PL195815B1 - Method of receiving bacteriofage strain featuring increased affinity for eucariotic cells, compounds containing such bacteriofage strain and bacteriofage application - Google Patents
Method of receiving bacteriofage strain featuring increased affinity for eucariotic cells, compounds containing such bacteriofage strain and bacteriofage applicationInfo
- Publication number
- PL195815B1 PL195815B1 PL355355A PL35535502A PL195815B1 PL 195815 B1 PL195815 B1 PL 195815B1 PL 355355 A PL355355 A PL 355355A PL 35535502 A PL35535502 A PL 35535502A PL 195815 B1 PL195815 B1 PL 195815B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- bacteriophage
- cell
- eukaryotic cell
- cells
- eukaryotic
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 35
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims abstract description 88
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 46
- 102100037373 DNA-(apurinic or apyrimidinic site) endonuclease Human genes 0.000 claims description 15
- 101710088570 Flagellar hook-associated protein 1 Proteins 0.000 claims description 15
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 11
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 claims 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 claims 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 claims 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 24
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 7
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 6
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229940124447 delivery agent Drugs 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10111—Myoviridae
- C12N2795/10132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10111—Myoviridae
- C12N2795/10151—Methods of production or purification of viral material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
Abstract
Description
Opis wynalazkuDescription of the invention
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania bakteriofagów o zwiększonym powinowactwie do komórek eukariotycznych, nowe zastosowania bakteriofagów, mutant bakteriofaga i środek farmaceutyczny.The subject of the invention is a method of obtaining bacteriophages with increased affinity for eukaryotic cells, new applications of bacteriophages, a mutant of a bacteriophage and a pharmaceutical.
Choroby nowotworowe stanowią poważne wyzwanie dla współczesnej medycyny. Mimo wielu lat badań zmierzających do uzyskania uniwersalnej terapii antynowotworowej medycyna nie dysponuje tego rodzaju narzędziami. Istnieje zatem potrzeba dostarczenia środków i sposobów leczenia, zapobiegania i powstrzymywania rozwoju chorób nowotworowych.Neoplastic diseases pose a serious challenge to modern medicine. Despite many years of research aimed at obtaining universal anti-cancer therapy, medicine does not have such tools at its disposal. There is therefore a need to provide means and methods for the treatment, prevention and suppression of the development of neoplastic diseases.
Znane są liczne zastosowania bakteriofagów polegające na wykorzystaniu ich jako czynnika antybakteryjnego. Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu otrzymywania bakteriofagów wykazujące powinowactwo do komórek eukariotycznych. Bakteriofagi posiadające podwyższone powinowactwo do komórek eukariotycznych mogłyby znaleźć szereg zastosowań zarówno w terapii jak i diagnostyce. W szczególnym przypadku pożądane jest otrzymanie bakteriofagów posiadających podwyższone powinowactwo do komórek nowotworowych.There are many known applications of bacteriophages consisting in using them as an antibacterial agent. The object of the invention is to provide a method for the preparation of bacteriophages showing affinity for eukaryotic cells. Bacteriophages with increased affinity for eukaryotic cells could find a number of applications in both therapy and diagnostics. In a particular case, it is desirable to obtain bacteriophages having an increased affinity for tumor cells.
W szczególności celem tego wynalazku jest dostarczenie środków, które mogą być wykorzystane do diagnozowania, leczenia, zapobiegania i powstrzymywania rozwoju chorób związanych z występowaniem, określonych komórek eukariotycznych, zwłaszcza nowotworowych.In particular, the object of this invention is to provide means that can be used for the diagnosis, treatment, prevention and suppression of the development of diseases associated with the occurrence of certain eukaryotic cells, especially neoplastic.
Określone powyżej zamierzenia zostały nieoczekiwanie zrealizowane w niniejszym wynalazku.The purposes stated above have surprisingly been realized in the present invention.
Przedmiotem wynalazku sposób otrzymywania szczepu bakteriofaga o zwiększonym powinowactwie do komórek eukariotycznych, charakteryzujący się tym, że zawiera etapy, w których: (a) kontaktuje się komórkę eukariotyczną z bakteriofagami, (b) usuwa się niezwiązane lub słabo związane bakteriofagi, (c) bakteriofaga związanego z komórką eukariotyczną namnaża się w komórce bakteryjnej uzyskując w ten sposób szczep bakteriofaga o zwiększonym powinowactwie do komórek eukariotycznych. Korzystnie, szczep bakteriofaga uzyskanego w (c) wykorzystuje się w kolejnym powtórzeniu etapów (a), (b) i (c), przy czym korzystnie liczba kolejnych powtórzeń jest większa niż 1, korzystnie nie mniejsza niż 7. Korzystnie etap (a) obejmuje dodatkowo poddawanie bakteriofaga działaniu czynników mutagennych przed skontaktowaniem go z komórką eukariotyczną. W sposobie według wynalazku, korzystnie komórką eukariotyczną jest komórka nowotworowa. Korzystnie w etapie (a) inkubuje się komórki eukariotyczne z roztworem zawierającym bakteriofagi w stosunku ilościowym od 1do 105 pfu bakteriofaga na komórkę eukariotyczną, przy czym korzystniej w etapie (a) inkubuje się komórki eukariotyczne z roztworem zawierającym bakteriofagi w stosunku ilościowym 1000 pfu bakteriofaga na komórkę eukariotyczną, w temperaturze 37°C przez 2 h. Korzystnie w etapie (b) sposobu według wynalazku prowadzi się przynajmniej jedno płukanie komórek, przy czym korzystniej w etapie (b) prowadzi się 1-10-krotne płukanie wodą lub nisko stężonym roztworem soli. Korzystnie w etapie (c) sposobu według wynalazku prowadzi się hodowlę bakteriofaga metodą płytek dwuwarstwowych. Korzystnie w etapie (c) sposobu według wynalazku otrzymaną w wyniku namnażania zawiesinę zawierającą bakteriofagi przesącza się przez sączki antybakteryjne.The subject of the invention is a method of obtaining a bacteriophage strain with increased affinity for eukaryotic cells, characterized in that it comprises the steps of: (a) contacting the eukaryotic cell with bacteriophages, (b) removing unbound or weakly bound bacteriophages, (c) bound bacteriophage with a eukaryotic cell is multiplied in a bacterial cell, thus obtaining a bacteriophage strain with increased affinity for eukaryotic cells. Preferably, the bacteriophage strain obtained in (c) is used in the successive repetition of steps (a), (b) and (c), preferably the number of consecutive repeats is greater than 1, preferably not less than 7. Preferably step (a) comprises in addition, exposing the bacteriophage to the mutagenic agents before contacting it with the eukaryotic cell. In the method of the invention, preferably the eukaryotic cell is a tumor cell. Preferably in step (a) eukaryotic cells are incubated with a solution containing bacteriophages in a ratio of 1 to 10 5 pfu of bacteriophage per eukaryotic cell, more preferably in step (a) eukaryotic cells are incubated with a solution containing bacteriophages in a ratio of 1000 pfu of bacteriophage per eukaryotic cell. a eukaryotic cell, at 37 ° C for 2 h. Preferably, in step (b) of the method according to the invention, at least one washing of the cells is carried out, more preferably in step (b), washing is carried out 1-10 times with water or low-concentrated salt solution . Preferably, in step (c) of the method according to the invention, the bacteriophage is cultivated by the bilayer plate method. Preferably, in step (c) of the method according to the invention, the multiplication suspension containing the bacteriophages is filtered through antibacterial filters.
Przedmiotem wynalazku jest także bakteriofag HAP1 zdeponowany w PCM jako F/00028.The invention also relates to the HAP1 bacteriophage deposited in the PCM as F / 00028.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie bakteriofaga do wiązania się z komórką eukariotyczną, korzystnie komórką nowotworową.The invention also relates to the use of a bacteriophage for binding to a eukaryotic cell, preferably a tumor cell.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie bakteriofaga wiążącego się z komórką eukariotyczną do wytwarzania preparatu do diagnozowania i/lub leczenia i/lub zapobiegania B i/lub powstrzymywania rozwoju choroby związanej z występowaniem tej komórki eukariotycznej, korzystnie komórką eukariotyczną którą jest komórka nowotworowa.The invention also relates to the use of a bacteriophage that binds to a eukaryotic cell for the production of a preparation for the diagnosis and / or treatment and / or prevention of B and / or inhibiting the development of a disease associated with the occurrence of this eukaryotic cell, preferably a eukaryotic cell which is a tumor cell.
Przedmiotem wynalazku jest także środek do diagnozowania i/lub leczenia i/lub zapobiegania i/lub powstrzymywania rozwoju choroby związanej z występowaniem komórki eukariotycznej, charakteryzujący się tym, że jako czynnik aktywny zawiera bakteriofaga wiążącego się z tą komórką eukariotyczną, korzystnie komórką nowotworową.The invention also relates to an agent for diagnosing and / or treating and / or preventing and / or suppressing the development of a disease associated with the occurrence of a eukaryotic cell, characterized in that the active agent comprises a bacteriophage which binds to this eukaryotic cell, preferably a tumor cell.
W wyniku przeprowadzonych badań nieoczekiwanie stwierdzono, że zaprezentowany sposób pozwala uzyskać bakteriofagi wykazujące zwiększone powinowactwo do komórek eukariotycznych. Uzyskane w ten sposób bakteriofagi stanowią dogodne narzędzie dla współczesnej medycyny, które może być szeroko wykorzystane zarówno w terapii jak i w diagnostyce. Zastosowania terapeutyczne mogą obejmować terapię celowaną, polegającą np. na wykorzystaniu bakteriofagów jako czynnika dostarczającego lek (np. obce białko wbudowane w strukturę, lub obce, lecznicze DNA wbudowane w genom faga). Inne zastosowanie terapeutyczne otrzymanych bakteriofagów może polegać na pośrednimAs a result of the conducted research, it was surprisingly found that the presented method allows to obtain bacteriophages showing increased affinity for eukaryotic cells. The bacteriophages obtained in this way are a convenient tool for modern medicine, which can be widely used both in therapy and in diagnostics. Therapeutic uses may include targeted therapy, such as the use of bacteriophages as a drug delivery agent (e.g., a foreign protein integrated into a structure, or a foreign therapeutic DNA integrated into a phage genome). Another therapeutic use of the obtained bacteriophages may be indirect
PL 195 815 B1 stymulowaniu i ukierunkowywaniu odpowiedzi immunologicznej organizmu gospodarza na tkankę, do której powinowactwo wykazują bakteriofagi. Fagi o zwiększonym powinowactwie do tkanki nowotworowej mogą być wykorzystane do leczenia, zapobiegania i powstrzymywania rozwoju chorób nowotworowych, oraz zapobieganiu powstawania przerzutów. Zaprezentowane figury stanowią uzupełnienie treści niniejszego opisu.By stimulating and directing the immune response of the host organism to tissue affinity for bacteriophages. Phages with increased affinity for neoplastic tissue can be used to treat, prevent and stop the development of neoplastic diseases, and to prevent metastasis. The presented figures supplement the content of this description.
Figura 1 przedstawia liczbę kolonii nowotworowych w płucach myszy w 22 dni po dożylnym podaniu komórek mysiego czerniaka B16 w ilości komórek 3x105/mysz, myszom z grupy T4 podawano lizat bakteriofaga T4, HAP1 myszom z grupy HAP1 podawano lizat bakteriofaga HAP1, myszom z grupy SON podawano sonifikat bakteryjny, natomiast myszy z grupy K (kontrola) otrzymywały sól fizjologiczną (szczegółowy opis patrz przykład 2).Figure 1 shows the number of tumor colonies in the lungs of mice 22 days after intravenous administration of B16 mouse melanoma cells in the amount of 3x10 5 cells / mouse, T4 mice were treated with T4 bacteriophage lysate, HAP1 mice HAP1 mice were treated with HAP1 bacteriophage lysate, SON mice bacterial sonication was administered while mice from group K (control) received saline (see example 2 for a detailed description).
Dla lepszego zrozumienia istoty wynalazku została ona zilustrowana poniższymi przykładami. Błędne byłoby jednak ograniczanie zakresu wynalazku jedynie do tych przykładowych realizacji.For a better understanding of the essence of the invention, it has been illustrated by the following examples. It would be wrong, however, to limit the scope of the invention to only these exemplary implementations.
P r z y k ł a d 1. Uzyskanie mutanta bakteriofagowego o zwiększonym powinowactwie do komórek eukariotycznych.Example 1. Obtaining a bacteriophage mutant with increased affinity for eukaryotic cells.
Jako docelowe komórki eukariotyczne zastosowano komórki przeszczepialnego mysiego czerniaka B16. Linię tą otrzymano z Narodowego Instytutu Rakowego, Bethesda, USA i obecnie jest ona utrzymywana w Banku Linii Komórkowych w Zakładzie Immunologii Nowotworów IITD. Badany bakteriofag T4 został zakupiony w American Type Culture Collection USA. Zastosowano lizaty bakteriofagowe uzyskane w wyniku hodowli bakteriofaga T4 na bakteriach Escherichia coli Bz Kolekcji Mikroorganizmów IITD; lizaty przesączono przez sączki antybakteryjne 0,22 μm Millipore. Miana lizatów bakteriofagowych użytych w doświadczeniach wynosiły 108-109 pfu/ml.B16 transplant mouse melanoma cells were used as target eukaryotic cells. This line was obtained from the National Cancer Institute, Bethesda, USA, and is currently maintained at the Cell Line Bank of the IITD Cancer Immunology Unit. The test bacteriophage T4 was purchased from the American Type Culture Collection USA. Bacteriophage lysates obtained by culturing T4 bacteriophage on Escherichia coli B bacteria from the IITD Microbial Collection were used; The lysates were filtered through 0.22 µm Millipore antibacterial filters. Titer bacteriophage lysates were used in the experiments were 10 8 -10 9 pfu / ml.
Przeprowadzono mutagenezę bakteriofaga T4 z zastosowaniem EMS (ethyl methane sulphonate, Sigma) [Lawley P.D., Martin C.N. (1975): Molecular Mechanisms in Alkylation Mutagenesis. Biochem.J. 145, 85-91].T4 bacteriophage mutagenesis was performed using EMS (ethyl methane sulphonate, Sigma) [Lawley P.D., Martin C.N. (1975): Molecular Mechanisms in Alkylation Mutagenesis. Biochem. J. 145, 85-91].
Wykonano serię pasaży bakteriofaga na komórkach B16 in vitro. W każdym pojedynczym pasażu inkubowano komórki B16 z lizatem bakteriofagowym w stosunku ilościowym 1000 pfu bakteriofaga T4 na 1komórkę B16, w temperaturze 37°C przez 2 h. Następnie komórki B16 były 5-7-krotnie płukane 0,9% NaCl: komórki zwirowywano, zlewano supernatant, zawieszano w 0,9% NaCl. Końcowa zawiesina komórek była wykorzystana do hodowli bakteriofaga metodą płytek dwuwarstwowych [Adams M.H. (1959): Bacteriophages. Inter. Science Publ., New York], na bakteriach Escherichia coli B z Kolekcji Mikroorganizmów IITD. Otrzymaną zawiesinę przesączono przez sączki antybakteryjne 0,22 μm Millipore i używano do następnego pasażu. Łącznie wykonano 7 pasaży.A series of bacteriophage passages was performed on B16 cells in vitro. In each single passage, B16 cells were incubated with bacteriophage lysate in the ratio of 1000 pfu of bacteriophage T4 per 1 cell B16 at 37 ° C for 2 h. Then B16 cells were washed 5-7 times with 0.9% NaCl: cells were centrifuged, pooled supernatant, suspended in 0.9% NaCl. The final cell suspension was used to culture bacteriophage by the two-layer plate method [Adams M.H. (1959): Bacteriophages. Inter. Science Publ., New York], on Escherichia coli B bacteria from the IITD Microbial Collection. The resulting suspension was filtered through 0.22 µm Millipore antibacterial filters and used for the next passage. A total of 7 passages were made.
Po serii pasaży porównano zdolność do wiązania się z komórkami B16 bakteriofaga T4 oraz populacji fagów otrzymanej drogą selekcji w pasażach (PPF). Przygotowano lizat bakteriofaga T4 oraz lizat po hodowli PPF na bakteriachEscherichia coli Bz Kolekcji Mikroorganizmów IITD, tak, abymiana w obu lizatach były takie same. Lizaty przesączono przez sączki antybakteryjne 0,22 μm Millipore. Inkubowano komórki B16 z powyższymi lizatami w stosunku ilościowym 1000 pfu na 1 komórkę B16 bakteriofaga, w temperaturze 37°C przez 2 h. Następnie komórki B16 były 7-krotnie płukane 0,9% NaCl: komórki zwirowywano, zlewano supernatant, zawieszano w 0,9%NaCl. W końcowej zawiesinie komórek ustalano liczbę komórek B16 w 1 ml zawiesiny oraz miano bakteriofaga. W ostatnim zlanym supernatancie ustalano miano bakteriofaga w celu potwierdzenia dokładnego usunięcia niezwiązanych bakteriofagów. Następnie ustalano stosunek ilościowy bakteriofagów znajdujących się w uzyskanej zawiesinie końcowej komórek B16 do liczby komórek w tej zawiesinie. Potwierdzono, że stosunek ten w przypadku komórek B16 inkubowanych z lizatem uzyskanym drogą hodowli PPF jest większy od stosunku w przypadku komórek B16 inkubowanych z bakteriofagiem T4 (Tab.1.).After the series of passages, the ability to bind to B16 T4 bacteriophage cells and the phage population obtained by passage selection (PPF) were compared. A bacteriophage T4 lysate and a PPF lysate were prepared on Escherichia coli B bacteria from the IITD Microbial Collection, so that the titers in both lysates were the same. The lysates were filtered through 0.22 µm Millipore antibacterial filters. B16 cells with the above lysates were incubated in the ratio of 1000 pfu per 1 bacteriophage B16 cell at 37 ° C for 2 h. Then the B16 cells were washed 7 times with 0.9% NaCl: the cells were centrifuged, the supernatant was decanted, suspended at 0, 9% NaCl. In the final cell suspension, the number of B16 cells in 1 ml of suspension and the titer of bacteriophage were determined. A bacteriophage titer was determined in the last pooled supernatant to confirm the thorough removal of unbound bacteriophages. Subsequently, the quantitative ratio of bacteriophages present in the resulting final B16 cell suspension to the number of cells in this suspension was determined. It was confirmed that this ratio in the case of B16 cells incubated with the lysate obtained by PPF culture is greater than the ratio in the case of B16 cells incubated with the bacteriophage T4 (Tab. 1).
Następnie z bakteriofagów należących do PPF wyprowadzono hodowle bakteriofagowe z pojedynczych łysinek. Hodowle prowadzono na bakteriach Escherichia coli B z Kolekcji Mikroorganizmów IITD, tak, aby miana w lizatach były takie same. Lizaty przesączono przez sączki antybakteryjne 0,22 μm Millipore. Dla każdej tak uzyskanej czystej linii fagowej porównano zdolność do wiązania się z komórkami B16 w stosunku do bakteriofaga T4 (wykonano jw.).Wybrano linię bakteriofaga, który wykazywał największą różnicę w stosunku do bakteriofaga T4; bakteriofag ten otrzymał nazwę HAP1 (Tab. 2.). Bakteriofag HAP1 został zdeponowany dnia 05 sierpnia 2002 r. zgodnie z wymogami traktatu budapeszteńskiego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) zanumerem dostępu PCM F/000028.Then, single-plaque bacteriophage cultures were derived from bacteriophages belonging to PPF. Cultures were carried out on Escherichia coli B bacteria from the IITD Microbial Collection so that the titers in the lysates were the same. The lysates were filtered through 0.22 µm Millipore antibacterial filters. For each pure phage line thus obtained, the ability to bind to B16 cells was compared against T4 bacteriophage (as above). The bacteriophage line which showed the greatest difference against T4 bacteriophage was selected; This bacteriophage was named HAP1 (Tab. 2). The HAP1 bacteriophage was deposited on August 5, 2002 in accordance with the requirements of the Budapest Treaty at the Polish Microbiological Collection (PCM) with the PCM access number F / 000028.
PL 195 815 B1PL 195 815 B1
T ab el a 1T ab el a 1
Porównanie zdolności do wiązania się z komórkami B16 bakteriofaga T4 oraz populacji bakteriofagów otrzymanej drogą selekcji w pasażach (PPF).Comparison of the ability to bind to B16 T4 bacteriophage cells and the bacteriophage population obtained by passage selection (PPF).
T ab el a 2Table 2
Porównanie zdolności do wiązania się z komórkami B16 bakteriofaga T4 oraz bakteriofaga HAP1Comparison of the ability to bind to B16 cells of bacteriophage T4 and bacteriophage HAP1
Podsumowanie: Stwierdzono, że bakteriofagi mogą wykazywać powinowactwo do komórek eukariotycznych. Nieoczekiwanie dowiedziono, że zaprezentowany sposób pozwala na uzyskanie bakteriofagów o podwyższonym powinowactwie do komórek eukariotycznych, przykładowo komórek nowotworowych.Summary: It was found that bacteriophages can show affinity for eukaryotic cells. Unexpectedly, it was proved that the presented method allows to obtain bacteriophages with increased affinity for eukaryotic cells, for example neoplastic cells.
Przykład 2. Aktywność antynowotworowa bakteriofagów wiążących się z komórkami nowotworowymi. Testy in-vivo.Example 2. Antitumor activity of bacteriophages binding to tumor cells. In-vivo tests.
W badaniach zastosowano komórki przeszczepialnego mysiego czerniaka B16. Linię tą otrzymano z Narodowego Instytutu Rakowego, Bethesda, USA i obecnie jest ona utrzymywana w Banku Linii Komórkowych w Zakładzie Immunologii Nowotworów IITD.B16 mouse melanoma cells were used in the research. This line was obtained from the National Cancer Institute, Bethesda, USA, and is currently maintained at the Cell Line Bank of the IITD Cancer Immunology Unit.
Do badań wykorzystano 6-12 tyg. samice myszy szczepu wsobnego: C57Bl/6 pochodzące z Centrum Onkologii w Warszawie. Wszystkie zwierzęta utrzymywane były w konwencjonalnych warunkach laboratoryjnych. Na przeprowadzenie doświadczeń na zwierzętach uzyskano zgodę I Lokalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń z Wykorzystaniem Zwierząt Laboratoryjnych we Wrocławiu.6-12 weeks old female mice of inbred strain: C57B1 / 6 from the Oncology Center in Warsaw were used for the study. All animals were kept under conventional laboratory conditions. The consent of the 1st Local Ethical Committee for Experiments with the Use of Laboratory Animals in Wrocław was granted to conduct experiments on animals.
Do przeszczepiania drogą dożylną (i.v.) stosowano zawiesinę komórek pochodzących z hodowli in vitro. Jednorodną zawiesinę komórek (3x105/mysz) w 0,9% NaCl wstrzykiwano do żyły ogonowej bocznej w objętości 0,2 ml. W wyniku tego rodzaju przeszczepu (komórki nowotworowe wprowadzane są bezpośrednio do krwiobiegu) uzyskujemy przerzuty „eksperymentalne” (sztuczne) [DR: Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis 1997; 15: 272-306]. Po iniekcji dożylnej część komórek nowotworowych przeżywa w krążeniu i po zatrzymaniu się i opuszczeniu światła naczynia zasiedla narząd, w którym może utworzyć ognisko nowotworowe. W przypadku czerniaka B16 narządem tym są płuca.For transplantation by the intravenous (iv) route, a suspension of cells derived from in vitro culture was used. An homogeneous suspension of cells (3x10 5 / mouse) in 0.9% NaCl was injected into the lateral tail vein in a volume of 0.2 ml. As a result of this type of transplant (cancer cells are introduced directly into the bloodstream), we obtain "experimental" (artificial) metastases [DR: Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis 1997; 15: 272-306]. After intravenous injection, some neoplastic cells survive in the circulation and, after stopping and leaving the vessel lumen, settle in the organ where it can form a neoplastic focus. In B16 melanoma, this organ is the lungs.
W badaniach zastosowano bakteriofaga T4 zakupionego w American Type Culture Collection USA oraz jego mutanta HAP1, charakteryzującego się zwiększonym powinowactwem do komórek czerniaka B16, wyselekcjonowanego drogą seryjnych pasaży in vitro bakteriofaga T4 na komórkach czerniaka B16 (patrz przykład 1). Zastosowano lizaty bakteriofagowe uzyskane w wyniku hodowli bakteriofagów na bakteriach Escherichia coli B z Kolekcji Mikroorganizmów IITD. Lizaty przed podaniem zwierzętom przesączono przez sączki antybakteryjne 0,22 μm Millipore. Miana lizatów bakteriofagowych wynosiły 1-2x109 pfu/ml. W pierwszej kontrolnej grupie zwierzętom podawano 0,9% NaCl, w drugiej grupie kontrolnej myszy otrzymały hodowlę bakteryjną Escherichia coli Bz Kolekcji Mikroorganizmów IITD, po rozbiciu bakterii metodą sonifikacji oraz przesączeniu przez sączki antybakteryjne 0,22 μmThe studies used T4 bacteriophage purchased from the American Type Culture Collection USA and its HAP1 mutant, characterized by an increased affinity for B16 melanoma cells, selected by serial in vitro passages of T4 bacteriophage on B16 melanoma cells (see example 1). Bacteriophage lysates obtained as a result of bacteriophage cultivation on Escherichia coli B bacteria from the IITD Microbial Collection were used. Lysates were filtered through 0.22 µm Millipore antibacterial filters prior to animal administration. Bacteriophage lysate titers were 1-2x10 9 pfu / ml. In the first control group, animals were administered 0.9% NaCl, in the second control group, mice received the Escherichia coli B bacterial culture from the IITD Microbial Collection, after breaking the bacteria by sonication and filtering through 0.22 μm antibacterial filters.
Millipore. Metodą chromatografii gazowej spektroskopii masowej (GCMS) porównywano zawartość lipopolisacharydu w lizatach oraz sonifikowanej hodowli bakteryjnej i przygotowano preparaty o takiej samej zawartości LPS. Wszystkie preparaty były podawane dootrzewnowo (i.p.) w objętości 0,2ml naMillipore. The content of lipopolysaccharide in the lysates and the sonicated bacterial culture were compared by gas chromatography mass spectroscopy (GCMS), and preparations with the same LPS content were prepared. All preparations were administered intraperitoneally (i.p.) in a volume of 0.2 ml per
PL 195 815 B1 mysz. Myszom z grupy T4 podawano lizat bakteriofaga T4, myszom z grupy HAP1 podawano lizat bakteriofaga HAP1, myszom z grupy SON podawano sonifikat bakteryjny, natomiast myszy z grupy K (KONTROLA) otrzymywały roztwór soli fizjologicznej. Pierwsza dawka była podawana 1 godzinę przed podaniem komórek nowotworowych, a dalsze dawki 1 raz dziennie, począwszy od następnej doby po podaniu komórek, do końca doświadczenia, tj. przez 21-22 dni. Zwierzęta były obserwowane przez okres 3 tyg. Myszy uśmiercano przez przemieszczenie kręgów szyjnych i przeprowadzano dokładne oględziny poszczególnych narządów. W ocenie wzrostu nowotworu brano pod uwagę liczbę kolonii nowotworowych w płucach. Do badań histopatologicznych narządy umieszczano w 4% zbuforowanym roztworze formaliny. Do opracowań wyników używano pakietu programowego STATISTICA. Do oszacowania stopnia istotności stosowano test t-Studenta. Wyniki zgromadzono w tabeli 3 i przedstawiono na figurze 1.Mouse. T4 mice were given T4 bacteriophage lysate, HAP1 mice were given HAP1 bacteriophage lysate, SON mice were given bacterial sonication, and K (CONTROL) mice were given physiological saline. The first dose was administered 1 hour before the administration of the tumor cells, and further doses were administered once a day, starting from the next day after the administration of the cells, until the end of the experiment, ie for 21-22 days. The animals were observed for a period of 3 weeks. Mice were sacrificed by dislocation of the cervical vertebrae and a careful examination of the individual organs was performed. The number of neoplastic colonies in the lungs was taken into account when assessing tumor growth. For histopathological examination, the organs were placed in a 4% buffered formalin solution. The STATISTICA software package was used to compile the results. Student's t-test was used to estimate the significance level. The results are summarized in Table 3 and shown in Figure 1.
Tabela 3Table 3
Liczba kolonii nowotworowych w płucach myszy po dożylnym podaniu komórek mysiego czerniaka B16 w liczbie 3x105/mysz (dzień 22)Number of tumor colonies in the lungs of mice after intravenous administration of 3x10 5 murine B16 melanoma cells / mouse (day 22)
* p<0,05 - w porównaniu do kontroli - test t-Studenta dla danych niezależnych (T4: p=0,0005, HAP1: p=0,00002) @ p<0,05 - w porównaniu do T4 - test t -Studenta dla danych niezależnych (p=0,03)* p <0.05 - compared to control - Student's t-test for independent data (T4: p = 0.0005, HAP1: p = 0.00002) @ p <0.05 - compared to T4 - t-test -Student for independent data (p = 0.03)
Podsumowanie:Summary:
Nieoczekiwanie okazało się, że preparaty bakteriofagowe, zwłaszcza preparat zawierający fagi HAP1 o podwyższonym powinowactwie do komórek B16 pozwalają na zahamowanie powstawania i rozwoju guzów w płucach zwierząt zaszczepianych dożylnie komórkami nowotworowymi. Świadczy too wysokim potencjale terapeutycznym preparatów fagowych posiadających powinowactwo do komórek eukariotycznych wywołujących chorobę. Wykazano także, że zwiększenie tego powinowactwa potęguje aktywność leczniczą.Surprisingly, it turned out that bacteriophage preparations, especially a preparation containing HAP1 phages with increased affinity for B16 cells, allowed to inhibit the formation and development of tumors in the lungs of animals vaccinated with cancer cells intravenously. It proves the high therapeutic potential of phage preparations having an affinity for the disease-causing eukaryotic cells. It has also been shown that increasing this affinity enhances therapeutic activity.
Claims (17)
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL355355A PL195815B1 (en) | 2002-08-05 | 2002-08-05 | Method of receiving bacteriofage strain featuring increased affinity for eucariotic cells, compounds containing such bacteriofage strain and bacteriofage application |
| PCT/PL2003/000075 WO2004013317A1 (en) | 2002-08-05 | 2003-08-05 | A method of obtaining a bacteriophage strain of increased affinity to eukaryotic cells, preparations containing it, and applications of bacteriophages |
| AU2003272158A AU2003272158A1 (en) | 2002-08-05 | 2003-08-05 | A method of obtaining a bacteriophage strain of increased affinity to eukaryotic cells, preparations containing it, and applications of bacteriophages |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL355355A PL195815B1 (en) | 2002-08-05 | 2002-08-05 | Method of receiving bacteriofage strain featuring increased affinity for eucariotic cells, compounds containing such bacteriofage strain and bacteriofage application |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL355355A1 PL355355A1 (en) | 2004-02-09 |
| PL195815B1 true PL195815B1 (en) | 2007-10-31 |
Family
ID=31492971
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL355355A PL195815B1 (en) | 2002-08-05 | 2002-08-05 | Method of receiving bacteriofage strain featuring increased affinity for eucariotic cells, compounds containing such bacteriofage strain and bacteriofage application |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| AU (1) | AU2003272158A1 (en) |
| PL (1) | PL195815B1 (en) |
| WO (1) | WO2004013317A1 (en) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1618886A1 (en) * | 2004-07-20 | 2006-01-25 | Fonds zur Förderung der Forschung auf dem Gebiet der molekularen Virologie und Gentherapie | Bacteriophage and prophage proteins in cancer gene therapy |
| WO2006066224A2 (en) * | 2004-12-14 | 2006-06-22 | Yale University | Virulence targeted antibiotics |
| PL212286B1 (en) | 2010-06-20 | 2012-09-28 | Inst Immunologii I Terapii Doswiadczalnej Pan | Method for the preparation of bacteriophages |
| PL232951B1 (en) | 2013-06-03 | 2019-08-30 | Inst Immunologii I Terapii Doswiadczalnej Im Ludwika Hirszfelda Polskiej Akademii Nauk | Use of bacteriophages |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5736388A (en) * | 1994-12-30 | 1998-04-07 | Chada; Sunil | Bacteriophage-mediated gene transfer systems capable of transfecting eukaryotic cells |
-
2002
- 2002-08-05 PL PL355355A patent/PL195815B1/en not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-08-05 WO PCT/PL2003/000075 patent/WO2004013317A1/en not_active Application Discontinuation
- 2003-08-05 AU AU2003272158A patent/AU2003272158A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2004013317A1 (en) | 2004-02-12 |
| PL355355A1 (en) | 2004-02-09 |
| AU2003272158A1 (en) | 2004-02-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107027291A (en) | With the combination treatment of glutamine enzyme inhibitor | |
| KR101765575B1 (en) | Pharmaceutical composition for inhibiting a growth of cancer stem cells comprising aldehyde inhibitor and biguanide compounds | |
| Ortiz | Extracellular vesicles in cancer progression | |
| JP2023533485A (en) | How to treat severe pulmonary hypertension | |
| CZ20023228A3 (en) | Pharmaceutical preparations used for inducing blood vessel-damaging effect | |
| JPH0225415A (en) | Agent for suppressing metastasis of cancer | |
| EA030783B1 (en) | Method of treating and/or preventing graft versus host disease in a patient undergoing hematopoietic stem cell transplantation | |
| CN112566628A (en) | Pharmaceutical composition for preventing and treating cancer comprising gossypol, phenformin and anticancer agent | |
| Fowler et al. | Targeting the canonical nuclear factor-κB pathway with a high-potency IKK2 inhibitor improves outcomes in a mouse model of idiopathic pneumonia syndrome | |
| CN106974908B (en) | Pharmaceutical composition and purposes containing hdac inhibitor and IRE1 inhibitor | |
| PL195815B1 (en) | Method of receiving bacteriofage strain featuring increased affinity for eucariotic cells, compounds containing such bacteriofage strain and bacteriofage application | |
| CN103930113A (en) | Composition for preventing and treating non-small cell lung cancer, containing pyrazino-triazine derivatives | |
| JP2020508290A (en) | Pharmaceutical composition for preventing and treating pancreatic cancer comprising gossypol and phenformin as active ingredients | |
| CN108410878A (en) | A kind of LRPPRC specific nucleic acids aptamers and its application | |
| CN105147683B (en) | 3 for the treatment of for kidney cell cancer, 3 ', 4,4 '-tetrahydroxy -2,2 '-bipyridyl-N, N '-dioxide | |
| JP2008540585A (en) | Compounds for treating metastatic melanoma and other cancers, compositions containing such compounds, and methods of treatment | |
| JPH10511677A (en) | Use of inositol triphosphate for drug preparation. | |
| AU2004296129A1 (en) | CHP-gemcitabin combined agent and use thereof as anti-tumoural active substances | |
| JP2002540172A (en) | Sphingomyelin-containing preparations for enhancing tumor treatment | |
| South-East European Oncology Group (SEEOG) et al. | Phase II study of 4′-epi-doxorubicin in patients with untreated, extensive small cell lung cancer | |
| Bellelli et al. | In vitro and in vivo enhancement of vincristine antitumor activity on B16 melanoma cells by calcium antagonist flunarizine | |
| JP2842888B2 (en) | Cancer cell metastasis inhibitor containing ribonuclease inhibitor as active ingredient | |
| EP1220687B1 (en) | Administration of gamma globulins to treat lymphoma | |
| CN114949000B (en) | Musk extract and application thereof in enhancing curative effect of CAR-T cells | |
| CN114222753B (en) | Polypeptide medicine for preventing and/or treating neuroblastoma and application thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20130805 |