PL197939B1

PL197939B1 - Anti-cancer liposome preparation, method for its manufacture and compound pharmaceutical containing such preparation

Info

Publication number: PL197939B1
Application number: PL364657A
Authority: PL
Inventors: Arkadiusz Kozubek; Grzegorz Grynkiewicz; Wieslaw Szelejewski; Piotr Slifirski; Jerzy Gubernator; Krzysztof Wisniewski; Maria Stasiuk
Original assignee: Inst Farmaceutyczny
Priority date: 2004-01-30
Filing date: 2004-01-30
Publication date: 2008-05-30
Also published as: PL364657A1

Abstract

1. Liposomowy preparat zawierający przeciwnowotoworową substancję aktywną zamkniętą w pęcherzykach liposomowych stanowiących kompozycję składników lipidowych w proporcji 1 część wagowa substancji aktywnej na 10 do 30 części wagowych składników lipidowych, korzystnie 1 część wagowa substancji aktywnej na 20 części wagowych składników lipidowych, znamienny tym, że kompozycja składników lipidowych obejmuje co najmniej jedną pochodną fosfolipidu i co najmniej jedną modyfikowaną pochodną fitolipidu przedstawioną wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę -CH2-(R2)-(R3), gdzie R2 stanowi grupę alkilową CmH2m+1, przy czym m = 1-15, a R3 stanowi grupę metylową lub karboksylową; n = 1-17; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę karboksylową. 7. Sposób wytwarzania liposomowego preparatu przeciwnowotworowej substancji aktywnej, znamienny tym, że a) roztwór substancji aktywnej w rozpuszczalniku, korzystnie alkanolu, łączy się z roztworem składników lipidowych w rozpuszczalniku organicznym, przy czym składniki lipidowe stanowią mieszaninę co najmniej jednej pochodnej fosfolipidu i co najmniej jednej modyfikowanej pochodnej fitolipidu przedstawionej wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę -CH2-(R2)-(R3), gdzie R2 stanowi grupę alkilową CmH2m+1 przy czym m = 1-15, a R3 stanowi grupę metylową lub karboksylową; n = 1-17; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę karboksylową,................... 9. Kompozycja farmaceutyczna do podawania pozajelitowego obejmująca farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i/lub substancje pomocnicze i terapeutycznie skuteczną ilość przeciwnowotworowej substancji aktywnej, znamienna tym, że zawiera liposomowy preparat substancji aktywnej zamkniętej w pęcherzykach liposomowych stanowiących kompozycję składników lipidowych w proporcji 1.....1. Liposomal preparation containing an anti-cancer substance active closed in liposomal vesicles a composition of lipid components in the proportion of 1 part by weight of active substance in 10 to 30 parts by weight of ingredients lipids, preferably 1 part by weight of active substance to 20 parts by weight of lipid components, characterized in that the composition The lipid components include at least one derivative a phospholipid and at least one modified phytolipid derivative represented by general formula I, wherein R1 is an atom hydrogen or a group -CH2- (R2) - (R3), wherein R2 is an alkyl group CmH2m + 1, with m = 1-15 and R3 being a methyl or carboxyl group; n = 1-17; and R4 is hydrogen or carboxy. 7. A method of producing a liposomal antitumor preparation active ingredient, characterized in that a) a solution the active substance in a solvent, preferably an alkanol, is combined with a solution of lipid components in an organic solvent, wherein the lipid components are a mixture of at least one phospholipid derivative and at least one modified a phytolipid derivative represented by the general formula I, wherein R1 is hydrogen or a group -CH2- (R2) - (R3), where R2 is CmH2m + 1 alkyl group with m = 1-15 and R3 is a group methyl or carboxyl; n = 1-17; and R4 is hydrogen or a carboxyl group, ................... 9. Pharmaceutical composition for parenteral administration including pharmaceutically acceptable carriers and / or substances an auxiliary and therapeutically effective amount of anti-neoplastic active substance, characterized in that it contains a liposomal formulation active substance enclosed in liposome vesicles constituting a composition of lipid components in the proportion of 1 .....

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest liposomowy preparat zawierający przeciwnowotworową substancję aktywną, sposób jego wytwarzania i zawierająca go kompozycja farmaceutyczna.The subject of the invention is a liposomal preparation containing an antitumor active substance, a method of its preparation and a pharmaceutical composition containing the same.

Użyteczność liposomów w farmacji i medycynie, jako nośników substancji leczniczych, była postulowana od wczesnych lat sześćdziesiątych, kiedy poznano zjawisko zamykania niektórych związków chemicznych w mikropęcherzykach lipidowych. Jednak dopiero w ostatnich kilku latach uzyskano obiektywne dowody terapeutycznej skuteczności tego sposobu podawania substancji farmaceutycznych i wprowadzono do lecznictwa pierwsze liposomowe formy leków.The utility of liposomes in pharmacy and medicine as carriers of medicinal substances has been postulated since the early 1960s, when the phenomenon of encapsulating certain chemical compounds in lipid microbubbles was known. However, it is only in the last few years that objective evidence of the therapeutic effectiveness of this method of administering pharmaceutical substances has been obtained, and the first liposomal forms of drugs have been introduced into therapy.

Korzystne skutki podawania substancji aktywnych farmakologicznie w postaci liposomów polegają na podwyższeniu biodostępności, obniżeniu toksyczności układowej i/lub narządowej, ukierunkowaniu działania do konkretnych obszarów, np. tkanki nowotworowej, wydłużeniu okresu półtrwania, czyli w sumie na polepszeniu selektywności działania i indeksu terapeutycznego.The beneficial effects of administering pharmacologically active substances in the form of liposomes consist in increasing the bioavailability, reducing systemic and / or organ toxicity, targeting specific areas, e.g. neoplastic tissue, extending the half-life, i.e., in general, improving the selectivity of action and the therapeutic index.

Aktualny stan wiedzy na temat liposomów, szczególnie ich zastosowań farmaceutycznych, znany jest z opracowań literaturowych, m.in. D. D. Lasic, Liposomes: from physics to applications, Elsevier, Amsterdam 1995; D. D. Lasic, F. Martin Stealth liposomes CRC Press Boca Raton 1995, D. D. Lasic, D. Papahadjopoulos, „Medical applications of liposomes, Elsevier, Amsterdam 1998, Lian T., Ho R. J. Y. „Trends and developments in liposome drug delivery systems, J. Pharm.Sci. 90(6), 667-680, 2001.The current state of knowledge about liposomes, especially their pharmaceutical applications, is known from literature studies, incl. D. D. Lasic, Liposomes: from physics to applications, Elsevier, Amsterdam 1995; DD Lasic, F. Martin Stealth liposomes CRC Press Boca Raton 1995, DD Lasic, D. Papahadjopoulos, "Medical applications of liposomes, Elsevier, Amsterdam 1998, Lian T., Ho RJY" Trends and developments in liposome drug delivery systems, J. Pharm.Sci. 90 (6), 667-680, 2001.

Liposomy stanowią zamknięte struktury, jedno- lub wielowarstwowe, w których podwójna warstwa amfifilowego lipidu stanowi otoczkę mikrokropelki wody (liposomy jednowarstwowe) lub też błony lipidowe układają się koncentrycznie na przemian z warstwami wody (liposomy wielowarstwowe). Amfifilowe lipidy tworzące dwuwarstwę posiadają polarną grupę hydrofilową i jeden lub więcej hydrofobowych prostych łańcuchów wielowęglowych (>C8). Grupy polarne mogą stanowić pochodne fosforanów, siarczanów i związków azotu, ale najczęściej stosowane są fosfolipidy, zwłaszcza pochodzenia naturalnego, jak na przykład fosfatydylocholiny będące wynikiem rafinacji tłuszczów roślinnych, fosfolipidy syntetyczne, dostępne handlowo preparaty fosfolipidowe, w tym fosfolipidy modyfikowane chemicznie przy zastosowaniu pochodnych glikolu etylenowego i pochodne cholesterolu. Substancja lecznicza, zależnie od rozpuszczalności, umiejscowiona jest w warstwie wodnej lub w warstwie lipidowej liposomu.Liposomes are closed structures, single or multilayer, in which the double layer of amphiphilic lipid is a coating of water microdroplets (unilamellar liposomes) or lipid membranes alternate concentrically with water layers (multilayer liposomes). Amphiphilic lipids forming a bilayer have a polar hydrophilic group and one or more hydrophobic straight multi-carbon chains (> C8). Polar groups may be derivatives of phosphates, sulphates and nitrogen compounds, but the most commonly used are phospholipids, especially of natural origin, such as phosphatidylcholines resulting from the refining of vegetable fats, synthetic phospholipids, commercially available phospholipid preparations, including phospholipids chemically modified using ethylene glycol derivatives and cholesterol derivatives. The drug substance, depending on its solubility, is located in the aqueous layer or in the lipid layer of the liposome.

Znanych jest szereg sposobów otrzymywania liposomów. Klasyczna metoda wytwarzania liposomów wielowarstwowych polega na odparowaniu roztworu lipid - rozpuszczalnik organiczny i rehydratacji filmu lipidowego wodnym roztworem substancji leczniczej (J. Mol. Biol. 13 (1965), 238-252). Inne techniki obejmują emulgowanie lipidu w dwufazowej mieszaninie fazy wodnej i organicznej zawierającej lipid, przy jednoczesnym odparowywaniu rozpuszczalnika organicznego (np. opisy patentowe US 4,522,803, 5,030,453 i 5,169,637), tworzenie emulsji woda w oleju, z której odparowywana jest faza organiczna do uzyskania żelu, następnie mieszanego do otrzymania liposomów oligowarstwowych (US 4,235,871) oraz wielokrotnie powtarzanych cykli zamrażania i rozmrażania (US 5,008,050). Liposomy jednowarstwowe otrzymuje się z liposomów wielowarstwowych działaniem ultradźwięków, metodą ekstruzji (np. US 4,975,282), homogenizacji, jak również wstrzykiwania eterowych lub etanolowych roztworów lipidów do fazy wodnej (Deamer R., Uster, P. „Liposome preparation; Methods and Mechanisms , w: „Liposomes, wyd. M. Ostro, Marcel Dekker, New York, 1987).Several methods are known for the preparation of liposomes. The classic method of producing multilayer liposomes consists in evaporating the lipid-organic solvent solution and rehydrating the lipid film with an aqueous solution of the drug substance (J. Mol. Biol. 13 (1965), 238-252). Other techniques include emulsifying the lipid in a biphasic mixture of aqueous and lipid-containing organic phases, while evaporating the organic solvent (e.g., US Patents 4,522,803, 5,030,453, and 5,169,637), forming a water-in-oil emulsion from which the organic phase is evaporated to form a gel, then mixed to obtain oligolayer liposomes (US 4,235,871) and repeated cycles of freezing and thawing (US 5,008,050). Monolayer liposomes are obtained from multilayer liposomes by the action of ultrasound, by extrusion (e.g. US 4,975,282), homogenization, as well as injection of ethereal or ethanolic lipid solutions into the aqueous phase (Deamer R., Uster, P. "Liposome preparation; Methods and Mechanisms, in : "Liposomes, ed. M. Ostro, Marcel Dekker, New York, 1987).

W przypadku wielu grup terapeutyków zarówno wydajność zamykania substancji czynnej w pęcherzykach jak i trwałość liposomów (in vitro i in vivo) stanowią poważny problem techniczny. W szczególności klasyczne preparaty liposomowe trudno rozpuszczalnych w wodzie taksoidów na bazie lecytyny sojowej lub syntetycznego analogu fosfolipidowego (Bartoli i in. J. Microencapsulation 7, 1990, 191-197, Riondel i in. In Vivo 6, 1992, 23-28), wykazują tendencję do agregowania, a także niestabilność, powodującą „wyciekanie substancji aktywnej z liposomu i jej krystalizację.For many groups of therapeutics, both the vesicle entrapment efficiency and the liposome stability (in vitro and in vivo) represent a serious technical problem. In particular, the classic liposomal preparations of the sparingly water-soluble taxoids based on soy lecithin or a synthetic phospholipid analogue (Bartoli et al. J. Microencapsulation 7, 1990, 191-197, Riondel et al. In Vivo 6, 1992, 23-28), show a tendency to aggregate, as well as instability, resulting in "leakage of the active substance from the liposome and its crystallization.

W wielu przypadkach sporządzenie liposomowych preparatów substancji przeciwnowotworowych o efektywnym stosunku lipid/lek wymaga stosowania specjalnych zabiegów, takich jak na przykład opisany w publikacji WO 9202208 i zgłoszeniu patentowym EP 546951 A1 dodatek ujemnie naładowanych fosfolipidów lub ujawnione w japońskim opisie patentowym JP 06254379 dodawanie alkoholu wielowodorotlenowego i czwartorzędowych soli amoniowych.In many cases, the preparation of liposomal preparations of antineoplastic substances with an effective lipid / drug ratio requires special procedures, such as for example the addition of negatively charged phospholipids described in WO 9202208 and EP 546951 A1 or the addition of a polyhydric alcohol disclosed in Japanese Patent JP 06254379 and quaternary ammonium salts.

Udoskonalone postaci liposomowe, zapewniające większą trwałość poprzez steryczną stabilizację powierzchni sfery lipidowej, stanowią tzw. liposomy Stealth (D. D. Lasic, F.Martin „Stealth liposomes, CRC Press Boca Raton, 1995). Jedną z metod zmierzających do opracowania bardziej trwaPL 197 939 B1 łych form liposomowych stało się użycie do opłaszczania liposomów hydrofilowego glikolu polietylenowego, opisane m.in. w publikacji zgłoszenia międzynarodowego WO 9422429. Do lecznictwa została wprowadzona liposomowa postać doksorubicyny powlekanej glikolem polietylenowym pod nazwą handlową Doxil®. Preparat Doxil® zawiera doksorubicynę zamkniętą w liposomowych nośnikach Stealth, składających się z trzech składników lipidowych - uwodornionej lecytyny z soi, cholesterolu i karbaminianowego konjugatu distearynylofosfatydyloetanoloaminy z metoksylową pochodną glikolu polietylenowego 2000 w odpowiednim stosunku molowym.Improved liposomal forms, ensuring greater stability through steric stabilization of the surface of the lipid sphere, constitute the so-called Stealth liposomes (D. D. Lasic, F. Martin "Stealth liposomes, CRC Press Boca Raton, 1995). One of the methods leading to the development of more stable liposome forms has been the use of hydrophilic polyethylene glycol for the coating of liposomes, described e.g. in the publication of international application WO 9422429. A liposomal form of doxorubicin coated with polyethylene glycol under the trade name Doxil® has been introduced into therapy. Doxil® contains doxorubicin enclosed in liposomal Stealth carriers, consisting of three lipid components - hydrogenated soy lecithin, cholesterol and carbamate distearinylphosphatidylethanolamine conjugate with a methoxy derivative of polyethylene glycol 2000 in the appropriate molar ratio.

Długi czas półtrwania liposomów Stealth, związany także z niskim wyciekiem leku, uzyskuje się stosując unikalne metody ładowania, które zapewniają wysoką wydajność ładowania i utrzymywanie leku we wnętrzu przez dłuższy czas. Metody te obejmują ładowanie gradientem elektrolitu (zgłoszenie EP 361894 A1) lub gradientem pH (publikacja WO 8806442).The long half-life of Stealth liposomes, also associated with low drug leakage, is achieved using unique loading methods that ensure high loading efficiency and keep the drug inside for longer periods. These methods include charging with an electrolyte gradient (EP application 361894 A1) or with a pH gradient (WO publication 8806442).

W publikacji WO 8806442 składniki warstwy lipidowej stanowią klasyczne związki lipidowe, takie jak fosfatydylocholiny naturalne i syntetyczne, z ewentualnym dodatkiem cholesterolu, a w procesie enkapsulacji wykorzystuje się gradient pH. Zgodnie z opisem, ograniczona szybkość wyciekania zamkniętego składnika biologicznie aktywnego jest wynikiem różnic pH po dwu stronach błony lipidowej.In WO 8806442, the components of the lipid layer are classic lipid compounds, such as natural and synthetic phosphatidylcholines, with the optional addition of cholesterol, and a pH gradient is used in the encapsulation process. As described, the limited leakage rate of the entrapped biologically active ingredient is a result of the differences in pH on both sides of the lipid membrane.

Metoda ładowania gradientem pH ograniczona jest jednak tylko do leków rozpuszczających się w fazie wodnej, będących słabymi kwasami lub zasadami.However, the pH gradient loading method is limited to only water-soluble drugs that are weak acids or bases.

Preparaty liposomowe zawierające topotekan i lipidy w proporcji 0,05:0,2, ładowane metodą gradientu pH lub jonoforetyczną, opisane są w publikacji WO 0202078. W skład warstwy lipidowej wchodzą sfingomielina i cholesterol.Liposome formulations containing topotecan and lipids in the proportion of 0.05: 0.2, loaded by a pH gradient or iontophoretic method, are described in WO 0202078. The lipid layer comprises sphingomyelin and cholesterol.

W opisie zgłoszenia międzynarodowego WO 9915153 ujawnione są m.in. liposomy taksolu, charakteryzujące się stężeniem substancji aktywnej w liposomie nie wyższym niż 5 mg/ml i zawierające jako lipid syntetyczną lecytynę-dilauroilofosfatydylocholinę. Autorzy deklarują, że stosunek lek : lipid mieści się w zakresie od 1:1 do 1:2000, korzystnie 1 : 30, nie przedstawiają jednak informacji na temat trwałości tych preparatów liposomowych, przeznaczonych do podawania substancji przeciwnowotworowych drogą wziewną.In the international application WO 9915153 there are disclosed, inter alia, taxol liposomes, characterized by a concentration of the active substance in the liposome not exceeding 5 mg / ml and containing as the lipid synthetic lecithin-dilauroylphosphatidylcholine. The authors declare that the drug: lipid ratio is in the range from 1: 1 to 1: 2000, preferably 1:30, but they do not provide information on the stability of these liposome formulations intended for the administration of anti-cancer substances by inhalation.

Stabilne preparaty liposomowe uzyskiwano dotychczas głównie dzięki stosowaniu specjalnych zabiegów bądź modyfikacji cząsteczek substancji aktywnej, np. przez dołączanie łańcuchów węglowodorowych, polimerycznych lub peptydowych.Until now, stable liposome preparations have been obtained mainly through the use of special treatments or modification of active substance molecules, e.g. by adding hydrocarbon, polymeric or peptide chains.

W polskich patentach nr 190 077 i 190 078 wysoki poziom enkapsulacji doksorubicyny lub mitoksantronu przy korzystnym stosunku lek : lipid w preparacie liposomowym uzyskano w wyniku modyfikacji składu warstwy lipidowej, która zawiera oprócz klasycznych składników, lecytyny jajecznej i uwodornionej lecytyny jajecznej, wodorosiarczanową pochodną acylową rezorcyny.In Polish patents No. 190 077 and 190 078, a high level of doxorubicin or mitoxantrone encapsulation with a favorable drug: lipid ratio in a liposome preparation was obtained by modifying the composition of the lipid layer, which contains, in addition to the classic ingredients, egg lecithin and hydrogenated egg lecithin, a bisulfate acyl derivative of resorcinol.

Stabilne preparaty liposomowe paklitakselu uzyskano przez dodatek do kompozycji lipidowej kardiolipiny (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych nr 5,424,073, 5,648,090, 5,939,567 i 6,146,659). Z opisu patentowego US 6,146,659 wynika, że w tym przypadku wydajność zamykania paklitakselu w pęcherzykach liposomowych przekracza 90%, przy stosunku wagowym substancji aktywnej do nośnika lipidowego około 7%. Generalnie, możliwość inkorporowania paklitakselu do liposomów, wskutek jego wysokiej hydrofobowości, ograniczona jest do 1-10% (w/w), najczęściej 2-8% (w/w) w stosunku do nośnika lipidowego. Współczynnik ten tylko nieznacznie udaje się poprawić (do 12-14% w/w) w wyniku modyfikacji cząsteczki paklitakselu, np. przez dołączenie łańcuchów węglowodorowych (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych nr 5,919,815, 5,939,567, 6,118,011).Stable liposome formulations of paclitaxel were obtained by adding cardiolipin to the lipid composition (US Pat. Nos. 5,424,073, 5,648,090, 5,939,567 and 6,146,659). US 6,146,659 shows that in this case the entrapment efficiency of paclitaxel in liposome vesicles exceeds 90%, with a weight ratio of active substance to lipid carrier of about 7%. In general, the possibility of incorporating paclitaxel into liposomes, due to its high hydrophobicity, is limited to 1-10% (w / w), most often 2-8% (w / w) of the lipid carrier. This factor is only slightly improved (up to 12-14% w / w) by modifying the paclitaxel molecule, e.g. by adding hydrocarbon chains (US Pat. Nos. 5,919,815, 5,939,567, 6,118,011).

W dalszym ciągu istnieje zatem potrzeba opracowania liposomowych preparatów farmaceutycznych, zwłaszcza liposomowych preparatów zawierających hydrofobowe substancje przeciwnowotworowe, o korzystnym stosunku lipid/substancja aktywna, czyli umożliwiających przenoszenie takiej samej ilości substancji aktywnej przez mniejszą ilość lipidowego nośnika. W szczególności istnieje potrzeba opracowania liposomowych preparatów substancji przeciwnowotworowych, które mogłyby zostać użyte do wytwarzania leku podawanego drogą pozajelitową, charakteryzujących się wysoką wydajnością zamykania (stopniem enkapsulacji) substancji aktywnej i odpowiednią trwałością.There is therefore still a need to develop liposomal pharmaceutical formulations, especially liposomal formulations containing hydrophobic antineoplastic substances, with a favorable lipid / active ratio, i.e. allowing the same amount of active ingredient to be transported by a smaller amount of lipid carrier. In particular, there is a need to develop liposomal preparations of antitumor substances that could be used in the preparation of a parenteral drug, characterized by a high entrapment efficiency (degree of encapsulation) of the active substance and adequate stability.

Nieoczekiwanie okazało się, że potrzebę tę zaspokaja preparat liposomowy substancji hydrofobowych, w którym wysoką wydajność zamykania substancji aktywnej i trwałość uzyskuje się w wyniku modyfikacji składu klasycznego nośnika lipidowego, polegającej na wprowadzeniu do kompozycji fosfolipidu modyfikowanych pochodnych naturalnych fitolipidów zawierających w cząsteczce nasycone łańcuchy węglowodorowe i grupy karboksylowe.Unexpectedly, it turned out that this need is met by the liposomal preparation of hydrophobic substances, in which the high efficiency of the active substance entrapment and stability is achieved as a result of modifying the composition of the classic lipid carrier, consisting in the incorporation of modified natural phytolipid derivatives containing saturated hydrocarbon chains and groups in the phospholipid composition. carboxylic.

Istotę wynalazku stanowi liposomowy preparat zawierający przeciwnowotoworową substancję aktywną zamkniętą w pęcherzykach liposomowych stanowiących kompozycję składników lipidowychThe essence of the invention is a liposomal preparation containing an antitumor active substance enclosed in liposome vesicles constituting a composition of lipid components

PL 197 939 B1 w proporcji 1 część wagowa substancji aktywnej na 10 do 30 części wagowych składników lipidowych, korzystnie 1 część wagowa substancji aktywnej na 20 części wagowych składników lipidowych, charakteryzujący się tym, że kompozycja składników lipidowych obejmuje co najmniej jedną pochodną fosfolipidu i co najmniej jedną modyfikowaną pochodną fitolipidu przedstawioną wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę -CH2-(R2)-(R3), gdzie R2 stanowi grupę alkilową C_mH2m+1, przy czym m = 1-15, a R3 stanowi grupę metylową lub karboksylową; n = 1-17; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę karboksylową.In a proportion of 1 part by weight of active substance to 10 to 30 parts by weight of lipid components, preferably 1 part by weight of active substance to 20 parts by weight of lipid components, characterized in that the lipid component composition comprises at least one phospholipid derivative and at least fitolipidu one modified derivative represented by the general formula I wherein R1 is hydrogen or -CH 2 (R2) - (R3), where R2 is an alkyl group C _m H2m + 1, wherein m = 1-15, and R3 is a methyl or carboxyl group; n = 1-17; and R4 is hydrogen or carboxy.

Pochodne fitolipidu o wzorze 1 otrzymać można w wyniku przekształceń chemicznych naturalnych alkilofenoli, poprzez uwodornianie łańcucha węglowego, alkilowanie i karboksylację. Pochodne o wzorze I, w wyniku derywatyzacji naturalnych struktur, mogą różnić się charakterem chemicznym, jak również właściwościami fizykochemicznymi, na przykład rozpuszczalnością i lipofilowością.Phytolipid derivatives of the formula I can be obtained by chemical transformations of natural alkylphenols by hydrogenation of the carbon chain, alkylation and carboxylation. The derivatives of formula I, as a result of derivatization of natural structures, can differ in their chemical nature as well as their physicochemical properties, for example solubility and lipophilicity.

Szczególnie korzystne pochodne mające zastosowanie zgodnie z wynalazkiem stanowią te, w których R3 w podstawniku R1 stanowi grupę karboksylową, n = 15, m = 1, a R₄ stanowi atom wodoru, czyli kwas 2-(3-pentadecyloofenoksy)octowy.Particularly preferred derivatives to be applied in accordance with the invention are those wherein R3 substituent R1 is a carboxyl group, n = 15, m = 1, and R ₄ is hydrogen, i.e. 2- (3-pentadecyloofenoksy) acetic acid.

Korzystnie fosfolipid i pochodna fitoplipidu o wzorze I występują w kompozycji składników lipidowych w stosunku molowym około 9:1.Preferably the phospholipid and the phytoplipid derivative of formula I are present in the lipid component composition in a molar ratio of about 9: 1.

Substancję aktywną wchodzącą w skład preparatu liposomowego według wynalazku może stanowić dowolna substancja terapeutyczna wykazująca skuteczność i bezpieczeństwo przy podaniu ssakom, zwłaszcza ludziom. W szczególności należy rozważyć możliwość użycia trudno rozpuszczalnych substancji o aktywności przeciwnowotworowej, wybranych spośród antybiotyków antracyklinowych takich jak mitoksantron, daunomycyna, doksorubicyna, epirubicyna czy idarubicyna, związków alkilujących, pochodnych kamptotecyny takich jak irinotekan i kamptotekan, lignanów takich jak etopozyd oraz taksoidów takich jak paklitaksel i docetaksel, przy czym wymienione przykłady nie stanowią w żadnym stopniu ograniczenia wynalazku.The active substance in the liposome formulation according to the invention can be any therapeutic substance which is effective and safe when administered to mammals, especially humans. In particular, the possibility of using sparingly soluble substances with antitumor activity should be considered, selected from anthracycline antibiotics such as mitoxantrone, daunomycin, doxorubicin, epirubicin or idarubicin, alkylating compounds, camptothecin derivatives such as irinotecan and camptothecan, paclitans such as etaloposide and taklitoposide. docetaxel, wherein the examples mentioned do not limit the invention in any way.

Preparat liposomowy według wynalazku oprócz substancji aktywnej i składników lipidowych może zawierać dodatkowe stabilizatory struktury pęcherzyka i ewentualnie inne dopuszczalne farmaceutycznie środki pomocnicze, wpływające na zwiększenie jego trwałości.In addition to the active substance and lipid components, the liposome preparation according to the invention may contain additional vesicle structure stabilizers and, optionally, other pharmaceutically acceptable auxiliaries, which increase its stability.

Kompozycja składników lipidowych według wynalazku zapewnia wysoki stopień zamykania substancji aktywnej w pęcherzykach lipidowych. Szczególnie korzystne rezultaty uzyskuje się w przypadku paklitakselu, gdzie stopień enkapsulacji wynosi ponad 95%.The composition of the lipid components according to the invention ensures a high degree of entrapment of the active substance in lipid vesicles. Particularly favorable results are obtained with paclitaxel, where the encapsulation degree is over 95%.

Wynalazek obejmuje ponadto sposób wytwarzania preparatu liposomowego substancji przeciwnowotworowej o wysokim stopniu zamykania substancji aktywnej.The invention further comprises a method for the preparation of a liposomal formulation of an antitumor substance with a high degree of active substance entrapment.

Zgodnie z tym sposobem:According to this way:

a) roztwór substancji aktywnej w rozpuszczalniku, korzystnie alkanolu, łączy się z roztworem składników lipidowych w rozpuszczalniku organicznym, przy czym składniki lipidowe stanowią mieszaninę co najmniej jednej pochodnej fosfolipidu i co najmniej jednej modyfikowanej pochodnej fitolipidu przedstawionej wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę -CH2-(R2)-(R3), gdzie R2 stanowi grupę alkilową C_mH2m+1, przy czym m = 1-15, a R3 stanowi grupę metylową lub karboksylową; n = 1-17; a R₄ oznacza atom wodoru lub grupę karboksylową,a) a solution of the active substance in a solvent, preferably an alkanol, is combined with a solution of the lipid components in an organic solvent, the lipid components being a mixture of at least one phospholipid derivative and at least one modified phytolipid derivative represented by the general formula I, in which R1 is hydrogen or -CH 2 (R2) - (R3), where R2 is an alkyl group C _m H2m + 1, wherein m = 1-15, and R 3 represents a methyl group or a carboxyl group; n = 1-17; and R ₄ is hydrogen or carboxyl,

b) odpędza się rozpuszczalniki,b) the solvents are stripped off,

c) film lipidowy otrzymany w etapie b) rozprowadza się w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie alkanolu, i poddaje liofilizacji,c) the lipid film obtained in step b) is spread in an organic solvent, preferably an alkanol, and lyophilized,

d) IlofHlzat z etapuc) hydratyzuje się wodą, otrzymując pierwotny preparat widowarstwowych llposomów,d) The IlofHlzat from step c) is hydrated with water to give the primary preparation of the layered llposomes,

e) preparat pierwotny poddajesię dodatkowymprocesom fizycznym. otι^^'^rm^u^cz^\^i^^i(^^ kantowanych liposomów dwuwarstwowych o wielkości 50-200 nm, korzystnie 100 nm, a następnie(e) the primary preparation is subjected to additional physical processes. otι ^^ '^ rm ^ u ^ cz ^ \ ^ i ^^ i (^^ canted bilayer liposomes with a size of 50-200 nm, preferably 100 nm, then

f) zawiesinę liposomową z ewentualnym dodatkiem substancji pomocniczych, takich jak substancje krioochronne, poddaje się liofilizacji.f) the liposomal suspension is lyophilized with the possible addition of auxiliary substances, such as cryoprotective substances.

Zawiesinę w etapie c) zamraża się przez zanurzenie kolby z zawiesiną, ewentualnie z dodatkiem substancji krioochronnych, w ciekłym azocie, a następnie rozmrażanie w temperaturze 40°C. Czynności te powtarza się 7 do 10 razy. Badania przy użyciu elektronowego mikroskopu transmisyjnego Jeol 100C, przy powiększeniach 5.000-100.000x wykazują, że wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie zawiesiny liposomowej powoduje dwie istotne z punktu widzenia zastosowań farmaceutycznych zmiany: zmniejszenie warstwowości liposomów oraz ujednolicenie ich rozmiarów.The suspension in step c) is frozen by immersing the flask with the suspension, optionally with the addition of cryoprotective substances, in liquid nitrogen and then thawing at 40 ° C. These steps are repeated 7 to 10 times. Studies using the Jeol 100C transmission electron microscope at magnification of 5,000-100,000x show that repeated freezing and thawing of the liposome suspension causes two changes important from the point of view of pharmaceutical applications: reduction of liposome layering and unification of their size.

Podobne zadanie spełnia poddawanie zawiesiny liposomów krótkotrwałemu działaniu ultradźwięków, czyli sonikacja.A similar task is fulfilled by subjecting the liposome suspension to short-term ultrasound, i.e. sonication.

PL 197 939 B1PL 197 939 B1

Właściwy liposomowy preparat substancji aktywnej otrzymuje się przez hydratację preparatu pierwotnego, polegającą na wytrząsaniu, mieszaniu mechanicznym, lub poddaniu preparatu działaniu ultradźwięków (sonikacji) w obecności wody, roztworu soli fizjologicznej, buforu i ewentualnie roztworu innych farmaceutycznie dopuszczalnych substancji.A proper liposomal preparation of the active substance is obtained by hydration of the original preparation by shaking, mechanical agitation, or subjecting the preparation to ultrasound (sonication) in the presence of water, saline solution, buffer and optionally a solution of other pharmaceutically acceptable substances.

Otrzymany w etapie d) hydratyzowany preparat liposomowy składa się z liposomów wielo- i jednowarstwowych o średniej wielkości 80-1500 nm. Dwuwarstwowe liposomy o korzystnej wielkości 100-200 nm można uzyskać poddając zawiesinę liposomową odpowiednim procesom fizycznym, takim jak wymrażanie, ekstruzja, homogenizacja wysokociśnieniowa lub sonikacja.The hydrated liposome preparation obtained in step d) consists of multilayer and monolayer liposomes with an average size of 80-1500 nm. Bilayer liposomes with a preferred size of 100-200 nm can be obtained by subjecting the liposome suspension to appropriate physical processes such as freezing, extrusion, high pressure homogenization, or sonication.

Odpowiednią metodę ujednolicania wielkości liposomów stanowi kilkukrotna ekstruzja zawiesiny przez membranę poliwęglanową o średnicy porów 50-200 nm, korzystnie o średnicy 100 nm. Przeprowadzona kilkukrotnie ekstruzja pozwala na przeprowadzenie w jednej operacji jednostkowej trzech procesów wytwarzania preparatu liposomowego: ładowania pęcherzyków substancją aktywną, kalibracji liposomów i sterylizacji preparatu.A suitable method of liposome size uniformity is the multiple extrusion of the suspension through a polycarbonate membrane with a pore diameter of 50-200 nm, preferably with a diameter of 100 nm. The extrusion carried out several times allows to carry out three processes of producing a liposome preparation in one unit operation: loading the vesicles with the active substance, calibrating the liposomes and sterilizing the preparation.

Hydratacja liofilizatu substancji przeciwnowotworowej o ujawnionym składzie nawet w najprostszych warunkach, przez wytrząsanie składników lipidowych z wodnym roztworem substancji czynnej, zapewnia uzyskanie liposomowego preparatu o wysokim stopniu enkapsulacji, przekraczającym 95%.Hydration of the lyophilisate of the antitumor substance of the disclosed composition, even under the simplest conditions, by shaking the lipid components with an aqueous solution of the active substance, provides a liposomal preparation with a high degree of encapsulation, exceeding 95%.

Wynalazek stanowi ponadto kompozycja farmaceutyczna do podawania pozajelitowego charakteryzująca się tym, że zawiera liposomowy preparat substancji aktywnej zamkniętej w pęcherzykach liposomowych stanowiących kompozycję składników lipidowych w proporcji 1 część wagowa substancji aktywnej na 10 do 30 części wagowych składników lipidowych, korzystnie 1 część wagowa substancji aktywnej na 20 części wagowych składników lipidowych, przy czym kompozycja składników lipidowych obejmuje co najmniej jedną pochodną fosfolipidu i co najmniej jedną modyfikowaną pochodną fitolipidu przedstawioną wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę -CH2-(R2)-(R3), gdzie R2 stanowi grupę alkilową C_mH2m+1, przy czym m = 1-15, a R3 stanowi grupę metylową lub karboksylową; n = 1-17; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę karboksylową, oraz farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i/lub substancje pomocnicze.The invention further provides a pharmaceutical composition for parenteral administration, characterized in that it comprises a liposomal preparation of active substance enclosed in liposome vesicles constituting a lipid component composition in the proportion of 1 part by weight of active substance to 10 to 30 parts by weight of lipid components, preferably 1 part by weight of active substance per 20 parts by weight of lipid components, wherein the lipid component composition comprises at least one phospholipid derivative and at least one modified phytolipid derivative represented by the general formula I, wherein R1 is hydrogen or the group -CH2- (R2) - (R3), wherein R2 is _{C m} H 2 m + 1 alkyl group, with m = 1-15 and R 3 being a methyl or carboxyl group; n = 1-17; and R4 represents a hydrogen atom or a carboxyl group, and pharmaceutically acceptable carriers and / or auxiliaries.

Farmaceutycznie dopuszczalny nośnik stanowi dowolna znana z praktyki farmaceutycznej substancja lub mieszanina substancji nośnikowych nie wywierających własnego działania farmakologicznego, rozcieńczalnik lub substancja pomocnicza, przeznaczone do podawania substancji biologicznie czynnych. Korzystne do stosowania w związku z wynalazkiem nośniki odpowiednie do podawania kompozycji drogą dożylną obejmują na przykład wyjałowione roztwory wodne, takie jak roztwór soli fizjologicznej, roztwory węglowodanów, np. glukozy, mannitolu, dekstrozy, laktozy i roztwory wodne buforów, na przykład buforu fosforanowego. Ponadto kompozycja może zawierać inne substancje pomocnicze, tradycyjnie stosowane w celu zapewnienia izoosmotyczności, przeciwutleniacze, substancje konserwujące i inne, nie wykazujące niezgodności z substancją aktywną i ze składnikami dwuwarstwy lipidowej.A pharmaceutically acceptable carrier is any substance or mixture of carrier substances which do not exert their own pharmacological effect, diluent or excipient known in pharmaceutical practice, intended for the administration of biologically active substances. Preferred carriers for use in connection with the invention are suitable for intravenous administration of the composition, for example, sterile aqueous solutions such as saline, carbohydrate solutions, e.g., glucose, mannitol, dextrose, lactose, and aqueous buffer solutions, e.g., phosphate buffer. In addition, the composition may contain other excipients conventionally used to provide isoosmotic properties, antioxidants, preservatives, and others not incompatible with the active ingredient and with the components of the lipid bilayer.

W korzystnej postaci wykonania wynalazku, do kompozycji farmaceutycznej dodaje się glukozę, w ilości około 5:1 (w/w) w stosunku do składników llpidowych.In a preferred embodiment of the invention, glucose is added to the pharmaceutical composition in an amount of about 5: 1 (w / w) based on the lipid components.

Glukoza pełni w kompozycji funkcję substancji wypełniającej i krioochronnej. Stosuje się ilość glukozy zapewniającą odpowiednią izoosmotyczność i izochydryczność kompozycji, tak że preparat przed użyciem można odtwarzać wyłącznie wodą do iniekcji, uzyskując roztwór o odpowiednim stężeniu glukozy (5%), bez konieczności stosowania dodatkowych rozcieńczalników substancji pomocniczych.Glucose acts as a filling and cryoprotective substance in the composition. The amount of glucose used is sufficient to ensure adequate isoosmolarity and isochydricity of the composition, so that the preparation can only be reconstituted with water for injection before use to obtain a solution with the appropriate glucose concentration (5%) without the need for additional excipient diluents.

Kompozycja farmaceutyczna może mieć postać zawiesiny liposomowego preparatu substancji przeciwnowotworowej gotowej do podania, postać liofilizatu do odtwarzania ex tempore bądź też koncentratu do sporządzania wlewów dożylnych. Liofilizat występuje w jednostkowej postaci dawkowania, korzystnie w ampułce, zawierającej terapeutycznie skuteczną ilość substancji aktywnej. Kompozycję w jednostkowych postaciach dawkowania otrzymuje się przez rozdysponowanie jałowej zawiesiny w sterylnych warunkach do ampułek, liofilizację i szczelne zamknięcie. Liofilizat odtwarza się wodą do iniekcji lub innym farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem bezpośrednio przed użyciem.The pharmaceutical composition may be in the form of a liposomal preparation of antitumor substance suspension ready for administration, a lyophilisate for ex tempore reconstitution, or a concentrate for the preparation of intravenous infusions. The lyophilisate is presented in unit dosage form, preferably in an ampoule, containing a therapeutically effective amount of the active ingredient. A composition in unit dosage form is prepared by dispensing the sterile suspension into ampoules under sterile conditions, lyophilizing and sealing. The lyophilisate is reconstituted with water for injection or other pharmaceutically acceptable diluent immediately prior to use.

Skład warstwy lipidowej według wynalazku umożliwia uzyskanie liposomowego preparatu przeciwnowotworowych substancji aktywnych o korzystnym stosunku lipid/substancja aktywna, charakteryzującego się wysoką wydajnością zamykania substancji aktywnej i odpowiednią trwałością. Preparat liposomowy znajduje zastosowanie do wytwarzania liofilizowanych kompozycji do podawania pozajelitowego, zawierających terapeutycznie skuteczną ilość substancji aktywnej. Liofilizowane kompozycjeThe composition of the lipid layer according to the invention makes it possible to obtain a liposomal preparation of antitumor active substances with a favorable lipid / active substance ratio, characterized by high efficiency of active substance entrapment and adequate stability. The liposome formulation finds use in the preparation of lyophilized compositions for parenteral administration containing a therapeutically effective amount of the active ingredient. Freeze-dried compositions

PL 197 939 B1 według wynalazku zachowują stabilność w temperaturach przechowywania 4°C, 25°C i 30° w okresie do 2 lat.According to the invention, they are stable at storage temperatures of 4 ° C, 25 ° C and 30 ° C for up to 2 years.

Opis rysunków i wykresówDescription of figures and charts

Figura 1Figure 1

Analiza wielkości liposomów PC/KW-23.3 (9:1 m/m) zawierających paklitaksel (1:30 w/w), przeprowadzona metodą PCS (Korelacyjna Spektroskopia Fotonowa).Analysis of the size of PC / KW-23.3 liposomes (9: 1 m / m) containing paclitaxel (1:30 w / w), carried out by the PCS method (Correlative Photon Spectroscopy).

Małe jednowarstwowe liposomy otrzymano poprzez kalibrację dużych wielowarstwowych liposomów za pomocą filtru o średnicy porów 100 nm. Warunki pomiaru: średnia wielkość liposomów (w funkcji objętości): 106,6 nm, szerokość piku: 65 nm, jakość: Pass, indeks polidyspersyjności: 0,118, temperatura pomiaru 21,3°C, lepkość ośrodka: 0,97, ilość zliczeń/sek: 312k.Small unilamellar liposomes were obtained by calibrating large multilayer liposomes with a filter with a pore diameter of 100 nm. Measurement conditions: mean liposome size (as a function of volume): 106.6 nm, peak width: 65 nm, quality: Pass, polydispersity index: 0.118, measurement temperature 21.3 ° C, medium viscosity: 0.97, number of counts / sec: 312k.

Figura 2Figure 2

Analiza wielkości liposomów PC/KW-28 (9:1 m/m) zawierających paklitaksel (1:30 w/w), przeprowadzona metodą PCS.Analysis of the size of PC / KW-28 liposomes (9: 1 m / m) containing paclitaxel (1:30 w / w), carried out by the PCS method.

Małe jednowarstwowe liposomy otrzymano poprzez kalibrację dużych wielowarstwowych liposomów za pomocą filtru o średnicy porów 100 nm. Warunki pomiaru: średnia wielkość liposomów (w funkcji objętości): 129 nm, szerokość piku: 81,8 nm, jakość: Pass, indeks polidyspersyjności: 0,142, temperatura pomiaru 21,6°C, lepkość ośrodka: 0,96, ilość zliczeń/sek: 345k.Small unilamellar liposomes were obtained by calibrating large multilayer liposomes with a filter with a pore diameter of 100 nm. Measurement conditions: mean liposome size (as a function of volume): 129 nm, peak width: 81.8 nm, quality: Pass, polydispersity index: 0.142, measurement temperature 21.6 ° C, medium viscosity: 0.96, number of counts / sec: 345k.

Figura 3Figure 3

Analiza wielkości liposomów PC/KW-18 (9:1 m/m) zawierających paklitaksel (1:30 w/w), przeprowadzona metodą PCS.Analysis of the size of PC / KW-18 liposomes (9: 1 m / m) containing paclitaxel (1:30 w / w), carried out by the PCS method.

Małe jednowarstwowe liposomy otrzymano poprzez kalibrację dużych wielowarstwowych liposomów za pomocą filtru o średnicy porów 100 nm. Warunki pomiaru: średnia wielkość liposomów (w funkcji objętości): 133,9 nm, szerokość piku: 70,9 nm, jakość: Pass, Indeks polidyspersyjności: 0,133, temperatura pomiaru 21,5°C, lepkość ośrodka: 0,97, ilość zliczeń/sek: 343.9k.Small unilamellar liposomes were obtained by calibrating large multilayer liposomes with a filter with a pore diameter of 100 nm. Measurement conditions: mean liposome size (as a function of volume): 133.9 nm, peak width: 70.9 nm, quality: Pass, Polydispersity index: 0.133, measurement temperature 21.5 ° C, medium viscosity: 0.97, quantity counts / sec: 343.9k.

Figura 4Figure 4

Analiza wielkości liposomów PC/KW-23.3 (9:1 m/m) zawierających paklitaksel (1:30 w/w), przeprowadzona metodą PCS.Analysis of the size of PC / KW-23.3 liposomes (9: 1 m / m) containing paclitaxel (1:30 w / w), carried out by the PCS method.

A - liposomy po kalibracji przez filtr o porach 100 nm;A - liposomes calibrated through a filter with 100 nm pores;

B - liposomy z punktu A poddane liofilizacji w obecności substancji krioochronnej (glukoza, substancja krioochronna/lipid =5:1) i odtwarzane wodą.B - liposomes from point A, freeze-dried in the presence of a cryoprotective substance (glucose, cryoprotective substance / lipid = 5: 1) and reconstituted with water.

Warunki pomiaru:Measurement conditions:

A - Średnia wielkość liposomów (w funkcji objętości): 111,7 nm, szerokość piku: 68.2 nm, jakość: Pass, Indeks polidyspersyjności: 0,113, temperatura pomiaru 21,2°C, lepkość ośrodka: 0,97, ilość zliczeń/sek: 446k. B - Średnia wielkość liposomów (w funkcji objętości): 111,7, szerokość piku: 72,8 nm, jakość: Pass, Indeks polidyspersyjności: 0,121, temperatura pomiaru 21,1°C, lepkość ośrodka: 0,98, ilość zliczeń/sek: 421,7k.A - Average size of liposomes (as a function of volume): 111.7 nm, peak width: 68.2 nm, quality: Pass, Polydispersity index: 0.113, measurement temperature 21.2 ° C, medium viscosity: 0.97, number of counts / sec : 446k. B - Average size of liposomes (as a function of volume): 111.7, peak width: 72.8 nm, quality: Pass, Polydispersity index: 0.121, measurement temperature 21.1 ° C, medium viscosity: 0.98, number of counts / sec: 421.7k.

Figura 5Figure 5

Analiza wielkości liposomów PC/KW-23.3 (9:1 m/m) zawierających paklitaksel (1:30 w/w), przeprowadzona metodą PCS. Liposomy otrzymane wg. przykładu 1 przechowywano w postaci zawiesiny w temp. 4°C przez okres 1 miesiąca. Warunki pomiaru: średnia wielkość liposomów (w funkcji objętości) : 107,2, szerokość piku: 68,5 nm, jakość: Pass, Indeks polidyspersyjności: 0,123, temperatura pomiaru 20,7°C, lepkość ośrodka: 0,99, ilość zliczeń/sek: 296, 9k.Analysis of the size of PC / KW-23.3 liposomes (9: 1 m / m) containing paclitaxel (1:30 w / w), carried out by the PCS method. Liposomes obtained according to Example 1 was stored as a suspension at 4 ° C for 1 month. Measurement conditions: mean liposome size (as a function of volume): 107.2, peak width: 68.5 nm, quality: Pass, Polydispersity index: 0.123, measurement temperature 20.7 ° C, medium viscosity: 0.99, number of counts / sec: 296,9k.

Sposób według wynalazku ilustrują, nie ograniczając jego zakresu, następujące przykłady.The process of the invention is illustrated, without limitation, in the following examples.

P r z y k ł a d 1P r z k ł a d 1

Do zakręcanej probówki szklanej o pojemności 30 ml dodano 114 mg lecytyny jajecznej (PC) w chloroformie (10 mg/ml), 6 mg pochodnej KW-23.3 (kwasu 2-heksadecyloksy-4-pentadecylobenzoesowego) w chloroformie (10 mg/ml) oraz 4 mg paklitakselu w postaci roztworu metanolowego (5 mg/ml), po czym rozpuszczalniki organiczne odpędzono strumieniem czystego azotu, ogrzewając jednocześnie probówkę do temperatury 35°C. Mazistą pozostałość rozpuszczono następnie w 5 ml alkoholu tert-butylowego, zamrażano i liofilizowano przez noc.114 mg of egg lecithin (PC) in chloroform (10 mg / ml), 6 mg of the KW-23.3 derivative (2-hexadecyloxy-4-pentadecylbenzoic acid) in chloroform (10 mg / ml) were added to a screw cap glass tube with a capacity of 30 ml. 4 mg of paclitaxel as methanol solution (5 mg / ml), then the organic solvents were stripped with a stream of pure nitrogen while the tube was heated to 35 ° C. The greasy residue was then dissolved in 5 ml of tert-butyl alcohol, frozen and lyophilized overnight.

Suchą pozostałość uwodniono, energicznie wytrząsając z 2 ml sterylnej soli fizjologicznej. Otrzymane wielowarstwowe liposomy zawierające paklitaksel poddano 10 cyklom ekstruzji przy użyciu ciśnieniowego ekstrudera zaopatrzonego w filtry poliwęglanowe 100 nm (fig. 3). Po ekstruzji pobrano 50 μΙ próbkę liposomów i oznaczono w niej metodą analizy HPLC zawartość paklitakselu i składników lipidowych. Wydajność zamykania substancji aktywnej w liposomach > 95%.The dry residue was rehydrated by vigorously shaking with 2 ml of sterile saline. The obtained multilayer paclitaxel-containing liposomes were subjected to 10 cycles of extrusion using a pressure extruder equipped with 100 nm polycarbonate filters (Fig. 3). After extrusion, a 50 μΙ sample of liposomes was taken and the content of paclitaxel and lipid components was determined by HPLC analysis. Liposomal encapsulation efficiency> 95%.

PL 197 939 B1PL 197 939 B1

P r z y k ł a d 2P r z k ł a d 2

Do zakręcanej probówki odważono: 113,3 mg dimirystylofosfatydylocholiny (DMPC), 6,72 mg pochodnej KW28 (kwasu 2-(3-pentadecylofenoksy)octowego oraz 4 mg paklitakselu. Do odważonych substancji dodano następnie 5 ml alkoholu tert-butylowego. Całość wytrząsano na mikrowytrząsarce, aż do rozpuszczenia wszystkich składników. Następnie klarowny roztwór zamrożono i poddawano liofilizacji przez okres 24 godzin. Otrzymany suchy liofilizat uwodniono 2 ml sterylnej soli fizjologicznej wytrząsając energicznie probówką (10 min) przy pomocy miniwytrząsarki. Mleczną zawiesinę wielowarstwowych liposomów poddano 10 cyklom ekstruzji (fig. 4) i oznaczono wydajność zamykania paklitakselu jak w przykładzie 1. Wydajność zamykania > 95%.113.3 mg of dimyristylphosphatidylcholine (DMPC), 6.72 mg of KW28 derivative (2- (3-pentadecylphenoxy) acetic acid and 4 mg of paclitaxel were weighed into a screw-cap test tube. Then, 5 ml of tert-butyl alcohol was added to the weighed substances. Then, the clear solution was frozen and freeze-dried for 24 hours. The obtained dry lyophilisate was hydrated with 2 ml of sterile saline by shaking the tube vigorously (10 min) with a mini-shaker. The milky suspension of multilayer liposomes was subjected to 10 cycles of extrusion (fig) 4) and the sealing efficiency of paclitaxel was determined as in Example 1. Sealing efficiency> 95%.

P r z y k ł a d 3P r z k ł a d 3

Analogicznie jak w przykładzie 1 przygotowano preparat liposomowy paklitakselu o składzie:Similarly as in example 1, a paclitaxel liposomal preparation was prepared with the following composition:

KW-18 (kwas 2-hydroksy-4-pentadecylobenzoesowy) - 6 mg,KW-18 (2-hydroxy-4-pentadecylbenzoic acid) - 6 mg,

Lecytyna jajeczna - 114 mg,Egg lecithin - 114 mg,

Paklitaksel - 4 mg.Paclitaxel - 4 mg.

Analizę uzyskanych po kalibracji liposomów przedstawia fig. 5. Wydajność zamykania > 94%.An analysis of the calibrated liposomes is shown in Figure 5. Sealing efficiency> 94%.

Badania stabilnościStability studies

A. Baadnie stabilnośśi I ippsomoweeo preppratuppklitakkelu przzprowaadzno doddjąc do I milliltra zawiesiny kalibrowanych liposomów otrzymanych w przykładzie 1, 300 mg glukozy. Po rozpuszczeniu glukozy próbkę zamrożono i liofilizowano przez 12 godzin. Do pozostałego suchego liofilizatu dodano następnie 1 ml wody destylowanej i preparat odtworzono. Oznaczona średnia wielkość liposomów była identyczna jak w preparacie wyjściowym i wynosiła 111 nm (+/-4 nm) (fig. 4A i fig. 4B). Okres przechowywania preparatu po odtworzeniu w temperaturze 25°C wynosił 5 dni - w tym czasie nie zaobserwowano tworzenia się kryształów paklitakselu.A. Testing of the I ippsomic stability of preppratuppklitakkel by adding to I milliliter the suspension of the calibrated liposomes obtained in Example 1, 300 mg of glucose. After dissolving the glucose, the sample was frozen and lyophilized for 12 hours. 1 ml of distilled water was then added to the remaining dry lyophilisate and the preparation was reconstituted. The mean liposome size determined was identical to that in the starting preparation and was 111 nm (+/- 4 nm) (Fig. 4A and Fig. 4B). The shelf-life of the preparation after reconstitution at 25 ° C was 5 days - during this time no formation of paclitaxel crystals was observed.

B. Ocenę stabiiności z^^i<^^ir^n< Ilp^c^^t^r^c^\^^j przeprowaddono na podotawie obserwacjj nia się kryształów paklitakselu w zawiesinie liposomowej w wyniku uwalniania wolnego związku do roztworu.B. Stability evaluation with ^^ and <^^ ir ^ n <Ilp ^ c ^^ t ^ r ^ c ^ \ ^^ j was performed by observing paclitaxel crystals in the liposomal suspension as a result of free compound release into solution.

Zawiesinę liposomów przygotowanych jak w przykładach 1-3 przechowywano w temp. 4°C. Próbki preparatu oglądano codziennie pod mikroskopem świetlnym, poszukując zaczątków krystalizacji paklitakselu. Okres dwu dni przed pojawieniem się pierwszych niewielkich igłowatych kryształów substancji uznawano za maksymalny okres przechowywania zawiesiny liposomowej.The liposome suspension prepared as in examples 1-3 was stored at 4 ° C. The specimens of the preparation were examined daily under a light microscope for the crystallization of paclitaxel. The two-day period before the appearance of the first small needle-like crystals of the substance was considered the maximum shelf life of the liposome suspension.

Okres ten wynosi co najmniej 3 tygodnie dla preparatu z przykładu 1 i 10 dni dla preparatów z przykładów 2 i 3.This period is at least 3 weeks for the formulations of Example 1 and 10 days for the formulations of Examples 2 and 3.

Analiza wielkości liposomów nie wykazuje procesów degradacji zawiesiny liposomów w przeciągu 1 miesiąca (fig. 5).Analysis of the liposome size did not show any degradation processes of the liposome suspension within 1 month (Fig. 5).

C. Oceny stabiiności Ilofiilzowanej kompozyt Ilposomowej według przykładu 2 dokonano na podstawie analizy HPLC zawartości paklitakselu i kwasu 2-(3-pentadecylofenoksy)octowego po odtworzeniu wodą liofilizatu (dawka 5 mg/2,5 ml). Wyniki oznaczenia stabilności liofilizatów przechowywanych w temperaturach 4°C, 25°C i 30°C przedstawiono w tabeli. Rezultaty potwierdzają stabilność preparatu po 12 miesiącach przechowywania w temp. 25°C i po 24 miesiącach w temp. 4°C.C. The stability of the ilophilized Ilposomal composite according to Example 2 was assessed by HPLC analysis of the paclitaxel and 2- (3-pentadecylphenoxy) acetic acid content after reconstitution of the lyophilisate with water (dose 5 mg / 2.5 ml). The results of the stability determination of the lyophilisates stored at 4 ° C, 25 ° C and 30 ° C are shown in the table. The results confirm the stability of the preparation after 12 months of storage at 25 ° C and after 24 months at 4 ° C.

PL 197 939 B1PL 197 939 B1

Tabela. Wyniki badań stabilności Iiofilizatu paklitakselu w dawce 5 mg/2,5 mlTable. Stability test results of paclitaxel lyophilisate at a dose of 5 mg / 2.5 ml

24 m-ce 24 months bialo- kremo- wy White- creamy you zgodna z wzor- cem compatible with pattern cem zgodna z wzor- cem compatible with pattern cem 0,7424 | 0.7424 | O Γή.. ABOUT Γή .. 1 1 1 1 O0 O\ O0 ABOUT\ 104 104 12 m-cy 12 months o Γ<1 about Γ <1 ciemno- kremo- wy dark- creamy you zgodna z wzor- cem compatible with pattern cem zgodna z wzor- cem compatible with pattern cem 0,7489 0.7489 4,24 4.24 1 1 00 o\ 00 about\ 104 104 r-i r-i kremo- | wy cream- | you Ί s s o y υ & £ υ N N Ί s s o y υ & £ υ N N zgodna i z wzór- i cem compatible and with pattern- and cem 0,7433 0.7433 4,14 4.14 1 - 1 - 00 σ> 00 σ> 103 103 bialo- kremo- wy White- creamy you 3 ś c o £ 1 N N 3 c o £ 1 N N zgodna . z wzor- cem compatible. with pattern cem m r* cT m r * cT 4,20 4.20 i and 0© σ\ 0 © σ \ 102 102 9 m-cy 9 months o> ΓΊ o> ΓΊ ciemno- kremo- wy dark- creamy you -g s o o S o co ? O N N -g s o o S o What ? O N N zgodna z wzorcem consistent with the pattern o· l> o' about· l> about' 4,22 4.22 1 1 1 1 σ\ ο\ σ \ ο \ 66 66 ΐτΊ ΓΝ ΐτΊ ΓΝ kremo- wy creamy you zgodna z wzorcem consistent with the pattern zgodna z wzorcem consistent with the pattern 0,7421 0.7421 4,15 4.15 i I and AND σ\ ο. σ \ ο. Ob o Ob about biało- kremo- wy White- creamy you zgodna z wzorcem consistent with the pattern zgodna z wzorcem consistent with the pattern 0,7415 0.7415 00 00 1 1 1 1 1 1 1 1 100 100 105 105 6 m-cy | 6 months | Φ m Φ m ciemno- kremo- ^wydark kremo- ^y ca Λ 00 > U N N all Λ 00> U N N o s C > U on > < N N axis C> U on> <N N T* [-* o' T * [- * about' 1 1 1 1 ο ο ο ο rj o rj about CM CM kremo- wy creamy you zgodna z wzorcem consistent with the pattern zgodna z wzorcem consistent with the pattern 0,7421 I i 0.7421 I. and 4,24 4.24 ! ! 100 100 o about bialo- kremo- wy White- creamy you zgodna z wzorcem consistent with the pattern zgodna : z wzor- Ś cem compliant with the pattern Willing 0,7415 | 0.7415 | Γ* T· Γ * T j j 100 100 102 102 3 m-ce 3 months O m ABOUT m biało- kremo- wy White- creamy you 1 s s nN 3 N N 1 s s nN 3 N N N | K o K o o > υ on SI N | K o K o o> υ on SI 0,7626 0.7626 4,08 4.08 1 1 O σ\ ABOUT σ \ 107 107 Mn Ol Me Ol biało- kremo- wy White- creamy you zgodna j z wzor- i cem compliant with the pattern and cem zgodna z wzorcem consistent with the pattern 0,7591 0.7591 4,04 4.04 J J. 100 ! 100! 104 104 Tt Tt biało- kremo- wy White- creamy you zgodna z wzorcem consistent with the pattern zgodna z wzorcem consistent with the pattern 0,7396 0.7396 4,04 4.04 ^-- 100 100 V) O V) ABOUT Po sporzą- dzeniu After drawn up doing bialo- kremo- wy White- creamy you zgodna z wzorcem consistent with the pattern zgodna z wzorcem consistent with the pattern 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4,09 4.09 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ο ο ο ο O o r— ABOUT about r— Oznaczenie Mark I Temperatura CC) 1 I Temperature CC) 1 Wygląd krążka The appearance of the puck Tożsamość paklitakselu (HPLC) Identity paclitaxel (HPLC) Tożsamość lipidów (lecytyna, KW.28) Identity of lipids (lecithin, KW 28) Śr. masa Iiofilizatu (g) Wed mass Lyophilisate (g) pH zawiesiny wodnej pH of the aqueous suspension Zawartość wody w liofilizacie (mg) Water content in the lyophilisate (mg) Zawartość j paklitakselu w liofilizacie * (% w stos, do ilości początkowej) Content j paclitaxel lyophilisate * (% stacked to the starting amount) Zawartość KW.28 w liofilizacie * (% w stos, do ilości początkowej) KW.28 content in the lyophilisate * (% in the stack, to the initial amount)

Zawartość oznaczana wg. HPLC po odtworzeniu suchego Iiofilizatu wodą do 2,5 ml i rozcieńczeniu metanolem do 25 ml. Zawartość oznaczano względem wzorca.The content is marked according to HPLC after reconstitution of the dry lyophilisate with water to 2.5 ml and dilution with methanol to 25 ml. The content was determined against the standard.

Claims

Patent claims

A liposomal preparation containing an antitumor active substance enclosed in liposome vesicles constituting a lipid component composition in the proportion of 1 part by weight of active substance to 10 to 30 parts by weight of lipid components, preferably 1 part by weight of active substance to 20 parts by weight of lipid components, characterized in that the composition The lipid components include at least one phospholipid derivative and at least one modified phytolipid derivative represented by the general formula I, in which R1 is a hydrogen atom or a group -CH2- (R2) - (R3), where R2 is an alkyl group C _m H _{2 m} +1 with m = 1-15 and R3 being a methyl or carboxyl group; n = 1-17; and R4 is hydrogen or carboxy.

2. A liposomal formulation according to claim 1 1, in that the Ilpid component composition comprises a phospholipid derivative and a phytolipid derivative of formula I in a molar ratio of about 9: 1.

3. A liposomal formulation according to claims. 1, z ^ r ^^ i ^ i ^ i ^ yy t ^ r ^ fitollpidu that the derivative has the formula wherein R 3 q R 1 in the substituent is a carboxyl group, n = 15, m = 1, and R ₄ is hydrogen.

4. A liposomal preparation according to 1, characterized in that it comprises a taxoid derivative as the active substance.

5. Liposomal preparation according to the replacement. The pharmaceutical composition of claim 4, wherein the lactate derivative is paclitaxel.

6. Liposomal preparation according to principles. The method of claim 4, wherein the lacoid derivative is docetaxel.

A method of producing a liposomal preparation of an antitumor active substance, characterized in that a) a solution of the active substance in a solvent, preferably an alkanol, is combined with a solution of lipid components in an organic solvent, the lipid components being a mixture of at least one phospholipid derivative and at least one fitolipidu modified derivative represented by the general formula I wherein R1 is hydrogen or -CH ₂ - (R ₂₎ - (R3), where R2 is an alkyl group C _m H2m + 1 wherein m = 1-15, and R3 is a methyl or carboxyl group; n = 1-17; and R4 is hydrogen or carboxyl,

b) the solvents are stripped off,

c) Him Ilpidowy obtained in step b) is in an organic solvent, preferably an alkanol, and subjected to lyophilization,

d) The ilofHlzat from the cc step is hydrated with water, o-romoting the primitives pr ^^ e ^^ r ^^ t ινίε ^ νθ ^ Λ ^ Λ ^ οΙη liposomes,

e) the preparation of pieιΓwo-nypodo is subject to additional physical processes, consisting of a suspension of calibrated bilayer liposomes with a size of 50-200 nm, preferably 100 nm, and then

f) the Ilposomal suspension is freeze-dried with the possible addition of auxiliary substances, such as cryoprotective substances.

8. The method according to principles. 6. The process according to claim 7, characterized in that in the θ-preparation step I, the microsomal is extruded through membranes with a pore diameter of 50-200 nm, preferably with a diameter of 100 nm.

9. A pharmaceutical composition for parenteral administration, comprising pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients and a therapeutically effective amount of an antitumor active substance, characterized in that it comprises a liposomal preparation of the active substance enclosed in liposome vesicles constituting a composition of lipid components in the proportion of 1 part by weight of active substance per 10. up to 30 parts by weight of lipid components, preferably 1 part by weight of active substance per 20 parts by weight of lipid components, wherein the lipid component composition comprises at least one phospholipid derivative and at least one modified phytolipid derivative represented by the general formula I, in which R1 is hydrogen or a group -CH ₂ - (R ₂ ) - (R 3), where R ₂ is a C _m H _{2 m} +1 alkyl group, with m = 1-15 and R 3 is a methyl or carboxyl group; n = 1-17; and R4 is hydrogen or carboxy.

10. Pharmaceutical composition according to claims. 9. The formulation of claim 9, wherein the excipient is glucose.

11. The composer and the pharmacist after his merit. The method according to claim 9 or 10, characterized in that the glucose and lipid components are present in a weight ratio of 5: 1.

12. A pharmaceutical composer of merit. The pharmaceutical composition of claim 9, characterized in that it is in a dosage form.