PL192948B1

PL192948B1 - Urease immobilising method

Info

Publication number: PL192948B1
Application number: PL340161A
Authority: PL
Inventors: Agnieszka Ulatowska-Jarża; Halina Podbielska
Original assignee: Politechnika Wroclawska
Priority date: 2000-05-17
Filing date: 2000-05-17
Publication date: 2006-12-29
Also published as: PL340161A1

Abstract

1. Sposób unieruchamiania ureazy, znamienny tym, że matrycę ze szkła zol-żelowego, której prekursorem jest związek silanu wytwarza się z płynnego związku krzemu, który miesza się z wodą w obecności kwaśnego katalizatora, aż do wystąpienia hydrolizy, po czym hydrolizat w postaci jednorodnej mieszaniny umieszcza się w pojemniku z lodem i miesza się aż do momentu osiągnięcia równomiernego rozkładu temperatury w całym układzie, równolegle rozpuszcza się ureazę w buforze fosforanowo-szczawianowym o pH do 6 i również umieszcza się w temperaturze topniejącego lodu, następnie przy zachowanej temperaturze miesza się oba składniki i zobojętnia się do pH 6 roztworem amoniaku w wodzie i prowadzi się proces żelowania, zaś powstałą matrycę z unieruchomioną ureazą przechowuje się w temperaturze do 4°C.A method for immobilizing urease, characterized in that a sol-gel glass matrix the precursor is a silane compound produced from a liquid silicon compound that is mixed with water in the presence of an acid catalyst until hydrolysis occurs, followed by hydrolyzate in the form of a homogeneous mixture, it is placed in a container with ice and stirred until achieving an even temperature distribution throughout the system, dissolves in parallel urease in a phosphate-oxalate buffer pH up to 6 and is also placed at temperature of melting ice, the two components are then mixed while maintaining the temperature and neutralized is adjusted to pH 6 with a solution of ammonia in water and the gelling process is carried out, and the resulting matrix with immobilized urease are stored at temperatures up to 4 ° C.

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest sposób unieruchamiania ureazy przeznaczony do wytwarzania testów do wykrywania mocznika, który jest głównym produktem metabolizmu białek w organizmach żywych. Monitorowanie poziomu mocznika ważne jest z punktu widzenia medycyny, jak i ochrony środowiska. Głównym źródłem mocznika w glebie są nawozy sztuczne. Wykrywanie mocznika może odbyć się na zasadzie reakcji enzymatycznejThe subject of the invention is a method of immobilizing urease for the production of tests for the detection of urea, which is the main product of protein metabolism in living organisms. Monitoring urea levels is important both from a medical and environmental perspective. Chemical fertilizers are the main source of urea in the soil. The detection of urea can be carried out by an enzymatic reaction

CO(NH2)2 + 3H2O -> CO2 + 2 NK4OH, w której katalizatorem jest ureaza, a zmiany stężenia mocznika dają charakterystyczne zmiany pH, przy czym wzrost pH jest proporcjonalny do stężenia mocznika. Wykrywanie mocznika odbywa się więc za pomocą układu detekcyjnego, w którego skład wchodzą: ureaza jako katalizator i błękit bromotymolowy jako indykator. Układ detekcyjny wymaga więc zamknięcia w jakiejś matrycy katalizatora reakcji - ureazy.CO (NH2) 2 + 3H2O -> CO2 + 2 NK4OH, in which the catalyst is urease, and changes in urea concentration give characteristic changes in pH, with the increase in pH being proportional to the urea concentration. Detection of urea is therefore carried out by means of a detection system which includes: urease as a catalyst and bromothymol blue as an indicator. Therefore, the detection system requires enclosing the reaction catalyst - urease in some matrix.

Znany z polskiego opisu patentowego nr 166 404 sposób unieruchamiania ureazy, polega na tym, że przygotowuje się roztwór skrobi, środka żelującego, niejonowego środka powierzchniowo czynnego i buforu o pH = 4. Następnie miesza się go z drugim roztworem zawierającym ureazę, błękit bromotymolowy, porofor, środek powierzchniowo czynny i żelujący oraz bufor dodając rozpuszczalnika organicznego. Otrzymany roztwór nakłada się na bibułę i suszy.The method of urease immobilization, known from Polish patent specification No. 166,404, consists in preparing a solution of starch, gelling agent, non-ionic surfactant and a buffer with pH = 4. Then it is mixed with a second solution containing urease, bromothymol blue, blowing agent , surfactant and gelling agent, and buffer by adding an organic solvent. The resulting solution is put on a filter paper and dried.

Przedmiotem wynalazku jest sposób unieruchamiania ureazy.The present invention relates to a method for immobilizing urease.

Istota sposobu polega na tym, że matrycę ze szkła zol-żelowego, której prekursorem jest związek siłami wytwarza się z płynnego związku krzemu, który miesza się z wodą w obecności kwaśnego katalizatora, aż do wystąpienia hydrolizy. Hydrolizat w postaci jednorodnej mieszaniny umieszcza się w pojemniku z lodem i miesza się aż do momentu osiągnięcia równomiernego rozkładu temperatury w całym układzie. Równolegle rozpuszcza się ureazę w buforze fosforanowo-szczawianowym o pH 6 i również umieszcza się w temperaturze topniejącego lodu. Następnie przy zachowanej temperaturze miesza się oba składniki i zobojętnia się do pH 6 roztworem amoniaku w wodzie i prowadzi się proces żelowania. Powstałą matrycę z unieruchomioną ureazą przechowuje się w temperaturze do 4°C.The essence of the method consists in the fact that the sol-gel glass matrix, the precursor of which is the compound, is by force produced from a liquid silicon compound which is mixed with water in the presence of an acid catalyst until hydrolysis occurs. The hydrolyzate in the form of a homogeneous mixture is placed in a container with ice and mixed until the temperature is uniformly distributed throughout the system. In parallel, urease is dissolved in a phosphate-oxalate buffer at pH 6 and also placed at the temperature of melting ice. Then, while maintaining the temperature, the two components are mixed and neutralized to pH 6 with a solution of ammonia in water, and the gelling process is carried out. The resulting matrix with urease immobilized is stored at a temperature of up to 4 ° C.

Korzystnie matrycę wytwarza się z 4 części hydrolizatu i 1 części roztworu ureazy w buforze.Preferably, the matrix is made of 4 parts of hydrolyzate and 1 part of urease solution in buffer.

Zamykanie ureazy w zol-żelu nie niszczy jej aktywności enzymatycznej i daje możliwość wytworzenia elementu detekcyjnego, który stanowi optoda czujnika do wykrywania mocznika. Zaletą nowego sposobu unieruchamiania ureazy w szkle zol-żelowym jest to, że prowadzi się go w procesie niskotemperaturowym, co zapewnia dużą aktywność enzymatyczną ureazy.Enclosing urease in a sol-gel does not destroy its enzymatic activity and makes it possible to produce a detection element, which is an optode of a sensor for urea detection. The advantage of the new method of immobilizing urease in sol-gel glass is that it is carried out in a low-temperature process, which ensures high enzymatic activity of urease.

Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w przykładzie wykonania.The subject of the invention is presented in an exemplary embodiment.

Sposób unieruchamiania ureazy polega na tym, że matrycę ze szkła zol-żelowego, w której prekursorem jest związek silanu wytwarza się z płynnego związku krzemu, który miesza się z wodą w obecności kwaśnego katalizatora, aż do wystąpienia hydrolizy, czyli około 4 godziny. Hydrolizat w postaci jednorodnej mieszaniny umieszcza się w pojemniku z lodem i miesza się aż do momentu osiągnięcia równomiernego rozkładu temperatury w całym układzie. Równolegle rozpuszcza się ureazę w buforze fosforanowo-szczawianowym o pH 6 i również umieszcza się w temperaturze topniejącego lodu. Następnie przy zachowanej temperaturze miesza się oba składniki i zobojętnia się do pH 6 roztworem amoniaku w wodzie i prowadzi się proces żelowania. Powstałą matrycę z unieruchomioną ureazą przechowuje się w temperaturze do 4°C. Matrycę wytwarza się z 4 części hydrolizatu i 1 części roztworu ureazy w buforze.The method of immobilizing urease is that a sol-gel glass matrix in which the precursor is a silane compound is made of a liquid silicon compound which is mixed with water in the presence of an acid catalyst until hydrolysis occurs, i.e. about 4 hours. The hydrolyzate in the form of a homogeneous mixture is placed in a container with ice and mixed until the temperature is uniformly distributed throughout the system. In parallel, urease is dissolved in a phosphate-oxalate buffer at pH 6 and also placed at the temperature of melting ice. Then, while maintaining the temperature, both components are mixed and neutralized to pH 6 with a solution of ammonia in water, and the gelling process is carried out. The resulting matrix with urease immobilized is stored at a temperature of up to 4 ° C. The matrix is prepared from 4 parts of hydrolyzate and 1 part of urease solution in buffer.

Zamykanie ureazy odbywa się etapowo. Po pierwsze wytwarzana jest matryca ze szkła zol-żelowego, gdzie prekursorem jest związek silanu. Płynny związek krzemu mieszany jest z wodą w obecności kwaśnego katalizatora, aż do wystąpienia hydrolizy (ok. 4h). Po tym czasie jednorodna mieszanina tzw. hydrolizat, zostaje umieszczona w pojemniku z lodem i mieszanie odbywa się aż do momentu osiągnięcia równomiernego rozkładu temperatury w całym układzie.Urease closure takes place in stages. First, a sol-gel glass matrix is produced where the precursor is a silane compound. The liquid silicon compound is mixed with water in the presence of an acid catalyst until hydrolysis occurs (approx. 4 hours). After this time, a homogeneous mixture of the so-called the hydrolyzate is placed in a container with ice and mixing takes place until the temperature is uniformly distributed throughout the system.

Równolegle odbywa się proces rozpuszczania ureazy w buforze fosforanowo-szczawianowym o pH 6, również w temperaturze topniejącego lodu.At the same time, urease is dissolved in a phosphate-oxalate buffer at pH 6, also at the temperature of melting ice.

Matryca wykonywana jest z 4 części hydrolizatu i 1 części roztworu enzymu w buforze. Nie zmieniając temperatury powstałą mieszaninę zobojętniamy do pH 6, używając odpowiedniego roztworu amoniaku w wodzie następuje żelowanie. Powstałą matrycę z unieruchomioną ureazą, przechowuje się w temperaturze 4°C. Aktywność unieruchomionej w ten sposób ureazy jest zachowana.The matrix is made of 4 parts of the hydrolyzate and 1 part of the enzyme solution in the buffer. Neutralize the resulting mixture to pH 6 without changing the temperature, gelation occurs using an appropriate solution of ammonia in water. The resulting urease-immobilized matrix is stored at 4 ° C. The activity of the urease immobilized in this way is preserved.

Claims

Patent claims

The method of immobilizing urease, characterized in that the sol-gel glass matrix, the precursor of which is a silane compound, is made of a liquid silicon compound which is mixed with water in the presence of an acid catalyst until hydrolysis occurs, and then the hydrolyzate is homogeneous the mixtures are placed in a container with ice and mixed until an even temperature distribution is achieved throughout the system, urease is simultaneously dissolved in a phosphate-oxalate buffer with a pH of 6 and also placed at the temperature of melting ice, then, while maintaining the temperature, both components and neutralized to pH 6 with a solution of ammonia in water, the gelling process is carried out, and the resulting matrix with urease immobilized is stored at a temperature of up to 4 ° C.

2. The method according to p. The method of claim 1, wherein the matrix is made of 4 parts of hydrolyzate and 1 part of urease solution in buffer.