PL188925B1

PL188925B1 - Vaccine with overproduction of a homologous antigen and method of obtaining same

Info

Publication number: PL188925B1
Application number: PL97341528A
Authority: PL
Inventors: Stephen M. Boyle; Silvio Cravero; Lynette Corbeil; Gerhardt G. Schurig; Nammalwar Spirnaganathan; Ramesh Vemulapalli
Original assignee: Univ California; Virginia Tech Intell Prop
Priority date: 1997-12-05
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 2005-05-31
Also published as: EA200000618A1; EA005234B1; DE69735506D1; PL341528A1; UA73469C2

Abstract

1. A vaccine for the immunization of vertebrates against Brucellosis, wherein said vaccine comprises an attenuated or avirulent pathogen of Brucella that over-expresses at least one homologous antigens encoded by at least one gene from said Brucella and wherein said at least one antigen is capable of inducing a protective immune response against the Brucellosis. 2. The vaccine of claim 1, wherein said attenuated or avirulent pathogen of Brucella further expresses one or more heterologous antigens. 3. A vaccine for prophylaxis or treatment of a vertebrate against Brucellosis, wherein said vaccine comprises an attenuated or avirulent pathogen of Brucella, wherein the attenuated or avirulent pathogen over-expresses at least one homologous antigen encoded by at least one gene from said pathogen, and wherein the at least one antigen is capable of inducing a protective immune response in the vertebrate against Brucellosis. 4. The vaccine of claim 3, wherein the pathogen is selected from the group consisting of B. aborts, B. melitensis, B. suis, and B. canis. 5. The vaccine of claim 4, wherein Brucella is B. abortus strain RB51 or a derivative thereof. 6. The vaccine of claim 5, wherein the at least one gene, encoding homologous antigen, is a Cu/Zn SOD gene. 7. The vaccine of claim 6, wherein the Cu/Zn gene is obtained from apUC19 genomic library of B. abortus strain 2308. 8. The vaccine of claim 6, wherein the at least one gene, encoding homologous antigen, is one or both of a GroES gene and a GroEL gene. 9. The vaccine of claim 8, wherein the GroES gene and the GroEL gene are obtained from apUC19 genomic library of B. abortus strain 2308. 10. The vaccine of claim 3, wherein the vertebrate is bovine. 11. An attenuated or avirulent version of B. abortus strain RB51 that over-expresses at least one homologous antigen capable of stimulating protective immunity against Brucellosis. 12. The attenuated or avirulent version of B. abortus strain RB51 of claim 11, wherein the at least one homologous antigen is encoded by at least one gene selected from the group consisting of a Cu/Zn SOD gene, a GroES gene and a GroEL gene. 13. A method for prophylaxis or treatment of a vertebrate from Brucellosis comprising administering an effective amount of vaccine of any one of claims 1-10. 14. The method of claim 13, wherein the vertebrate is human. 15. The method of claim 13, wherein said vaccine comprises pathogen of Brucella which further expresses one or more heterologous antigens. 16. The method of claim 13, wherein the at least one gene, encoding homologous antigen, is a Cu/Zn SOD gene. 17. The method of claim 16, wherein the Cu/Zn gene is obtained from apUC19 genomic library of B. abortus strain 2308. 18. The method of claim 13, wherein said vaccine comprises pathogen of Brucella in which at least one gene, encoding homologous antigen, is one or both of a GroES gene and a GroEL gene in B. abortus strain RB51. 19. The method of claim 18, wherein the GroES gene and the GroEL gene are obtained from apUC19 genomic library of B. abortus strain 2308. 20. A method of producing a vaccine strain for prophylaxis or treatment of a vertebrate from Brucellosis, comprising extracting deoxyribonucleic acid from pathogen of Brucella, identifying at least one gene encoding at least one homologous antigen, wherein said at least one antigen is capable of stimulating protective immunity against Brucellosis, inserting the at least one gene into a multicopy plasmid capable of replicating and expressing in the pathogenic Brucella micro-organism transforming an attenuated or avirulent version of the pathogenic Brucella micro-organism with the plasmid to form a strain, which is apart of vaccine of any one of claims 1-10. 21. The method of claim 20, wherein said attenuated or avirulent pathogen Brucella micro-organism further expresses one or more heterologous antigens. 22. The method of claim 20, wherein said strain is selected from the group consisting of B. aborts, B. melitensis, B. suis, B. ovis, B.neotomae and B. canis. 23. The method of claim 22, wherein said strain is B. abortus strain RB51. 24. The method of claim 23, wherein the at least one gene, encoding homologous antigen, is a Cu/Zn SOD gene. 25. The method of claim 23, wherein the at least one gene, encoding homologous antigen is one or both of a GroES gene and a GroEL gene.

Description

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka przeciwko brucelozie, osłabiona lub awirulentna odmiana szczepu RB51 B. abortus, zastosowanie szczepionki, sposób wytwarzania szczepionki.The present invention relates to a brucellosis vaccine, an attenuated or avirulent variant of the RB51 B. abortus strain, the use of a vaccine, a method of producing the vaccine.

Szczepionka pochodzi z osłabionych lub awirulentnych wersji patogenu i wykazuje nadekspresję jednego lub więcej genów z patogenu dostarczając tym samym silniejszej odporności od indukowanej przez szczepionkę tego samego patogenu bez nadekspresji genu.The vaccine is derived from an attenuated or avirulent version of the pathogen and overexpresses one or more genes from the pathogen thereby providing stronger immunity than the vaccine-induced version of the same pathogen without overexpressing the gene.

Szczepionki stosowane są dla ochrony przed chorobami wywoływanymi patogenami. Patogeny te są organizmami mikrobiologicznymi, takimi jak bakterie i wirusy, które mają wpływ na zwierzęta w tym również na ludzi. Szczepionki pochodzą głównie z patogenów i są produkowane i podawane w postaci:Vaccines are used to protect against diseases caused by pathogens. These pathogens are microbial organisms such as bacteria and viruses that affect animals including humans. Vaccines are mainly derived from pathogens and are produced and administered in the form of:

a) osłabionej lub awirulentnej odmiany patogenu;(a) a weakened or avirulent variant of the pathogen;

b) zabitego patogenu;b) killed pathogen;

c) wyekstrahowanych antygenów ochronnych lub mieszanin antygenów z patogena (antygeny homologiczne); lubc) extracted protective antigens or mixtures of antigens from the pathogen (homologous antigens); or

d) mikroorganizmu wytwarzającego jeden lub więcej antygenów ochronnych, kodowanych przez sklonowane geny pochodzące z patogenu mikrobiologicznego różniącego się od szczepu szczepionki (heterologiczne antygeny).d) a microorganism producing one or more protective antigens, encoded by cloned genes derived from a microbial pathogen different from the vaccine strain (heterologous antigens).

Szczepionki, zarówno bakteryjne jak wirusowe, konstruuje się z mikroorganizmów wytwarzających jeden lub więcej antygenów ochronnych, jak opisali K. Jones i M. Sheppard w Designer Vaccines, CRC Press (1997). Szczepionki mają na ceiu wytwarzanie odpowiedzi odpornościowej przez biorcę, która składa się z co najmniej jednej odpowiedzi odpornościowej, w której uczestniczy przeciwciało lub limfocyt T i tym samym zapobiega dalszej infekcji przez patogen lub walczy z bieżącą infekcją patogenną. W szczególności szczepionki przeciwko fakultatywnym patogenom wewnątrzkomórkowym, tym rozwijającym się wewnątrz komórek zainfekowanego gospodarza, muszą indukować silną i odpowiednią komórkową odpowiedź odpornościową. Dla kontrastu, szczepionki przeciwko obligatoryjnym zewnątrzkomórkowym patogenom muszą indukować odpowiednią odpowiedź odpornościową, w której pośredniczy przeciwciało. Często, bez względu na patogen odpowiednia kombinacja odpowiedzi odpornościowej z pośrednictwem przeciwciała i komórki daje wystarczającą ochronę lub złagodzenie infekcji. W celu osiągnięcia ochrony i złagodzenia infekcji szczepionki mogą wytwarzać jeden lub więcej antygenów homologicznych, antygenów heterologicznych lub kombinację ich obu.Vaccines, both bacterial and viral, are constructed from microorganisms that produce one or more protective antigens as described by K. Jones and M. Sheppard in Designer Vaccines, CRC Press (1997). The vaccines are intended to produce an immune response by the recipient that consists of at least one antibody or T-lymphocyte-mediated immune response and thereby prevents further infection by the pathogen or fights an ongoing pathogenic infection. In particular, vaccines against facultative intracellular pathogens, those developing inside the cells of an infected host, must induce a strong and appropriate cellular immune response. In contrast, vaccines against obligate extracellular pathogens must induce an appropriate antibody-mediated immune response. Often, irrespective of the pathogen, an appropriate combination of antibody and cell mediated immune responses will provide sufficient protection or amelioration of infection. Vaccines can produce one or more homologous antigens, heterologous antigens, or a combination of both, to achieve protection and mitigate infection.

Szczepionki można podawać kręgowcom zarówno dla zapobiegania jak i leczenia infekcji wywołanej patogenami. Zatem, szczepionki są często podawane dla zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby wywołanej patogenem. W szczególności, zwierzęta stadne, jak krowy, kozy, owce i świnie są często szczepione celem zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby wśród członków stada. Dalej, ze względu na to, że pewne choroby mogą przenosić się pomiędzy różnymi kręgowcami, w tym pomiędzy różnymi zwierzętami oraz pomiędzy zwierzętami i ludźmi, szczepionki są stosowane do zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby pomiędzy różnymi gatunkami, zazwyczaj poprzez podawanie ich zainfekowanym zwierzętom oraz innym niezainfekowanym zwierzętom z bezpośredniego sąsiedztwa. Jednakże w celach profilaktycznych można także szczepić inne zwierzęta z tego terenu, które z mniejszym prawdopodobieństwem mogły nabawić się choroby. Przykładowo, zainfekowaną krowę i jej jeszcze niezainfekowane stado można szczepić w ceiu leczenia choroby i zapobieganiu jej dalszemu rozprzestrzenianiu. W celach profilaktycznych można również szczepić inne zwie4Vaccines can be administered to vertebrates to both prevent and treat infection due to pathogens. Thus, vaccines are often administered to prevent the spread of a pathogen-induced disease. In particular, herd animals such as cows, goats, sheep and pigs are frequently vaccinated to prevent the spread of disease among members of the herd. Further, because certain diseases can spread between different vertebrates, including different animals and between animals and humans, vaccines are used to prevent disease spreading between different species, typically by administering them to infected animals and other uninfected animals. from the immediate vicinity. However, for prophylactic purposes, other animals in the area that are less likely to contract the disease can also be vaccinated. For example, an infected cow and its as yet uninfected herd can be vaccinated to treat the disease and prevent its further spread. Other animals can also be vaccinated for prophylactic purposes

188 925 rzęta, jak sąsiadujące krowy, owce lub ludzi, które mogłyby nabawić się choroby od zainfekowanej krowy'.188,925 rows, like neighboring cows, sheep, or humans that could contract disease from an infected cow. '

Stwierdzono, że szczepionki pochodzące z osłabionych lub awirulentnych odmian patogenu są bardziej skuteczne w zapobieganiu i zwalczaniu choroby wywołanej przez ten patogen. W szczególności wiadomo, że takie osłabione lub awirulentne patogeny można modyfikować celem wytworzenia przez ekspresję heterologicznych antygenów (antygenów, które pochodzą z patogenu innego gatunku). W ceiu wytworzenia antygenów heterologicznych w żądanym osłabionym lub awirulentnym patogenie, gen kodujący antygen zdolny do dostarczenia ochrony przed patogenem jest identyfikowany w kwasie dezoksyrybonukleinowym gatunku heterologicznego. Żądany gen jest izolowany, a następnie wprowadzony do plazmidu zdolnego do replikacji i ekspresji w osłabionym lub awirulentnym patogenie. Plazmid jest następnie wprowadzany do osłabionego lub awirulentnego patogenu i umożliwia ekspresję heterologicznego antygenu po podaniu zwierzęciu kręgowemu.Vaccines derived from attenuated or avirulent variants of the pathogen have been found to be more effective in preventing and controlling disease caused by the pathogen. In particular, it is known that such attenuated or avirulent pathogens can be modified to produce by expression of heterologous antigens (antigens that are derived from a pathogen of another species). In order to generate heterologous antigens in a desired attenuated or avirulent pathogen, a gene encoding an antigen capable of providing protection against the pathogen is identified in the deoxyribonucleic acid of the heterologous species. The desired gene is isolated and then inserted into a plasmid capable of replication and expression in an attenuated or avirulent pathogen. The plasmid is then introduced into the attenuated or avirulent pathogen and allows expression of the heterologous antigen upon administration to the vertebrate animal.

Przykładem takiej ekspresji antygenu heterologicznego jest bakteiyjna szczepionka z Salmonella, która wytwarza białko spaA ze Streptococcus. Patrz patent USA nr 4888170. Szczepionka ta obejmuje awirulentną pochodną mikroorganizmu patogennego z rodzaju Salmonella, w której z kolei ekspresji ulega zrekombinowany gen pochodzący z patogenu z gatunku Streptococcus mutans, w wyniku czego produkowany jest antygen zdolny do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciw patogenowi u zwierzęcia kręgowego.An example of such expression of a heterologous antigen is a Salmonella bacterial vaccine that produces the Streptococcus spaA protein. See US Patent No. 4,888,170. This vaccine comprises an avirulent derivative of a pathogenic microorganism of the genus Salmonella which in turn expresses a recombinant gene derived from a pathogen of the genus Streptococcus mutans to produce an antigen capable of inducing an immune response against the pathogen in a vertebrate animal.

Dalszym przykładem ekspresji heterologicznej są szczepionki Vibrio cholera. Szereg żywych, osłabionych szczepów Vibrio cholera wytworzono w celu szczepienia ludzi przeciwko cholerze. Patrz: Kaper, J.B. i wsp., New and improved vaccines against cholera w New Generation Vaccines (wyd. MM Levin i wsp.) Marcel Deker, Inc., NY, 1997. Niektóre z tych szczepów nadprodukują antygeny heterologiczne. Patrz: Butterton, J.R. i S.B. Calderwood, Attenuated Vibrio cholera as a live vector for expression of foreign antigens in New Generation Vaccines (wyd. MM Levin i wsp.) Marcel Deker, Inc., NY, 1997. Odporność indukowana osłabionymi szczepami szczepionek jest wynikiem indukcji przeciwciał, które mają aktywności przeciwbakteryjne i/lub antytoksyczne. Niektóre szczepy osłabiano poprzez usuwanie szeregu genów kodujących komponenty toksygenne, w tym podjednostkę A toksyny cholery, kodowaną przez gen ctxA. Jednakże, po to by szczep szczepionki cholery był w pełni ochronny, konieczne jest, aby gen ctxB, kodujący podjednostkę B (z którą wiąże się podjednostka A), ulegał ekspresji, co pozwala na wytworzenie przeciwciał neutralizujących toksynę cholery. Gen ctxB nadwyrażano w Vbrio cholera w ceiu wytworzenia dużej ilości antygenu dla toksyny B cholery (CTB). Nadprodukowany antygen CTB zbierano, oczyszczano i stosowano jako szczepionkę podjednostkową, która jest ekstrahowanym antygenem CTB. Patrz: Lebens M. i wsp., 1993, Biotechnology (NY) Dec; 11:1574-1578. Jednakże pomimo, że nadprodukowany antygen sam jest stosowany jako szczepionka, to osłabiony lub awirulentny patogen z Vibrio cholera, który nadwyraża gen ctxB lub jakikolwiek inny gen homologiczny nie był stosowany jako żywa szczepionka.Vibrio cholera vaccines are a further example of heterologous expression. A number of live, attenuated strains of Vibrio cholera have been produced to vaccinate humans against cholera. See Kaper, J.B. et al., New and improved vaccines against cholera in New Generation Vaccines (edited by MM Levin et al.) Marcel Deker, Inc., NY, 1997. Some of these strains overproduce heterologous antigens. See: Butterton, J.R. and S.B. Calderwood, Attenuated Vibrio cholera as a live vector for expression of foreign antigens in New Generation Vaccines (MM Levin et al. Ed.) Marcel Deker, Inc., NY, 1997. Immunity induced by weakened vaccine strains is the result of the induction of antibodies that have activity antibacterial and / or antitoxic. Some strains were attenuated by deleting a number of genes encoding toxigenic components, including the cholera toxin A subunit, encoded by the ctxA gene. However, in order for the cholera vaccine strain to be fully protective, it is imperative that the ctxB gene encoding the B subunit (to which the A subunit binds) is expressed to allow the generation of cholera neutralizing antibodies. The ctxB gene has been overexpressed in Vbrio cholera in order to produce a large amount of the cholera toxin B (CTB) antigen. The overproduced CTB antigen was harvested, purified, and used as a subunit vaccine that is the extracted CTB antigen. See: Lebens M. et al., 1993, Biotechnology (NY) Dec; 11: 1574-1578. However, although an overproduced antigen is itself used as a vaccine, an attenuated or avirulent Vibrio cholera pathogen that overexpresses the ctxB gene or any other homologous gene has not been used as a live vaccine.

Innym przykładem ekspresji heterologicznej jest ekspresja zachodząca w szczepionkach Mycobacterium sp., stosowanych przy zapobieganiu gruźlicy u ludzi. Białko GroEL z Mycobacterium tuberculosis indukuje odporność ochronną, kiedy gen GroEL ulega ekspresji po transfekcji do makrofagów (Silva, C.L. i Lowrie, D.B., 1994, Immunology 84:244-248), co wskazuje na to, że białko GroEL jest antygenem ochronnym, jeśli jest prezentowane limfocytom T przez ten typ komórek prezentujących antygen (APC). Szczepionki z nagiego DNA wykorzystujące geny Mycobacterium, kodujące różnorodne antygeny (hsp70, 85kDa, 65kDa, 36kDa, 6kDa) są także zdolne do indukowania odporności ochronnej. Patrz: Lowrie, D.B. i wsp., 1997, Vaccine 15:834-838; Tascon, E. i wsp., 1996, Nat. Med. 2:888-892 oraz Lozes, E. i wsp., 1997, Vaccine 15:880-833. Uważa się, że szczepionki z nagiego DNA pracują ponieważ transfekują one APC (Chattergon, M i wsp. 1997, FASEB J. 11:753-763), które z kolei prezentują antygen odpowiednio limfocytom T, indukując tym samym komórkową odporność ochronną. M bovis bCg, żywy, osłabiony szczep Mycobacterium jest stosowany do indukcji odporności ochronnej przeciw infekcjom M.tuberculosis u ludzi. Fine, PM 1988, Br. Med. Buli. 44-91.Another example of heterologous expression is the expression that occurs in Mycobacterium sp. Vaccines used to prevent tuberculosis in humans. GroEL protein from Mycobacterium tuberculosis induces protective immunity when the GroEL gene is expressed after transfection into macrophages (Silva, CL and Lowrie, DB, 1994, Immunology 84: 244-248), indicating that the GroEL protein is a protective antigen if it is presented to T lymphocytes by this type of antigen presenting cell (APC). Naked DNA vaccines using Mycobacterium genes encoding a variety of antigens (hsp70, 85kDa, 65kDa, 36kDa, 6kDa) are also able to induce protective immunity. See Lowrie, D.B. et al., 1997, Vaccine 15: 834-838; Tascon, E. et al., 1996, Nat. Med. 2: 888-892 and Lozes, E. et al., 1997, Vaccine 15: 880-833. Naked DNA vaccines are believed to work because they transfect APCs (Chattergon, M et al. 1997, FASEB J. 11: 753-763), which in turn present antigen to T cells, respectively, thereby inducing cellular protective immunity. M bovis bCg, a live attenuated strain of Mycobacterium, is used to induce protective immunity against M.tuberculosis infections in humans. Fine, PM 1988, Br. Med. Bull. 44-91.

188 925188 925

Szczepionki antygenowe wytworzone przeciwko brucelozie stanowią przykłady ekspresji antygenu homologicznego, gdzie antygen pochodzi z tego samego gatunku co osłabiony patogen. Bruceloza jest zakaźną chorobą bakteryjną, która może przenosić się ze zwierząt na ludzi. Wywoływana jest przez dowolny gatunek różnorodnych, patogennych bakterii tlenowych z rodzaju Brucella. U zwierząt bruceloza wywołuje poronienia i niepłodność. U ludzi wywołuje gorączkę, złe samopoczucie i ból głowy. Szczegółowo zbadano tę chorobę i wynikiem tego stało się wytworzenie szeregu szczepionek.Anti-brucellosis antigen vaccines are examples of homologous antigen expression where the antigen is from the same species as the attenuated pathogen. Brucellosis is an infectious bacterial disease that can be spread from animals to humans. It is caused by any species of various pathogenic aerobic bacteria of the genus Brucella. In animals, brucellosis causes miscarriage and infertility. In humans, it causes fever, malaise and headache. The disease has been studied in detail and has resulted in the development of a range of vaccines.

Wiadomo, że istniejące szczepy szczepionkowe Brucella, takie jak szczep 19 i RB51 B. abortus oraz szczep REVl B. melitensis mogą chronić przed gatunkami Brucella, z których pochodzą oraz krzyżowo chronić przed infekcją przez inne gatunki, takie jak B. abortus, B. melitensis, B. ovis, B. suis, B. canis i B. neotomae. Patrz Winter, A.J. i wsp., 1996, Am. J. Vet. Res., 57:677; P. Nicoletti w Animal Brucellosis, CRC Press (1990), str. 284-296; J.M. Blasco w Animal Brucellosis, CRC Press (1990), str. 368-370 oraz G.C. Alton w Animal Brucellosis, CRC Press (1990), str. 395-400. Nowe szczepy VTRM1 B. melitensis i VTRS1 B. suis także krzyżowo chronią przed różnymi gatunkami Brucella. Patrz: Winter, A.J. i wsp., Am. J. Vet. Res., 57:677.It is known that existing Brucella vaccine strains such as B. abortus strain 19 and RB51 and B. melitensis strain REV1 can protect against the Brucella species from which they are derived and cross-protect against infection by other species such as B. abortus, B. melitensis , B. ovis, B. suis, B. canis and B. neotomae. See Winter, A.J. et al., 1996, Am. J. Vet. Res. 57: 677; P. Nicoletti in Animal Brucellosis, CRC Press (1990), pp. 284-296; J.M. Blasco in Animal Brucellosis, CRC Press (1990), pp. 368-370 and G.C. Alton in Animal Brucellosis, CRC Press (1990), pp. 395-400. The new B. melitensis VTRM1 and B. suis VTRS1 strains also cross-protect against different Brucella species. See Winter, A.J. et al., Am. J. Vet. Res. 57: 677.

W przeszłości, jedną z najpowszechniej stosowanych szczepionek dla zapobiegania brucelozie bydlęcej był szczep 19 B. abortus, opisany przez P. Nicoletti w Animal Brucellosis, CRC Press (1990), str. 284-296. Ten szczególny szczep B. abortus nadawał odporności bydłu z zakresem ochrony od 65 do 75%, w zależności od wielu zmiennych, takich jak wiek szczepionego bydła, wielkość podawanej dawki, droga podawania oraz rozpowszechnienie brucelozy w szczepionym stadzie.In the past, one of the most widely used vaccines to prevent bovine brucellosis was the 19 strain B. abortus, described by P. Nicoletti in Animal Brucellosis, CRC Press (1990), pp. 284-296. This particular strain of B. abortus conferred immunity in cattle with a protection range of 65 to 75% depending on a number of variables such as the age of the vaccinated cattle, the dose administered, the route of administration and the prevalence of brucellosis in the vaccinated herd.

Szczep RB51 B. abortus, nowa szczepionka z żywej osłabionej Brucella (oznaczona jako RB-51®* jest stabilną szczepionką zatwierdzoną do użytku w USA. Patrz: Schurig, G.G. i wsp., 1991, Vet. Microbiol. 26:359 oraz Colby, L., 1997, M.Sc Thesis, Virginia Tech, Blacksburg, Va. Osłabienie szczepu RB51 wykazano poprzez badania prowadzone na myszach, kozach i bydle. Patrz: Schurig, G.G. i wsp., 1991, Vet. Microbiol. 28:171; Palmer, R.M. i wsp., 1997, Am. J. Vet Res. 58:472; Roop, R.M. i wsp., 1995, Res. Vet. Science, 51:359 oraz Zambrano, A.J. i wsp., 1995, Archivos de Medicina Veterinaria XXV111, No. extraordinario: 119-121. W porównaniu z ochroną dostarczaną przez szczep 19, szczep RB51 wpojedynczym szczepieniu daje podobną ochronę u bydła. Patrz: Cheville, N:F. i wsp., 1993, Amer. J. Vet Research 53:1881 oraz Cheville, N.F. i wsp., 1996, Amer. J. Vet Research, 57:1153. Ponadto, podawanie doustne szczepu RB 51 u myszy i bydła nadawało odporność ochronną. Patrz Stevens, M.G. i wsp., 1996, Infect. 1mmun. 64:534. W szczególności, model mysi wykazuje, że odporność ochronna na brucelozę wywołana szczepem RB51 odbywa się wyłącznie za pośrednictwem limfocytów T, ponieważ bierny transfer zaindukowanych przez RB 51 przeciwciał nie chroni przed chorobą, podczas gdy adoptywny transfer limfocytów T chroni. Patrz: Bagchi, T., 1990, M.Sc Thesis, Virginia Tech, Blacksburg, Va; Jimenez deBagues, M.P. i wsp.,Strain RB51 B. abortus, a new live attenuated Brucella vaccine (designated RB-51® * is a stable vaccine approved for use in the US. See Schurig, GG et al., 1991, Vet. Microbiol. 26: 359 and Colby, L., 1997, M.Sc Thesis, Virginia Tech, Blacksburg, Va .. Weakening of the RB51 strain has been demonstrated by studies in mice, goats and cattle See: Schurig, GG et al., 1991, Vet Microbiol 28: 171; Palmer, RM et al., 1997, Am. J. Vet Res. 58: 472; Roop, RM et al., 1995, Res. Vet. Science, 51: 359 and Zambrano, AJ et al., 1995, Archivos de Medicina Veterinaria XXV111, No. extraordinario: 119-121 Compared to the protection provided by strain 19, strain RB51 in a single vaccination gives similar protection in cattle. See Cheville, N: F. Et al., 1993, Amer. J. Vet Research 53: 1881 and Cheville, NF et al., 1996, Amer. J. Vet Research, 57: 1153. In addition, oral administration of the RB 51 strain in mice and cattle conferred protective immunity. See Stevens, MG et al., 1996, Inf ect. 1mmun. 64: 534. In particular, the mouse model shows that protective immunity to brucellosis induced by strain RB51 is mediated exclusively by T cells, since passive transfer of RB 51-induced antibodies does not protect against disease, while adoptive T cell transfer protects. See: Bagchi, T., 1990, M. Sc Thesis, Virginia Tech, Blacksburg, Va; Jimenez deBagues, M.P. et al.,

1994, Infect. 1mmun. 62:4990. Uważa się, że szczepienie RB-51® nadaje ochronę osobnikowi poprzez indukcję wytwarzania interferonu gamma, zdolnego do aktywowania makrofagów i swoistych limfocytów T cytotoksycznych, które są zdolne do zabicia makrofagów zainfekowanych Brucella.1994, Infect. 1mmun. 62: 4990. Vaccination with RB-51® is believed to confer protection on an individual by inducing the production of gamma interferon capable of activating macrophages and specific cytotoxic T cells that are capable of killing Brucella infected macrophages.

Chociaż RB-51®, pochodząca ze szczepu 2308 B. abortus jest obecnie najlepszą dla zwierząt szczepionką przeciw brucelozie, ciągle nie posiada ona 100% skuteczności. Żadna z obecnych szczepionek przeciw brucelozie nie ma całkowitej skuteczności. Zatem, kontynuowane są badania na obiecujących szczepach jak szczep RB51 B. abortus. Przykładowo, opisano ekspresję heterologicznych antygenów przez szczep RB51 B. abortus, S. Cravero i wsp.,Although RB-51®, derived from the 2308 B. abortus strain, is currently the best vaccine for animals against brucellosis, it is still not 100% effective. None of the current brucellosis vaccines are completely effective. Thus, research on promising strains such as the RB51 B. abortus strain is continued. For example, the expression of heterologous antigens by the RB51 strain of B. abortus, S. Cravero et al.,

1995, Proceedings 4*“ 1ntl. Vet. Immunol. Symposium, July, Davis, Ca., Abstract # 276 oraz Cravero i wsp., 1996, Conference of Research Workers in Animal Diseases, Nov., Chicago, Abstract # 150. Nadprodukcję antygenu homologicznego przez Brucella opisano jako narzędzie badawcze do komplementacji specyficznych mutantów delecyjnych przy badaniu białka HtrA w B. abortus (P.H. Elzer, 1nf. 1mmun., 1994, 62:4131) oraz przy badaniu funkcji fizjologicznych jak omówione przez R. Wrigth w ustnej prezentacji podczas Brucella Research Conference, Nov. 9, 1997 w Chicago, 111.1995, Proceedings 4 * "1stl. Vet. Immunol. Symposium, July, Davis, Ca., Abstract # 276 and Cravero et al., 1996, Conference of Research Workers in Animal Diseases, Nov., Chicago, Abstract # 150. Overproduction of homologous antigen by Brucella has been described as a research tool for complementing specific mutants deletions when examining the HtrA protein in B. abortus (PH Elzer, 1nf. 1mmun., 1994, 62: 4131) and in examining physiological functions as discussed by R. Wrigth in an oral presentation at the Brucella Research Conference, Nov. 9, 1997 in Chicago, 111.

188 925188 925

Jednakże, nadprodukcję antygenów homologicznych z Brucella lub innych patogenów·', z lub bez towarzyszącego powstawania w wyniku ekspresji antygenu heterologicznego, nie badano pod kątem zastosowania w szczepionkach. Nadprodukcji antygenów homologicznych używano wcześniej głównie jako narzędzia badawczego, jak opisano powyżej. Osłabiony lub awirulentny patogen zmodyfikowany do nadprodukcji antygenu homologicznego nie był używany jako żywa szczepionka. Jednakże stwierdziliśmy, że taka szczepionka, która jest osłabionym lub awirulentnym patogenem nadprodukującym jeden lub więcej antygenów homologicznych, jak tu opisano, będzie dostarczać większą ochronę przeciw chorobie patogennej niż szczepionki z osłabionych patogenów wytwarzających te same antygeny homologiczne na poziomach dzikiego typu.However, the overproduction of homologous antigens from Brucella or other · 'pathogens, with or without concomitant expression from a heterologous antigen, has not been studied for use in vaccines. The overproduction of homologous antigens has previously been used mainly as a research tool, as described above. An attenuated or avirulent pathogen modified to overproduce the homologous antigen has not been used as a live vaccine. However, we have found that such a vaccine which is an attenuated or avirulent pathogen overproducing one or more homologous antigens as described herein will provide greater protection against pathogenic disease than attenuated pathogen vaccines producing the same homologous antigens at wild-type levels.

Zatem, wynalazek dotyczy szczepionki, sposobu wytwarzania szczepionki oraz jej zastosowania do wytwarzania leku do stosowania w profilaktyce i leczeniu chorób patogennych, przy czym szczepionka jest osłabionym lub awirulentnym patogenem nadprodukującym co najmniej jeden antygen homologiczny i tym samym dostarcza większej ochrony i leczenia choroby wywołanej nie osłabionym patogenem u osobnika, którym jest kręgowiec.Thus, the invention relates to a vaccine, a method of producing a vaccine, and its use in the manufacture of a medicament for use in the prophylaxis and treatment of pathogenic diseases, wherein the vaccine is an attenuated or avirulent pathogen that overproduces at least one homologous antigen and thus provides greater protection and treatment of a disease caused by an unimpaired a pathogen in an individual that is a vertebrate.

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka przeciwko brucelozie, która obejmuje osłabiony lub awirulentny patogen wyselekcjonowany z grupy składającej się z B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis, B. neotomae oraz B. canis, w której osłabiony lub awirulentny patogen nadprodukuje co najmniej jeden antygen homologiczny kodowany przez co najmniej jeden gen z tego patogenu, oraz w której co najmniej jeden antygen jest zdolny do indukcji ochronnej odpowiedzi odpornościowej w kręgowcu przeciwko brucelozie. Korzystnie szczepionka jako patogen Brucella zawiera szczep RB51 B. abortus. Patogen jako co najmniej jeden gen zawiera gen Cu/Zn SOD, który korzystnie pochodzi z biblioteki genomowej szczepu 2308 B. abortus na wektorze pUC19. Jako co najmniej jeden gen patogen może również zawierać może jeden lub obydwa geny GrosES i GroEL, korzystnie pochodzące z biblioteki genomowej szczepu 2308 B. abortus na wektorze pUC19. Szczepionka jest głównie przeznaczona dla bydła.The present invention relates to a brucellosis vaccine which comprises an attenuated or avirulent pathogen selected from the group consisting of B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis, B. neotomae and B. canis, wherein the attenuated or avirulent pathogen overproduces at least one homologous antigen encoded by at least one gene from said pathogen, and wherein at least one antigen is capable of inducing a protective immune response in a vertebrate against brucellosis. Preferably, the Brucella pathogen vaccine comprises the B. abortus strain RB51. The pathogen as at least one gene contains the Cu / Zn SOD gene, which is preferably derived from the genomic library of the strain 2308 of B. abortus on the pUC19 vector. As at least one gene, the pathogen may also contain one or both of the GrosES and GroEL genes, preferably derived from the genomic library of the 2308 B. abortus strain on the pUC19 vector. The vaccine is mainly intended for cattle.

Szczepionka według wynalazku z nadprodukcją antygenu homologicznego jest wytwarzana sposobem według wynalazku na drodze inżynierii genetycznej żywych, osłabionych mikroorganizmów w procesie obejmującym etapy:The vaccine according to the invention with overproduction of the homologous antigen is produced by the method according to the invention by genetically engineering live, weakened microorganisms by a process comprising the steps of:

a) izolowania kwasu dezoksyrybonukleinowego z mikroorganizmu patogennego;a) isolating deoxyribonucleic acid from the pathogenic microorganism;

b) identyfikacji w kwasie dezoksyrybonukleinowym co najmniej jednego genu kodującego co najmniej jeden antygen, który zdolny jest do stymulacji odporności ochronnej przeciwko mikroorganizmowi patogennemu;b) identifying, in deoxyribonucleic acid, at least one gene encoding at least one antigen which is capable of stimulating a protective immunity against a pathogenic microorganism;

c) wprowadzenia co najmniej jednego genu do wielokopiowego plazmidu zdolnego do replikacji i ekspresji w mikroorganizmie patogennym;c) introducing at least one gene into a multicopy plasmid capable of replication and expression in a pathogenic microorganism;

d) transformacji odmiany osłabionego lub awirulentnego mikroorganizmu patogennego tym plazmidem;d) transforming a variant of an attenuated or avirulent pathogenic microorganism with said plasmid;

e) wytwarzania szczepionki z uzyskanego mikroorganizmu.e) the manufacture of a vaccine from the obtained micro-organism.

Wytworzona szczepionka syntetyzuje antygen w wyniku transkrypcji i translacji genu położonego co najmniej w dwóch miejscach tzn. w genomie i w plazmidzie. W szczególności korzystnie, gdy plazmid jest typu wielokopiowego, tak że może wytwarzać większą ilość ochronnego antygenu niż z pojedynczej kopii genomowej.The produced vaccine synthesizes the antigen by transcription and translation of a gene located at least in two places, ie in the genome and in the plasmid. It is particularly preferred that the plasmid is of the multicopy type so that it can produce a greater amount of protective antigen than from a single genomic copy.

Powyższy sposób można stosować do wytwarzania szczepionek z nadprodukcją antygenu homologicznego dla wielu różnych chorób. Nadprodukcja antygenu zazwyczaj podnosi odpowiedź odpornościową związaną zarówno z limfocytami T jak i przeciwciałami, podnosząc tym samym znacząco poziom ochrony w osobniku. Ponieważ wzmocnione są oba typy odpowiedzi odpornościowej, atakowane są zarówno patogeny wewnątrzkomórkowe jak zewnątrzkomórkowe, a tym samym dostarczana jest większa ochrona przed patogenem.The above method can be used to produce vaccines that overproduce an antigen homologous to a wide variety of diseases. Antigen overproduction typically enhances the immune response associated with both T lymphocytes and antibodies, thereby significantly increasing the level of protection in the subject. Since both types of immune response are enhanced, both intracellular and extracellular pathogens are attacked and thus greater protection against the pathogen is provided.

Szczepionka użyta w sposobie profilaktyki i leczenia może być pierwotnym szczepem szczepionkowym lub modyfikacją istniejącego szczepu szczepionkowego. Przykładowo, szczep RB 51 B. abortus można modyfikować dla uzyskania nadprodukcji antygenu homologicznego wytwarzając tym samym nowy szczep, którego można użyć w szczepionce do profilaktyki lub leczenia brucelozy, szczególnie u bydła.A vaccine used in a method of prophylaxis and treatment may be a primary vaccine strain or a modification of an existing vaccine strain. For example, the B. abortus strain RB 51 can be modified to overproduce the homologous antigen, thereby generating a new strain that can be used in a vaccine for the prevention or treatment of brucellosis, particularly in cattle.

W szczególności nową szczepionkę Brucella można wytwarzać poprzez:In particular, the new Brucella vaccine can be produced by:

1) wyselekcjonowanie genu kodującego ochronny antygen ze szczepu Brucella·,1) selecting the gene encoding a protective antigen from the Brucella strain,

188 925188 925

2) wprowadzenie genu z patogenu do wiełokopiowego plazmidu zdolnego do replikacji i ekspresji w Brucella; oraz2) insertion of a gene from the pathogen into a multiplication and Brucella expressive multiplication plasmid; and

3) wprowadzenie plazmidu do Brucella sposobem takim jak transformacja. W ten sposób można nadprodukować jeden lub więcej antygenów homologicznych. Dodatkowo, jeden lub więcej antygenów heterologicznych można wytwarzać w szczepionce metodami znanymi specjalistom.3) introducing the plasmid into Brucella by a method such as transformation. In this way, one or more homologous antigens can be overproduced. Additionally, one or more heterologous antigens can be produced in the vaccine by methods known to those skilled in the art.

Poprzez wytworzenie jednego lub kilku antygenów homologicznych danego patogenu, stymulowana jest większa odpowiedź odpornościowa za pośrednictwem limfocytów T i/lub przeciwciał przeciwko patogenowi w kręgowcu, któremu podano szczepionkę wytworzoną z osłabionego lub awirulentnego patogenu, dostarczającą większej ochrony przed nieosłabionym patogenem. Dalszą ochronę można nadać poprzez dodatkową produkcję jednego lub kilku antygenów heterologicznych przez osłabiony lub awirulentny patogen, sposobami znanymi specjalistom.By producing one or more homologous antigens of a given pathogen, a greater immune response is stimulated through T lymphocytes and / or antibodies against the pathogen in a vertebrate animal that has been administered a vaccine made of an attenuated or avirulent pathogen, providing greater protection against the unaffected pathogen. Further protection can be conferred by the additional production of one or more heterologous antigens by an attenuated or avirulent pathogen by methods known to those skilled in the art.

Wytwarzaną szczepionkę z nadprodukcją antygenu homologicznego można podawać w skutecznych dawkach dla umożliwienia profilaktyki i leczenia choroby wywołanej patogenem w żądanym organizmie kręgowca. Dawki, co znane jest specjalistom, powinny być dostosowane do każdego osobnika w oparciu o takie czynniki jak waga, wiek oraz czynniki środowiskowe. Skuteczna dawka może być podawana w skuteczny sposób w oparciu o typ zwierzęcia, któremu jest podawana, jego wiek i stan.The resulting vaccine with overproduction of homologous antigen can be administered in effective doses to allow for the prevention and treatment of pathogen-induced disease in the desired vertebrate organism. Doses, as is known to those skilled in the art, should be adjusted for each individual based on factors such as weight, age, and environmental factors. The effective dose can be administered in an effective manner based on the type of animal to be administered, its age, and condition.

Wynalazek obejmuje również zastosowanie szczepionki do wytwarzania leku do leczenia i profilaktyki kręgowca przeciwko brucelozie. Jak opisano powyżej zastosowanie w którym osłabiony lub awirulentny patogen obecny w szczepionce dodatkowo wytwarza antygen heterologiczny.The invention also includes the use of a vaccine for the manufacture of a medicament for the treatment and prophylaxis of vertebrates against brucellosis. As described above, the use in which an attenuated or avirulent pathogen present in the vaccine additionally produces a heterologous antigen.

W zakres wynalazku wchodzi też osłabiona lub awirulentna odmiana szczepu RB51 B. abortus nadprodukująca co najmniej jeden antygen homologiczny zdolny do stymulowania odporności ochronnej przeciwko brucelozie, przy czym ten antygen homologiczny jest kodowany przez co najmniej jeden gen wyselekcjonowany z grupy składającej się z genu Cu/Zn, genu GroES oraz genu GroEL.Also within the scope of the invention is a weakened or avirulent variant of the RB51 B. abortus strain that overproduces at least one homologous antigen capable of stimulating protective immunity against brucellosis, said homologous antigen being encoded by at least one gene selected from the group consisting of the Cu / Zn gene , the GroES gene and the GroEL gene.

Załączone figury mają na ceiu wyjaśnienie i szczegółowe zilustrowanie opisanego tu wynalazku. W szczególności:The accompanying figures are intended to explain and illustrate the invention in detail. Especially:

Figura 1. stanowi diagram przedstawiający otrzymywanie antygenu homologicznego z gatunków Brucella i wprowadzenie antygenu do szczepionki szczepu gatunków Brucella',Figure 1 is a diagram showing the preparation of homologous antigen from Brucella species and introduction of the antigen into a vaccine of a Brucella species strain.

Figura 2. przedstawia konstrukcję zrekombinowanych plazmidów do nadprodukcji miedź/cynk SOD (A) i GroES i GroEL (B) w szczepie RB51 B. abortus;Figure 2. shows the construction of recombinant plasmids for the overproduction of copper / zinc SOD (A) and GroES and GroEL (B) in the RB51 B. abortus strain;

Figura 3. przedstawia oczyszczanie szczepu 2308 B. abobortus ze śledzion myszy szczepionych szczepem RB51 B. abortus, nadprodukujących miedź/cynk SOD lub GroES/EL; orazFigure 3 shows the purification of B. abobortus strain 2308 from the spleens of mice vaccinated with B. abortus strain RB51, overproducing copper / zinc SOD or GroES / EL; and

Figura 4. przedstawia aktywność cytotoksyczną limfocytów przeciwko komórkom zainfekowanym Brucella z myszy szczepionych szczepem RB51 B. abortus nadprodukującym miedź/cynk SOD lub GroES/EL.Figure 4 shows the cytotoxic activity of lymphocytes against Brucella infected cells from mice vaccinated with the RB51 B. abortus strain overproducing copper / zinc SOD or GroES / EL.

PrzykładyExamples

Przykład 1Example 1

Dwie OHAV skonstruowano poprzez nadprodukcję genu Cu/Zn SOD lub genów GroES i GroEL w szczepie RB51 B. abortus. Geny Cu/Zn SOD, GroES i GroEL otrzymano pierwotnie z genomowej biblioteki szczepu 2308 B. abortus na wektorze pUC19. Jak przedstawiono na fig. 2 wstawki zawierające te geny wraz z ich własnymi promotorami wycinano z regionów wpBA113 (SOD) i pBA2131 (GroES i GroEL) i subklonowano wpBBRlMCS, plazmid o szerokim zakresie gospodarza, który rutynowo jest stosowany w badaniach z Brucella. Otrzymane zrekombinowane plazmidy nazwano pBBSOD i pBBGrosES/EL (fig. 2). Szczep RB51 B. abortus transformowano tymi plazmidami poprzez elektroporację. Brucella zawierające plazmidy selekcjonowano poprzez wysianie stransformowanych bakterii na szalkach z agarem sojowym (trypticase soya agar) zawierającym 30 pg/ml chloramfenikolu. Celem określenia nadekspresji sklonowanych genów kolonie oporne na antybiotyk hodowano pojedynczo w podłożu sojowym (trypticase soja broth), a ekstrakty bakteryjne stosowano jako antygeny w analizie typu immunoblot. Szczep RB51, zawierający pBBSOD (RB51SOD) i pBBGroES/ELTwo OHAVs were constructed by overproducing the Cu / Zn SOD gene or the GroES and GroEL genes in the RB51 B. abortus strain. The Cu / Zn SOD, GroES and GroEL genes were originally obtained from the genomic library of B. abortus strain 2308 on the pUC19 vector. As shown in Figure 2, inserts containing these genes along with their own promoters were excised from the wpBA113 (SOD) and pBA2131 (GroES and GroEL) regions and wpBBR1MCS, a broad host range plasmid that is routinely used in the Brucella studies, was subcloned. The obtained recombinant plasmids were named pBBSOD and pBBGrosES / EL (Fig. 2). The B. abortus strain RB51 was transformed with these plasmids by electroporation. Brucella containing the plasmids were selected by plating the transformed bacteria on trypticase soya agar plates containing 30 pg / ml chloramphenicol. To determine the overexpression of the cloned genes, the antibiotic resistant colonies were single cultured in trypticase soybean broth and the bacterial extracts were used as antigens in the immunoblot analysis. Strain RB51, containing pBBSOD (RB51SOD) and pBBGroES / EL

188 925 (RB51GroESL), nadprodukował odpowiednio Cu/Zn SOD i GroEL w porównaniu ze szczepem RB51 zawierającym sam pBBRIMCS (RB51pBB).188,925 (RB51GroESL), overproduced Cu / Zn SOD and GroEL, respectively, compared to the RB51 strain containing pBBRIMCS (RB51pBB) alone.

Badanie ochrony u myszy.Protection study in mice.

Grupy po 8 myszy szczepiono poprzez podanie dootrzewnowo, 4 x 10⁸ jednostek koloniotwórczych (cfu), każdego ze szczepów RB51SOD, BRB51GroESL, RB51pBB lub RB51 w 0,5 ml w wodnym roztworze. Jedną grupę myszy szczepiono 0,5 ml wodnego roztworu soli, jako kontrolę. Po 6 tygodniach, 5 myszom z każdej grupy podawano dootrzewnowo 2,5 x 104 cfu wirulentnego szczepu 2308. Pozostałe trzy myszy w każdej grupie stosowano do scharakteryzowania odpowiedzi odpornościowych. Dwa tygodnie po podaniu wirulentnego szczepu 2308 myszy uśmiercano i określano cfu szczepu 2308 na śledzionę. Myszy immunizowane szczepem RB51SOD miały znacząco niższą liczbę bakterii w porównaniu z tymi immunizowanymi szczepem RB51. W myszach immunizowanych szczepem RB51GroESL liczba obserwowanych bakterii była poniżej granicy wykrywalności metody (<20 cfu/śledzionę).Groups of 8 mice were vaccinated by intraperitoneal administration of 4 x 10 ⁸ colony forming units (cfu) of each of the strains RB51SOD, BRB51GroESL, RB51pBB or RB51 in 0.5 ml in aqueous solution. One group of mice was vaccinated with 0.5 ml of saline aqueous solution as a control. After 6 weeks, 5 mice in each group were intraperitoneally administered 2.5 x 10 4 cfu of virulent strain 2308. The remaining three mice in each group were used to characterize the immune responses. Two weeks after administration of virulent strain 2308, mice were sacrificed and the cfu of strain 2308 per spleen were determined. Mice immunized with the RB51SOD strain had a significantly lower number of bacteria compared to those immunized with the RB51 strain. In mice immunized with the RB51GroESL strain, the number of bacteria observed was below the detection limit of the method (<20 cfu / spleen).

Charakterystyka odpowiedzi odpornościowych.Characteristics of immune responses.

Po 6 tygodniach po szczepieniu, pobierano surowicę od 3 myszy z każdej grupy do analizy odpowiedzi humoralnej przeciwciał. Myszy te uśmiercano, a limfocyty zebrane z ich śledzion stosowano do badania komórkowej odpowiedzi odpornościowej. Jak pokazano na fig. 3 myszy szczepione szczepem RB 51 wytworzyły przeciwciała przeciwko GroEL, lecz nie wytworzyły przeciwciał przeciwko Cu/Zn SOD. Dla kontrastu, myszy szczepione szczepem RB51SOD wytworzyły silną odpowiedź przeciwciał przeciwko Cu/Zn SOD, a myszy szczepione szczepem RBŚlGroESL wytworzyły silniejszą odpowiedź przeciwciał przeciwko białku GroEL (fig. 3), niż myszy szczepione szczepem RB51. Wyniki te wskazują na wzmocnioną odpowiedź przeciwciał dzięki OHAV.Six weeks after vaccination, serum was collected from 3 mice of each group for analysis of the humoral antibody response. These mice were sacrificed and the lymphocytes collected from their spleens were used to study the cellular immune response. As shown in Figure 3, mice vaccinated with the RB 51 strain developed antibodies to GroEL but did not develop antibodies to Cu / Zn SOD. In contrast, mice vaccinated with the RB51SOD strain produced a strong antibody response against Cu / Zn SOD, and mice vaccinated with the RBŚlGroESL strain developed a stronger antibody response against the GroEL protein (Fig. 3) than mice vaccinated with the RB51 strain. These results indicate an enhanced antibody response due to OHAV.

Wywołaną komórkową odpowiedź odpornościową charakteryzowano poprzez określenie aktywności cytotoksycznej limfocytów w stosunku do komórek zainfekowanych Brucella. Swoista aktywność śledzionowych limfocytów była wzmocniona, in vitro, przez wspólne hodowanie z traktowanymi mitomycyną C makrofagami zainfekowanymi Brucella jako komórkami stymulatorowymi. Test na cytotoksyczność prowadzono przy użyciu wzmocnionych limfocytów jako komórek efektorowych(E) a makrofagów zainfekowanych Brucella jako komórek docelowych (T). W oznaczeniu komórki E i T mieszano w dwóch różnych stosunkach, 10:1 i 5:1. Procent swoistej lizy komórek docelowych obliczano dla każdego stosunku E:T przy użyciu standardowych metod (fig. 4). Limfocyty z myszy szczepionych RB51SOD lub R.B51 GroESL wykazywały wzmocnioną aktywność cytotoksyczną względem myszy szczepionych wodnym roztworem soli lub szczepem RB51. Ta podniesiona cytotoksyczną aktywność limfocytów (wykazana na podstawie wzrostu % swoistej lizy) bezpośrednio koreluje z obserwowaną wzmocnioną ochroną myszy przeciwko działaniu wirulentnego szczepu 2308 B. abortus; im wyższy podwyższony poziom ochrony tym wyższa swoista aktywność cytotoksyczną.The induced cellular immune response was characterized by determining the cytotoxic activity of lymphocytes against Brucella infected cells. The specific activity of splenic lymphocytes was enhanced, in vitro, by co-culturing with mitomycin C treated Brucella infected macrophages as stimulator cells. The cytotoxicity assay was performed using boosted lymphocytes as effector cells (E) and Brucella infected macrophages as target cells (T). In the assay, E and T cells were mixed at two different ratios, 10: 1 and 5: 1. The percentage of specific target cell lysis was calculated for each E: T ratio using standard methods (Fig. 4). Lymphocytes from mice vaccinated with RB51SOD or R.B51 GroESL showed enhanced cytotoxic activity against mice vaccinated with aqueous saline solution or with the RB51 strain. This elevated cytotoxic activity of lymphocytes (as shown by an increase in% specific lysis) directly correlates with the observed enhanced protection of mice against the action of the virulent strain 2308 B. abortus; the higher the elevated level of protection, the higher the specific cytotoxic activity.

Przykład 2Example 2

OHAV konstruowano poprzez nadekspresję genu ctxB w Vibrlo cholera. Gen otrzymano z kwasu dezoksyrybonukleinowego z patogenu i wprowadzono do plazmidu zdolnego do replikacji i ekspresji w patogenie. Powstały zrekombinowany plazmid jest używany do transformacji Vlbrlo cholera na drodze elektroporacji. Plazmidy wysiewano i selekcjonowano metodami znanymi specjalistom. Otrzymany szczep do szczepionki, nadprodukujący homologiczny antygen pobudza nadprodukcję przeciwciał neutralizujących toksynę cholery, dostarcza zatem większą ochronę w profilaktyce i leczeniu cholery u ludzi.OHAV was constructed by overexpressing the ctxB gene in Vibrlo cholera. The gene was obtained from deoxyribonucleic acid from the pathogen and inserted into a plasmid capable of replication and expression in the pathogen. The resulting recombinant plasmid is used to transform Vlbrlo cholera by electroporation. Plasmids were plated and selected by methods known to those skilled in the art. The resulting vaccine strain, overproducing a homologous antigen, stimulates the overproduction of cholera toxin neutralizing antibodies, thus providing greater protection in the prevention and treatment of cholera in humans.

Przykład 3Example 3

OHAV konstruowano poprzez nadekspresję genu groEL z Mycobacterlum tuberculosls w gatunkach Mycobacterlum. Gen otrzymano z kwasu dezoksyrybonukleinowego z patogenu i wprowadzono do plazmidu zdolnego do replikacji i ekspresji w patogenie. Powstały zrekombinowany plazmid jest używany do transformacji gatunków Mycobacterlum na drodze elektroporacji. Plazmidy wysiewano i selekcjonowano metodami znanymi specjalistom. Otrzymany szczep do szczepionki, nadprodukujący homologiczny antygen pobudza nadprodukcję białka GroEL, dostarcza zatem większą ochronę w profilaktyce i leczeniu gruźlicy u ludzi. W szczególności nadekspresja genu groEL kodującego białko GroEL w M bovlsOHAV was constructed by overexpressing the groEL gene from Mycobacterlum tuberculosls in Mycobacterlum species. The gene was obtained from deoxyribonucleic acid from the pathogen and inserted into a plasmid capable of replication and expression in the pathogen. The resulting recombinant plasmid is used to transform Mycobacterlum species by electroporation. Plasmids were plated and selected by methods known to those skilled in the art. The resulting vaccine strain, overproducing a homologous antigen, stimulates the overproduction of the GroEL protein, thus providing greater protection in the prevention and treatment of tuberculosis in humans. In particular, overexpression of the groEL gene encoding the GroEL protein in M bovls

188 925188 925

BCG dostarcza większej odporności ochronnej przeciwko gruźlicy ponieważ wiadomo, że szczepionki BCG rozpoznają komórki chroniące antygen, jak makrofagi, dostarczając tym samym sposobu wprowadzania antygenu do komórek limfocytów T, co indukuje ochronną odporność komórkową.BCG provides greater protective immunity against tuberculosis because BCG vaccines are known to recognize antigen-protective cells such as macrophages, thus providing a means of introducing antigen into T-lymphocyte cells, which induces protective cellular immunity.

Powyższe przykłady są jedynie ilustracją. Zakres wynalazku nie jest ograniczony do przykładów lecz jest opisany w specyfikacji i towarzyszących zastrzeżeniach. Specjaliści w dziedzinie znają metody i materiały, którymi można zastąpić opisane powyżej i jakiekolwiek sposoby i materiały są objęte powyższym ujawnieniem i następującymi zastrzeżeniami.The above examples are for illustration only. The scope of the invention is not limited to the examples but is described in the specification and accompanying claims. Those skilled in the art are familiar with methods and materials with which to replace those described above, and any methods and materials are encompassed by the above disclosure and the following claims.

188 925188 925

wstawkę 1,1 kb Clal wycinano i klonowano | w miejsce z pBBRIMCS wstawkę 4,5 kb Smal-Hpal wycinano i klonowano w miejsce Smal z pBBRIMCSthe 1.1 kb Clal insert was cut and cloned | in place of pBBRIMCS the 4.5 kb Smal-Hpal insert was excised and cloned in place of the Smal of pBBRIMCS

CiałThe bodies

Sma 1Sma 1

wstawkainset

FIG. 2BFIG. 2B

Smal/HpalSmal / Hpal

FIG. 2AFIG. 2A

188 925188 925

poziom wykrywalnościlevel of detection

FIG, 3FIG, 3

-10-1-ΙΙΟ: 1 5:1-10-1-ΙΙΟ: 1 5: 1

E:T stosunekE: T ratio

FIG. 4FIG. 4

188 925188 925

WWW—►WWW — ►

BruceilaBruceil

DNA gen kodujący antygenDNA the gene encoding the antigen

stransformowany szczep szczepionki Bruceila wielokopiowy szczep szczepionki plazmidtransformed Bruceil vaccine strain multicopy plasmid vaccine strain

Bruceila kodujący antygenBruceil encoding antigen

Szczepionka z nadprodukcja antygenu homologicznego przeciwko Bruceila sp. Uwaga: gen kodujący antygen homologiczny ulega ekspresji w szczepie szczepionkiVaccine with overproduction of homologous antigen against Bruceila sp. Note: the gene encoding the homologous antigen is expressed in the vaccine strain

FIG. IFIG. AND

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.Publishing Department of the UP RP. Circulation of 50 copies

Cena 4,00 zł.Price PLN 4.00.

Claims

Patent claims

1. Brucellosis vaccine, characterized in that it comprises an attenuated or avirulent pathogen selected from the group consisting of B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis, B. neotomae and B. canis, in which the weakened or avirulent pathogen the pathogen overproduces at least one homologous antigen encoded by at least one gene from that pathogen, and wherein at least one antigen is capable of inducing a protective immune response in a vertebrate animal against brucellosis.

2. A vaccine according to claim 1 The method of claim 1, wherein the Brucella pathogen is the B. abortus strain RB51.

3. A vaccine according to claim 1 The method of claim 2, wherein the at least one gene comprises the Cu / Zn SOD gene.

4. A vaccine according to claim 1 3. The method according to claim 3, characterized in that the Cu / Zn gene is derived from the genomic library of B. abortus strain 2308 on the pUC19 vector.

5. A vaccine according to claim 1 The pathogen of claim 2, wherein the at least one gene comprises one or both of the GrosES and GroEL genes.

6. A vaccine according to claim 1 5. A method according to claim 5, characterized in that the GroES gene and the GroEL gene are derived from the genomic library of B. abortus strain 2308 on the pUC19 vector.

7. A vaccine according to claim 1 4. A composition according to claim 1, characterized in that it is intended for cattle.

8. A weakened or avirulent variant of the RB 51 B. abortus strain overproducing at least one homologous antigen capable of stimulating protective immunity against brucellosis, where this homologous antigen is encoded by at least one gene selected from the group consisting of the Cu / Zn gene GroES and the GroEL gene.

9. Use of the vaccine according to claim 1 1 for the manufacture of a medicament for the treatment and prophylaxis of vertebrate animals against brucellosis.

Use according to claim 1 The method of claim 9, wherein the attenuated or avirulent pathogen present in the vaccine further produces a heterologous antigen.

11. The use according to claim 1 9. The vaccine according to claim 9, characterized in that the vaccine comprises the B. abortus strain RB51 in which the at least one gene is the Cu / Zn SOD gene as pathogen.

12. The use according to claim 1 11. A method according to claim 11, characterized in that the Cu / Zn gene is derived from the genomic library of B. abortus strain 2308 on the pUC19 vector.

13. Use according to claim 1 9. The vaccine according to claim 9, characterized in that the vaccine comprises the B. abortus strain RB51 as pathogen, wherein at least one gene is one or both of the GrosES and GroEL genes.

14. Use according to claim 1 13. A method according to claim 13, characterized in that the GroES gene and the GroEL gene are derived from the genomic library of B. abortus strain 2308 on the pUC19 vector.

15. A method of producing a vaccine according to claim 1 The process of claim 1, comprising the steps of:

a) isolating deoxyribonucleic acid from the pathogenic microorganism;

b) identifying, in deoxyribonucleic acid, at least one gene encoding at least one antigen which is capable of stimulating a protective immunity against a pathogenic microorganism;

c) introducing at least one gene into a multicopy plasmid capable of replication and expression in a pathogenic microorganism;

d) transforming a variant of an attenuated or avirulent pathogenic microorganism with said plasmid;

e) the manufacture of a vaccine from the obtained micro-organism.

16. The method according to p. The method of claim 15, wherein the attenuated or avirulent variety of the pathogenic microorganism additionally produces one or more heterologous antigens.

188 925

17. The method according to p. The method of claim 15, wherein the pathogenic microorganism is B. abortus strain RB51.

18. The method according to p. The method of claim 15, wherein the at least one gene of the microorganism comprises the Cu / Zn SOD gene.

19. The method according to p. The method of claim 15, characterized in that the at least one gene of the microorganism comprises one or both of the GrosES and GroEL genes.