pressure homogenization or sonication.

Odpowiednią metodę ujednolicania wielkości liposomów stanowi kilkukrotna ekstruzja zawiesiny przez membranę poliwęglanową o średnicy porów 50-200 nm, korzystnie o średnicy 100 nm. Przeprowadzona kilkukrotnie ekstruzja pozwala na przeprowadzenie w jednej operacji jednostkowej trzech procesów wytwarzania preparatu liposomowego: ładowania pęcherzyków substancją aktywną, kalibracji liposomów i sterylizacji preparatu.A suitable method for standardizing liposome size is repeated extrusion of the suspension through a polycarbonate membrane with a pore diameter of 50-200 nm, preferably 100 nm. Repeated extrusion allows for three liposome preparation processes to be performed in a single operation: loading the vesicles with the active substance, calibrating the liposomes, and sterilizing the preparation.

Hydratacja liofilizatu substancji przeciwnowotworowej o ujawnionym składzie nawet w najprostszych warunkach, przez wytrząsanie składników lipidowych z wodnym roztworem substancji czynnej, zapewnia uzyskanie liposomowego preparatu o wysokim stopniu enkapsulacji, przekraczającym 95%.Hydration of a lyophilisate of an anticancer substance with a disclosed composition even under the simplest conditions, by shaking the lipid components with an aqueous solution of the active substance, ensures obtaining a liposomal preparation with a high degree of encapsulation, exceeding 95%.

Wynalazek stanowi ponadto kompozycja farmaceutyczna do podawania pozajelitowego charakteryzująca się tym, że zawiera liposomowy preparat substancji aktywnej zamkniętej w pęcherzykach liposomowych stanowiących kompozycję składników lipidowych w proporcji 1 część wagowa substancji aktywnej na 10 do 30 części wagowych składników lipidowych, korzystnie 1 część wagowa substancji aktywnej na 20 części wagowych składników lipidowych, przy czym kompozycja składników lipidowych obejmuje co najmniej jedną pochodną fosfolipidu i co najmniej jedną modyfikowaną pochodną fitolipidu przedstawioną wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę -CH2-(R2)-(R3), gdzie R2 stanowi grupę alkilową C_mH2m+1, przy czym m = 1-15, a R3 stanowi grupę metylową lub karboksylową; n = 1-17; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę karboksylową, oraz farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i/lub substancje pomocnicze.The invention is furthermore a pharmaceutical composition for parenteral administration characterized in that it contains a liposome preparation of an active substance enclosed in liposome vesicles constituting a composition of lipid components in a ratio of 1 part by weight of the active substance to 10 to 30 parts by weight of the lipid components, preferably 1 part by weight of the active substance to 20 parts by weight of the lipid components, wherein the composition of lipid components comprises at least one phospholipid derivative and at least one modified phytolipid derivative represented by the general formula I, wherein R1 is a hydrogen atom or a -CH2-(R2)-(R3) group, wherein R2 is a _Cm H2m+1 alkyl group, wherein m = 1-15, and R3 is a methyl or carboxyl group; n = 1-17; and R4 is a hydrogen atom or a carboxyl group, and pharmaceutically acceptable carriers and/or excipients.

Farmaceutycznie dopuszczalny nośnik stanowi dowolna znana z praktyki farmaceutycznej substancja lub mieszanina substancji nośnikowych nie wywierających własnego działania farmakologicznego, rozcieńczalnik lub substancja pomocnicza, przeznaczone do podawania substancji biologicznie czynnych. Korzystne do stosowania w związku z wynalazkiem nośniki odpowiednie do podawania kompozycji drogą dożylną obejmują na przykład wyjałowione roztwory wodne, takie jak roztwór soli fizjologicznej, roztwory węglowodanów, np. glukozy, mannitolu, dekstrozy, laktozy i roztwory wodne buforów, na przykład buforu fosforanowego. Ponadto kompozycja może zawierać inne substancje pomocnicze, tradycyjnie stosowane w celu zapewnienia izoosmotyczności, przeciwutleniacze, substancje konserwujące i inne, nie wykazujące niezgodności z substancją aktywną i ze składnikami dwuwarstwy lipidowej.A pharmaceutically acceptable carrier is any substance or mixture of carrier substances that do not exert their own pharmacological activity, diluent, or excipient known in pharmaceutical practice, intended for the administration of biologically active substances. Preferred carriers suitable for intravenous administration of the composition for use in connection with the invention include, for example, sterile aqueous solutions such as physiological saline, carbohydrate solutions, e.g., glucose, mannitol, dextrose, lactose, and aqueous buffer solutions, e.g., phosphate buffer. Furthermore, the composition may contain other excipients traditionally used to ensure iso-osmoticity, antioxidants, preservatives, and other substances that are compatible with the active substance and the components of the lipid bilayer.

W korzystnej postaci wykonania wynalazku, do kompozycji farmaceutycznej dodaje się glukozę, w ilości około 5:1 (w/w) w stosunku do składników llpidowych.In a preferred embodiment of the invention, glucose is added to the pharmaceutical composition in an amount of about 5:1 (w/w) relative to the lyophilized components.

Glukoza pełni w kompozycji funkcję substancji wypełniającej i krioochronnej. Stosuje się ilość glukozy zapewniającą odpowiednią izoosmotyczność i izochydryczność kompozycji, tak że preparat przed użyciem można odtwarzać wyłącznie wodą do iniekcji, uzyskując roztwór o odpowiednim stężeniu glukozy (5%), bez konieczności stosowania dodatkowych rozcieńczalników substancji pomocniczych.Glucose acts as a bulking agent and cryoprotectant in the composition. The amount of glucose used ensures the appropriate iso-osmolarity and isohydricity of the composition, so that the preparation can be reconstituted solely with water for injection before use, obtaining a solution with the appropriate glucose concentration (5%), without the need for additional diluents or excipients.

Kompozycja farmaceutyczna może mieć postać zawiesiny liposomowego preparatu substancji przeciwnowotworowej gotowej do podania, postać liofilizatu do odtwarzania ex tempore bądź też koncentratu do sporządzania wlewów dożylnych. Liofilizat występuje w jednostkowej postaci dawkowania, korzystnie w ampułce, zawierającej terapeutycznie skuteczną ilość substancji aktywnej. Kompozycję w jednostkowych postaciach dawkowania otrzymuje się przez rozdysponowanie jałowej zawiesiny w sterylnych warunkach do ampułek, liofilizację i szczelne zamknięcie. Liofilizat odtwarza się wodą do iniekcji lub innym farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem bezpośrednio przed użyciem.The pharmaceutical composition may be in the form of a suspension of a liposomal anticancer agent ready for administration, a lyophilizate for extemporaneous reconstitution, or a concentrate for intravenous infusion. The lyophilizate is presented in a unit dosage form, preferably in an ampoule, containing a therapeutically effective amount of the active ingredient. The unit dosage composition is obtained by dispensing the sterile suspension under sterile conditions into ampoules, lyophilizing, and sealing them tightly. The lyophilizate is reconstituted with water for injection or another pharmaceutically acceptable diluent immediately before use.

Skład warstwy lipidowej według wynalazku umożliwia uzyskanie liposomowego preparatu przeciwnowotworowych substancji aktywnych o korzystnym stosunku lipid/substancja aktywna, charakteryzującego się wysoką wydajnością zamykania substancji aktywnej i odpowiednią trwałością. Preparat liposomowy znajduje zastosowanie do wytwarzania liofilizowanych kompozycji do podawania pozajelitowego, zawierających terapeutycznie skuteczną ilość substancji aktywnej. Liofilizowane kompozycjeThe composition of the lipid layer according to the invention allows for the production of a liposomal formulation of anticancer active substances with a favorable lipid/active substance ratio, characterized by high efficiency of active substance encapsulation and adequate stability. The liposomal formulation is used to produce lyophilized compositions for parenteral administration, containing a therapeutically effective amount of the active substance. Lyophilized compositions

PL 197 939 B1 według wynalazku zachowują stabilność w temperaturach przechowywania 4°C, 25°C i 30° w okresie do 2 lat.PL 197 939 B1 according to the invention are stable at storage temperatures of 4°C, 25°C and 30°C for up to 2 years.

Opis rysunków i wykresówDescription of drawings and charts

Figura 1Figure 1

Analiza wielkości liposomów PC/KW-23.3 (9:1 m/m) zawierających paklitaksel (1:30 w/w), przeprowadzona metodą PCS (Korelacyjna Spektroskopia Fotonowa).Size analysis of PC/KW-23.3 liposomes (9:1 m/m) containing paclitaxel (1:30 w/w), performed by the PCS (Photon Correlation Spectroscopy) method.

Małe jednowarstwowe liposomy otrzymano poprzez kalibrację dużych wielowarstwowych liposomów za pomocą filtru o średnicy porów 100 nm. Warunki pomiaru: średnia wielkość liposomów (w funkcji objętości): 106,6 nm, szerokość piku: 65 nm, jakość: Pass, indeks polidyspersyjności: 0,118, temperatura pomiaru 21,3°C, lepkość ośrodka: 0,97, ilość zliczeń/sek: 312k.Small unilamellar liposomes were obtained by calibrating large multilamellar liposomes using a 100 nm filter. Measurement conditions: average liposome size (as a function of volume): 106.6 nm, peak width: 65 nm, quality: Pass, polydispersity index: 0.118, measurement temperature: 21.3°C, medium viscosity: 0.97, counts/sec: 312k.

Figura 2Figure 2

Analiza wielkości liposomów PC/KW-28 (9:1 m/m) zawierających paklitaksel (1:30 w/w), przeprowadzona metodą PCS.Size analysis of PC/KW-28 liposomes (9:1 m/m) containing paclitaxel (1:30 w/w), performed by the PCS method.

Małe jednowarstwowe liposomy otrzymano poprzez kalibrację dużych wielowarstwowych liposomów za pomocą filtru o średnicy porów 100 nm. Warunki pomiaru: średnia wielkość liposomów (w funkcji objętości): 129 nm, szerokość piku: 81,8 nm, jakość: Pass, indeks polidyspersyjności: 0,142, temperatura pomiaru 21,6°C, lepkość ośrodka: 0,96, ilość zliczeń/sek: 345k.Small unilamellar liposomes were obtained by calibrating large multilamellar liposomes using a 100 nm filter. Measurement conditions: average liposome size (as a function of volume): 129 nm, peak width: 81.8 nm, quality: Pass, polydispersity index: 0.142, measurement temperature: 21.6°C, medium viscosity: 0.96, counts/sec: 345k.

Figura 3Figure 3

Analiza wielkości liposomów PC/KW-18 (9:1 m/m) zawierających paklitaksel (1:30 w/w), przeprowadzona metodą PCS.Size analysis of PC/KW-18 liposomes (9:1 m/m) containing paclitaxel (1:30 w/w), performed by the PCS method.

Małe jednowarstwowe liposomy otrzymano poprzez kalibrację dużych wielowarstwowych liposomów za pomocą filtru o średnicy porów 100 nm. Warunki pomiaru: średnia wielkość liposomów (w funkcji objętości): 133,9 nm, szerokość piku: 70,9 nm, jakość: Pass, Indeks polidyspersyjności: 0,133, temperatura pomiaru 21,5°C, lepkość ośrodka: 0,97, ilość zliczeń/sek: 343.9k.Small unilamellar liposomes were obtained by calibrating large multilamellar liposomes using a 100 nm filter. Measurement conditions: average liposome size (as a function of volume): 133.9 nm, peak width: 70.9 nm, quality: Pass, polydispersity index: 0.133, measurement temperature: 21.5°C, medium viscosity: 0.97, counts/sec: 343.9k.

Figura 4Figure 4

Analiza wielkości liposomów PC/KW-23.3 (9:1 m/m) zawierających paklitaksel (1:30 w/w), przeprowadzona metodą PCS.Size analysis of PC/KW-23.3 liposomes (9:1 m/m) containing paclitaxel (1:30 w/w), performed by the PCS method.

A - liposomy po kalibracji przez filtr o porach 100 nm;A - liposomes after calibration through a 100 nm filter;

B - liposomy z punktu A poddane liofilizacji w obecności substancji krioochronnej (glukoza, substancja krioochronna/lipid =5:1) i odtwarzane wodą.B - liposomes from point A subjected to lyophilization in the presence of a cryoprotective substance (glucose, cryoprotective substance/lipid = 5: 1) and reconstituted with water.

Warunki pomiaru:Measurement conditions:

A - Średnia wielkość liposomów (w funkcji objętości): 111,7 nm, szerokość piku: 68.2 nm, jakość: Pass, Indeks polidyspersyjności: 0,113, temperatura pomiaru 21,2°C, lepkość ośrodka: 0,97, ilość zliczeń/sek: 446k. B - Średnia wielkość liposomów (w funkcji objętości): 111,7, szerokość piku: 72,8 nm, jakość: Pass, Indeks polidyspersyjności: 0,121, temperatura pomiaru 21,1°C, lepkość ośrodka: 0,98, ilość zliczeń/sek: 421,7k.A - Average liposome size (as a function of volume): 111.7 nm, peak width: 68.2 nm, quality: Pass, Polydispersity index: 0.113, measurement temperature 21.2°C, medium viscosity: 0.97, counts/sec: 446k. B - Average liposome size (as a function of volume): 111.7, peak width: 72.8 nm, quality: Pass, Polydispersity index: 0.121, measurement temperature 21.1°C, medium viscosity: 0.98, counts/sec: 421.7k.

Figura 5Figure 5

Analiza wielkości liposomów PC/KW-23.3 (9:1 m/m) zawierających paklitaksel (1:30 w/w), przeprowadzona metodą PCS. Liposomy otrzymane wg. przykładu 1 przechowywano w postaci zawiesiny w temp. 4°C przez okres 1 miesiąca. Warunki pomiaru: średnia wielkość liposomów (w funkcji objętości) : 107,2, szerokość piku: 68,5 nm, jakość: Pass, Indeks polidyspersyjności: 0,123, temperatura pomiaru 20,7°C, lepkość ośrodka: 0,99, ilość zliczeń/sek: 296, 9k.Size analysis of PC/KW-23.3 liposomes (9:1 m/m) containing paclitaxel (1:30 w/w), performed by the PCS method. Liposomes obtained according to Example 1 were stored in the form of a suspension at 4°C for 1 month. Measurement conditions: average liposome size (as a function of volume): 107.2, peak width: 68.5 nm, quality: Pass, Polydispersity index: 0.123, measurement temperature: 20.7°C, medium viscosity: 0.99, number of counts/sec: 296.9k.

Sposób według wynalazku ilustrują, nie ograniczając jego zakresu, następujące przykłady.The method according to the invention is illustrated, without limiting its scope, by the following examples.

P r z y k ł a d 1Example 1

Do zakręcanej probówki szklanej o pojemności 30 ml dodano 114 mg lecytyny jajecznej (PC) w chloroformie (10 mg/ml), 6 mg pochodnej KW-23.3 (kwasu 2-heksadecyloksy-4-pentadecylobenzoesowego) w chloroformie (10 mg/ml) oraz 4 mg paklitakselu w postaci roztworu metanolowego (5 mg/ml), po czym rozpuszczalniki organiczne odpędzono strumieniem czystego azotu, ogrzewając jednocześnie probówkę do temperatury 35°C. Mazistą pozostałość rozpuszczono następnie w 5 ml alkoholu tert-butylowego, zamrażano i liofilizowano przez noc.To a 30 ml screw-capped glass tube were added 114 mg of egg lecithin (PC) in chloroform (10 mg/ml), 6 mg of the KW-23.3 derivative (2-hexadecyloxy-4-pentadecylbenzoic acid) in chloroform (10 mg/ml), and 4 mg of paclitaxel in the form of a methanol solution (5 mg/ml), and the organic solvents were then removed with a stream of pure nitrogen while heating the tube to 35°C. The unctuous residue was then dissolved in 5 ml of tert-butyl alcohol, frozen, and lyophilized overnight.

Suchą pozostałość uwodniono, energicznie wytrząsając z 2 ml sterylnej soli fizjologicznej. Otrzymane wielowarstwowe liposomy zawierające paklitaksel poddano 10 cyklom ekstruzji przy użyciu ciśnieniowego ekstrudera zaopatrzonego w filtry poliwęglanowe 100 nm (fig. 3). Po ekstruzji pobrano 50 μΙ próbkę liposomów i oznaczono w niej metodą analizy HPLC zawartość paklitakselu i składników lipidowych. Wydajność zamykania substancji aktywnej w liposomach > 95%.The dry residue was hydrated by vigorous shaking with 2 ml of sterile saline. The obtained multilamellar liposomes containing paclitaxel were subjected to 10 cycles of extrusion using a pressurized extruder equipped with 100 nm polycarbonate filters (Fig. 3). After extrusion, a 50 μI liposome sample was collected and the content of paclitaxel and lipid components was determined by HPLC analysis. The efficiency of encapsulation of the active substance in liposomes was > 95%.

PL 197 939 B1PL 197 939 B1

P r z y k ł a d 2Example 2

Do zakręcanej probówki odważono: 113,3 mg dimirystylofosfatydylocholiny (DMPC), 6,72 mg pochodnej KW28 (kwasu 2-(3-pentadecylofenoksy)octowego oraz 4 mg paklitakselu. Do odważonych substancji dodano następnie 5 ml alkoholu tert-butylowego. Całość wytrząsano na mikrowytrząsarce, aż do rozpuszczenia wszystkich składników. Następnie klarowny roztwór zamrożono i poddawano liofilizacji przez okres 24 godzin. Otrzymany suchy liofilizat uwodniono 2 ml sterylnej soli fizjologicznej wytrząsając energicznie probówką (10 min) przy pomocy miniwytrząsarki. Mleczną zawiesinę wielowarstwowych liposomów poddano 10 cyklom ekstruzji (fig. 4) i oznaczono wydajność zamykania paklitakselu jak w przykładzie 1. Wydajność zamykania > 95%.The following substances were weighed into a screw-capped test tube: 113.3 mg of dimyristylphosphatidylcholine (DMPC), 6.72 mg of the KW28 derivative (2-(3-pentadecylphenoxy)acetic acid) and 4 mg of paclitaxel. 5 ml of tert-butyl alcohol were then added to the weighed substances. The mixture was shaken on a microshaker until all components were dissolved. Then, the clear solution was frozen and lyophilized for 24 hours. The obtained dry lyophilizate was hydrated with 2 ml of sterile physiological saline by shaking the test tube vigorously (10 min) using a minishaker. The milky suspension of multilamellar liposomes was subjected to 10 extrusion cycles (Fig. 4) and the paclitaxel encapsulation efficiency was determined as in Example 1. Encapsulation efficiency > 95%.

P r z y k ł a d 3Example 3

Analogicznie jak w przykładzie 1 przygotowano preparat liposomowy paklitakselu o składzie:Similarly to example 1, a liposomal preparation of paclitaxel was prepared with the following composition:

KW-18 (kwas 2-hydroksy-4-pentadecylobenzoesowy) - 6 mg,KW-18 (2-hydroxy-4-pentadecylbenzoic acid) - 6 mg,

Lecytyna jajeczna - 114 mg,Egg lecithin - 114 mg,

Paklitaksel - 4 mg.Paclitaxel - 4 mg.

Analizę uzyskanych po kalibracji liposomów przedstawia fig. 5. Wydajność zamykania > 94%.The analysis of liposomes obtained after calibration is presented in Fig. 5. Encapsulation efficiency > 94%.

Badania stabilnościStability studies

A. Baadnie stabilnośśi I ippsomoweeo preppratuppklitakkelu przzprowaadzno doddjąc do I milliltra zawiesiny kalibrowanych liposomów otrzymanych w przykładzie 1, 300 mg glukozy. Po rozpuszczeniu glukozy próbkę zamrożono i liofilizowano przez 12 godzin. Do pozostałego suchego liofilizatu dodano następnie 1 ml wody destylowanej i preparat odtworzono. Oznaczona średnia wielkość liposomów była identyczna jak w preparacie wyjściowym i wynosiła 111 nm (+/-4 nm) (fig. 4A i fig. 4B). Okres przechowywania preparatu po odtworzeniu w temperaturze 25°C wynosił 5 dni - w tym czasie nie zaobserwowano tworzenia się kryształów paklitakselu.A. The stability study of the paclitaxel liposome preparation was performed by adding 300 mg of glucose to 1 milliliter of the suspension of calibrated liposomes obtained in Example 1. After dissolving the glucose, the sample was frozen and lyophilized for 12 hours. 1 ml of distilled water was then added to the remaining dry lyophilizate, and the preparation was reconstituted. The determined average liposome size was identical to that in the initial preparation and was 111 nm (+/- 4 nm) (Fig. 4A and Fig. 4B). The preparation was stored at 25°C for 5 days - during this time, no formation of paclitaxel crystals was observed.

B. Ocenę stabiiności z^^i<^^ir^n< Ilp^c^^t^r^c^\^^j przeprowaddono na podotawie obserwacjj nia się kryształów paklitakselu w zawiesinie liposomowej w wyniku uwalniania wolnego związku do roztworu.B. The stability assessment of the drug was performed by observing the formation of paclitaxel crystals in the liposomal suspension as a result of the release of the free compound into the solution.

Zawiesinę liposomów przygotowanych jak w przykładach 1-3 przechowywano w temp. 4°C. Próbki preparatu oglądano codziennie pod mikroskopem świetlnym, poszukując zaczątków krystalizacji paklitakselu. Okres dwu dni przed pojawieniem się pierwszych niewielkich igłowatych kryształów substancji uznawano za maksymalny okres przechowywania zawiesiny liposomowej.The liposome suspension prepared as in Examples 1-3 was stored at 4°C. Samples of the preparation were examined daily under a light microscope for signs of paclitaxel crystallization. The two-day period before the first small, needle-like crystals of the substance appeared was considered the maximum storage period for the liposome suspension.

Okres ten wynosi co najmniej 3 tygodnie dla preparatu z przykładu 1 i 10 dni dla preparatów z przykładów 2 i 3.This period is at least 3 weeks for the preparation of example 1 and 10 days for the preparations of examples 2 and 3.

Analiza wielkości liposomów nie wykazuje procesów degradacji zawiesiny liposomów w przeciągu 1 miesiąca (fig. 5).The liposome size analysis did not show any degradation processes of the liposome suspension within 1 month (Fig. 5).

C. Oceny stabiiności Ilofiilzowanej kompozyt Ilposomowej według przykładu 2 dokonano na podstawie analizy HPLC zawartości paklitakselu i kwasu 2-(3-pentadecylofenoksy)octowego po odtworzeniu wodą liofilizatu (dawka 5 mg/2,5 ml). Wyniki oznaczenia stabilności liofilizatów przechowywanych w temperaturach 4°C, 25°C i 30°C przedstawiono w tabeli. Rezultaty potwierdzają stabilność preparatu po 12 miesiącach przechowywania w temp. 25°C i po 24 miesiącach w temp. 4°C.C. The stability of the lyophilized lyophilized lyophilisate composite according to Example 2 was assessed by HPLC analysis of the paclitaxel and 2-(3-pentadecylphenoxy)acetic acid content after reconstitution of the lyophilizate with water (dose 5 mg/2.5 ml). The stability results of the lyophilizates stored at 4°C, 25°C, and 30°C are presented in the table. The results confirm the stability of the preparation after 12 months of storage at 25°C and after 24 months at 4°C.

PL 197 939 B1PL 197 939 B1

Tabela. Wyniki badań stabilności Iiofilizatu paklitakselu w dawce 5 mg/2,5 mlTable. Stability test results for paclitaxel lyophilisate at a dose of 5 mg/2.5 ml

24 m-ce 24 months bialo- kremo- wy white- cream zgodna z wzor- cem consistent with the pattern zgodna z wzor- cem consistent with the pattern 0,7424 | 0.7424 | O Γή.. Oh G.. 1 1 1 1 O0 O\ O0 O\ 104 104 12 m-cy 12 months o Γ<1 o Γ<1 ciemno- kremo- wy dark- cream zgodna z wzor- cem consistent with the pattern zgodna z wzor- cem consistent with the pattern 0,7489 0.7489 4,24 4.24 1 1 00 o\ 00 o\ 104 104 r-i r-i kremo- | wy creamy Ί s s o y υ & £ υ N N Ί s s o y υ & £ υ N N zgodna i z wzór- i cem consistent with the pattern 0,7433 0.7433 4,14 4.14 1 - 1 - 00 σ> 00 σ> 103 103 bialo- kremo- wy white- cream 3 ś c o £ 1 N N3 £ 1 N N zgodna . z wzor- cem consistent with the pattern m r* cT m r* cT 4,20 4.20 i and 0© σ\ 0© σ\ 102 102 9 m-cy 9 months o> ΓΊ o> ΓΊ ciemno- kremo- wy dark- cream -g s o o S o co ? O N N -g s o o S o what? O N N zgodna z wzorcem consistent with the pattern o· l> o' o· l> o' 4,22 4.22 1 1 1 1 σ\ ο\ σ\ ο\ 66 66 ΐτΊ ΓΝ AτΊ ΓΝ kremo- wycreamy zgodna z wzorcem consistent with the pattern zgodna z wzorcem consistent with the pattern 0,7421 0.7421 4,15 4.15 i I and I σ\ ο. σ\ ο. Ob o Ob o biało- kremo- wy white- cream zgodna z wzorcem consistent with the pattern zgodna z wzorcem consistent with the pattern 0,7415 0.7415 00 00 1 1 1 1 1 1 1 1 100 100 105 105 6 m-cy | 6 months | Φ m Φ m ciemno- kremo- ^wy ^dark cream ca Λ 00 > U N N ca Λ 00 > U N N o s C > U on > < N N o s C > U on > < N N T* [-* o' T* [-* o' 1 1 1 1 ο ο o o rj o rj o CM CM kremo- wycreamy zgodna z wzorcem consistent with the pattern zgodna z wzorcem consistent with the pattern 0,7421 I i 0.7421 I i 4,24 4.24 !! 100 100 o about bialo- kremo- wy white- cream zgodna z wzorcem consistent with the pattern zgodna : z wzor- Ś cem consistent with the pattern 0,7415 | 0.7415 | Γ* T· Γ* T· j j 100 100 102 102 3 m-ce 3 months O m About m biało- kremo- wy white- cream 1 s s nN 3 N N 1 s s nN 3 N N N | K o K o o > υ on SI N | K o K o o > υ on SI 0,7626 0.7626 4,08 4.08 1 1 O σ\ O σ\ 107 107 Mn Ol Mn Ol biało- kremo- wy white- cream zgodna j z wzor- i cem consistent with the pattern zgodna z wzorcem consistent with the pattern 0,7591 0.7591 4,04 4.04 JJ 100 ! 100! 104 104 Tt Tt biało- kremo- wy white- cream zgodna z wzorcem consistent with the pattern zgodna z wzorcem consistent with the pattern 0,7396 0.7396 4,04 4.04 ^-- 100 100 V) O V) O Po sporzą- dzeniuAfter preparing bialo- kremo- wy white- cream zgodna z wzorcem consistent with the pattern zgodna z wzorcem consistent with the pattern 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4,09 4.09 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ο ο o o O o r— O o r— Oznaczenie Designation I Temperatura CC) 1 I Temperature CC) 1 Wygląd krążkaAppearance of the disc Tożsamość paklitakselu (HPLC)Paclitaxel Identity (HPLC) Tożsamość lipidów (lecytyna, KW.28)Lipid Identity (Lecithin, KW.28) Śr. masa Iiofilizatu (g)Average lyophilizate weight (g) pH zawiesiny wodnej pH of the aqueous suspension Zawartość wody w liofilizacie (mg)Water content in the lyophilisate (mg) Zawartość j paklitakselu w liofilizacie * (% w stos, do ilości początkowej)Paclitaxel content in the lyophilisate * (% of the initial amount) Zawartość KW.28 w liofilizacie * (% w stos, do ilości początkowej) KW.28 content in the lyophilisate * (% of the stack, relative to the initial amount)

Zawartość oznaczana wg. HPLC po odtworzeniu suchego Iiofilizatu wodą do 2,5 ml i rozcieńczeniu metanolem do 25 ml. Zawartość oznaczano względem wzorca.Content determined by HPLC after reconstitution of the dry lyophilisate with water to 2.5 ml and dilution with methanol to 25 ml. Content was determined relative to a standard.

Claims

Patent claims

A liposomal preparation containing an antitumor active substance enclosed in liposome vesicles constituting a lipid component composition in the proportion of 1 part by weight of active substance to 10 to 30 parts by weight of lipid components, preferably 1 part by weight of active substance to 20 parts by weight of lipid components, characterized in that the composition The lipid components include at least one phospholipid derivative and at least one modified phytolipid derivative represented by the general formula I, in which R1 is a hydrogen atom or a group -CH2- (R2) - (R3), where R2 is an alkyl group C _m H _{2 m} +1 with m = 1-15 and R3 being a methyl or carboxyl group; n = 1-17; and R4 is hydrogen or carboxy.

2. A liposomal formulation according to claim 1 1, in that the Ilpid component composition comprises a phospholipid derivative and a phytolipid derivative of formula I in a molar ratio of about 9: 1.

3. A liposomal formulation according to claims. 1, z ^ r ^^ i ^ i ^ i ^ yy t ^ r ^ fitollpidu that the derivative has the formula wherein R 3 q R 1 in the substituent is a carboxyl group, n = 15, m = 1, and R ₄ is hydrogen.

4. A liposomal preparation according to 1, characterized in that it comprises a taxoid derivative as the active substance.

5. Liposomal preparation according to the replacement. The pharmaceutical composition of claim 4, wherein the lactate derivative is paclitaxel.

6. Liposomal preparation according to principles. The method of claim 4, wherein the lacoid derivative is docetaxel.

A method of producing a liposomal preparation of an antitumor active substance, characterized in that a) a solution of the active substance in a solvent, preferably an alkanol, is combined with a solution of lipid components in an organic solvent, the lipid components being a mixture of at least one phospholipid derivative and at least one fitolipidu modified derivative represented by the general formula I wherein R1 is hydrogen or -CH ₂ - (R ₂₎ - (R3), where R2 is an alkyl group C _m H2m + 1 wherein m = 1-15, and R3 is a methyl or carboxyl group; n = 1-17; and R4 is hydrogen or carboxyl,

b) the solvents are stripped off,

c) Him Ilpidowy obtained in step b) is in an organic solvent, preferably an alkanol, and subjected to lyophilization,

d) The ilofHlzat from the cc step is hydrated with water, o-romoting the primitives pr ^^ e ^^ r ^^ t ινίε ^ νθ ^ Λ ^ Λ ^ οΙη liposomes,

e) the preparation of pieιΓwo-nypodo is subject to additional physical processes, consisting of a suspension of calibrated bilayer liposomes with a size of 50-200 nm, preferably 100 nm, and then

f) the Ilposomal suspension is freeze-dried with the possible addition of auxiliary substances, such as cryoprotective substances.

8. The method according to principles. 6. The process according to claim 7, characterized in that in the θ-preparation step I, the microsomal is extruded through membranes with a pore diameter of 50-200 nm, preferably with a diameter of 100 nm.

9. A pharmaceutical composition for parenteral administration, comprising pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients and a therapeutically effective amount of an antitumor active substance, characterized in that it comprises a liposomal preparation of the active substance enclosed in liposome vesicles constituting a composition of lipid components in the proportion of 1 part by weight of active substance per 10. up to 30 parts by weight of lipid components, preferably 1 part by weight of active substance per 20 parts by weight of lipid components, wherein the lipid component composition comprises at least one phospholipid derivative and at least one modified phytolipid derivative represented by the general formula I, in which R1 is hydrogen or a group -CH ₂ - (R ₂ ) - (R 3), where R ₂ is a C _m H _{2 m} +1 alkyl group, with m = 1-15 and R 3 is a methyl or carboxyl group; n = 1-17; and R4 is hydrogen or carboxy.

10. Pharmaceutical composition according to claims. 9. The formulation of claim 9, wherein the excipient is glucose.

11. The composer and the pharmacist after his merit. The method according to claim 9 or 10, characterized in that the glucose and lipid components are present in a weight ratio of 5: 1.

12. A pharmaceutical composer of merit. The pharmaceutical composition of claim 9, characterized in that it is in a dosage form.