Przedmiotem niniejszego wynalazku jest przedewszystkiem ten specjalny spo¬ sób hodowli, opierajacy sie na fakcie, ze wszystkie czynniki fermentacji acetono-bu- tylowej pod wszelkiemi nazwami sa nad¬ zwyczaj wrazliwe na dzialanie kwasu, de¬ generuja sie w kwasnych srodowiskach po- zywkowych, staja sie asporogenowe i wresz¬ cie zamieraja. Celem wynalazku jest obni¬ zenie wrazliwosci tego rodzaju czynników fermentacyjnych na wolny kwas zapontoca stopniowego przyzwyczajania. Sposób, pto~ — 2 —wadzacy do tego celu, polega na tern, ze Bacillus A. M. et Bredemann hoduje sie na pozywkach o wzrastajacej kwasowosci po¬ czatkowej, bez zobojetniania kwasu two¬ rzacego sie podczas fermentacji dopóty, az bakterja stanie sie w odpowiednim stopniu Wytrzymala na dzialanie kwasu, przytem jednakze miedzy kazde dwa kolejne proce¬ sy hodowania na takiej pozywce (co w dal¬ szym ciagu nazywane bedzie „fermentacja przyzwyczajania" wlacza sie fermentacje w obojetnem lub alkalicznem srodowisku, podczas której zobojetnia sie kwasy, two¬ rzace sie podczas tej fermentacji) zwanej w dalszym ciagu „fermentacja sporulacyj- na") i hodowle przed przeniesieniem do na¬ stepnej „fermentacji przyzwyczajania", o wyzszej kwasowosci poczatkowej kazdora¬ zowo ogrzewa sie w zwykly sposób przez czas krótki, aby zabic wszystkie formy we¬ getatywne, tak iz w' fermentacjach przy¬ zwyczajania hoduje sie tylko zarodniki.Zgodnie z korzystniejsza odmiana wy¬ konania wynalazku, moderujac pozywke fermentacji przyzwyczajania, zapobiega sie przekroczeniu pewnej granicy stezenia jo¬ nów wodorowych pomimo wzrostu zawar¬ tosci kwasu podczas fermentacji, przyczem stopien moderacji tt pozywek w kolejnych fermentacjach przyzwyczajania wzrasta od¬ powiednio do wzrastajacej kwasowosci po¬ czatkowej. Do moderacji nadaja sie znane uklady: mieszaniny slabych kwasów z ich solami alkaljów (porównaj Michaelis, Die Wassersitoiffionen korizentration str. 37 i nast. oraz 89 i nasi).Stopien moderacji tt wyraza sie mate- dk matycznie zapomoca równania tt = . dPk Ilosciowa wartosc moderacji oznacza sie, jak wiadomo, mierzac zmiane wartosci ste¬ zenia Vk po dodaniu pewnej okreslonej ma¬ lej ilosci kwasu lub alkaljów do danej ilo¬ sci srodowiska fermentacyjkiego. Dodatki powinny byc teoretycznie nieskonczenie male, w praktyce zas dolna granice stano¬ wi tu dokladnosc metody okreslania *Ph Aby otrzymac wyniki pomiarów, dajace sie porównywac, dodawana ilosc kwasu albti lugu powinna byc we wszystkich próbach stala. PodstaWa okreslania nizej podawa¬ nych wartosci tt jest metoda nastepujaca: pobiera sie jednoczesnie trzy próbki srodo¬ wiska fermentacyjnego, kazda po 1 cm3; W jednej z tych próbek mierzy sie PA fcwykl^ metoda; do drugiej dodaje sie 0,5 cm? n/100 H2S04, a do trzeciej 0,5 cm3 n/100 NaOH, poczem w obu tych próbach mierzy sie wartosc Pk ta sama metoda. Zmiany wartosci Ph sa odwrotnie proporcjonalne do moderacji n. Wysokosc tych zmian teo¬ retycznie powinna miec te sama wartosc przy róznych oznaczeniach. - Praktycznie jednak pomiedzy zmianami wartosci PA, spowodowanemi przez równowazne ilosci kwasu i lugu, wystepuja czysto znaczne róznice. Przy praktycznem oziiaczaiiiu przyjmuje sie srednia arytmetyczna od¬ wrotnosci zmian wartosci PA ku stronife kwasnej i alkalicznej jako wartosci ^,Do oznaczania wartosci P\ stosowano znana metode indykatorów foljowych Dr. Peter Wulff (patent niemiecki Nr 405091 Iadika- torfolienmethode).Stopien moderacji srodowisk pozywko* Wych w kolejnych fermentacjach przyzwy¬ czajania reguluje sie przy uzyciu tej meto¬ dy oznaczania w taki sposób, ze wzrasta on powoli od wartosci w przyblizeniu 4 na po¬ czatku szeregu hodowlanego, az do 10 na koncu. Okazalo sie przytem bardzo ko- rzystnem stosowanie do moderacji srodo¬ wisk fermentacyjnych dobrze buforujacych mieszanin materjalów tego samego typu, które nastepnie dodaje sie w fermentacjach glównych do zawierajacego cukier materja- lu wyjsciowego, jako pozywek, zawieraja¬ cych azot (np. kielków slodowych, zabitych i rozlozonych drozdzy, mocznika, fosfora¬ nu amonowego lub tym podobnych). Dzieki temu drobnoustroje, przyzwyczajajac si'$ do wzrastajacych ilosci kwasu, przyzwy- — 3 —czjtjaja sie jednoczesnie do wzrastajacych ilosci takich dodatków pozywkowych za¬ wierajacych azot.Do zakwaszenia srodowisk pozywko¬ wych w fermentacjach przyzwyczajania najlepiej stosowac kwasy organiczne, najle¬ piej mleczny. Dobre wyniki osiaga sie, jesli poczatkowa kwasowosc srodowiska fermen¬ tacyjnego w kolejnych fermentacjach przy¬ zwyczajania wzrasta od 0,1 (przy wartosci Ti = 4) do 1,6 (przy wartosci n ¦= 10).Stopnie kwasowosci daja tutaj i w dalszym ciagu opisu liczbe cm8 normalnego lugu so¬ dowego, potrzebnych przy uzyciu blekitu bromotymolowego jako wskaznika do zobo¬ jetnienia 100 cnj?v srodowiska. Ze wzrostem kwasowosci i stopnia moderacji mozna po¬ zwolic równiez na staly wzrost stezenia weglowodanów w pozywce od jednfej fer¬ mentacji przyzwyczajania do nastepnej.Rozpoczyna sie korzystnie z pozywkami za* wierajacemi 1% weglowodanu (liczonego jako skrobia) i konczy sie z zawartoscia w^gjlowodanów równa 6 do 8%.Pozywka o zmiennym skladzie, stosowa¬ na do fermentacji przyzwyczajania, moze zawierac, jako materjaly wyjsciowe weglo¬ wodanowe, np. zienmiaki, make kukurydza- na albo ryzowa. Zawierajace azot miesza¬ niny buforujace zawieraja dodatki orga¬ niczne, jak kielki slodowe lub autolizowane drozdze, i dodatki nieorganiczne, jak mocz¬ nik, fosforan amonu albo siarczan amom* w rozmaitych kombinacjach. Srodowisko po¬ zywkowe dla fermentacyj zarodnikowych ma stale ten sam sklad i sklada sie, np., ze 100 czesci wagowych papki kartoflanej, 100 czesci wagowych wody, 10 czesci wago¬ wych kielków slodowych lub krwi i 2 czesci wagowych kredy (CaCOJ. Obie pozywki wlewa sie do probówek i trzykrotnie stery¬ lizuje sie je frakcjami. Bakterje z gruntu albo z jarzyn chwyta sie sposobem poda¬ nym przez Bredemanna i prowadzi sie ho-j / dowie czysta (wym. zr. str. 390 i nasi), al-j I bo tez pobiera sie zarodniki róznego pocho-tj dzenia bacillus amylobacter A. M. et Bre- demann z gotowych juz hodowli. Drobnou¬ stroje te hoduje sie najprzód dalej przez 24 godziny na pozywce sporulacyjnej, nastep¬ nie okolo 5 minut ogrzewa sie do 90°C i za¬ szczepia sie do pozywki pierwszej fermen¬ tacji przyzwyczajania. Po 48 "godzinnej fermentacji bada sie hodowle w zwykly spo¬ sób pod wzgledem ich wlasciwosci bakterjo- logicznych, morfologicznych i fizjologicz¬ nych. Najodpowiedniejsze drobnoustroje poddaje sie drugiej fermentacji na pozyw¬ ce sporulacyjnej i po zabiciu form wegeta¬ tywnych przenosi sie na odpowiednio przy¬ gotowana pozywke drugiej fermentacji przyzwyczajania. Wszystkie fermentacje prowadzi sie zupelnie beztlenowo w tem¬ peraturze 37° do 38°C. Ten proces kolej¬ nych fermentacyj przyzwyczajania i sporu- lacyjnych prowadzi sie dopóty, ai fermen¬ tacja próbna wykaze, ze drobnoustroje zdolne sa do calkowitego przefermentowa- nia zacieru, zawierajacego 6 do 8% skrobi i zakwaszonego przez dodatek kwasu az do stopnia kwasowosci 1,4 do 1,6, zas poczat¬ kowy stopien moderacji wynosi co najmniej 4f prjy Pk równem 5 do 4,7, przyczem na koncu fermentacji w srodowisku jej prak¬ tycznie nie powinno byc ani cukru, ani skro¬ bi, dajacej sie wykryc. (Poniewaz hodowle wytwarzaja duzo gazów, wiec do wykona¬ nia tej fermentacji próbnej, jak sie to zwy¬ kle dzieje podczas hodowania bakterji bez¬ tlenowych, stosuje sie odpowiednie za¬ mkniecie przepuszczalne dla gazu). Do za¬ mierzonego celu dochodzi sie dopiero po bardzo dlugim szeregu fermentacyj przy¬ zwyczajania, nie krepujac sie jednakze wy¬ borem jakiejs okreslonej odipiany bacillus amylobacter A. M. et Bredemann.Stosujac te metode, udalo sie w prze¬ szlo 100 fermentacjach przyzwyczajania wyhodowac dwie odmiany tych bakteryj. specjalnie odpowiednie do fermentacji ace- tonobutylowej, oznaczane nazwami: bacil¬ lus amylobacter W. i bacillus amylobacterS. Obie te odmiany róznia sie morfologicz¬ nie swemi postaciami wegetatywnemi tylko tern, ze bacillus amylobacter W. tworzy dluzsze preciki, natomiast formy wegeta¬ tywne drugiej odmiany maja postac nie tak smukla. W stadjum zarodników (spor) w bacillus amylobacter. W. przewazaja for¬ my plectridiów, zas w drugiej odmianie for¬ my dloistridiów. Oidia obu organizmów sa bardzo ruchliwe. Obie odmiany nie prze¬ prowadzaja zelatyny w stan ciekly i sa o- bowiazkowo beztlenowe, a wiec pod tym wzgledem róznia sie zupelnie od bakteryj, zalecanych przez Weizlnana (patent au- stryjacki Nr. 95449).Do wykonania fermentacji na duza ska¬ le rozmnaza sie, jak zwykle, hodowle za¬ wierajace tylko spory w kilku kolejnych nastawieniach o wzrastajacej objetosci, az do otrzymania wreszcie ilosci zaczynu, po¬ trzebnej do nastawienia zacieru glównego.Równiez i zaciery do wielkiej fermenta¬ cji przygotowuje sie w zwykly sposób. Op¬ tymalne stezenie skrobi lub cukru wynosi 6 do 7%.W odróznieniu od znanych metod, zgod¬ nie z wynalazkiem prowadzi sie fermenta¬ cje glówna w zacierach, które przed rozpo¬ czeciem fermentacji zakwaszono przez do¬ danie kwasów organicznych, zwlaszcza mle¬ kowego. Korzystnem okazalo sie nastawia¬ nie kwasowosci poczatkowej zacieru glów¬ nego (kwasowosc mianowana blekitem bro- motymolowym) na co najmniej 1,4 do 1,6.Wartosc P/t przy stopniu moderacji conaj- mniej 4 powinna lezec miedzy 5 a 4,6. W zwiazku z tern do regulowania procesu z re¬ guly^okazalo sie koniecznem nietylko kon¬ trolowanie fermentacji zapomoca bakterjo- logicznego badania i okreslania krzywej kwasowosci, lecz równiez zapomoca perjo- dycznych pomiarów stopnia moderacji, przyczean wartosc jt dostosowuje sie do zmiainy kwasowosci, t. j. powinna wlzra- stac wraz z nia i osiagac maximum z chwila osiagniecia maxiinum przez kwa¬ sowosc. W razie stwierdzenia niedo¬ statecznie wysokiego stopnia moderacji, nalezy brak ten wyrównac przez do¬ danie silnie buforujacych cial, np. kwasu mlekowego, winnego, cytrynowego lub soli kwasu szczawiowego, w ciagu fermentacji glównej. W ten sposób wyzyskuje sie za¬ pomoca wyzej opisanych fermentacyj przy¬ zwyczajania obnizenie wrazliwosci czynni¬ ków fermentacyjnych na dzialanie kwasów, aby izapewmic czystosc fermentacji glównej w nieosiaganym dotychczas stopniu, a w zwiazku z tern równomierne otrzymywanie najwyzszych wydajnosci.W tych warunkach pracy w najwyz¬ szych punktach fermentacji glównej osiaga sie maximum dla kwasowosci od 8 do 9°.A zatem drobnoustroje, przyzwyczajone do kwasu, wytwarzaja w ciagu fermentacji wieksze ilosci kwasu, niz to dotychczas stwierdzono podczas fermentacji acetono- butylowej.Przyklad. 100 litrów zacieru powinno zawierac okolo 35 — 37 kg ziemniaków lub 9 — 10 kg maki kukurydzanej. Inne mate- rjaly zawierajace skrobie przerabia sie na zaciery o tern samem stezeniu (6 — 1% czy¬ stej skrobi), odpowiednio do zawartosci w nich skrobi. Ziemniaki nierozdrobione, a kukurydze lub tym podobne w postaci ma¬ ki wprowadza sie z odpowiednia iloscia wody do autoklawów, zaopatrzonych w mieszadla, i zaparza sie pod cisnieniem dwóch do trzech atmosfer w ciagu 1 do 2 godzin. Dodatki pozywkowe (drozdze za¬ bite lub zautolizowane, albo kielki slodo¬ we, albo mocznik lub fosforan amonowy, albo siarczan amonowy, albo wreszcie roz¬ maite kombinacje tych i podobnych mate- rjalów, zawierajacych azot) dodaje sie do zacieru korzystnie juiz w autoklawie. Od¬ powiednim skladem ilosciowym jest tutaj nastepujacy: np., na 100 litrów zacieru przypada 125 g zabitych lub rozlozonych drozdzy, 125 g kielków slodowych i 40 g siarczanu amonowego. Mozna równiez pra- — 5 —cowac, stosujac wylacznie azot nieorga¬ niczny; wtedy na 100 litrów zacieru doda¬ je sie 100 g fosforanu amonowego i 100 g siarczanu amonowego. Zacier zamyka sie bezposrednio w uprzednio starannie wyja¬ lowionych i zaopatrzonych w mieszadla na¬ czyniach fermentacyjnych, które sa zupel¬ nie zamkniete i zaopatrzone w nasade fer¬ mentacyjna dla odprowadzania wydziela¬ jacych sie gazów. Po nastawieniu odpo¬ wiedniej kwasowosci poczatkowej, do cze¬ go na kazde 100 litrów zacieru potrzeba 80 do 90 cm3 80% kwasu mlecznego, ozie¬ bia sie zacier, np. zapomoca wbudowanej chlodnicy, do temperatury fermentacyjnej 37° — 38°; mozna jednakze do tego celu dojsc zapomoca dobudowanych aparatów, wymieniajacych cieplo.Gdy zacier glówny gotowy jest do na¬ stawienia, musi byc równiez gotowy zaczyn bakteryjny o odpowiedniej objetosci. Aby go otrzymac zaszczepia sie bacterium amy- lóbacter W. albo S. po krótkiem ogrzewaniu do 90° w 100 cm3 pozywki, przygotowanej w taki sam sposób, jak zacier glówny, i po¬ zostawia sie do rozwoju w temperaturze 37° — 38° w warunkach beztlenowych. Po 48 godzinach rozpoczyna sie wzrost i roz¬ wój oidiów. Po przekonaniu sie o odpo¬ wiednich wlasciwosciach hodowli zaszcze¬ pia sie ja na 2 litrach wyjalowionego zacie¬ ru o takim samym skladzie i wlasciwo¬ sciach, a po 24 godzinach na 20 litrach ta¬ kiego samego zacieru. Po dalszych 24 go¬ dzinach te 20 litrów wprowadza sie do za¬ cieru, przygotowanego w ilosci 200 do 300 litrów, który po dalszych 24 godz przepro¬ wadza sie do zacieru glównego, przygoto¬ wanego tymczasem do nastawienia.• Podczas fermentacji zacieru glównego conajmniej 4 razy dziennie, oprócz kon¬ troli bakterjologicznej i mianowania kwa¬ sowosci, oznacza sie PA i stopien modera¬ cji co w pewnych okolicznosciach prowadzi do dodawania dalszych ilosci materialów buforowych. Przy przeprowadzaniu sposo¬ bu w skali przemyslowej i przy uzyciu ja¬ ko materjalu wyjsciowego kukurydzy kwa¬ sowosc 6° osiaga sie przecietnie po uply¬ wie 10 — 12 godzin. Jednakze drobnou¬ stroje, przyzwyczajone do kwasu oraz za¬ bezpieczone wysokim stopniem moderacji zacieru, znosza równiez doskonale bez osla¬ bienia kwasowosc 8 — 9°. Po uplywie oko¬ lo 17 — 22 godzin fermentacja jest ukon¬ czona, czyli ze w zacierze w praktyce nie- wykrywalna jest skrobia ani cukier.Po ukonczeniu fermentacji wytworzone glówne produkty (alkohol butylowy i ace¬ ton) oddestylowuje sie w sposób zwykly zapomoca destylacji frakcjonowanej. Nie¬ wielkich ilosci innych alkoholi nie oplaca sie wydzielac.Gazy uchodzace podczas fermentacji (wodór i dwutlenek wegla) mozna, jak sie to dzieje i obecnie, zuzytkowac; równiez mozna zuzytkowac pozostalosci, zawieraja¬ ce cenne produkty pokarmowe.Proponowano obecnie czynniki fermen¬ tacyjne acetonobutylowej fermentacji uod¬ porniac zapomoca przyzwyczajania do pewnych materjalów, obecnych w zacierze podczas tak zwanej ,fermentacji leniwej'\ Materjaly te nawet przy starannem sacze¬ niu zacieru przez saczek bakteryjny pozo¬ staja w zacierze, a oprócz tego i z innych powodów przyjeto, ze czynniki fermentacji „leniwej" naleza do ultramikroskopowych.Równiez i tutaj idzie o przyzwyczajenie drobnoustrojów do niedostrzegalnego jadu czyli bakterjofagów, dlatego tez znane jest poddawanie hodowli bakteryjnych jedne¬ mu lub kilku procesom selekcyjnym, przy- czem bakterje te hoduje sie na pozywce, do której dodaje sie niewielkie ilosci pro¬ duktów, jakie otrzymuje sie podczas takiej fermentacji. W danym zas przypadku idzie o to, zeby czynniki fermentacyjne uodpor¬ nic na dzialanie acetonu, wzglednie alko¬ holu butylowego. Z metodami temi wynala¬ zek niniejszy ma wspólna tylko powszech¬ nie znana bakterjologiczna metode przy- — 6 —zwyczajania drobnoustrojów do pewnych okreslonych materjalów zapomoca wielo¬ krotnej hodowli w obecnosci tych materja¬ lów. PL