PL188497B1

PL188497B1 - Lipoid composition for obtaining liposomes

Info

Publication number: PL188497B1
Application number: PL98329424A
Authority: PL
Inventors: Jerzy Gubernator; Arkadiusz Kozubek
Original assignee: Univ Wroclawski
Priority date: 1998-10-28
Filing date: 1998-10-28
Publication date: 2005-02-28
Also published as: PL329424A1

Abstract

1. Kompozycja lipidowa do wytwarzania liposomów, zawierająca znane składniki lipidowe, korzystnie fosfolipidy pochodzenia naturalnego i/lub fosfolipidy syntetyczne, znamienna tym, że zawiera modyfikator, korzystnie w ilości od 15% wagowych do 50% wagowych, w postaci 1,3-dihydroksy-5-ałkilobenzenu albo O-acylo-alkilobenzeno-O-siarczanu.1. A lipid composition for the production of liposomes, containing known lipid components, preferably phospholipids of natural origin and / or synthetic phospholipids, characterized in that it contains a modifier, preferably in an amount from 15 wt% to 50 wt%, in the form 1,3-dihydroxy-5-alkylbenzene or O-acyl-alkylbenzene-O-sulfate.

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja lipidowa do wytwarzania liposomów, znajdujących zastosowanie zwłaszcza do produkcji leczniczych preparatów liposomowych.The present invention relates to a lipid composition for the production of liposomes, which can be used in particular for the production of therapeutic liposome preparations.

Z polskiego zgłoszenia wynalazku nr P.317273 znana jest kompozycja lipidowa do wytwarzania liposomów składająca się z lecytyny jajecznej, dimirystylofosfatydyloglicerolu i dimirystylofosfatydylocholiny, w stosunku molowym 3:3:4.From the Polish patent application No. P.317273, a lipid composition for the production of liposomes is known, consisting of egg lecithin, dimyristylphosphatidylglycerol and dimyristylphosphatidylcholine in a molar ratio of 3: 3: 4.

Wynalazek dotyczy kompozycji lipidowej do wytwarzania liposomów, zawierającej znane składniki lipidowe, korzystnie fosfolipidy pochodzenia naturalnego i/lub fosfolipidy syntetyczne. Istota wynalazku polega na tym, że kompozycja zawiera modyfikator, korzystnie w ilości od 15% wagowych do 50% wagowych, w postaci 1,3-dihydroksy-5-alkilobenzenu albo O-acylo-alkilobenzeno-O-siarczanu, korzystnie 1 -mirystyloksy-5-pentadecylobenzeno-3-siarczanu.The invention relates to a lipid composition for the production of liposomes, containing known lipid components, preferably phospholipids of natural origin and / or synthetic phospholipids. The essence of the invention consists in that the composition contains the modifier, preferably in an amount from 15% by weight to 50% by weight, in the form of 1,3-dihydroxy-5-alkylbenzene or O-acyl-alkylbenzene-O-sulfate, preferably 1-myristyloxy- 5-pentadecylbenzene-3-sulfate.

Obecność modyfikatorów w kompozycji według wynalazku powoduje, że w najprostszych warunkach (przez wytrząsanie składników lipidowych z wodnym roztworem chlorowodorku substancji czynnej oraz poprzez zamrażanie i rozmrażanie) stopień enkapsulacja tak związków markerowych, jak i modelowych leków antracyklinowych ulega kilkukrotnemu zwiększeniu, w porównaniu ze stopniem enkapsulacji liposomów wytwarzanych ze znanych kompozycji lipidowych, przy równoczesnym zmniejszeniu warstwowości i wielkości liposomów. Dodatkowo, zastosowanie acylowych pochodnych monosulfonowych lipidów rezorcynolowych umożliwiło zwiększenie enkapsulacji modelowego leku antracyklinowego do ponad 95%, podczas gdy przy stosowaniu kompozycji lipidowej zawierającej dimirytylofosfatydyloglicerol, wartość ta nie przekracza 55%. Korzystny wpływ obecności lipidów rezorcynolowych i ich pochodnych w składzie lipidowym liposomów wyrażany jest również w stosunku do kompozycji zawierających w swoim składzie cholesterol. Dzięki właściwościom antyoksydacyjnym lipidów rezorcynolowych oraz inhibitorowych w stosunku do fosfolipaz ich obecność w składzie lipidowym zapewnia dodatkowo ochronę składników lipidowych przed procesami ich oksydatywnej degradacji a także powodującej destrukcję struktury liposomowej hydrolizie przez fosfolipazy. Porównanie objętości zamkniętej roztworu wodnego związku markerowego w liposomach utworzonych z kompozycji lipidowych zawierających lipidy rezorcynolowe z objętością zamkniętą liposomów fosfolipidowych, przedstawia poniższa tabela. Objętość liposomów przygotowanych z kompozycji kontrolnych przyjęto za 100.The presence of modifiers in the composition according to the invention causes that, under the simplest conditions (by shaking the lipid components with an aqueous solution of the active substance hydrochloride, and by freezing and thawing), the degree of encapsulation of both marker compounds and model anthracycline drugs is increased several times compared to the degree of liposome encapsulation. prepared from known lipid compositions, while reducing the layering and size of the liposomes. In addition, the use of acyl monosulfone derivatives of resorcinol lipids made it possible to increase the encapsulation of the model anthracycline drug to more than 95%, while when using a lipid composition containing dimyrilphosphatidylglycerol, this value did not exceed 55%. The beneficial effect of the presence of resorcinol lipids and their derivatives in the lipid composition of the liposomes is also expressed in relation to compositions containing cholesterol in their composition. Due to the antioxidant properties of resorcinol and inhibitory lipids in relation to phospholipases, their presence in the lipid composition provides additional protection of lipid components against the processes of their oxidative degradation and the destruction of liposomal structure by phospholipases. A comparison of the closed volume of an aqueous marker compound in liposomes formed from lipid compositions containing resorcinol lipids with the closed volume of phospholipid liposomes is shown in the table below. The volume of liposomes prepared from the control compositions was taken to be 100.

188 497188 497

TabelaTable

Kompozycja (fosfolipidy) Composition (Phospholipids) Względna objętość zamknięta przy udziale wagowym w kompozycji lipidu rezorcynolowego Relative volume enclosed with the weight fraction of resorcinol lipid in the composition 0 0 10% w/w 10% w / w 20% w/w 20% w / w 30% w/w 30% w / w PC PC 100 100 180 180 300 300 520 520 PC/PE (7:3) PC / PE (7: 3) 100 100 230 230 440 440 480 480 PC/CHOL (7:3) PC / CHOL (7: 3) 100 100 270 270 370 370 650 650

W tabeli PC oznacza lecytynę jajeczną, PE - fosfatydyloetanoloaminę, CHOL - cholesterol, w/w - stosunek wagowy składników kompozycji.In the table, PC means egg lecithin, PE - phosphatidylethanolamine, CHOL - cholesterol, w / w - weight ratio of the components of the composition.

Przedmiot wynalazku jest objaśniony w przykładach wykonania, które ilustrują skład ilościowo-jakościowy kompozycji lipidowych o różnych składnikach oraz sposób wytwarzania liposomów z tych kompozycji.The subject matter of the invention is elucidated in the working examples which illustrate the quantitative-qualitative composition of the lipid compositions of different components and the method of preparing liposomes from these compositions.

Przykład 1. Kompozycja lipidowa składa się z 85% wagowych lecytyny jajecznej i 15% wagowych alkilorezorcynoli izolowanych z materiału zbożowego. Sposób wytwarzania liposomów z przykładowej kompozycji lipidowej jest następujący. W kolbie okrągłodennej, o pojemności 250 ml, umieszcza się 85 mg lecytyny jajecznej, firmy Lipid Products, Wielka Brytania, i 15 mg alkilorezorcynoli izolowanych z materiału zbożowego w postaci rozpuszczonej w chloroformie, a następnie odparowuje rozpuszczalnik na wyparce obrotowej, pod zmniejszonym ciśnieniem. Do kolby z pozostałością po odparowaniu, umieszczonej w termostatowanej łaźni wodnej o temperaturze 40°C, dodaje się wodny roztwór związku markerowego (Patent Blue Violet) ( 20 mg w 10 ml) o tej samej temperaturze, a następnie zawartość kolby wytrząsa energicznie przez 5 minut oraz poddaje procesowi zamrażania i rozmrazania. Po tych operacjach substancja markerowa jest w większości zawarta w rozproszonej warstwie lipidowej. Badanie zawartości kolby po wytrząsaniu, przeprowadzone przy użyciu mikroskopu optycznego z głowicą kontrastowo-fazową, przy powiększeniu 2250 razy pozwala obserwować struktury liposomowe, wypełnione barwną zawartością. Sączenie molekularne zawiesiny liposomów przez kolumnę z wypełnieniem Sephadex G 50 Fine (Sigma, St. Louis, MO, USA) prowadzi do oddzielenia niezamkniętej w liposomach substancji. Ilość zamkniętej w liposomach substancji określona jest we frakcjach wycieku z kolumny sefadeksowej, po rozbiciu struktur liposomowych przez użycie detergentu (np. Triton X-100), przez zmierzenie ekstynkcji roztworu przy długości fali odpowiadającej zamkniętej w liposomach substancji. Niezależny pomiar zawartości fosforu (metoda z kwasem nadchlorowym, molibdenianem amonu i kwasem askorbinowym z pomiarem ekstynkcji przy 812 nm), pozwolił oznaczyć stopień enkapsulacji badanych próbek na poziomie trzykrotnie wyższym od oznaczanego dla liposomów niezawierających lipidów rezorcynolowych i/lub ich pochodnych. Uzyskane liposomy, w odróżnieniu od liposomów niezawierających modyfikatorów będących przedmiotem wynalazku, wykazują wielkość około 180 nm, stabilną w szerokim zakresie temperatur. Stwierdzono, że dodanie substancji zwiększających trwałość liposomów in vivo nie obniża efektywności enkapsulacji.Example 1. The lipid composition consists of 85% by weight of egg lecithin and 15% by weight of alkylresorcinols isolated from cereal material. The method of preparing liposomes from an exemplary lipid composition is as follows. 85 mg of egg lecithin, Lipid Products, UK, and 15 mg of alkylresorcinols isolated from cereal as dissolved in chloroform are placed in a 250 ml round-bottom flask, and the solvent is then evaporated on a rotary evaporator under reduced pressure. An aqueous solution of the marker compound (Patent Blue Violet) (20 mg in 10 ml) at the same temperature is added to the flask with the evaporation residue, placed in a thermostatic water bath at 40 ° C, and the contents of the flask are shaken vigorously for 5 minutes. and subjected to the process of freezing and thawing. After these operations, the marker substance is mostly contained in the dispersed lipid layer. Examination of the contents of the flask after shaking, carried out with the use of an optical microscope with a phase-contrast head, at a magnification of 2250 times, allows to observe the liposome structures filled with colored contents. Molecular filtration of the liposome suspension through a Sephadex G 50 Fine packed column (Sigma, St. Louis, MO, USA) results in the separation of non-liposome-encapsulated substance. The amount of liposome-entrapped substance is determined in the fractions of the sephadex effluent, after disrupting the liposomal structures by the use of a detergent (e.g. Triton X-100), by measuring the extinction of the solution at a wavelength corresponding to the liposome-encapsulated substance. An independent measurement of phosphorus content (the method with perchloric acid, ammonium molybdate and ascorbic acid with extinction measurement at 812 nm) allowed to determine the degree of encapsulation of the tested samples at a level three times higher than that determined for liposomes containing no resorcinol lipids and / or their derivatives. The obtained liposomes, unlike the liposomes which do not contain the modifiers according to the invention, have a size of about 180 nm, stable over a wide temperature range. It was found that the addition of substances increasing the stability of liposomes in vivo did not reduce the encapsulation efficiency.

Przykład 2. Kompozycja lipidowa składa się z 75% wagowych lecytyny jajecznej i 25% wagowych alkilorezorcynoli izolowanych z materiału zbożowego. Sposób wytwarzania liposomów z przykładowej kompozycji lipidowej jest następujący. W kolbie okrągłodennej, o pojemności 250 ml, umieszczono 75 mg lecytyny jajecznej, firmy Lipid Products, Wielka Brytania, i 25 mg alkilorezorcynoli izolowanych z materiału zbożowego w postaci rozpuszczonej w chloroformie, a następnie odparowano rozpuszczalnik na wyparce obrotowej, pod zmniejszonym ciśnieniem. Do kolby z pozostałością po odparowaniu, umieszczonej w termostatowanej łaźni wodnej o temperaturze 40°C, dodano wodny roztwór związku markerowego (Patent Blue Violet) (20 mg w 10 ml) o tej samej temperaturze, a następnie zawartość kolby wytrząsano energicznie przezExample 2. The lipid composition consists of 75% by weight of egg lecithin and 25% by weight of alkylresorcinols isolated from cereal material. The method of preparing liposomes from an exemplary lipid composition is as follows. 75 mg of egg lecithin, Lipid Products, UK, and 25 mg of alkylresorcinols isolated from cereal, dissolved in chloroform, were placed in a 250 ml round-bottom flask, and the solvent was then evaporated on a rotary evaporator under reduced pressure. An aqueous solution of the marker compound (Patent Blue Violet) (20 mg in 10 ml) at the same temperature was added to the evaporation flask placed in a thermostatic water bath at 40 ° C at the same temperature, and then the contents of the flask were shaken vigorously for

188 497 minut. Po tych operacjach substancja aktywna jest w większości zawarta w rozproszonej warstwie lipidowej. Badanie zawartości kolby po wytrząsaniu, przeprowadzone przy użyciu mikroskopu optycznego z głowicą kontrastowo-fazową, przy powiększeniu 2250 razy pozwala obserwować struktury liposomowe, wypełnione barwną zawartością. Sączenie molekularne zawiesiny liposomów przez kolumnę z wypełnieniem Sephadex G 50 Fine (Sigma, St. Louis, MO, USA) prowadzi do oddzielenia niezamkniętej w liposomach substancji. Ilość zamkniętej w liposomach substancji określona jest we frakcjach wycieku z kolumny sefadeksowej, po rozbiciu struktur liposomowych przez użycie detergentu (np. Triton X-100), przez zmierzenie ekstynkcji roztworu przy długości fali odpowiadającej zamkniętej w liposomach substancji. Niezależny pomiar zawartości fosforu (metoda z kwasem nadchlorowym, molibdenianem amonu i kwasem askorbinowym z pomiarem ekstynkcji przy 812 nm), pozwolił oznaczyć stopień enkapsulacji badanych próbek na poziomie czterokrotnie wyższym od oznaczanego dla liposomów niezawierających lipidów rezorcynolowych i/lub ich pochodnych.188,497 minutes. After these operations, the active substance is mostly contained in the dispersed lipid layer. Examination of the contents of the flask after shaking, carried out with the use of an optical microscope with a phase-contrast head, at a magnification of 2250 times, allows to observe the liposome structures filled with colored contents. Molecular filtration of the liposome suspension through a Sephadex G 50 Fine packed column (Sigma, St. Louis, MO, USA) results in the separation of non-liposome-encapsulated substance. The amount of liposome-entrapped substance is determined in the fractions of the sephadex effluent, after breaking down the liposomal structures by using a detergent (e.g. Triton X-100), by measuring the extinction of the solution at a wavelength corresponding to the liposome-encapsulated substance. An independent measurement of phosphorus content (the method with perchloric acid, ammonium molybdate and ascorbic acid with extinction measurement at 812 nm) allowed to determine the degree of encapsulation of the tested samples at a level four times higher than that determined for liposomes containing no resorcinol lipids and / or their derivatives.

Przykład 3. Kompozycja lipidowa składa się z 25% wagowych lecytyny jajecznej, 25% wagowych uwodornionej lecytyny jajecznej i 50% wagowych 1-mirystyloksy-5-pentadecylobenzeno-3-siarczanu. Sposób wytwarzania liposomów z przykładowej kompozycji lipidowej jest następujący. W kolbie okrągłodennej, o pojemności 250 ml, umieszczono 25 mg lecytyny jajecznej, firmy Lipid Products, Wielka Brytania, 25 mg uwodornionej lecytyny jajecznej, firmy Lipid Products, Wielka Brytania, i 50 mg 1-mirystyloksy-5-pentadecylobenzeno-3-siarczanu w postaci rozpuszczonej w chloroformie, a następnie odparowano rozpuszczalnik na wyparce obrotowej, pod zmniejszonym ciśnieniem. Do kolby z pozostałością po odparowaniu, umieszczonej w termostatowanej łaźni wodnej o temperaturze 40°C, dodano wodny roztwór chlorowodorku doksorubicyny (20 mg w 10 ml) i całość poddano procesom dalszej obróbki w sposób opisany w przykładzie pierwszym. Badanie zawartości kolby po wytrząsaniu, przeprowadzone przy użyciu mikroskopu optycznego z głowicą kontrastowo-fazową, przy powiększeniu 2250 razy pozwala obserwować struktury liposomowe, wypełnione barwną zawartością. Roztwór wodny otrzymany przez odwirowanie (16 tys. obr/min, przez 6 min) jest bezbarwny i nie wykazuje maksimów absorpcji charakterystycznych dla pochodnych antracyklinowych w widmie ultrafioletowym. Również sączenie molekularne zawiesiny liposomów przez kolumnę z wypełnieniem Sephadex G 50 Fine (Sigma, St. Louis, MO, USA) nie prowadzi do zatrzymania wykrywalnych ilości doksorubicyny na złożu, co dowodzi całkowitej enkapsulacji. Całość substancji czynnej można natomiast oznaczyć we frakcjach wycieku z kolumny sefadeksowej, po rozbiciu struktur liposomowych przez użycie detergentu (np. Triton X100), przez zmierzenie ekstynkcji roztworu przy długości fali 489 nm. Stopień enkapsulacji badanych próbek kształtuje się na poziomie 98%, czyli poziomie dwu-, trzykrotnie wyższym od oznaczanego dla liposomów niezawierających lipidów rezorcynolowych lub ich pochodnych. Poddając zawiesinę liposomów z substancją czynną ekstruzji, stosując membrany o średnicy porów 100 nm, uzyskuje się sterylny preparat liposomów o średniej wielkości około 180 nm. Proces ekstruzji nie zmieniał przy tym ilości zamykanego w liposomach leku (98%).Example 3. The lipid composition consists of 25% by weight of egg lecithin, 25% by weight of hydrogenated egg lecithin and 50% by weight of 1-myristyloxy-5-pentadecylbenzene-3-sulfate. The method of preparing liposomes from an exemplary lipid composition is as follows. In a 250 ml round bottom flask were placed 25 mg of egg lecithin, from Lipid Products, UK, 25 mg of hydrogenated egg lecithin, from Lipid Products, UK, and 50 mg of 1-myristyloxy-5-pentadecylbenzene-3-sulfate in dissolved in chloroform, and then the solvent was evaporated on a rotary evaporator under reduced pressure. To the evaporation flask placed in a thermostatic water bath at 40 ° C, an aqueous solution of doxorubicin hydrochloride (20 mg in 10 ml) was added and further processed as described in Example 1. Examination of the contents of the flask after shaking, carried out with the use of an optical microscope with a phase-contrast head, at a magnification of 2250 times, allows to observe the liposome structures filled with colored contents. The aqueous solution obtained by centrifugation (16,000 rpm, 6 min) is colorless and does not show the absorption maxima characteristic for anthracycline derivatives in the ultraviolet spectrum. Also, molecular filtration of the liposome suspension through a Sephadex G 50 Fine packed column (Sigma, St. Louis, MO, USA) did not result in the retention of detectable amounts of doxorubicin on the bead, demonstrating complete encapsulation. On the other hand, the total active ingredient can be determined in the fractions of the sephadex effluent, after breaking down the liposomal structures by using a detergent (e.g. Triton X100), by measuring the extinction of the solution at 489 nm. The degree of encapsulation of the tested samples is at the level of 98%, i.e. a level two or three times higher than that determined for liposomes that do not contain resorcinol lipids or their derivatives. By extrusion of the liposome suspension with the active substance using membranes with a pore diameter of 100 nm, a sterile preparation of liposomes with an average size of about 180 nm is obtained. The extrusion process did not change the amount of the drug enclosed in liposomes (98%).

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz Cena 2,00 zł.Publishing Department of the UP RP. Mintage 50 copies Price PLN 2.00.

Claims

Patent claims

CLAIMS 1. A lipid composition for the production of liposomes, containing known lipid components, preferably phospholipids of natural origin and / or synthetic phospholipids, characterized in that it contains a modifier, preferably in an amount of 15% by weight to 50% by weight, in the form of 1,3-dihydroxy- 5-alkylbenzene or O-acylalkylbenzene-O-sulfate.

2. A composition according to claim 1 The process of claim 1, wherein the O-acylalkylbenzene-O-sulfate is 1-myristyloxy-5-pentadecylbenzene-3-sulfate.