PL185293B1 - Novel growth factor and genetic sequence encoding same - Google Patents
Novel growth factor and genetic sequence encoding sameInfo
- Publication number
- PL185293B1 PL185293B1 PL96322067A PL32206796A PL185293B1 PL 185293 B1 PL185293 B1 PL 185293B1 PL 96322067 A PL96322067 A PL 96322067A PL 32206796 A PL32206796 A PL 32206796A PL 185293 B1 PL185293 B1 PL 185293B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- acid sequence
- molecule
- vegf
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
1. Izolowany polipeptyd posiadający przynajmniej jedną spośród następujących cech: (i) zdolność do indukowania proliferacji komórek nabłonka naczyniowego; (ii) zdolność do oddziaływania z rodziną receptoróworaz (iii) zdolność do indukowania migracji komórek, przeżywalności komórek i/lub wzrostu wewnątrzkomórkowych poziomów alkalicznej fosfatazy; przy czym polipeptyd zawiera: a. sekwencję aminokwasowąkodowanąprzez sekwencję nukleotydowąprzedstawioną na SEQ ID nr 3 lub sekwencję nukleotydowązdolnądo hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzacji w obecności 0,1-1 x SSC/0,7% wag./wag. SDS w 60°C przez 1-3 godzin, lub b. sekwencję aminokwasową przedstawionąna SEQ ID nr 4 lub sekwencję aminokwasową posiadającą wobec niej przynajmniej 70% podobieństwo; lub pochodna takiego polipeptydu, wykazująca przynajmniej jedną z cech (i) - (iii).1. An isolated polypeptide having at least one of the following characteristics: (i) the ability to induce proliferation of vascular epithelial cells; (ii) the ability to interact with the receptor family, and (iii) the ability to induce cell migration, cell survival and / or growth intracellular levels of alkaline phosphatase; wherein the polypeptide comprises: a. Amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown on SEQ ID No. 3 or a nucleotide sequence capable of hybridizing to SEQ ID No. 3 or not complementary under stringent hybridization conditions in the presence of 0.1-1 x SSC / 0.7% weight / weight SDS at 60 ° C for 1-3 hours, or b. the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 4 or the amino acid sequence having at least 70% similarity to her; or a derivative of such a polypeptide, showing at least one of the features (i) - (iii).
Description
Przedmiotem wynalazku jest izolowany polipeptyd posiadający przynajmniej jedną spośród następujących cech:The invention relates to an isolated polypeptide having at least one of the following characteristics:
(i) zdolność do indukowania proliferacji komórek nabłonka naczyniowego;(i) the ability to induce proliferation of vascular epithelial cells;
(ii) zdolność do oddziaływania z rodziną receptorów flt-l/flk-1,, oraz (iii) zdolność do indukowania migracji komórek, przeżywalności komórek i/lub wzrostu wewnątrzkomórkowych poziomów alkalicznej fosfatazy;(ii) the ability to interact with the flt-1 / flk-1 receptor family, and (iii) the ability to induce cell migration, cell survival and / or an increase in intracellular levels of alkaline phosphatase;
przy czym polipeptyd zawiera:wherein the polypeptide comprises:
a) sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzacji wo becności 0,1-1 x SSC/0, 1% wag./wag. SDS w 60°C przez 1-3 godzin, luba) the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID No. 3 or a nucleotide sequence capable of hybridizing to SEQ ID No. 3 or complementary to it under stringent hybridization conditions in the presence of 0.1-1 x SSC / 0.1-1% w / w / wt. SDS at 60 ° C for 1-3 hours, or
b) sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 4 lub sekwencję aminokwasową posiadającą wobec niej przynajmniej 70% podobieństwo; lub pochodna takiego polipeptydu, wykazująca przynajmniej jedną z cech (i) - (iii).b) the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 4 or an amino acid sequence having at least 70% similarity thereto; or a derivative of such a polypeptide, showing at least one of the features (i) - (iii).
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3.Preferably, an isolated polypeptide according to the invention comprises the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID No. 3.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową 13 przedstawioną na SEQ ID nr 5.Preferably, an isolated polypeptide according to the invention comprises the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID No. 5.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 7.Preferably, an isolated polypeptide according to the invention comprises the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID No. 7.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 9.Preferably, an isolated polypeptide according to the invention comprises the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID No. 9.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 4.Preferably, an isolated polypeptide according to the invention comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 4.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 6.Preferably, an isolated polypeptide according to the invention comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 6.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 8.Preferably, an isolated polypeptide according to the invention comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 8.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 10.Preferably, an isolated polypeptide according to the invention comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 10.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku jest pochodzenia ludzkiego.Preferably, an isolated polypeptide according to the invention is of human origin.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku posiada przynajmniej jedną spośród następujących cech: zdolność indukowania proliferacji astrogleju, zdolność do wspomagania neuronowej żywotności i/lub proliferacji u ssaków.Preferably, an isolated polypeptide of the invention has at least one of the following characteristics: ability to induce astroglial proliferation, ability to promote neuronal viability and / or proliferation in mammals.
Korzystnie izolowany polipeptyd według wynalazku jest dojrzałą formą polipeptydu z odtrawioną sekwencją liderową. Przedmiotem wynalazku jest także izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego posiadająca sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lubPreferably, an isolated polypeptide of the invention is a mature form of the polypeptide with a cleaved leader sequence. The invention also relates to an isolated nucleic acid molecule having the nucleotide sequence shown in SEQ ID No. 3 or
185 293 sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzacjj wo becności 0,1-1 x SSC/0, 1% wag./wag. SDS w 60°C przez 1-3 godzin.Nucleotide sequence capable of hybridizing to SEQ ID No. 3 or the complement thereof under stringent hybridization conditions in the presence of 0.1-1 x SSC / 0.1% w / w. SDS at 60 ° C for 1-3 hours.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3.Preferably, an isolated nucleic acid molecule according to the invention comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID No. 3.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 5.Preferably, an isolated nucleic acid molecule according to the invention comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID No. 5.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 7.Preferably, an isolated nucleic acid molecule according to the invention comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID No. 7.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 9.Preferably, an isolated nucleic acid molecule according to the invention comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID No. 9.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 4 lub sekwencję aminokwasową posiadającą wobec niej przynajmniej 70% podobieństwo.Preferably, an isolated nucleic acid molecule according to the invention encodes a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 4 or an amino acid sequence having at least 70% similarity thereto.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 4.Preferably, an isolated nucleic acid molecule according to the invention encodes a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 4.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 6.Preferably, an isolated nucleic acid molecule according to the invention encodes a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 6.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 8.Preferably, an isolated nucleic acid molecule according to the invention encodes a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 8.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 10.Preferably, an isolated nucleic acid molecule according to the invention encodes a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 10.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje polipeptyd posiadający przynajmniej jedną spośród następujących cech:Preferably, an isolated nucleic acid molecule of the invention encodes a polypeptide having at least one of the following characteristics:
(i) zdolność do indukowania proliferacji komórek nabłonka naczyniowego;(i) the ability to induce proliferation of vascular epithelial cells;
(ii) zdolność do oddziaływania z rodziną receptorów flt-1/flk-1, oraz (iii) zdolność do indukowania migracji komórek, przeżywalności komórek i/lub wzrostu wewnątrzkomórkowych poziomów alkalicznej fosfatazy;(ii) the ability to interact with the flt-1 / flk-1 receptor family, and (iii) the ability to induce cell migration, cell survival and / or an increase in intracellular levels of alkaline phosphatase;
lub pochodną takiego polipeptydu, wykazującą przynajmniej jedną z cech (i) - (iii).or a derivative of such a polypeptide, showing at least one of the features (i) - (iii).
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje polipeptyd dodatkowo posiadający zdolność indukowania proliferacji astrogleju.Preferably, an isolated nucleic acid molecule according to the invention encodes a polypeptide additionally having the ability to induce astroglial proliferation.
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje polipeptyd dodatkowo posiadający zdolność do wspomagania neuronowej żywotności i/lub proliferacji u ssaków. .Preferably, an isolated nucleic acid molecule of the invention encodes a polypeptide additionally having the ability to promote neuronal viability and / or proliferation in mammals. .
Korzystnie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku lub kodowany przez nią polipeptyd jest pochodzenia ludzkiego.Preferably, the isolated nucleic acid molecule according to the invention or the polypeptide encoded by it is of human origin.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania polipeptydu posiadającego przynajmniej jedną spośród następujących cech:The invention also relates to a method of obtaining a polypeptide having at least one of the following characteristics:
(i) zdolność do indukowania proliferacji komórek nabłonka naczyniowego;(i) the ability to induce proliferation of vascular epithelial cells;
(ii) zdolność do oddziaływania z rodziną receptorów flt-1/flk-1, oraz (iii) zdolność do indukowania migracji komórek, przeżywalności komórek i/lub wzrostu wewnątrzkomórkowych poziomów alkalicznej fosfatazy, charakteryzujący się tym, że obejmuje ekspresjonowanie cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd zawierający:(ii) the ability to interact with the flt-1 / flk-1 receptor family, and (iii) the ability to induce cell migration, cell survival, and / or an increase in intracellular levels of alkaline phosphatase, characterized by the expression of a nucleic acid molecule encoding the polypeptide containing:
a) sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybi^r^y^^/z^cci wo becności 0,1-1 x SSC/0,1% wag./wag. SdS w 60°C przez 1-3 godzin, luba) the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID No. 3 or a nucleotide sequence capable of hybridizing to SEQ ID No. 3 or complementary to it under stringent conditions hybi ^ r ^ y ^ ^ / z ^ cci in the presence of 0.1-1 x SSC / 0.1% w / w SdS at 60 ° C for 1-3 hours, or
b) sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 4 lub sekwencję aminokwasową. posiadającą wobec niej przynajmniej 70% podobieństwo;b) the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 4 or the amino acid sequence. having at least 70% similarity to her;
lub pochodna takiego polipeptydu w odpowiednim gospodarzu hodowanym w warunkach odpowiednich dla syntezy polipeptydu.or a derivative of such a polypeptide in a suitable host grown under conditions suitable for polypeptide synthesis.
185 293185 293
Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową wybraną spośród SEQ ID nr 3, SEQ ID nr 5, SEQ ID nr 7 i SEQ ID nr 9, albo sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEQ ID nr 4, SEQ ID nr 6, SEQ ID nr 8, SEQ ID nr 10, przy czym korzystnie izolowany polipeptyd jest pochodzenia ludzkiego.Preferably, the method of the invention is characterized in that the polypeptide comprises an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence selected from SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7 and SEQ ID No. 9, or an amino acid sequence selected from SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, wherein preferably the isolated polypeptide is of human origin.
Przedmiotem wynalazku jest także cząsteczka antysensowna hybrydyzująca z cząsteczką kwasu nukleinowego posiadającą sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną lub z cząsteczką kwasu nukleinowego posiadającą sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzaaji wo becności 0,1-1 x SSC/0,1% 30 wag./wag. SDS w 60°C przez 1-3 godzin.The invention also provides an antisense molecule that hybridizes to a nucleic acid molecule having or complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID No. 3, or to a nucleic acid molecule having a nucleotide sequence capable of hybridizing to SEQ ID No. 3 or complementary to it under stringent hybridization conditions under stringent hybridization conditions. 0.1-1 x SSC / 0.1% w / w SDS at 60 ° C for 1-3 hours.
Korzystnie cząsteczka antysensowna według wynalazku charakteryzuje się tym, że hybrydyzuje z cząsteczką kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową wybraną spośród SEQ ID nr 3, SEQ ID nr 5, SEQ ID nr 7, SEQ ID nr 9, albo cząsteczką kwasu nukleinowego, która koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEQ ID nr 4, SEQ ID nr 6, SEQ ID nr 8, SEQ ID nr 10 lub sekwencji aminokwasowej posiadającej przynajmniej 70% podobieństwo do SEQ ID nr 4.Preferably, the antisense molecule of the invention is characterized in that it hybridizes with a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, or a nucleic acid molecule that encodes a polypeptide containing the sequence an amino acid selected from SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, or an amino acid sequence having at least 70% similarity to SEQ ID No. 4.
Przedmiotem wynalazku jest także środek farmaceutyczny do wywoływania proliferacji astrogleju u ssaka i/lub zwiększania przetrwania i/lub proliferacji neuronów ssaków zawierający czynnik aktywny oraz jeden lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych nośników i/lub rozcieńczalników, charakteryzujący się tym, że jako czynnik aktywny zawiera izolowany polipeptyd posiadający przynajmniej jedną spośród następujących cech:The invention also relates to a pharmaceutical for inducing astroglial proliferation in a mammal and / or enhancing survival and / or proliferation of mammalian neurons comprising an active agent and one or more pharmaceutically acceptable carriers and / or diluents, characterized in that the active agent comprises an isolated polypeptide having at least one of the following characteristics:
(i) zdolność do indukowania proliferacji komórek nabłonka naczyniowego;(i) the ability to induce proliferation of vascular epithelial cells;
(ii) zdolność do oddziaływania z rodziną receptorów flt-l/flk-1, oraz (iii) zdolność do indukowania migracji komórek, przeżywalności komórek i/lub wzrostu wewnątrzkomórkowych poziomów alkalicznej fosfatazy;(ii) the ability to interact with the flt-1 / flk-1 receptor family, and (iii) the ability to induce cell migration, cell survival and / or an increase in intracellular levels of alkaline phosphatase;
przy czym polipeptyd zawiera:wherein the polypeptide comprises:
a) sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzacji wo becności 0,1-1 x SSC/0,1% wag./wag. SDS w 60176C przez 1-3 godzin, luba) the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID No. 3 or a nucleotide sequence capable of hybridizing to SEQ ID No. 3 or complementary to it under stringent hybridization conditions in the presence of 0.1-1 x SSC / 0.1% w / w / wt. SDS at 60176C for 1-3 hours, or
b) sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 4 lub sekwencję aminokwasową posiadającą wobec niej przynajmniej 70% podobieństwo;b) the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 4 or an amino acid sequence having at least 70% similarity thereto;
lub pochodna takiego polipeptydu, wykazująca przynajmniej jedną z cech (i) - (iii).or a derivative of such a polypeptide, showing at least one of the features (i) - (iii).
Korzystnie środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że izolowany polipeptyd zawiera sekwencję aminokwaso wą kodowaną przez sekwencję nukleotydową wybraną spośród SEQ ID nr 3, SeQ ID nr 5, sEq ID nr 7 i SEQ ID nr 9, albo sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEQ ID nr 4, SEQ ID nr 6, SEQ ID nr 8, SEQ ID nr 10, przy czym izolowany polipeptyd jest korzystnie pochodzenia ludzkiego lub dojrzałą formą polipeptydu z odtrawioną sekwencją liderową.Preferably the pharmaceutical composition according to the invention is characterized in that the isolated polypeptide comprises an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence selected from SEQ ID No. 3, SeQ ID No. 5, sEq ID No. 7 and SEQ ID No. 9, or an amino acid sequence selected from SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, wherein the isolated polypeptide is preferably of human origin or the mature form of the polypeptide with a cleaved leader sequence.
Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza, która zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego posiadającą sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzowania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzacji wo becności 0,1-1 x SSC/0,1% wag./wag. SDS w 60°C przez 1-3 godzin.The invention also relates to a host cell which contains a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence shown in SEQ ID No. 3 or a nucleotide sequence capable of hybridizing to or complementary to SEQ ID No. 3 under stringent hybridization conditions in the presence of 0.1-1 × SSC / 0.1% w / w SDS at 60 ° C for 1-3 hours.
Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydową wybraną spośród SEQ ID nr 3, SEQ ID nr 5, SEQ ID nr 7, SEQ ID nr 9 albo koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEQ ID nr 4, SEQ ID nr 6, SeQ ID nr 8, SEQ ID nr 10 lub sekwencji aminokwasowej posiadającej przynajmniej 70% podobieństwo do SEQ ID nr 4.Preferably, the host cell according to the invention is characterized in that the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence selected from SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9 or encodes a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID No. 4. SEQ ID No. 6, SeQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, or an amino acid sequence having at least 70% similarity to SEQ ID No. 4.
185 293185 293
Przedmiotem wynalazku jest także wektor, który zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego cząsteczkę kwasu nukleinowego posiadającą sekwencję przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub sekwencję ncklaótydówa zdolną do hybrydyzówania z SEQ ID nr 3 lub do niej komplementarną w zaostrzonych warunkach hybrydyzacji wo eeicnc^ści 0,1-1 x SSC/0, 1% wag./wag. SDS w 60°C przez 1-3 godzin.The invention also relates to a vector which comprises a nucleic acid molecule, a nucleic acid molecule having the sequence shown in SEQ ID No. 3 or a ncklaocide sequence capable of hybridizing to SEQ ID No. 3 or complementary to it under stringent hybridization conditions of 0.1-1. x SSC / 0.1% w / w SDS at 60 ° C for 1-3 hours.
Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nckleotydową wybraną spośród SEQ ID nr 3, SEQ ID nr 5, SEQ ID nr 7, SEQ ID nr 9 albo koduje polipeptyd zawierający sekwencję amikokwasową wybraną spośród SEQ ID nr 4, SEQ ID nr 6, SEq ID nr 8, SEQ ID nr 10 lub sekwencji amikokwasoweO posiadającej przynajmniej 70% podobieństwo do SEQ ID nr 4.Preferably, the vector according to the invention is characterized in that the nucleic acid molecule comprises a nckleotide sequence selected from SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9 or encodes a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID No. 4, SEQ ID NO: 6, SEq ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or an amino acid sequence having at least 70% similarity to SEQ ID NO: 4.
Wynalazek zostanie dokładniej przedstawiony przy pomocy poniższych figur i przykładów, które nie ograniczającego zakresu, na rysunkach:The invention will be more fully illustrated with the aid of the following non-limiting examples and figures:
Figura 1. Sekwencja kukleotydowa [SEQ ID nr 1] i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasów [SEQ ID nr 2] VEGF165.Figure 1. Cucleotide sequence [SEQ ID No. 1] and the corresponding amino acid sequence [SEQ ID No. 2] of VEGF1 65 .
Figura 2. Sekwencja nUklaotydowa [SEQ ID nr 3] i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasów [SEQ ID nr 4] SOM175.Figure 2. The nUclaotide sequence [SEQ ID No. 3] and the corresponding amino acid sequence [SEQ ID No. 4] of SOM175.
Figura 3. Wyniki przeszukiwania sekwencji białka SOM175 z wykorzystaniem BLAST.Figure 3. Results of a BLAST sequence search of the SOM175 protein.
Figura 4. Dopasowanie cDNA VEGF i cDNA SOM175 z wykorzystaniem BESTFIT.Figure 4. Alignment of VEGF cDNA and SOM175 cDNA using BESTFIT.
Figura 5. Wielokrotne dopasowywanie VEGF,65 z SOM175 i jego wariantami składanymi na poziomie kckleotydó>w.Figure 5. Multiple matching VEGF 6 5 with SOM175 and its variants folding at kckleotydó> w.
Figura 6. Wielokrotne dopasowywanie VEGF)65 z SOM175 i jego wariantami składanymi na poziomie aminokwasów.Figure 6 Multiple matching VEGF) 6 5 with SOM175 and its folding variants at the amino acid level.
Figura 7. Przedstawienie SOM175 i jego wariantów składanych w postaci diagramów.Figure 7. Representation of SOM175 and its variants folded as diagrams.
Figura 8(a). Przedstawienie struktury gekomowaO ludzkiego gekómowagó SOM175 w postaci diagramu, pokazujące mapę agzók/iktron.Figure 8 (a). Presentation of the gecko structure of the human SOM175 gecko in the form of a diagram showing the agzók / iktron map.
Figura 8(b). Przedstawienie struktury genomowej ludzkiego ganomowego SOM175 w postaci diagramu, pokazujące granice agzonu/iktroku.Figure 8 (b). Diagrammatic representation of the genomic structure of the human ganomic SOM175 showing agsone / ictrok boundaries.
Figura 9. Sekwencje kukleotydówa i przewidywane sekwencje peptydowe pochodzące z cDNA klonu mVRF. Numerację nukleotydów podano z lewej strony, poczynając od A kodonu inicjacyjnego. Numerację aminokwasów podano z prawej strony poczynając od pierwszej reszty przewidywanego dojrzałego białka po usunięciu przypuszczalnego peptydu sygnałowego. Przemiennie składany obszar jest podwójnie podkreślony, a uzyskana sekwencja peptydowa z każdego mRNA została włączona. Potencjalny sygnał poliadanylowania zaznaczono pogrubionymi literami. Kodony startu i stopu mVRFj67 i mYRF^ są podkreślone, a polimorficzke powtórka w 3' UTR jest zaznaczona kropkowanym prostokątem. Pozycje granic iktrok/egzon zaznaczono strzałkami.Figure 9. Cucleotide sequences and predicted peptide sequences derived from the mVRF clone cDNA. The nucleotide numbering is given to the left, starting with the A initiation codon. Amino acid numbering is given on the right hand side starting with the first residue of the predicted mature protein after removal of the putative signal peptide. The alternately folded area is double underlined and the resulting peptide sequence from each mRNA has been included. A potential polyiadanylation signal is shown in bold letters. The start and stop codons of mVRFj6 7 and mYRF ^ are underlined and the polymorphic repeat in the 3 'UTR is indicated by a dotted box. The positions of the iktrok / exon boundaries are marked with arrows.
Figura 10. Dopasowanie izoform ludzkiej i mysiej białka VRF. A: mVRFj67 i hYRF^. B: mVRF]86 i hVRF]g6, od punktu, w którym sekwencje zaczynają różnić się od odpowiednich izoform o 167 aminokwasach. Identyczność aminokwasów zaznaczono kreskami pionowymi, a aminokwasy zachowane dwukropkiem. Strzałka zaznacza przewidywane miejsce odszczepienia peptydu sygnałowego od ludzkiego i mysiego VRF.Figure 10. Alignment of human and murine VRF protein isoforms. A: mVRFj67 and hYRF ^. B: mVRF ] 8 6 and hVRF ] g 6, from the point where the sequences begin to differ from the corresponding 167 amino acid isoforms. The identity of the amino acids is marked with vertical lines and the preserved amino acids with a colon. The arrow marks the predicted site for cleavage of the signal peptide from human and mouse VRF.
Figura 11. Dopasowanie sekwencji peptydowych mVRF167 i mVEGFlgg (Breier i inni, 1992) z wykorzystaniem BESTFIT. Strzałka zaznacza miejsce odszczapiania peptydu sygnałowego w mVEGF. Identyczne aminokwasy są zaznaczone pionowymi kreskami, a zachowawcze podstawienia dwukropkami. Zastosowane numerowanie aminokwasów opisano w legendzie do fig. 9.Figure 11. Alignment of the mVRF167 and mVEGFl gg peptide sequences (Breier et al., 1992) using BESTFIT. The arrow marks the mVEGF signal peptide cleavage site. Identical amino acids are marked with vertical lines and conservative substitutions with colons. The amino acid numbering used is described in the legend of Figure 9.
Figura 12. Porównanie struktur genu VRF (przedstawiono generyczny gen VRF, gdyż organizacja iktrok/agzon w mysim i ludzkim homologu jest prawie identyczna) z innymi członami rodziny ludzkich genów VEGF/PIGF/PDGF. Egzony zaznaczono ramkami. Obszary kodujące białko i obszary nie ulegające translacji przedstawiono odpowiednio jako części wypełnione i puste.Figure 12. Comparison of VRF gene structures (generic VRF gene shown as the ictroc / agsone organization in mouse and human homologs is nearly identical) with other members of the human VEGF / PIGF / PDGF gene family. The exons are framed. Protein coding and untranslated regions are shown as filled and empty, respectively.
185 293185 293
Zakreskowany obszar w VRF oznacza dodatkową sekwencję 3' UTR powstałą w wyniku przemiennego składania izoformy VRF186. Pokazano potencjalne produkty przemiennego składania każdego genu.The hatched area in VRF represents an additional 3 'UTR sequence resulting from alternating splicing of the VRF1 86 isoform. The potential products of the alternating splicing of each gene are shown.
Figura 13. Autoradiogram błotu northern pełnego mRNA z różnych tkanek (zaznaczonych) dorosłych myszy hybrydyzowanych z cDNA klonu mVRF. Główny transkrypt o 11 kb wykryto we wszystkich próbkach.Figure 13. Northern blot autoradiogram of full mRNA from different tissues (marked) of adult mice hybridized with mVRF clone cDNA. The 11 kb main transcript was detected in all samples.
Figura 14. Zdjęcia autoradiografii (A-C) i mikrografie z ciemnymi polami (D-E) ilustrujące układ mVRF i mRNA u myszy, w przypadku embriona myszy E14 (A) dodatnie sygnały są widoczne na rozwijającym się sercem (Ha) i korą mózgową (Cx). Niski sygnał tła jest również widoczny nad innymi tkankami w tej sekcji, w przypadku embriona myszy E17 (B) serce (Ha) jest wyraźnie widoczne z uwagi na silny sygnał hybrydyzacji. Równie silny sygnał występuje nad brunatną tkanką tłuszczową (Fa) z tyłu oraz wokół klatki piersiowej. Umiarkowany sygnał hybrydyzacji występuje nad rdzeniem kręgowym (SC) i językiem (T). Sygnał tła jest osłabiony w porównaniu z embrionem E14. w przypadku młodych dorosłych myszy (C-D) dodatnie sygnały są widoczne nad sercem (Ha) i tkanką tłuszczową (Fa) wokół klatki piersiowej, podczas gdy np. w przypadku płuc (Lu) znaczenie nie wystąpiło. Sygnał hybrydyzacji nad sercem jest równomiernie rozmieszczony nad całą lewą komorą, w tym nad mięśniami brodawkowymi (D). w przypadku serca E17 hybrydyzowanego z nadmiarem zimnej sondy nie występują dodatnie sygnały (D). Słupki skali: 0,5 mm (A), 1,2 mm (B), 1 mm (C), 0,3 mm (D), 0,1 mm (E) .Figure 14. Photographs of autoradiography (A-C) and dark-field micrographs (D-E) illustrating the mVRF and mRNA pattern in mice, in the case of the E14 (A) mouse embryo, positive signals are seen on the developing heart (Ha) and cerebral cortex (Cx). A low background signal is also seen over the other tissues in this section, in the case of the E17 (B) mouse embryo, the heart (Ha) is clearly visible due to the strong hybridization signal. An equally strong signal is found over the brown adipose tissue (Fa) behind and around the chest. A moderate hybridization signal occurs above the spinal cord (SC) and the tongue (T). The background signal is attenuated compared to the E14 embryo. in the case of young adult mice (C-D), positive signals are seen above the heart (Ha) and the adipose tissue (Fa) around the chest, while for example in the lung (Lu) no significance was observed. The hybridization signal over the heart is evenly distributed over the entire left ventricle, including the papillary muscles (D). no positive signals are present for the E17 heart hybridized with an excess of the cold probe (D). Scale bars: 0.5mm (A), 1.2mm (B), 1mm (C), 0.3mm (D), 0.1mm (E).
Figura 15. Mikrografie z ciemnymi (A i C) oraz jasnymi polami (B i D) przedstawiające ekspresję mRNA mVFR w mysiej tkance tłuszczowej (A-B) i rdzeniu kręgowym (C-D). Silny sygnał hybrydyzacji jest widoczny nad tłuszczem (A), co potwierdza silne znaczenie w sekcjach barwionych czernią sudańską (B). Słaby sygnał występuje także w mięśniu szkieletowym (M na A-B). w rdzeniu kręgowym dorosłej myszy (C) sondy mVRF uwidoczniają neuronalny układ barwienia nad istotą szara. Przeciwbarwienie toluidyną wykazało, że neurony ruchowe w rogu brzusznym, neurony wstawkowe w głębokiej części rogu grzbietowego oraz wokół kanału centralnego (nie pokazano) były silnie dodatnie w stosunku do mRNA mVRF. Słupki skali: 0,1 mm (A), 0,1 mm (B), 0,25 mm (C), 0,015 mm (D).Figure 15. Dark (A and C) and light field (B and D) micrographs showing mRNA expression of mVFR in mouse adipose tissue (A-B) and spinal cord (C-D). A strong hybridization signal is visible above the fat (A), confirming the strong importance in the Sudanese black stained sections (B). Weak signal is also present in skeletal muscle (M to A-B). in the spinal cord of an adult mouse (C), mVRF probes visualize the neural staining pattern above the gray matter. Toluidine counterstaining showed that the motor neurons in the ventral horn, the insertion neurons in the deep dorsal horn and around the central canal (not shown) were strongly positive for mVRF mRNA. Scale bars: 0.1mm (A), 0.1mm (B), 0.25mm (C), 0.015mm (D).
Figura 16. Wpływ VEGF na czuciowe neurony 8-dniowego embriona kurczaka (E8), określany jako % przetrwania, % przerostu neurytów i średnią długość neurytu (pm).Figure 16. Effect of VEGF on the sensory neurons of an 8-day-old chicken embryo (E8), defined as% survival,% neurite outgrowth and mean neurite length (pm).
Figura 17. Wpływ VEGF i SOM175 na glej pisklęcia. Zbadano glej z ośrodkowego układu nerwowego (CNS), glej obwodowy i oligodęndrocyty CNS.Figure 17. Effect of VEGF and SOM175 on hatchling glial. Central nervous system (CNS) glia, peripheral glia and CNS oligodendrocytes were examined.
Figura 18. Wpływ różnych białek SOM175 na mysie komórki astroglejowe. 3 H (sygnały/minutę)Figure 18. Effect of various SOM175 proteins on murine astroglial cells. 3 H (signals / minute)
1. FGF-2 (10 ng/ml) - dodatnia próba kontrolna1. FGF-2 (10 ng / ml) - positive control
2. SOM^C6* 1 ng/ml2. SOM? C6 * 1 ng / ml
3. SOMAX6 10 ng/ml3. SOMAX6 10 ng / ml
4. SOMAX6 100 ng/ml4. SOMAX6 100 ng / ml
5. SOMAX6 1000 ng/ml5. SOMAX6 1000 ng / ml
6. SOMAX6 1000 ng/ml, bez heparyny6. SOMAX6 1000 ng / ml, no heparin
7. SOMX6** 1 ng/ml7. SOMX6 ** 1 ng / ml
8. SOMX6 10 ng/ml8. SOMX6 10 ng / ml
9. SOMX6 100 ng/ml9. SOMX6 100 ng / ml
10. SOMX6 1000 ng/ml10. SOMX6 1000 ng / ml
11. SOMX6 1000 ng/ml, bez heparyny * Doyyczy SOM17P z nieobecnym egzonem 6 ** Dotyczy SOM17511. SOMX6 1000 ng / ml, no heparin * Doyyczy SOM17P absent exon 6 ** Applies to SOM175
185 293185 293
Figura 19. Wpływ różnych białek SOM175 na mysie komórki oligodendroglejowe. 3H (sygnały/minutę)Figure 19. Effect of various SOM175 proteins on murine oligodendroglial cells. 3 H (signals / minute)
1. FGF-2 (10 ng/ml) - dodatnia próba kontrolna1. FGF-2 (10 ng / ml) - positive control
2. SOMAX6* 1 ng/ml2. SOMAX6 * 1 ng / ml
3. SOMAX6 10 ng/ml3. SOMAX6 10 ng / ml
4. SOMAX6 100 ng/ml4. SOMAX6 100 ng / ml
5. SOMAX6 1000 ng/ml5. SOMAX6 1000 ng / ml
6. SOMA 1000 ng/ml, bez heparyny6. SOMA 1000 ng / ml, no heparin
7. SOMX6** 1 ng/ml7. SOMX6 ** 1 ng / ml
8. SOMX6 10 ng/ml8. SOMX6 10 ng / ml
9. SOMX6 100 ng/ml9. SOMX6 100 ng / ml
10. SOMX6 1000 ng/ml10. SOMX6 1000 ng / ml
11. SOMX6 1000 ng/ml, bez heparyny * Dotyczy SOM175 z nieobecnym egzonem 6 ** Dotyczy SOM17511. SOMX6 1000 ng / ml, without heparin * Applies to SOM175 with exon 6 absent ** Applies to SOM175
Figura 20. Wpływ różnych białek SOM175 na mysie neurony przedmózgowia. % przeżyciaFigure 20. Effect of various SOM175 proteins on mouse forebrain neurons. % survival
1. FGF-2 (10 ng/ml) - dodatnia próba kontrolna1. FGF-2 (10 ng / ml) - positive control
2. SOMAX6* 1 ng/ml2. SOMAX6 * 1 ng / ml
3. SOMAX6 10 ng/ml3. SOMAX6 10 ng / ml
4. SOMAX6 100 ng/ml4. SOMAX6 100 ng / ml
5. SOMAX6 1000 ng/ml5. SOMAX6 1000 ng / ml
6. SOMAX6 1000 ng/ml, bez heparyny6. SOMAX6 1000 ng / ml, no heparin
7. SOMX6** 1 ng/ml7. SOMX6 ** 1 ng / ml
8. SOMX6 10 ng/ml8. SOMX6 10 ng / ml
9. SOMX6 100 ng/ml9. SOMX6 100 ng / ml
10. SOMX6 1000 ng/ml10. SOMX6 1000 ng / ml
11. SOMX6 1000 ng/ml, bez heparyny * Dotyczy SOM175 z nieobecnym egzonem 6 ** Dotyczy SOM17511. SOMX6 1000 ng / ml, without heparin * Applies to SOM175 with exon 6 absent ** Applies to SOM175
Tabela 1Table 1
Zestawienie numerów identyfikacji sekwencjiList of sequence identification numbers
185 293185 293
Przykład 1. Ludzkie klony cDNAExample 1. Human cDNA clones
Oryginalne cDNA SOM175 wydzielono przez selekcjonowanie ludzkiej płodowej biblioteki mózgowej (/.zapli, Stratagene) kosmidem D11S750 (Larsson i inni, 1992). Plazmid wycięto „in v/vo” uzyskując pojedynczy cDNA o 1,1 KB. Trzy niezależne klony cDNA SOM175 wydzielono również z ludzkiej płodowej biblioteki śledziony (Stratagene, Unizap) stosując wyżej wspomniany insert SOM175 jako sondę. Otrzymano 3 klony: SOM175-4A, -5A i - 6A. SOM 175-4Ajest przemiennie złożonym klonem z nieobecnym egzonem 4 (SOM175-e4). Selekcjonowanie biblioteki wykonano przeprowadzając hybrydyzację w warunkach zalecanych przez producenta biblioteki (Stratagene) i przypadkowo znaczony insert SOM175.The original SOM175 cDNA was isolated by selecting the human fetal brain library (/. Zapli, Stratagene) with cosmid D11S750 (Larsson et al., 1992). The plasmid was excised "in v / vo" to yield a single cDNA of 1.1 KB. Three independent SOM175 cDNA clones were also isolated from the human fetal spleen library (Stratagene, Unizap) using the above-mentioned SOM175 insert as probe. 3 clones were obtained: SOM175-4A, -5A and - 6A. SOM 175-4A is an alternating complex clone with exon 4 absent (SOM175-e4). Library selection was performed by performing hybridization under the conditions recommended by the library manufacturer (Stratagene) and randomly labeled SOM175 insert.
Wydzielono także dwa częściowe ludzkie cDNA SOM175 z biblioteki A2058 linii ludzkich komórek czerniaka λ GT11 (Clontech). Selekcjonowanie biblioteki przeprowadzono stosując warunki hybrydyzacji opisane przez Churcha i Gilberta (1994). w każdym przypadku sondę wytwarzano przez przypadkowe znaczenie produktu PCR pochodzącego z SOM175 (18f-700r).Two partial human SOM175 cDNAs were also isolated from the A2058 library of the human λ GT11 melanoma cell line (Clontech). Library selection was performed using the hybridization conditions described by Church and Gilbert (1994). in each case, the probe was generated by random spotting of the PCR product derived from SOM175 (18f-700r).
Mysie klony cDNAMouse cDNA clones
Ludzki SOM175 zastosowano także do selekcjonowania biblioteki cDNA z całego mózgu nowo narodzonych myszy (Unizap, Stratagene). Wydzielono 4 niechimeryczne klony: M175-A, B, C i D. Wszystkie klony stanowiły częściowe cDNA, a M175-C zawierał szereg intronów. 3 spośród tych cDNA nie zawierały egzonu 6.Human SOM175 was also used to select a whole brain cDNA library from newborn mice (Unizap, Stratagene). 4 nonchimeric clones were isolated: M175-A, B, C and D. All clones were partial cDNAs and M175-C contained several introns. 3 of these cDNAs did not contain exon 6.
Inny klon oznaczony jako Ml poddano pełnemu sekwencjonowaniu stwierdzając, że zawiera on pełną otwartą ramkę odczytu oraz część 5'utr i cały 3'utr.Another clone, designated M1, was fully sequenced and found to contain a complete open reading frame and a 5'utr part and all 3'utr.
Przykład 2. Analiza sekwencji DNAExample 2. DNA sequence analysis
Pełną sekwencję cDNA klonu (SOM175) złożono i pokazano na fig. 2 wraz z odpowiednią sekwencją aminokwasów. Sekwencję tą przeszukiwano w celu znalezienia otwartych ramek odczytu z wykorzystaniem programu MAP (GCG, University of Wisconsin). Zaobserwowano pojedynczą otwartą ramkę odczytu o 672 bp (fig. 2). Okazało się, że zawiera ona niewielkie 5'-nietranslowane sekwencje (2 bp). Okazało się, że obszar 3'-nietranslowany jest kompletny, gdyż zawiera on sygnał poliadenylowania i ogon poli-A.The complete cDNA sequence of the clone (SOM175) was assembled and shown in Figure 2 along with the corresponding amino acid sequence. This sequence was searched for open reading frames using the MAP program (GCG, University of Wisconsin). A single open reading frame of 672 bp was observed (Fig. 2). It turned out to contain small 5'-untranslated sequences (2 bp). The 3'-untranslated region was found to be complete as it contains the polyadenylation signal and the poly-A tail.
Poszukiwania homologii w bazie danych przeprowadzono z wykorzystaniem algorytmu BLAST (wykonane w NCBI, USA). Analiza potwierdziła homologię z szeregiem ludzkich form VEGF (patrz fig. 3). Stopień homologii pomiędzy SOM175 i ludzkim VEGF165 ustalono z wykorzystaniem programu BESTFIT (CGC, University of Wisconsin, patrz fig. 4 i 5). Oszacowano, że homologia nukleotydów wynosi 69,7%, a homologię białka oceniono jako 33,3% identyczności i 52,5% zachowania przy wykorzystaniu analizy BESTFIT. Analiza BLAst sekwencji nukleotydowych potwierdziła prawie pełne dopasowanie z ludzką eksprymowaną sekwencją tag EST06302 (Adams i inni, 1993).Database homology searches were performed using the BLAST algorithm (performed at NCBI, USA). The analysis confirmed homology with a number of human VEGF forms (see Figure 3). The degree of homology between SOM175 and human VEGF 165 was determined using the BESTFIT program (CGC, University of Wisconsin, see Figures 4 and 5). The nucleotide homology was estimated to be 69.7%, and the protein homology was assessed as 33.3% identity and 52.5% behavior using BESTFIT analysis. BLAst analysis of the nucleotide sequences confirmed an almost complete alignment with the human expressed EST06302 tag sequence (Adams et al., 1993).
Wyniki te wskazują, że SOM175 koduje czynnik wzrostu strukturalnie podobny do VEGF. Obydwa geny zawierają kodony startu i stopu w podobnych pozycjach oraz wykazują dyskretne bloki homologii. Zachowanych zostało wszystkie 8 cystein oraz szereg innych reszt VEGF, które, jak się uważa, odgrywają rolę w dimeryzacji. Do reszt tych należy cysteina-47, prolina-70, cysteina-72, walina-74, arginina-77, cysteina-78, glicyna-80, cysteina-81, cysteina-82, cysteina-89, prolina-91, cysteina-122 i cysteina-124, co pokazano na fig. 6. w związku z zachowaniem struktury w VEGF i produktach genowych SOM175 możliwe jest również, że wykazują one podobne działanie. Zakłada się, że SOM175 koduje cząsteczkę VEGF-podobną, która dzieli pewne właściwości z VEGF, ale również wykazuje swoiste unikatowe właściwości. Sekwencję nukleotydową i odpowiadającą jej sekwencję aminokwasów VEGF165 pokazano na fig. 1.These results indicate that SOM175 codes for a growth factor structurally similar to VEGF. Both genes contain start and stop codons at similar positions and show discrete blocks of homology. All 8 cysteines are preserved as well as a number of other VEGF residues believed to play a role in dimerization. These residues include cysteine-47, proline-70, cysteine-72, valine-74, arginine-77, cysteine-78, glycine-80, cysteine-81, cysteine-82, cysteine-89, proline-91, cysteine- 122 and cysteine-124, as shown in Figure 6, due to the retention of structure in VEGF and the SOM175 gene products, it is also possible that they show similar effects. SOM175 is assumed to encode a VEGF-like molecule that shares some properties with VEGF, but also exhibits specific unique properties. The nucleotide sequence and the corresponding amino acid sequence of VEGF1 65 are shown in Figure 1.
Przykład 3. Procent podobieństwa i różnicy pomiędzy rodziną VEGF165 i rodziną SOM175 (białka) zanalizowano z wykorzystaniem metody Clustala, oprogramowanie MegAlign, DNSTAR, Wisconsin. Wyniki przedstawiono w tabelach 2.1 i 2.2. Wariantowo składane formy SOM175 skrócono do SOM715-e6, w którym wycięto całość egzon 6; SOM715-e6 i 7,Example 3. Percentage similarity and difference between the VEGF1 65 family and the SOM175 family (proteins) was analyzed using the Clustal method, MegAlign software, DNSTAR, Wisconsin. The results are presented in Tables 2.1 and 2.2. The alternatively folded forms of SOM175 were shortened to SOM715-e6 in which the entirety of exon 6 was excised; SOM715-e6 and 7,
185 293 w których wycięto całość egzonów 6 i 7; oraz SOM175-e4, w którym wycięto całość egzonu 4. Złożoną formę SOM175 pokazano na fig. 7. Mapy ganomewa SOM175 z zaznaczonymi granicami int-on/egzon przedstawiono na fig. 8a i 8b.185,293 in which all exons 6 and 7 were cut out; and SOM175-e4, in which the entirety of exon 4 was cut out. The complex form of SOM175 is shown in Fig. 7. Ganomew maps of SOM175 with the int-on / exon boundaries marked are shown in Figs. 8a and 8b.
Tabela 2.1Table 2.1
A. Procent podobieństwa nukleotydów pomiędzy złożonymi wariantami SOM175 i ludzkim VEGF]65 A. Percentage of nucleotide similarity between composite SOM175 variants and human VEGF ] 65
B. Procent różnic w kuklaetydanh pomiędzy złożonymi wariantami SOM175 i ludzkim VEGFI65B. Percentage of differences in kuklaetydanh between complex SOM175 variants and human VEGF I6 5
Tabela 2.2Table 2.2
A. Procent identyczności aminokwasów pomiędzy złożonymi wariantami SOM175 i ludzkim VEGF165A. Percentage of amino acid identity between composite SOM175 variants and human VEGF 16 5
B. Procent różnic w aminokwasach pomiędzy złożonymi wariantami SOM175 i ludzkim VEGFI65B. Percentage of amino acid differences between composite SOM175 variants and human VEGF I6 5
Przykład 4. Testy biologiczne do wyznaczania działania SOM175Example 4. Bioassays to determine the activity of SOM175
Testy przeprowadzono w celu ocenienia, czy SOM175 wykazuje podobną aktywność jak VEGF w odniesieniu do działania komórek nabłonkowych, ang^e^zy i gojenia się ran. Inne testy przeprowadzono w oparciu o wyniki badań rozkładu wiązania receptorów.Assays were performed to evaluate whether SOM175 exhibited similar activity to VEGF with respect to epithelial cell function, angiogenesis and wound healing. Other tests were performed based on the results of receptor binding degradation studies.
185 293185 293
Test działania komórek nabłonkowychTest of epithelial cells
Proliferacja komórek nabłonkowych. Testy wzrostu komórek nabłonkowych opisali Ferrara i Henzel (1989) oraz Gospodarowicz i inni (1989).Epithelial cell proliferation. Epithelial cell growth tests are described by Ferrara and Henzel (1989) and Gospodarowicz et al. (1989).
Test przepuszczalności naczyń. Test ten, w którym wykorzystuje się test Milesa na świnkach morskich, przeprowadzono w sposób, który opisali Miles i Miles (1952).Vascular Permeability Test. This test, which uses the Miles guinea pig test, was performed as described by Miles and Miles (1952).
Test adhezji komórek. Zanalizowano wpływ SOM175 na adhezję polimorf do komórek nabłonkowych.Cell adhesion test. The effect of SOM175 on adhesion of polymorphs to epithelial cells was analyzed.
Chemitaksja. Wykonano ją stosując standardową komorę Boydena do testu chemotaksji.Chemitaxy. It was performed using a standard Boyden chamber for chemotaxis assay.
Test aktywatora plazminogenu. w komórkach nabłonkowych oznaczono aktywator plazminogenu oraz wytwarzanie inhibitora aktywatora plazminogenu po dodaniu SOM175 (Pepper i inni (1991)).Plasminogen activator test. in epithelial cells the plasminogen activator and the production of the plasminogen activator inhibitor were determined after the addition of SOM175 (Pepper et al (1991)).
Test migracji komórek nabłonkowych. Zdolność SOM175 do pobudzania migracji komórek nabłonkowych i tworzenia cew zbadano w sposób opisany przez Montesano i innych (1986).Epithelial cell migration test. The ability of SOM175 to promote epithelial cell migration and tubular formation was investigated as described by Montesano et al (1986).
Test angiogenezyAngiogenesis test
Wywoływanie przez SOM175 reakcji angiogenicznej w błonie kosmówki omoczniowej pisklęcia zbadano w sposób, który opisali Leung i inni (1989).The induction of an angiogenic reaction by SOM175 in a hatchling chorionic membrane was investigated as described by Leung et al. (1989).
Ewentualne działanie neurotroficzne SOM175 oceniono z wykorzystaniem następujących testów:The possible neurotrophic effects of SOM175 were assessed using the following tests:
Ocena przerostu neurytów i indukcji genu (komórki C12)Assessment of neurite hypertrophy and gene induction (C12 cells)
Komórki P12 (linia komórek barwiaka chromochłonnego) reagują na NGF i inne czynniki neurotroficzne rozwijając charakterystyczne współczulne neurony obejmujące indukcję wczesnych i późnych genów oraz wydłużanie neurytów. Komórki wystawiono na działanie SOM175, po czym śledzono ich reakcję (Drinkwater i inni (1991) oraz Drinkwater i inni (1993)).P12 cells (phaeochromocytoma cell line) respond to NGF and other neurotrophic factors by developing characteristic sympathetic neurons including early and late gene induction and neurite extension. The cells were exposed to SOM175 and their reaction was followed (Drinkwater et al. (1991) and Drinkwater et al. (1993)).
Hodowane neurony z obwodowego układu nerwowego (PNS)Cultured neurons from the peripheral nervous system (PNS)
Pierwotne hodowle następujących neuronów PNS wystawiono na działanie SOM175, po czym prowadzono monitoring w celu wykrycia ewentualnych reakcji:Primary cultures of the following PNS neurons were exposed to SOM175 and monitored for possible reactions:
- neurony czuciowe ze zwojów nerwowych grzebienia i korzenia tylnego- sensory neurons from the ganglia of the crest and the posterior root
- neurony współczulne z współczulnych zwojów łańcuchowych- sympathetic neurons from sympathetic chain ganglia
- pochodzące z plakody neurony czuciowe ze zwoju dolnego nerwu błędnego- posterior sensory neurons from the lower vagal ganglion
- neurony ruchowe z rdzenia kręgowego.- motor neurons from the spinal cord.
Testy te opisali Suter i inni (1992) oraz Marinou i inni (1992).These tests are described by Suter et al. (1992) and Marinou et al. (1992).
Gdy obserwuje się reakcję in vitro, przeprowadza się testy in vivo w celu określenia w/aściwości takich jak wychwyt i transport wsteczny, w sposób opisany przez Hendry'ego i innych (1992).When an in vitro reaction is observed, in vivo tests are performed to determine properties such as uptake and retrograde transport as described by Hendry et al. (1992).
Regeneracja nerwu (PNS)Nerve regeneration (PNS)
Gdy obserwuje się działanie neutrotroficzne SOM175, jego ewentualną rolę w regeneracji aksonotmezowanych neuronów czuciowych, neuronów współczulnych i neuronów ruchowych analizuje się metodami, które opisali Otto i inni (1989), Yip i inni (1984) oraz Hendry i inni (1976).When the neutrotrophic effect of SOM175 is observed, its possible role in the regeneration of axonotrophied sensory neurons, sympathetic neurons, and motor neurons are analyzed by the methods described by Otto et al. (1989), Yip et al. (1984) and Hendry et al. (1976).
Działanie SOM175 na neurony CNSAction of SOM175 on CNS neurons
Zdolność SOM175 do podtrzymywania przeżycia neuronów ośrodkowego układu nerwowego analizuje się sposobami, które opisali Hagg i inni (1992), Williams i inni (1986), Hefti (1986) oraz Kromer (1987).The ability of SOM175 to support the survival of central nervous system neurons is analyzed by the methods described by Hagg et al. (1992), Williams et al. (1986), Hefti (1986), and Kromer (1987).
Gojenie się ranWound healing
Zdolność SOM175 do podtrzymywania gojenia się ran bada się na dostępnych modelach o największej wiarygodności klinicznej, jako to opisali Schilling i inni (1959), a zastosowali Hunt i inni (1967).The ability of SOM175 to support wound healing is tested with the most reliable models available as described by Schilling et al (1959) and used by Hunt et al (1967).
Układ hemopoetycznyThe hemopoietic system
Dostępne są różne testy in vitro i in vivo na określonych populacjach układu hemopoetycznego, które wymieniono poniżej:Various in vitro and in vivo tests are available on specific populations of the haemopoietic system, which are listed below:
185 293185 293
Test na komórkach macierzystych układu krwiotwórczegoHematopoietic stem cell test
Test na myszach. Opracowano szereg testów in vitro dla mysich komórek macierzystych układu krwiotwórczego z wykorzystaniem komórek oczyszczonych metodą FACS:Mice test. A series of in vitro tests were developed for murine haematopoietic stem cells using FACS purified cells:
(a) Repopulacja mysich komórek macierzystych układu krwiotwórczego(a) Repopulation of mouse haematopoietic progenitor cells
Są to komórki zdolne do repopulacji w szpiku kostnym myszy napromieniowanych śmiertelną dawką, wykazujące fenotyp Lin', Rhhl, Ly-6A/E+, c-kit+. Ocenia się działanie na te komórki samej badanej substancji lub prowadzi się inkubację z wieloma czynnikami, po czym mierzy się proliferację komórek na podstawie wbudowywania 3H tymidyny.These are cells capable of repopulation in the bone marrow of mice irradiated with a lethal dose, showing the Lin ', Rh hl , Ly-6A / E + , c-kit + phenotype. It is estimated effects on the cells of the test substance itself, or by incubation with multiple factors, and cell proliferation is measured by incorporation of 3 H thymidine.
(b) Komórki macierzyste układu krwiotwórczego późnego stadium(b) Late stage hematopoietic stem cells
Są to komórki wykazujące stosunkowo niewielką zdolność do repopulacji w szpiku kostnym, które jednak mogą wytwarzać D13 CFU-S. Są to komórki o fenotypie Lin', Rhhl, Ly6A/E + c-kit+. Badaną substancję inkubuje się z tymi komórkami przez pewien okres, po czym wstrzykuje się biorcom napromieniowanym śmiertelną dawką i określa się liczbę kolonii Dl 3 śledziony.These are cells that show a relatively low ability to repopulate in the bone marrow, but can produce D13 CFU-S. These are cells with the Lin ', Rh hl , Ly6A / E + c-kit + phenotype. The substance to be tested is incubated with these cells for a certain period, after which it is injected into recipients irradiated with a lethal dose and the number of spleen D13 colonies is determined.
(c) Komórki wzbogacone w przodka bezpośredniego(c) Cells enriched in direct ancestry
Są to komórki, które reagują in vitro na pojedyncze czynniki wzrostu, o fenotypie Lin-, Rh111, Ly-6A/E+, c-kit+. Test ten wykazuje, czy SOM175 może oddziaływać bezpośrednio na hemopoetyczne komórki rodzicielskie. Badaną substancję inkubuje się z komórkami w agarze, a po 7-14 dniach określa się liczbę kolonii.These are cells that react in vitro to single growth factors, with the phenotype Lin-, Rh 111 , Ly-6A / E +, c-kit +. This test shows whether SOM175 can act directly on the haemopoietic parental cells. The substance to be tested is incubated with the cells in the agar and the number of colonies is determined after 7-14 days.
Miażdżyca tętnic. Komórki mięśni gładkich odgrywają kluczową rolę w rozwoju lub zapoczątkowaniu miażdżycy tętnic, co wymaga zmiany ich fenotypu z kurczliwego w stan syntetyczny. Makrofagi, komórki nabłonkowe, limfocyty T i płytki krwi odgrywają rolę w rozwoju płytek miażdżycowych poprzez wpływ na wzrost modulowanie fenotypu komórki mięśni gładkich. Test in vitro, w którym mierzy się szybkość proliferacji i modulowanie fenotypu komórek mięśni gładkich w wielokomórkowym otoczeniu, wykorzystuje się do oceny wpływu SOM175 na komórki mięśni gładkich. W układzie wykorzystuje się zmodyfikowaną komorę Rose'a, w której różne typu komórek wysiewa się na przeciwległych szkiełkach nakrywkowych.Atherosclerosis. Smooth muscle cells play a key role in the development or initiation of atherosclerosis, requiring their phenotype to be changed from contractile to synthetic. Macrophages, epithelial cells, T cells, and platelets all play a role in the development of atherosclerotic plaques by increasing the modulation of the smooth muscle cell phenotype. An in vitro assay that measures the proliferation rate and modulation of the smooth muscle cell phenotype in a multicellular environment is used to evaluate the effect of SOM175 on smooth muscle cells. The system uses a modified Rose chamber in which different types of cells are seeded onto opposing coverslips.
Wpływ SOM175 na kości. Zdolność SOM175 do regulowania proliferacji osteoblastów ocenia się w sposób opisany przez Lowe’a i innych (1991). Jakikolwiek wpływ na resorpcję kości ocenia się w sposób opisany przez Lowe’a i innych (1991). Wpływ na migrację osteoblastów oraz zmiany w cząsteczkach wewnątrzkomórkowych (np. nagromadzanie cAMP. poziomy fosfatazy alkalicznej) analizuje się w sposób opisany przez Midy’ego i innych (1994).Effect of SOM175 on bones. The ability of SOM175 to regulate osteoblast proliferation is assessed as described by Lowe et al. (1991). Any effect on bone resorption is assessed as described by Lowe et al. (1991). The effects on osteoblast migration and changes in intracellular molecules (e.g., cAMP accumulation. Alkaline phosphatase levels) are analyzed as described by Midy et al. (1994).
Wpływ na komórki mięśni szkibletowych.Wpływ SOM175 na proliferację mioblastów i rozwój miotubuli określić można w sposób opisany przez Ewtona i innych (1980) oraz Gospodarowicza i innych (1976).Effect on the cells of the skeletal muscle The effect of SOM175 on myoblast proliferation and myotubule development can be determined as described by Ewton et al (1980) and Gospodarowicz et al (1976).
Przykład 5. Klonowanie mysiego DNA VEGFExample 5. Cloning of murine VEGF DNA
Wydzielanie cDNA. Mysie klony VRF (mVRF) wybrano biblioteki cDNA z całego mózgu noworodków /.zap (Stratagene). Pierwotne fagi z filtrów o wysokiej gęstości (5 x 104 pfu/płytkę) zidentyfikowano na drodze hybrydyzacji z 32P-znaczoną sondą o 628 bp wytworzoną w PCR z cDNA hVRF (pSOM175) w sposób opisany powyżej. Hybrydyzację i przemywanie z określoną ostrością membran poliamidowych (Hybond-N) prowadzono w 65°C w warunkach opisanych przez Churcha i Gilberta (1984). Dodatnie łysinki wyizolowano, oczyszczono i wycięto in vivo uzyskując kolonie bakteryjne zawierające klony cDNA w pBluescript SK-.Secretion of cDNA. Mouse VRF clones (mVRF) were selected from whole brain neonatal cDNA libraries / .zap (Stratagene). Primary phage from the high-density filters (5x10 4 pfu / plate) were identified by hybridization with a 32 P-labeled 628 bp probe made by PCR with the hVRF cDNA (pSOM175) as described above. Hybridization and stringency washing of the polyamide (Hybond-N) membranes were performed at 65 ° C under the conditions described by Church and Gilbert (1984). Positive plaques were isolated, purified and excised in vivo to yield bacterial colonies containing the cDNA clones in pBluescript SK-.
Wydzielanie klonów genomowych. Genomowe klony wydzielono z biblioteki mysiego szjZbpuSV/129 klonowanego w wektorze X Fix II (Stratagene). Filtry o wysokiej gęstości (5 x 104 pfu/filtr) selekcjonowano 32P-znaczoną sondą o 563 bp wytworzoną przez amplifikację PCR nukleotydowego obszaru 233-798 z cDNA mVRF (patrz fig. 9). Dodatnie klony zebrano tamponem i ponownie selekcjonowano z wykorzystaniem filtrów zawierających 400-800 pfu. Preparaty fagowe w dużej skali otrzymano z wykorzystaniem zestawu QUIAGEN X lub stosując oczyszczanie za pomocą ZnCl2 (Santos, 1991).Secretion of genomic clones. Genomic clones were isolated from the murine szjZbpuSV / 129 library cloned in the X Fix II vector (Stratagene). High density filters (5 x 10 4 pfu / filter) were selected 32 P-labeled 563 bp probe made by PCR amplification of the nucleotide 233-798 region of the cDNA mVRF (see Fig. 9). Positive clones were harvested with a tampon and re-selected using filters containing 400-800 pfu. Large scale phage preparations were obtained using the QUIAGEN X kit or by purification with ZnCl 2 (Santos, 1991).
185 293185 293
Sekweccjonowanie i analiza nukleotydów. cDNA sekwencjonowano w obydwu niciach z wykorzystaniem różnych opartych na wektorach i wewnętrznych starterów, stosując zestawy do sekwencjonowania z terminatorem barwnika, z Applied Biosystems, Incorporated (ABI), zgodnie ze specyfikacją producenta. Sekwencje analizowano w zautomatyzowanym aparacie DNA tequeneey Model 373A z ABI. Dopasowywanie homologii peptydów przeprowadzono z wykorzystaniem programu BESTFIT (GCG, Wisconsm).Sequencing and nucleotide analysis. cDNA was sequenced in both strands with a variety of vector-based and internal primers using dye terminator sequencing kits from Applied Biosystems, Incorporated (ABI) according to the manufacturer's specifications. Sequences were analyzed on a tequeneee Model 373A robotic DNA apparatus from ABI. Peptide homology matching was performed using the BESTFIT program (GCG, Wisconsm).
Identyfikacja granic ictrocu/egzocu. Identyfikację granic egzonu oraz obszarów flankujących przeprowadzono z wykorzystaniem PCR z mysim genomowym DNA lub z genomowymi klonami XX mVFR jako matrycami. Startery zastosowane w PCR do identyfikacji intronów pochodziły z sekwencji hVRF, a w celu umożliwienia potencjalnej hybrydyzacji błędnych sekwencji ludzko-mysich reakcję prowadzono w temperaturze o 5-10°C niższej od oszacowanej T Wszystkie produkty PCR rozdzielono pod względem wielkości na drodze elektroforezy na żelu agarozowym oraz oczyszczano na żelu z wykorzystaniem szybko wirujących kolumn QIAquick (Quiagen), a granice mtron/egzon sekwencjonowano bezpośrednio z tych produktów. Dodatkowo pewne połączenia składane sekwenejonowano z tubklonowanyeh genomowych fragmentów MVRF. Granice intron/egzon identyfikowano porównując cDNA z sekwencjami genomowego cDNA.Identification of ictroc / exot boundaries. Identification of exon boundaries and flanking areas was performed by PCR with mouse genomic DNA or with genomic XX mVFR clones as templates. The primers used in the PCR to identify introns were derived from the hVRF sequence, and to allow for potential hybridization of mismatched human-mouse sequences, the reaction was run at 5-10 ° C lower than the estimated T All PCR products were size separated by agarose gel electrophoresis and were gel purified using QIAquick fast spin columns (Quiagen) and mtron / exon boundaries were sequenced directly from these products. In addition, some splicing junctions were sequenced from tubcloned genomic MVRF fragments. Intron / exon boundaries were identified by comparing the cDNA with genomic cDNA sequences.
Analiza northern. Całkowity komórkowy RNA otrzymano z zestawu świeżych tkanek normalnych dorosłych myszy (mózg, nerki, wątroba, mięśnie) wykorzystując metodę Chomezyctki’ego i SacchRego (1987). 20 pg całkowitego RNA poddano elektroforezie, przeniesiono na membranę poliamidową (Hybond N, Amersham) i hybrydyzowano w zwykłych warunkach (Church i Gilbert, 1984). Filtry przemyto w 65°C w 0,1 x SsC (20 x SSC w 3M NaCl/O,3 M cytrynianie trisodowym), 0,1% SDS, po czym wykonano ekspozycję z błoną rentgenowską z ekranami intensyfikującymi, w -70°C przez 1-3 dni.Northern analysis. Total cellular RNA was obtained from a set of fresh tissues of normal adult mice (brain, kidney, liver, muscle) using the method of Chomezyctky and SacchRego (1987). 20 µg of total RNA was electrophoresed, transferred to a polyamide membrane (Hybond N, Amersham) and hybridized under standard conditions (Church and Gilbert, 1984). Filters were washed at 65 ° C in 0.1 × SsC (20 × SSC in 3M NaCl / O, 3M trisodium citrate), 0.1% SDS, followed by exposure to X-ray film with intensifying screens at -70 ° C for 1-3 days.
Charakterystyka cDNA mVRF, Mysie homologi mVRF wydzielono przez selekcjonowanie mysiej biblioteki cDNA klonem cDNA hVRF. Odzyskano 5 klonów o wielkościach w zakresie 0,8-1,5 kb, które następnie poddano sekwencjocowaniu. Sekwencje cDNA złożono uzyskując pełnej długości sekwencję cDNA o 1041 bp obejmującą całą otwartą ramkę odczytu (621 bp lub 564 bp, w zależności od postaci złożenia, patrz poniżej) oraz 3’ UTR (379 bp), a także 163 bp z 5' UTR (fig. 9).Characterization of the mVRF cDNA. Mouse mVRF homologues were isolated by selecting the murine cDNA library with the hVRF cDNA clone. 5 clones ranging in size from 0.8-1.5 kb were recovered and subsequently sequenced. The cDNA sequences were assembled to yield a full-length 1041 bp cDNA sequence spanning the entire open reading frame (621 bp or 564 bp, depending on assembly, see below) and a 3 'UTR (379 bp), and 163 bp of the 5' UTR ( Fig. 9).
Przewidywany kodon inicjacyjny pasował do pozycji kodonu startowego w hVRF. Inny kodon z ramki ATG zlokalizowano w pozycji -47, a dwa kodony terminacyjne zaobserwowano w górę (odpowiednio w pozycjach -9 i -33) oraz w ramce z domniemanym kodonem inicjacyjnym.The predicted initiation codon matched the position of the start codon in the hVRF. Another codon from the ATG frame was located at position -47, and two stop codons were observed upstream (at positions -9 and -33, respectively) and in-frame with the putative initiation codon.
Okazało się, że przewidywany N-końcowy peptyd sygnałowy z hVRF występuje w mVRF z 81% identyczności (aminokwasy 17/21). Oczekuje się, że rozszczepienie peptydu w mVRF wystąpi po reszcie 21 (fig. 10). Dane te sugerują, że dojrzały mVRF jest wydalany, w związku z czym nie wyklucza się, że może on działać jako czynnik wzrostu.It turned out that the predicted N-terminal signal peptide from hVRF is present in mVRF with 81% identity (amino acids 17/21). The peptide cleavage in mVRF is expected to occur after residue 21 (Figure 10). These data suggest that mature mVRF is excreted and therefore it is not excluded that it may act as a growth factor.
Podobnie jak w hVRF, dwie otwarte ramki odczytu (ORF) wykryto również w cDNA wydzielonych na drodze selekcjonowania biblioteki. Stwierdzono, że 4 lub 5 klonów stanowią klony przemiennie złożone, nie zawierające fragmentu o 101 bp, homologicznego z egzonem 6 w hVRF. Ustalono przewidywane sekwencje peptydowe dwóch izoform mVRF, dopasowując je następnie do odpowiednich izoform ludzkich (fig. 10).As in hVRF, two open reading frames (ORFs) were also detected in cDNAs isolated by library selection. 4 or 5 clones were found to be alternating clones lacking the 101 bp fragment homologous to exon 6 in hVRF. The predicted peptide sequences of the two mVRF isoforms were determined and then aligned with the corresponding human isoforms (Figure 10).
Informacja kodująca mVRF,86 zawiera ORF o 621 bp z sekwencjami kodującymi kończącymi się w pozycji +622, w kierunku końca egzonu 7 (fig. 9). Mniejsza informacja kodująca mVR^167 w rzeczywistości kończy się w dół od miejsca +622 TAG z uwagi na przesunięcie ramki spowodowane odszcze^^em egzonu 6 o 101 bp oraz wprowadzeniem kodonu stopu w pozycji +666, blisko początku egzonu 8 (fig. 9).The mVRF coding information 86 contains an ORF of 621 bp with the coding sequences ending at position +622, towards the end of exon 7 (Fig. 9). The smaller mVR ^ 167 coding information actually terminates downstream of the +622 TAG site due to the frame shift due to exon 6 ^^ emments by 101 bp and the introduction of a stop codon at position +666 near the start of exon 8 (Figure 9) .
Białko VRFj86 wykazuje silną homologię z aminową i środkową częścią VEGF, natomiast koniec karboksylowy jest zupełnie odmienny i jest wzbogacony w alaninę. mVRF]86 wykazuje te podobieństwa, a także zachowuje homologię z mVEGF na prawo do końca C (fig. 11). Ogólna homologia mYRF^ z hVRF167 obejmowała odpowiednio 85%The VRFj86 protein shows strong homology to the amine and middle parts of VEGF, while the carboxyl terminus is quite different and is enriched in alanine. mVRF ] 8 6 shares these similarities, and also retains homology from mVEGF to the right to the C-terminus (Figure 11). The overall homology of mYRF ^ with hVRF167 was 85%
185 293 identyczności i 92% podobieństwa (fig. 10). Natomiast homologia pomiędzy mVRF167 i VEGF (Breier i inni, 1992) obejmowała odpowiednio 49% identyczności i 71% podstawienia zachowawczych aminokwasów (fig. 11).185,293 identity and 92% similarity (Fig. 10). In contrast, the homology between mVRF1 67 and VEGF (Breier et al., 1992) comprised 49% identity and 71% conservative amino acid substitutions, respectively (Fig. 11).
Kanoniczny sygnał poliadenylowania kręgowców (AATAAA) (Bimstiel i inni, 1986) nie występował w cDNA mVRF, natomiast bardzo zbliżona sekwencja GATAAA występuje w podobnych pozycjach zarówno w mysim jak i w ludzkim cDNA VRF (fig. 9). Stwierdzono, że w przeciwieństwie do hVRF w mVRF znajduje się dinukleotydowa powtórka AC na samym końcu 3' w 3' UTR (pozycje nukleotydów 998 do 1011, fig. 9). Polimorfizm tego obszaru powtórkowego zaobserwowano w pewnych cDNA mVRF z liczbą dinukleotydów wahającą się od 7 do 11.The canonical vertebrate polyadenylation signal (AATAAA) (Bimstiel et al., 1986) was not present in the mVRF cDNA, while the very similar sequence of GATAAA is found at similar positions in both the mouse and human VRF cDNA (Figure 9). In contrast to hVRF, mVRF was found to have an AC dinucleotide repeat at the very 3 'end of the 3' UTR (nucleotide positions 998 to 1011, Figure 9). Polymorphism of this repeat region has been observed in certain mVRF cDNAs with dinucleotide numbers ranging from 7 to 11.
Genomowa charakterystyka mVRF, Granice intron/egzon (tabela 3) zmapowano z wykorzystaniem starterów, które flankują sekwencje homologiczne z odpowiednimi granicami hVRF. Introny I, III, IV oraz VI z mVRF (tabela 3, fig. 12) były mniejsze niż sekwencje intronowe hVRF. Pełną sekwencję genomową złożono z 5' UTR z mVRF do intronu VI, największego obszaru intronowego (2,2 kb), poddając sekwencjonowaniu zamplifikowane introny i klonowane genomowe części mVRF. Pomiędzy mVRF i hVRF występowała tylko jedna znacząca różnica 'w strukturze genomowej, polegająca na tym, że granica egzon 7/intron VI w mVRF była zlokalizowana o 10 bp bardziej w dół w stosunku do sekwencji cDNA, tak że egzon 7 w mVRF jest o 10 bp dłuższy od odpowiedniego egzonu w hVRF.Genomic characterization of mVRF. Intron / exon boundaries (Table 3) were mapped using primers that flank sequences homologous with the corresponding hVRF boundaries. The introns I, III, IV and VI of the mVRF (Table 3, Figure 12) were smaller than the hVRF intron sequences. The complete genomic sequence was assembled from the 5 'UTR from the mVRF to intron VI, the largest intron region (2.2 kb), by sequencing the amplified introns and cloned genomic portions of the mVRF. There was only one significant difference between mVRF and hVRF in the genomic structure that the exon 7 / intron VI boundary in mVRF was located 10 bp downstream of the cDNA sequence such that exon 7 in mVRF was 10 bp further downstream. bp longer than the corresponding exon in the hVRF.
Egzony 6 i 7 sąsiadują w mVRF, podobnie jak w ludzkim homologu. Silna homologia sekwencji egzonu 6 w mVRF i hVRF (fig. 10) sugeruje, że sekwencja ta nie stanowi zachowanej sekwencji intronowej, ale raczej koduje funkcyjną część izoformy VRF186.Exons 6 and 7 are adjacent to the mVRF, similar to the human homologue. The strong homology of the sequence of exon 6 and mVRF hVRF (Fig. 10) suggests that this sequence is not a retained intronic sequence but rather encodes a functional part VRF 18 6 isoforms.
Ogólna struktura intron/egzon jest zachowana w różnych elementach rodziny genu VEGF (VEGF, PIGH, hVRF) i z tego względu nie jest zaskoczeniem, że ogólna organizacja genomowa genu mVRF jest bardzo podobna do organizacji tych genów (fig. 12).The overall intron / exon structure is conserved in the various members of the VEGF gene family (VEGF, PIGH, hVRF) and therefore it is not surprising that the overall genomic organization of the mVRF gene is very similar to the organization of these genes (Figure 12).
Przeprowadzone wcześniej porównawcze mapowania wykazały, że obszar otaczający locus choroby ludzkich licznych nowotworów układu gruczołów hormonalnych typu 1 w chromosomie 19 jest synteniczny z bliskim segmentem mysiego chromosomu 19 (Rochelle i inni, 1992). w związku z tym, że twórcy wynalazku zmapowali gen hVRF w ludzkim locus MEN1 o 1 kb (patrz wyżej), jest bardzo prawdopodobne, że mysi gen VRF mapuje się w pobliżu centromeru chromosomu 19.Previously performed comparative mappings have shown that the area surrounding the human disease locus of numerous type 1 endocrine system tumors on chromosome 19 is synthetic with a close segment of the mouse chromosome 19 (Rochelle et al., 1992). since the inventors mapped the hVRF gene at the 1 kb human MEN1 locus (see above), it is very likely that the mouse VRF gene maps to the centromere of chromosome 19.
Badania ekspresji mVRF. Analiza northem RNA z tkanek dorosłej myszy (mięsień, serce, płuca i wątroba) wykazała, że ekspresja jest bardzo rozpowszechniona i objawia się przede wszystkim jako główne pasmo o wielkości około 1,3 kb (fig. 14). Różni się to w pewnym stopniu od układu obserwowanego w hVRF, gdzie zidentyfikowano dwa główne pasma o 2,0 i 5,5 kb we wszystkich badanych tkankach. Informacja mysia o 1,3 kb prawdopodobnie odpowiada krótszemu z ludzkich transkryptów, a odmienna jej wielkość jest najprawdopodobniej spowodowana różnicą w długości odpowiednich 5' UTR.Study of mVRF expression. Northem RNA analysis from adult mouse tissue (muscle, heart, lung and liver) showed that the expression is very widespread and manifests itself primarily as a major band of approximately 1.3 kb (Figure 14). This differs somewhat from that observed in hVRF, where two major bands of 2.0 and 5.5 kb were identified in all tissues examined. The 1.3 kb mouse information probably corresponds to the shorter of the human transcripts and the different size is most likely due to the difference in length of the respective 5 'UTRs.
Przykład 6. Ekspresja mysiego VEGF w nienarodzonych i narodzonych myszachExample 6. Expression of mouse VEGF in unborn and unborn mice
Zwierzęta. Ciężarne (n=4) i młode dorosłe (n-2) myszy (szczep wsobny C57, ALAB, Szwecja) uśmiercono dwutlenkiem węgla, po czym odpowiednie tkanki pobrano i zamrożono na pożywce. Tkanki trzymano w 70°C przed dalszym wykorzystaniem, w badaniach zastosowano myszy o dwóch różnych wiekach ciążowych: embrionalny dzień 8 *E8), 14 i E17.Animals. Pregnant (n = 4) and young adult (n-2) mice (C57 inbred, ALAB, Sweden) were sacrificed with carbon dioxide, then the appropriate tissues were harvested and frozen in medium. Tissues were kept at 70 ° C before further use, mice of two different gestational ages were used in the studies: embryonic day 8 * E8), 14 and E17.
Histochemia hybrydyzacji in situHistochemistry of in situ hybridization
Hybrydyzację in situ przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (Dagerlind i inni, 1992). w skrócie poprzeczne sekcje (14 pm) wycięto w kriostacie (Mierom, Niemcy), odmrożono na szkiełkach Probe-On (Fisher Scientific, USA) i przechowywano w zamkniętych czarnych pudełkach w -70°C aż do wykorzystania. Sekwencje syntetycznych 42-merowych oligonukleotydów komplementarnych z mRNA kodującym mVRF były następujące:In situ hybridization was performed as previously described (Dagerlind et al., 1992). briefly, transverse sections (14 µm) were cut in a cryostat (Mierom, Germany), thawed on Probe-On slides (Fisher Scientific, USA) and stored in closed black boxes at -70 ° C until use. The sequences of the synthetic 42-mer oligonucleotides complementary to the mRNA encoding the mVRF were as follows:
ACCACCACCTCCCTGGGCTGGCATGTGGCACGTGCATAAACG [SEQ ID nr 11] (komplementarna z nt 120-161) orazACCACCACCTCCCTGGGCTGGCATGTGGCACGTGCATAAACG [SEQ ID No. 11] (complementary to nt 120-161) and
AGTTGTTTGACCACATTGCCCATGAGTTCCATGCTCAGAGGC [SEQ ID nr 12]AGTTGTTTGACCACATTGCCCATGAGTTCCATGCTCAGAGGC [SEQ ID No. 12]
185 293 (komplementarna z nt 162-203). W celu wykrycia dwóch wariantowych składanych form użyto oligonukleotyd185 293 (complementary to nt 162-203). An oligonucleotide was used to detect the two variant folding forms
GATCCTGGGGCTGGAGTGGGATGGATGATGTCAGCTGG [SEQ ID nr 13] (komplementarna z ny xxx-xxx) orazGATCCTGGGGCTGGAGTGGGATGGATGATGTCAGCTGG [SEQ ID No.13] (complementary to ny xxx-xxx) and
GCGGGCAGAGGATCCTGGGGCTGTCTGGCCTCACAGCACT [SEQ ID nr 14]. Sondy znaczono na końcu 3' [tio]trifosforanem dezoksyadenozyny [35S] (NEN, USA) stosując terminalną transferazę dezoksynukleotydylową (IBI, USA), do uzyskania aktywności właściwej 7-10 x 108 impulsów na sekundę/pg, a następnie hybrydyzowano z sekcjami bez obróbki wstępnej przez 16-18 godzin w 42°C. Mieszanina hybrydyzacyjna zawierała 50% objęt. formamidu, 4 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl i 0,015 M cytrynian sodu), 1 x roztwór Denhardta (po 0,02% poliwinylopirolidonu, BSA i Ficollu), 1% objęt. sarkozylu (N-laurylosarkozyny, Sigma), 0,02 M bufor fosforanowy (pH 7,0), 10% wag./objęt. siarczanu dekstryny (Pharmacia, Szwecja), 250 pg/ml drożdżowego tRNA (Sigma), 500 pg/ml DNA ucieranego i zdenaturowanego cieplnie nasienia łososia oraz 200 mM ditiotreitol (DTT, LKB, Szwecja), w sekcjach kontrolnych specyficzność obydwu sond sprawdzano dodając 20-krotny nadmiar sondy nieznaczonej do mieszaniny hybrydyzacyjnej. Dodatkowo sąsiednie sekcje hybrydyzowano z sondą nie spokrewnioną z sekcjami stosowanymi w tym badaniu, uzyskując odmienny układ ekspresji. Po hybrydyzacji sekcje przemywano szereg razy w 1 x SSC w 55°C, odwadniano etanolem i zanurzano w emulsji do wykrywania promieniotwórczości NTB2 (Kodak, USA). Po 3-5 tygodniach sekcje wywoływano w wywoływaczu D-19 (Kodak, USA) i nakrywano szkiełkiem przykrywkowym, w pewnych przypadkach sekcje nanoszono na błonę autoradiograficzną (błoną do autoradiografii Beta-max z Amersham Ltd., W. Brytania) przed zanurzeniem w emulsji.GCGGGCAGAGGATCCTGGGGCTGTCTGGCCTCACAGCACT [SEQ ID No. 14]. The probes were labeled at the 3 'end [thio] triphosphate, deoxyadenosine [35 S] (NEN, USA) using terminal deoxynucleotidyl transferase (IBI, USA) to a specific activity of 7-10 x 10 8 pulses per second / pg, and then hybridized with sections without pretreatment for 16-18 hours at 42 ° C. The hybridization mixture was 50 vol. formamide, 4 x SSC (1 x SSC = 0.15 M NaCl and 0.015 M sodium citrate), 1 x Denhardt's solution (0.02% polyvinylpyrrolidone, BSA and Ficoll each), 1 vol. sarcosyl (N-lauryl sarcosine, Sigma), 0.02 M phosphate buffer (pH 7.0), 10% w / v. dextrin sulfate (Pharmacia, Sweden), 250 pg / ml yeast tRNA (Sigma), 500 pg / ml DNA of grated and heat denatured salmon semen and 200 mM dithiothreitol (DTT, LKB, Sweden), in the control sections the specificity of both probes was checked by adding 20 - fold excess of unlabelled probe to the hybridization mixture. In addition, adjacent sections were hybridized with a probe unrelated to the sections used in this study, resulting in a different expression pattern. After hybridization, the sections were washed several times in 1x SSC at 55 ° C, dehydrated with ethanol and immersed in an emulsion for detection of NTB2 radioactivity (Kodak, USA). After 3-5 weeks, sections were developed in a D-19 developer (Kodak, USA) and covered with a coverslip, in some cases sections were streaked onto an autoradiographic film (Beta-max autoradiography film from Amersham Ltd., UK) prior to immersion in the emulsion .
różne sondy dały identyczne obrazy hybrydyzacyjne we wszystkich badanych tkankach. Ekspresję mysiego VRF wykryto już w embrionie E8, w którym dodatni sygnał zarejestrowano nad strukturą najprawdopodobniej odpowiadającą cewie nerwowej, w sekcjach strzałkowych mysiego embriona E14 najsilniejszy sygnał hybrydyzacji występował nad sercem i w układzie nerwowym, zwłaszcza w korze mózgowej (fig. 14A). Niski poziom ekspresji występował we wszystkich innych tkankach, w późniejszym wieku ciążowym, E17, wysoki sygnał mRNA mVRF przypisano sercu i brunatnej tkance tłuszczowej w grzbiecie i wokół szyi (fig. 14B). Wyraźne dodatnie sygnały hybrydyzacji występowały w istocie szarej rdzenia kręgowego oraz w języku (fig. 14B). Ekspresja w korze mózgowej była wyraźnie słabsza niż w dniu 14. Słaba ekspresja tła obserwowana u embriona E14, np. w mięśniu, w tym wieku ciążowym uległa osłabieniu. Silny sygnał hybrydyzacji mRNA mVRF u młodych dorosłych myszy występował jedynie nad sercem i w brunatnej tkance tłuszczowej (fig. 14C). Sygnał nad sercem był równomiernie rozmieszczony na całej ściance przedsionka, w tym na mięśniach brodawkowych (fig. 14D). W sekcjach tkanki sercowej hybrydyzowanej z nadmiarem zimnej sondy nie wykryto swoistego znakowania ponad poziomem tła (fig. 14E).different probes gave identical hybridization images in all examined tissues. The expression of mouse VRF was already detected in embryo E8, in which a positive signal was recorded over the structure most likely corresponding to the neural tube, in the sagittal sections of the mouse embryo E14 the strongest hybridization signal was found over the heart and in the nervous system, especially in the cerebral cortex (Fig. 14A). Low expression levels were found in all other tissues, in later gestational age, E17, high mVRF mRNA signal was attributed to the heart and brown adipose tissue in the back and around the neck (Fig. 14B). Clearly positive hybridization signals were present in the gray matter of the spinal cord and in the tongue (Fig. 14B). Expression in the cerebral cortex was clearly weaker than on day 14. The weak background expression observed in embryo E14, eg in muscle, decreased at this gestational age. The strong mRNA hybridization signal of mVRF in young adult mice was present only over the heart and in brown adipose tissue (Fig. 14C). The signal above the heart was evenly distributed throughout the wall of the atrium, including the papillary muscles (Fig. 14D). No specific labeling above background level was detected in sections of cardiac tissue hybridized with an excess of cold probe (Fig. 14E).
Poza sercem sygnał mRNA mVRF występował w pewnych tkankach na zewnątrz klatki piersiowej, morfologicznie przypominających brunatny tłuszcz. Potwierdzono to na podstawie przeciwbarwienia czernią sudańską, które wykazało silne zabarwienie w tych samych obszarach (fig. 15A i 15B). w poprzecznych sekcjach rdzenia kręgowego dorosłej myszy sondy mVRF uwidaczniają neuronalny układ barwienia nad istotą szarą (fig. 15C). Przeciwbarwienie toluidyną (fig. 15D) wykazało, że neurony ruchowe w rogu brzusznym (fig. 15C i 15D), neurony wstawkowe (fig. 15C) w głębokiej części rogu grzbietowego oraz wokół kanału centralnego (nie pokazano) były silnie dodatnie w stosunku do mRNA mVRF.Outside the heart, mVRF mRNA signal was present in certain tissues outside the chest which morphologically resemble brown fat. This was confirmed by counterstaining with Sudan Black, which showed strong staining in the same areas (Figures 15A and 15B). in the transverse sections of the spinal cord of an adult mouse, mVRF probes show a neural pattern of staining above the gray matter (Fig. 15C). Toluidine counterstaining (Fig. 15D) showed that motor neurons in the ventral horn (Figs. 15C and 15D), insertion neurons (Fig. 15C) in the deep dorsal horn and around the central canal (not shown) were strongly positive for mRNA. mVRF.
Przykład 7. Wpływ białek VEGF i SOM175 na neurony czuciowe kurczęciaExample 7. Effect of VEGF and SOM175 proteins on chicken sensory neurons
Wpływ białek VEGF i SOM175 na neurony czuciowe 8-dniowego embriona kurczęcia określono z wykorzystaniem metody Nurcombre’a i innych (1992). Test neuronalny odczytywano po 48 godzinach stosując 2000 komórek/studzienkę. Wyniki uzyskano przez zliczanie 3H-tymidyny. Procent przeżycia neuronów, przerost neurytów oraz średnią długośćThe effect of VEGF and SOM175 proteins on the sensory neurons of an 8-day-old chicken embryo was determined using the method of Nurcombre et al. (1992). The neuronal test was read after 48 hours using 2000 cells / well. Results were obtained by counting 3 H-thymidine. Percentage of neuron survival, neurite outgrowth, and average length
185 293 neurytów w pm wyznaczono stosując NGF jako dodatnią próbę kontrolną oraz VEGF w różnych stężeniach, VEGF wo becności heparyny i VEGF wo beckości heparyny i 5 pM 5'-fluoroureeylu (5FU). 5FU zabija komórki glejowe.185,293 neurites in pm were determined using NGF as a positive control and VEGF at various concentrations, VEGF in the presence of heparin and VEGF in the absence of heparin and 5 pM 5'-fluoroureeyl (5FU). 5FU kills the glial cells.
Wyniki przedstawiono na fig. 16. Wyniki te wskazują, że VEGF skutecznie podtrzymuje przetrwanie neuronów, z tym że wymaga to obecności komórek glejowych. Na fig. 17 przedstawiono wyniki wpływu VEGF i SOM175 na 3 typy gleju kurczaka. Zbadano gleje CNS, gleje obwodowe i oligodendrocyty CNS. Heparynę zastosowano w stężeniu 10 pg/ml we wszystkich hodowlach, a test odczytywano po 24 godzinach. Wyniki oznaczano jako zliczenia 3H-tymidyny stosując 2000 komórek/studzienkę.The results are shown in Figure 16. These results indicate that VEGF is effective in maintaining neuronal survival, however, it requires the presence of glial cells. Fig. 17 shows the results of the effects of VEGF and SOM175 on 3 types of chicken glial. CNS glias, peripheral glazes and CNS oligodendrocytes were examined. Heparin was used at a concentration of 10 pg / ml in all cultures, and the test was read after 24 hours. Results were determined as counts 3 H-thymidine incorporation using a 2000 cells / well.
Wyniki wskazują, że dla ośrodkowych i obwodowych neuronów kurczaka proliferacja astroglaju była znacząco pobudzana przez SOM175 wo becności heparyny, natomiast dla oligodakdronytów kurczaka zaobserwowano minimalny wzrost szybkości podziału.The results indicated that for central and peripheral chicken neurons, astroglia proliferation was significantly stimulated by SOM175 in the presence of heparin, while for chicken oligodacdronites a minimal increase in the rate of division was observed.
Przykład 8. Wpływ białek SOM175 na neurony główne i ośrodkoweExample 8. Effect of SOM175 proteins on major and central neurons
Wyniki uzyskane w przykładzie 7 wskazują, że izoforma VEGF wywiera wpływ na główne i ośrodkowe neurony kurczaka poprzez oddziaływanie na komórki astroglejowe. Podobne doświadczenia powtórzono na komórkach mysich.The results obtained in Example 7 indicate that the VEGF isoform exerts an effect on major and central chicken neurons by acting on astroglial cells. Similar experiments were repeated on mouse cells.
Warunki hodowliBreeding conditions
Komórki naurokalna i glejowe do wszystkich doświadczeń in vitro preparowano i hodowano zgodnie z technikami opisanymi w „Methods in Neurosniannes (Vol. 2): Cell Culture”, red. P.M. Conn, Academin Press, San Diego, 1990, str. 33-46 dla komórek astroglejowych, str. 56-74 dla komórek oligodendroglejowych oraz 87-102 dla neuronów ośrodkowych.The neurocal and glial cells for all in vitro experiments were prepared and cultured according to the techniques described in "Methods in Neurosniannes (Vol. 2): Cell Culture", edited by P.M. Conn, Academin Press, San Diego, 1990, pp. 33-46 for astroglial cells, pp. 56-74 for oligodendroglial cells and 87-102 for central neurons.
Komórki wysiano na 24-studziekkowynh płytkach do hodowli (Nunc) powleczonych poli-L-óluityką (0,1 mg/ml, 1 godzina) w ilości 2000 komórek/studzienkę. Po hodowaniu przez 48 godzin neurony zliczono w studzienkach z wykorzystaniem światła z odwróconą faza, stosując dobrze znane techniki (Maruta i inni, 1993), a komórki glejowe oszacowano na podstawie wchłaniania [3H]tymidyny, w celu monitorowania szybkości podziału komórek, jak to opisano poniżej. Heparyna (10 pg/ml, frakcja o niskim ciężarze cząsteczkowym. Sigma Chemical Corp.) była obecna w hodowli we wszystkich przypadkach z zaznaczonymi wyjątkami. Hodowle keurokalna uzupełniono 5 mM 5-fluoro-2-dezoksyurydyną (Sigma) w celu zahamowania wzrostu gleju stanowiącego tło.Cells were seeded in 24-well culture plates (Nunc) coated with poly-L-ammonium (0.1 mg / ml, 1 hour) at 2000 cells / well. After culturing for 48 hours, neurons were counted in the wells using reverse phase light using well known techniques (Maruta et al., 1993), and glial cells were assessed by [3 H] thymidine uptake to monitor the rate of cell division as described. below. Heparin (10 pg / ml, low molecular weight fraction. Sigma Chemical Corp.) was present in the culture in all cases with the exceptions noted. Keurocal cultures were supplemented with 5 mM 5-fluoro-2-deoxyuridine (Sigma) to inhibit background glial growth.
Badanie wpływu wprowadzania 3H-tymidyny na proliferację komórek glejowychStudy of the influence of 3H-thymidine introduction on the proliferation of glial cells
Komórki pulsacyjnie zasilano przez 14 godzin 3H-tymidyną (aktywność właściwa 103 pCi/pg) w postaci podstawowego roztworu o stężeniu 0,1 mCi/ml w standardowym ośrodku, uzyskując końcową objętość inkubacyjną 20 pl/studzienkę. Zawartość studzienek zbierano i absorbowano na papierze nitrocelulozowym (Titertek, Flow). Pozostające przyklejone komórki usuwano przez 5-mikutówą inkubację z trypsyną/wersekem (CLS Limited, Victoria, Australia). Procedurę tą powtarzano dwukrotnie. Krążki z nitrocelulozy przemywano w standardowym aparacie do zbierania komórek Titertek (Flow) stosując najpierw wodę destylowan<ą a następnie metanol. Krążki nitrocelulozowe suszono, dodawano płyn scyntylacyjny (zawierający 5% objęt. środka Triton-N) i krążki zliczano w liczniku scyntylacyjnym.Cells were pulsed for 14 hours with 3H-thymidine (specific activity 103 pCi / µg) as a stock solution at 0.1 mCi / ml in standard medium, resulting in a final incubation volume of 20 µl / well. The contents of the wells were collected and absorbed onto nitrocellulose paper (Titertek, Flow). Remaining stuck cells were removed by 5-minute incubation with trypsin / verse (CLS Limited, Victoria, Australia). This procedure was repeated twice. The nitrocellulose discs were washed in a standard Titertek cell harvester (Flow) using first distilled water and then methanol. The nitrocellulose discs were dried, scintillation fluid (containing 5% v / v of Triton-N agent) was added and the discs were counted in a scintillation counter.
Największą aktywność zaobserwowano dla preparatów SOM175 bez egzonu 6 SOMaX6 w hodowlach mysich komórek astroglej owych, gdzie wystąpiło znaczące pobudzenie ich proliferacji przy zastosowaniu preparatów w połączeniu z heparyną (fig. 16). Niewielkie pobudzanie proliferacji wystąpiło w przypadku komórek oligodendroglejowych (fig. 17), oraz bardzo mało wyróżniające się wzmocnienie przetrwania izolowanych neuronów przedmózgowia (fig. 18). Odchylenie standardowe na wszystkich trzech wykresach dla każdego punktu wynosiło poniżej 8%.The greatest activity was observed for the SOM175 preparations without exon 6 of SOMaX6 in cultures of murine astroglial cells, where there was a significant stimulation of their proliferation when using the preparations in combination with heparin (Fig. 16). There was little stimulation of proliferation with oligodendroglial cells (Fig. 17), and very little enhancement of survival of isolated forebrain neurons (Fig. 18). Standard deviation in all three graphs for each point was less than 8%.
Żywotność neuronów można utrzymać pobudzając proliferację komórek glejowych. Ponadto SOMAX6 stanowi dobry środek indukujący proliferację astrogleju i może być eksprymoweeky w połączeniu z powstawaniem astroglejowych stopek końcowych na komórkach nabłonkowych ośrodkowego układu karuΌwego.The viability of neurons can be maintained by promoting the proliferation of glial cells. Furthermore, SOMAX6 is a good inducer of astroglial proliferation and can be expressed in conjunction with the formation of astroglial end plates on the epithelial cells of the central carousal system.
185 293185 293
Dla specjalistów zrozumiałe jest, że w opisanym wynalazku dokonać można zmian i modyfikacji innych niż konkretnie opisane. Należy zdawać sobie sprawę, że wynalazek obejmuje wszystkie takie zmiany i modyfikacje. Wynalazek obejmuje również swym zakresem wszystkie etapy, cechy, kompozycje i związki przywołane lub zaznaczone w opisie, pojedynczo lub łącznie, a także każdą oraz wszystkie kombinacje dwóch lub więcej takich etapów lub cech.It will be understood by those skilled in the art that changes and modifications other than those specifically described may be made to the described invention. It should be understood that all such changes and modifications are included in the invention. The invention also includes within its scope all of the steps, features, compositions and compounds referred to or indicated in the specification, individually or in combination, and each and all combinations of two or more of such steps or features.
Tabela 3Table 3
Połączenia składane, mysiego genu VRFSplice junctions of the mouse VRF gene
Duże i małe litery oznaczają odpowiednio sekwencje egzonowe i intronowe * Oznacza, że koniec 5' egzonu 1 nie został jeszcze ustalony.Uppercase and lowercase letters represent exon and intron sequences respectively. * Indicates that the 5 'end of exon 1 has not yet been determined.
185 293185 293
BibliografiaBibliography
Adams MD, Soares MB, Kerlavage· AR, Fields C, Venter JC, (1993) Nature Genet. 4,Adams MD, Soares MB, Kerlavage AR, Fields C, Venter JC, (1993) Nature Genet. 4,
373-380.373-380.
Bimstiel ML, Busslinger M and Strub K (1985) Cell 41, 349-359.Bimstiel ML, Busslinger M and Strub K (1985) Cell 41, 349-359.
Breier G, Albrecht U, Sterrer S and Risau W (1992) Development 114, 521-532.Breier G, Albrecht U, Sterrer S and Risau W (1992) Development 114, 521-532.
Chomczynski P and Sacchi N (1987) Analyt. Błochem. 162, 156-159.Chomczynski P and Sacchi N (1987) Analyt. The mud. 162, 156-159.
Church G and Gilbert w (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 18, 1991-1995.Church G and Gilbert in (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 18, 1991-1995.
Dagerlind A, Friberg K. Bean AJ and Hokfelt T (1992) Histochemistry 98, 39-49.Dagerlind A, Friberg K. Bean AJ and Hokfelt T (1992) Histochemistry 98, 39-49.
Dissen GA, Lara HE, Fabrenbach WH, Costa ME, Ojeda SR, (1994) Endocrinology 134,Dissen GA, Lara HE, Fabrenbach WH, Costa ME, Ojeda SR, (1994) Endocrinology 134,
1146-1154.1146-1154.
Drinkwater CC, Barker PA, Suter U and Shooter EM (1993) J. Biol. Chem, 268,Drinkwater CC, Barker PA, Suter U and Shooter EM (1993) J. Biol. Chem, 268,
23202-23207.23202-23207.
Drinkwater CC, Suter U, Angst C and Shootar EM (1991) Proc:. Roy Soc. Lond. (Series B), 246,Drinkwater CC, Suter U, Angst C and Shootar EM (1991) Proc :. Roy Soc. Lond. (Series B), 246,
307-313.307-313.
Ewton DZ & Florini JR (1980) Endocrinology, 106: 577-583.Ewton DZ & Florini JR (1980) Endocrinology, 106: 577-583.
Ferrara N & Henzel WJ (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 161, 851-858. Folkman J & Shing Y (1992) J Biol. Chem. 267, 10931-10934.Ferrara N & Henzel WJ (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 161, 851-858. Folkman J & Shing Y (1992) J Biol. Chem. 267, 10931-10934.
Gospodarow^ D, Abraham JA & Schilling J (1989) Proc:. Natl. Acad. Sci USA 86,Gospodarow ^ D, Abraham JA & Schilling J (1989) Proc :. Natl. Acad. Sci USA 86,
7311-7315.7311-7315.
Gespodarowicz D, Weseman J, Morgan JS & Lindstrom J (1976) J. Cell Biol., 70:Gespodarowicz D, Weseman J, Morgan JS & Lindstrom J (1976) J. Cell Biol., 70:
395-405.395-405.
Hagg T. Quek D, Higaki J & Varon S (1992) Neuron, 8, 145-158.Hagg T. Quek D, Higaki J & Varon S (1992) Neuron, 8, 145-158.
Hefti S (1986) J. Neurosci, 6, 2155-2162.Hefti S (1986) J. Neurosci, 6, 2155-2162.
Hendry IA& Campbell J (1976) J. Neurocytol, 5, 351-360.Hendry IA & Campbell J (1976) J. Neurocytol, 5, 351-360.
Hendry IA, Murphy M, Hilton DJ, Nicola NA & Bartlett PF (1992) J. Neurosci. 12,Hendry IA, Murphy M, Hilton DJ, Nicola NA & Bartlett PF (1992) J. Neurosci. 12,
3427-3434.3427-3434.
Hunt et al., (1967) Am. J. Surgery, 114: 302-307.Hunt et al., (1967) Am. J. Surgery, 114: 302-307.
Koch AE, Harlow LA, Haines GK, Amento EP, Unemoti EN, Wong WL, Pope RM,Koch AE, Harlow LA, Haines GK, Amento EP, Unemoti EN, Wong WL, Pope RM,
Ferrara N, (1994)7. Immunol. 152, 4149-4156.Ferrara N, (1994) 7. Immunol. 152, 4149-4156.
Kromer AF (1987) Science, 235, 214-216.Kromer AF (1987) Science, 235, 214-216.
Larsson C, Weber G, Kvanta E, Lewis C, Janson M, Jones C, Glaser T, Evans G. Nordenskjold M, (1992) Hum. Genet. 89, 187-193.Larsson C, Weber G, Kvanta E, Lewis C, Janson M, Jones C, Glaser T, Evans G. Nordenskjold M, (1992) Hum. Genet. 89, 187-193.
OZUS Leung DW. Cachianes G, Kuang W-J. Goeddel DV & Ferrara N (1989) ScienceOZUS Leung DW. Cachianes G, Kuang W-J. Goeddel DV & Ferrara N (1989) Science
246:1306-1309.246: 1306-1309.
Lowe C, Cornish J, Callon K, Martin TJ & Reid IR (1991) J. Bone Mineral Res, 6.Lowe C, Cornish J, Callon K, Martin TJ & Reid IR (1991) J. Bone Mineral Res, 6.
1277-1283.1277-1283.
Lowe C, Cornish J, Martin TJ & Reid IR (1991) Calcif. Tissue Int., 49, 394-397. Martinou JC, Martinou I & Kato AC (1992) Neuron, 8, 737-744.Lowe C, Cornish J, Martin TJ & Reid IR (1991) Calcif. Tissue Int., 49, 394-397. Martinou JC, Martinou I & Kato AC (1992) Neuron, 8, 737-744.
Maruta et al (1993) Growth Factors 8: 119-134.Maruta et al (1993) Growth Factors 8: 119-134.
Midy V & Plouet J (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun, 199: 380-386.Midy V & Plouet J (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun, 199: 380-386.
Miles AA & Miles EM (1952) J Physiol. (Lond) 118: 228-257.Miles AA & Miles EM (1952) J Physiol. (Lond) 118: 228-257.
Montano R, Vassalli JD, Baird A, Guillamik R & Orci, L (1986) Proc. Natl. Acad.Montano R, Vassalli JD, Baird A, Guillamik R & Orci, L (1986) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 83, 7297-7301.Sci. USA, 83,7297-7301.
Nurcombe et al (1992) Development 116: 1175-1183.Nurcombe et al (1992) Development 116: 1175-1183.
Otto D., Frotscher M & Unsicker K (1989) J. Neurosci. Res., 22, 83-91.Otto D., Frotscher M & Unsicker K (1989) J. Neurosci. Res., 22, 83-91.
Pepper MS, Ferrara N, Orci L, Montesano R. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181,Pepper MS, Ferrara N, Orci L, Montesano R. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181,
902-906).902-906).
Rochell JM, Watson ML, Oakey RJ and Seldin MF (1992) Genomics 14, 26-31.Rochell JM, Watson ML, Oakey RJ and Seldin MF (1992) Genomics 14, 26-31.
Roth S & Weston J (1967) Proc. Natl. Acad. Sei USA, 58: 974-980.Roth S & Weston J (1967) Proc. Natl. Acad. Sei USA, 58: 974-980.
Sambrook J. Fritsch EF, Maniatis T, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd £i/.Cold Sppring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.Sambrook J. Fritsch EF, Maniatis T, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd £ and /. Cold Sppring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
Santos MA (1991) Nucleic Acids Res. 19, 5442.Santos MA (1991) Nucleic Acids Res. 19, 5442.
185 293185 293
Schilling et al, (1959) Surgery, 46: 702-710.Schilling et al, (1959) Surgery, 46: 702-710.
Senger DR, Van De Water L, Brown LF, Nagy JA, Yeo KT, Yeo TK, Berse B, Jackman RW, Dvorak AM, Dvorak HF (1993) Cancer Netastasis Rev. 12, 303-324.Senger DR, Van De Water L, Brown LF, Nagy JA, Yeo KT, Yeo TK, Berse B, Jackman RW, Dvorak AM, Dvorak HF (1993) Cancer Netastasis Rev. 12, 303-324.
Sharkey AM, Chamock-Jones DS, Boocock CA, Brown KD, Smith SK, (1993) J. Reprod. Fertil. 99, 609-615.Sharkey AM, Chamock-Jones DS, Boocock CA, Brown KD, Smith SK, (1993) J. Reprod. Fertil. 99, 609-615.
Sunderkotter C, Steinbrink K, Goebeler M, Bhardway R, Sorg E, (1993) J. Leukocyt, Biol. 55, 410-422.Sunderkotter C, Steinbrink K, Goebeler M, Bhardway R, Sorg E, (1993) J. Leukocyte, Biol. 55, 410-422.
Suter U, Angst C, Tien C-L, Drinkwater CC, Lindsay RM and Shooter EM (1992) J. Neurosci, 12, 306-318.Suter U, Angst C, Tien C-L, Drinkwater CC, Lindsay RM and Shooter EM (1992) J. Neurosci, 12, 306-318.
Tischer E, Mitchell R, Hartman T, Silva M, Gospodarowicz D. Fiddes JC, & Abraham J. (1991) J. Biol. Chem. 266, 11947-11954.Tischer E, Mitchell R, Hartman T, Silva M, Gospodarowicz D. Fiddes JC, & Abraham J. (1991) J. Biol. Chem. 266, 11947-11954.
Williams LR, Varon S, Peterson GM, Wictorin K, Fischer W, Bjorklund A & Gage FH (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9231-9235.Williams LR, Varon S, Peterson GM, Wictorin K, Fischer W, Bjorklund A & Gage FH (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9231-9235.
Yan Z, Weich HA, Bemart W, Breckwoldt M, Neulen J, (1993) J. Clin.. Endocrinol. Metab. 77, 1723-1725.Yan Z, Weich HA, Bemart W, Breckwoldt M, Neulen J, (1993) J. Clin. Endocrinol. Metab. 77, 1723-1725.
Yip NK, Rich KM, Lampe PA & Johnson EM Jr (1984) J. Neurosci., 4, 2986-2992.Yip NK, Rich KM, Lampe PA & Johnson EM Jr (1984) J. Neurosci., 4, 2986-2992.
185 293185 293
Zestawienie sekwencji (1) Informacje ogólne:Sequence overview (1) General information:
(1) Zgłaszający:(1) Applicants:
(kraje inne niż USA): AMRAD OPERATIONS PTY. LTD.(countries other than the US): AMRAD OPERATIONS PTY. LTD.
(tylko USA): N. Hayward, G. Weber (ii) Tytuł wynalazku: Nowy czynnik wzrostu i kodująca go sekwencja genetyczna (iii) Liczba sekwencji: 14 (iv) Adres do korespondencji:(USA only): N. Hayward, G. Weber (ii) Title of invention: New growth factor and its genetic sequence (iii) Number of sequences: 14 (iv) Correspondence address:
(A) Adresat: Davies Collison Cave (b) Ulica: 1 Little Collins Street (C) Miasto: Melbourne (D) Stan: Victoria (E) Państwo: Australia (F) Kod: 3000 (v) Postać odczytywana komputerowo:(A) Addressee: Davies Collison Cave (b) Street: 1 Little Collins Street (C) City: Melbourne (D) State: Victoria (E) Country: Australia (F) Code: 3000 (v) Computer-readable form:
(A) Nośnik: Dyskietka (b) Komputer: Kompatybilny z IBM PC (c) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (vi) Dane dotyczące niniejszego zgłoszenia:(A) Media: Floppy disk (b) Computer: IBM PC compatible (c) Operating system: PC-DOS / MS-DOS (D) Software: Patent Release # 1.0, Version # 1.25 (vi) Details of this application:
(A) Numer zgłoszenia: Międzynarodowe PCT (b) Data zgłoszenia: 22 lutego 1996 (vii) Dane dotyczące wcześniejszego zgłoszenia:(A) Filing Number: PCT International (b) Filing Date: February 22, 1996 (vii) Previous Filing Details:
(A) Numer zgłoszenia: AU PN 1457 (B) Data zgłoszenia: 2 marca 1995 (A) Numer zgłoszenia: AU PN6647 (B) Data zgłoszenia: 20 listopada 1995 (A) Numer zgłoszenia: AU PN7274 (B) Data zgłoszenia: 22 grudnia 1995 (viii) Informacja dotycząca pełnomocnika/rzecznika:(A) Filing number: AU PN 1457 (B) Filing date: March 2, 1995 (A) Filing number: AU PN6647 (B) Filing date: November 20, 1995 (A) Filing number: AU PN7274 (B) Filing date: 22 December 1995 (viii) Information about the attorney / advocate:
(A) Nazwisko: dr E. John L. Hughes (C) Numer rejestracyjny: EJH/EK (ix) Ιηί'οπηΗφι (A) Telefon: +61 3 9254 2777 (B) Faks: +61 3 9254 2770 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 1:(A) Name: Dr. E. John L. Hughes (C) Registration number: EJH / EK (ix) Ιηί'οπηΗφι (A) Telephone: +61 3 9254 2777 (B) Fax: +61 3 9254 2770 (2) Information on SEQ ID NO: 1:
(i) Charakterystyka sekwencji:(i) Characteristics of the sequence:
(A) Długość: 649 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (ix) Cecha:(A) Length: 649 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Stranded: single (D) Topology: linear (ii) Molecular type: DNA (ix) Feature:
(A) Nazwa/klucz: CDS (b) Lokalizacja: 17...589 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:l:(A) Name / key: CDS (b) Location: 17 ... 589 (xi) Sequence description: SEQ ID NO: l:
185 293185 293
TCGGGCCTCC GAAACC ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp SerTCGGGCCTCC GAAACC ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser
1010
55
193193
241241
289289
33?33?
3Θ53Θ5
CAG CAC AAC AAA TGT GAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAA Gin His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg GinCAG CAC AAC AAA TGT GAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAA Gin His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gin
125 130 135125 130 135
GAA AAT CCC TGT GGG CCT TGC TCA GAG CGG AGA AAG CAT TTG TTT GTA Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val 140 145 ISO 155GAA AAT CCC TGT GGG CCT TGC TCA GAG CGG AGA AAG CAT TTG TTT GTA Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val 140 145 ISO 155
CAA GAT CCG CAG ACG TGT AAA TGT TCC TGC AAA AAC ACA GAC TCG CGT Gin Asp Pro Gin Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser ArgCAA GAT CCG CAG ACG TGT AAA TGT TCC TGC AAA AAC ACA GAC TCG CGT Gin Asp Pro Gin Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg
160 165 170160 165 170
TGC AAG GCG AGG CAG CTT GAG TTA AAC GAA CGT ACT TGC AGA TGT GAC Cys Lys Ala Arg Gin Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys AspTGC AAG GCG AGG CAG CTT GAG TTA AAC GAA CGT ACT TGC AGA TGT GAC Cys Lys Ala Arg Gin Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp
175 180 185175 180 185
AAG CCG AGG CGG TGAGCCGGGC AGGAGGAAGG AGCCTCCCTC AGCGTTTCGG Lys Pro Arg ArgAAG CCG AGG CGG TGAGCCGGGC AGGAGGAAGG AGCCTCCCTC AGCGTTTCGG Lys Pro Arg Arg
190190
433433
481481
529529
577577
629629
GAACCAGATC T.CTCACCAGGGAACCAGATC T.CTCACCAGG
649649
185 293 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:2:185 293 (2) Information on SEQ ID NO: 2:
(i) Charakterystyka sekwencji:(i) Characteristics of the sequence:
(A) Długość: 191 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:2:(A) Length: 191 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (ii) Molecular type: protein (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 2:
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 15 10 15Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 15 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gin Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gin Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30
Gly Gly Gin Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gin 35 40 45Gly Gly Gin Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gin 35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gin Glu 50 55 60Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gin Glu 50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro LeuTyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Cheese Cys Val Pro Leu
70 75 8070 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val ProMet Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
90 9590 95
185 293 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:3:185 293 (2) Information about SEQ ID NO: 3:
(i) Charakterystyka sekwencji:(i) Characteristics of the sequence:
(A) Długość: 1094 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niniowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (ix) Cecha:(A) Length: 1094 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Linearity: single (D) Topology: linear (ii) Molecule type: DNA (ix) Feature:
(A) Nazwa/klucz: CDS (b) Lokalizacja: 3...624 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:3:(A) Name / key: CDS (b) Location: 3 ... 624 (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 3:
CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG 47CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG 47
Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu GlnMet Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln
10 1510 15
CAG CCC CGG GAG GTG GTG GTG CCC TTG ACT GTG GAG CTC ATG GGC ACC 191.CAG CCC CGG GAG GTG GTG GTG CCC TTG ACT GTG GAG CTC ATG GGC ACC 191.
Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly ThrGln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr
55 6055 60
GTG GCC AAA CAG CTG GTG CCC AGC TGC GTG ACT GTG CAG CGC TGT GGT 239GTG GCC AAA CAG CTG GTG CCC AGC TGC GTG ACT GTG CAG CGC TGT GGT 239
Val Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys GlyVal Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly
70 7570 75
GGC TGC TGC CCT GAC GAT GGC CTG GAG TGT GTG CCC ACT GGG CAG CAC 237GGC TGC TGC CCT GAC GAT GGC CTG GAG TGT GTG CCC ACT GGG CAG CAC 237
Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln HisGly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His
75 90 9575 90 95
CAA GTC CCG7 ATG CIAG ATC CTC ATG ATC CGG TAC CCG AGC AGT CAG CTG 3 3 3CAA GTC CCG7 ATG CIAG ATC CTC ATG ATC CGG TAC CCG AGC AGT CAG CTG 3 3 3
Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile .Arg Tyr Pro Ser Ser Gln LeuGln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile .Arg Tyr Pro Cheese Ser Gln Leu
900 10t 110900 10t 110
GGG GAG ATT CCC CTG CGA CGA CCAC AGC CAG TGT GAA TGC AGA CCT AAA 3 9 7GGG GAG ATT CCC CTG CGA CGA CCAC AGC CAG TGT GAA TGC AGA CCT AAA 3 9 7
Gly Glu Mmi tse Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro LysGly Glu Mmi tse Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys
995 920 935995 920 935
960 16t 970 197960 16t 970 197
GCC CAC GCT GCA CCC AGC ACC ACC AGC GCC CTG ACC CCC GGA CCT GCC 5*7 5GCC CAC GCT GCA CCC AGC ACC ACC AGC GCC CTG ACC CCC GGA CCT GCC 5 * 7 5
Ala His AALa Ala Pro Ser Thr Thr Ser ALa Leu Thr Pro Gly Pro AlaAla His AALa Ala Pro Ser Thr Thr Ser ALa Leu Thr Pro Gly Pro Ala
170 18C 190170 18C 190
185 293185 293
GCT GCC GCT GCC GAC GCC GCA GCT TCC TCC GTT GCC AAG GGC GGG GCT T 624 Ala Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly AlaGCT GCC GCT GCC GAC GCC GCA GCT TCC TCC GTT GCC AAG GGC GGG GCT T 624 Ala Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala
195 200 205195 200 205
AGAGCTCAAC CCAGACACCT GCAGGTGCCG GAAGCTGCGA AGGTGACACA TGGCTTTTCA 684AGAGCTCAAC CCAGACACCT GCAGGTGCCG GAAGCTGCGA AGGTGACACA TGGCTTTTCA 684
GACTCAGCAG GGTGACTTGC CTCAGAGGCT ATATCCCAGT GGGGGAACAA AGGGGAGCCT 744GACTCAGCAG GGTGACTTGC CTCAGAGGCT ATATCCCAGT GGGGGAACAA AGGGGAGCCT 744
GGTAAAAAAC AGCCAAGCCC CCAAGACCTC AGCCCAGGCA GAAGCTGCTC TAGGACCTGG B04GGTAAAAAAC AGCCAAGCCC CCAAGACCTC AGCCCAGGCA GAAGCTGCTC TAGGACCTGG B04
GCCTCTCAGA GGGCTCTTCT GCCATCCCTT GTCTCCCTGA GGCCATCATC AAACAGGACA 864GCCTCTCAGA GGGCTCTTCT GCCATCCCTT GTCTCCCTGA GGCCATCATC AAACAGGACA 864
GAGTTGGAAG AGGAGACTGG GAGGCAGCAA GAGGGGTCAC ATACCAGCTC AGGGGAGAAT 924GAGTTGGAAG AGGAGACTGG GAGGCAGCAA GAGGGGTCAC ATACCAGCTC AGGGGAGAAT 924
GGAGTACTGT CTCAGTTTCT AACCACTCTG TGCAAGTAAG CATCTTACAA CTGGCTCTTC 984GGAGTACTGT CTCAGTTTCT AACCACTCTG TGCAAGTAAG CATCTTACAA CTGGCTCTTC 984
CTCCCCTCAC TAAGAAGACC CAAACCTCTG CATAATGGGA TTTGGGCTTT GGTACAAGAA 1044CTCCCCTCAC TAAGAAGACC CAAACCTCTG CATAATGGGA TTTGGGCTTT GGTACAAGAA 1044
CTGTGACCCC CAACCCTGAT AAAAGAGATG GAAGGAAAAA AAAAAAAAAA 1094 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:4:CTGTGACCCC CAACCCTGAT AAAAGAGATG GAAGGAAAAA AAAAAAAAAA 1094 (2) Information on SEQ ID N0: 4:
(i) Charakterystyka sekwencji:(i) Characteristics of the sequence:
(A) Długość: 207 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:4:(A) Length: 207 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (ii) Molecular type: protein (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 4:
Lys Αυρ Ser Ala Val Lys Prr Asp Arg W. a Ala Thr Pro His His Aro 130 11S 140Lys Αυρ Ser Ala Val Lys Prr Asp Arg W. a Ala Thr Pro His His Aro 130 11S 140
185 293185 293
195 200 205 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:5:195 200 205 (2) Information regarding SEQ ID NO: 5:
(i) Charakterystyka sekwencji:(i) Characteristics of the sequence:
(A) Długość: 993 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (ix) Cecha:(A) Length: 993 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Strandedness: single (D) Topology: linear (ii) Type of molecule: DNA (ix) Feature:
(A) Nazwa/klucz: CDS (b) Lokalizacja: 3...566 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:5:(A) Name / key: CDS (b) Location: 3 ... 566 (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 5:
185 293185 293
CGC TGC ACC CAG CAC CAC CAG CGC CCT GAC CCC CGG ACC TGC CGC TGC 4 7 9CGC TGC ACC CAG CAC CAC CAG CGC CCT GAC CCC CGG ACC TGC CGC TGC 4 7 9
Arg Cys Thr Gln His His Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg CysArg Cys Thr Gln His His Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys
145 150 155145 150 155
CGC TGC CGA CGC CGC AGC TTC CTC CGT TGC CAA GGG CGG GGC TTA GAG 52 7CGC TGC CGA CGC CGC AGC TTC CTC CGT TGC CAA GGG CGG GGC TTA GAG 52 7
Arg Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu 160 165 170 175Arg Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu 160 165 170 175
CTC AAC CCA GAC ACC TGC AGG TGC CGG AAG CTG CGA AGG TGACACATGG 557CTC AAC CCA GAC ACC TGC AGG TGC CGG AAG CTG CGA AGG TGACACATGG 557
Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg ArgLeu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg
180 1S5180 1S5
CTTTTCAGAC TCAGCAGGGT GACTTGCCTC AGAGGCTATA TCCCAGTGGG GGAACAAAGG 636CTTTTCAGAC TCAGCAGGGT GACTTGCCTC AGAGGCTATA TCCCAGTGGG GGAACAAAGG 636
GGAGCCTGGT AAAAAACAGC CAAGCCCCCA AGACCTCAGC CCAGGCAGAA GCTGCTCTAG 639GGAGCCTGGT AAAAAACAGC CAAGCCCCCA AGACCTCAGC CCAGGCAGAA GCTGCTCTAG 639
GACCTGGGCC TCTCAGAGGG CTCTTCTGCC ATCCCTTGTC TCCCTGAGGC CATCATCAAA 776GACCTGGGCC TCTCAGAGGG CTCTTCTGCC ATCCCTTGTC TCCCTGAGGC CATCATCAAA 776
CAGGACAGAG TTGGAAGAGG AGACTGGGAG GCAGCAAGAG GGGTCACATA CCAGCTCAGG 811CAGGACAGAG TTGGAAGAGG AGACTGGGAG GCAGCAAGAG GGGTCACATA CCAGCTCAGG 811
GGAGAATGGA GTACTGTCTC AGTTTCTAAC CACTCTGTGC AAGTAAGCAT CTTACAACTG 0 0 7GGAGAATGGA GTACTGTCTC AGTTTCTAAC CACTCTGTGC AAGTAAGCAT CTTACAACTG 0 0 7
GCTCTTCCTC CCCTCACTAA GAAGACCCAA ACCTCTGCAT AATGGGATTT GGGCTTTGGT 996GCTCTTCCTC CCCTCACTAA GAAGACCCAA ACCTCTGCAT AATGGGATTT GGGCTTTGGT 996
ACAAGAACTG TGACCCCCAA CCCTGATAAA AGAGATGGAA GGAAAAAAAA AAAAAAA 999 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:6:ACAAGAACTG TGACCCCCAA CCCTGATAAA AGAGATGGAA GGAAAAAAAA AAAAAAA 999 (2) Information on SEQ ID NO: 6:
(i) Charakterystyka sekwencji:(i) Characteristics of the sequence:
(A) Długość: 188 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:6:(A) Length: 188 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (ii) Molecular type: protein (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 6:
Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln 85 99 95Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln 85 99 95
Val Arg Met Gln Ile Leu Met liis Arg T/r Pro Ser Ser Gln Leu dy 100 105 110Val Arg Met Gln Ile Leu Met liis Arg T / r Pro Ser Ser Gln Leu dy 100 105 110
185 293185 293
180 185 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:7:180 185 (2) Information on SEQ ID NO: 7:
(i) Charakterystyka sekwencji:(i) Characteristics of the sequence:
(A) Długość: 858 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (ix) Cecha:(A) Length: 858 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Thread: single (D) Topology: linear (ii) Molecule type: DNA (ix) Feature:
(A) Nazwa/klucz: CDS (b) Lokalizacja: 3...431 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:7:(A) Name / key: CDS (b) Location: 3 ... 431 (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 7:
CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG 4 7CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG 4 7
Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu GlnMet Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln
185 293185 293
GGG GAG ATG TCC CTG GAA GAA CAC AGC CAG TGT GAA TGC AGA CCT AAA 383GGG GAG ATG TCC CTG GAA GAA CAC AGC CAG TGT GAA TGC AGA CCT AAA 383
Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro LysGly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys
115 120 125115 120 125
AAA AAG GlA AGT GCT GTG AAG CCA GAT AGG TGC CGG AAG CTG CGA AGG 511AAA AAG GlA AGT GCT GTG AAG CCA GAT AGG TGC CGG AAG CTG CGA AGG 511
Lys Lys Aap Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Cys Arg Lys Leu Arg ArgLys Lys Aap Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg
130 135 140130 135 140
TGACACATGG CTTTTCAGAC TCAGCAGGGT GACTTGCCTC AGAGGCTATA TCCCAGTdlG 591TGACACATGG CTTTTCAGAC TCAGCAGGGT GACTTGCCTC AGAGGCTATA TCCCAGTdlG 591
GGACCCACGG GGAGCCTGGT CACCAACCGC CAAGCCCCCA AGACCTCAGC CCAlAlCAGAA 5 51GGACCCACGG GGAGCCTGGT CACCAACCGC CAAGCCCCCA AGACCTCAGC CCAlAlCAGAA 5 51
GCTGCTCTAG GACCTGGGCC TCTCAGAGGG CTCTTCTGCC ATCCCTTGTC TCC<CTGA(AlC 611GCTGCTCTAG GACCTGGGCC TCTCAGAGGG CTCTTCTGCC ATCCCTTGTC TCC <CTGA (AlC 611
CCTCATCCCA CAGGACAGAG TTGGCCGCGG AGACTGGGAG GCAGCAAGAG GGCTCAGCTA (5 71CCTCATCCCA CAGGACAGAG TTGGCCGCGG AGACTGGGAG GCAGCAAGAG GGCTCAGCTA (5 71
CCAGCTCAGG GGAGAATGGA GTACTGTCTC AGTTTCTAAC CACTCTGTGC GAGT^^O^ 731CCAGCTCAGG GGAGAATGGA GTACTGTCTC AGTTTCTAAC CACTCTGTGC GAGT ^^ O ^ 731
CTTCCACCTG GCTCTTCCTC CCCTCACTAA GCCGΑCCCCΑ ACCTCTGCAT AATtUlATir 791CTTCCACCTG GCTCTTCCTC CCCTCACTAA GCCGΑCCCCΑ ACCTCTGCAT AATtUlATir 791
GGGCTTTGGT ΑCCCGΑCCTG TGACCCCCAA CCCTGATAAA CGCGCTGGCC GGA^CACCACC 8 51GGGCTTTGGT ΑCCCGΑCCTG TGACCCCCAA CCCTGATAAA CGCGCTGGCC GGA ^ CACCACC 8 51
CACAACC 8 58 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:8:CACAACC 8 58 (2) Information on SEQ ID NO: 8:
(i) Charakterystyka sekwencji:(i) Characteristics of the sequence:
(A) Długość: 143 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:8:(A) Length: 143 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (ii) Molecular type: protein (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 8:
55 6055 60
185 293 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:9:185 293 (2) Information about SEQ ID NO: 9:
(i) Charakterystyka sekwencji:(i) Characteristics of the sequence:
(A) Długość: 910 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (ix) Cecha:(A) Length: 910 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Strand: single (D) Topology: linear (ii) Type of molecule: DNA (ix) Feature:
(A) Nazwa/klucz: CDS (b) Lokalizacja: 3...305 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:9:(A) Name / key: CDS (b) Location: 3 ... 305 (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 9:
100100
CAGGGCTGCC ACTCCCCACC ACCGTCCCCA GCCCCGTTCT GTTCCGGGCT GGGACTCTGC 395CAGGGCTGCC ACTCCCCACC ACCGTCCCCA GCCCCGTTCT GTTCCGGGCT GGGACTCTGC 395
CCCCGGAGCA CCCTCCCCAG CTGACATCAC CCATCCCACT CCAGCCCCAG GCCCCTCTGC 455CCCCGGAGCA CCCTCCCCAG CTGACATCAC CCATCCCACT CCAGCCCCAG GCCCCTCTGC 455
CCACGCTGCA CCCAGCACCA CCAGCGCCCC GACCCCCtG» CCTGCCGCTG CCCGCTGCCG 551CCACGCTGCA CCCAGCACCA CCAGCGCCCC GACCCCCtG »CCTGCCGCTG CCCGCTGCCG 551
CGCCGCAGCT TCCTCCGTTG CCAAKKGGCG GGCTTAGAtGZ TCAACCCAGA OA^(7TGCIAG> 575CGCCGCAGCT TCCTCCGTTG CCAAKKGGCG GGCTTAGAtGZ TCAACCCAGA OA ^ (7TGCIAG> 575
TGCCGGAAGC TGCGAAGGTG ACACATOGCT TTTCAGACTC AGC^GGGTGA CrTCCCCnCA; 639TGCCGGAAGC TGCGAAGGTG ACACATOGCT TTTCAGACTC AGC ^ GGGTGA CrTCCCCnCA; 639
AGGCTATATC CCAGTGGGGA ACAAAlG^tGGA C^C^CTGGTAAA AiACCAGCCAA. (GCC^t^CCCAAGA 635AGGCTATATC CCAGTGGGGA ACAAAlG ^ tGGA C ^ C ^ CTGGTAAA AiACCAGCCAA. (GCC ^ t ^ CCCAAGA 635
CCTCAGCCCA GGCAGAAGCT GCTCTACG3AC CGGGGCCTCT CAGAGGCCCC TTCTGCCATC 75.CCTCAGCCCA GGCAGAAGCT GCTCTACG3AC CGGGGCCTCT CAGAGGCCCC TTCTGCCATC 75.
CCTTGTCTCC CTGGGGCCGC CA’ΓCGGGCGG ACAAG,A(3^(3 GGAGAGGAAA CTGGGAGGCA 815CCTTGTCTCC CTGGGGCCGC CA’ΓCGGGCGG ACAAG, A (3 ^ (3 GGAGAGGAAA CTGGGAGGCA 815
GCG.GGGGGGG CCGCGCGCCG GCTO^GGGGA AAATGGAGTA CGTTCTAAGT TTCTAiCCAC 9 ’5GCG.GGGGGGG CCGCGCGCCG GCTO ^ GGGGA AAATGGAGTA CGTTCTAAGT TTCTAiCCAC 9 '5
CCCGTGCAGG CG.GGCGTCCC ACAACTGGCT CCTTCCCCGTGCAGG CG.GGCGTCCC ACAACTGGCT CCTTC
950950
185 293 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 10:185 293 (2) Information about SEQ ID NO: 10:
(i) Charakterystyka sekwencji:(i) Characteristics of the sequence:
(A) Długość: 101 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:10:(A) Length: 101 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (ii) Molecular type: protein (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 10:
Val Arg Met Gln Thr 100 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 11:Val Arg Met Gln Thr 100 (2) Information on SEQ ID NO: 11:
(i) Charakterystyka sekwencji:(i) Characteristics of the sequence:
(A) Długość: 42 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: Oligonukleotyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 11:(A) Length: 42 base pairs (B) Type: Nucleic acid (C) Strand: Single (D) Topology: Linear (ii) Molecular Type: Oligonucleotide (xi) Sequence Description: SEQ ID NO: 11:
ACCACCACCT CCCTGGGCTG GCATGTGGCA CGTGCATAAA CG 42 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 12:ACCACCACCT CCCTGGGCTG GCATGTGGCA CGTGCATAAA CG 42 (2) Information on SEQ ID NO: 12:
(i) Charakterystyka sekwencji:(i) Characteristics of the sequence:
(A) Długość: 42 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: OLigonukleotyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 12:(A) Length: 42 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Stranded: single (D) Topology: linear (ii) Molecule type: OLigonucleotide (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 12:
AGTTGTTTGA CCACATTGCC CATGAGTTCC ATGCTCAGAG GCAGTTGTTTGA CCACATTGCC CATGAGTTCC ATGCTCAGAG GC
185 293 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 13:185 293 (2) Information about SEQ ID NO: 13:
(i) Charakterystyka sekwencji:(i) Characteristics of the sequence:
(A) Długość: 38 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: Oligonukleotyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:13:(A) Length: 38 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Stranded: single (D) Topology: linear (ii) Molecular type: Oligonucleotide (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 13:
GATCCTGGGG CTGGAGTGGG ATGGATGATG TCAGCTGG 313 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 14:GATCCTGGGG CTGGAGTGGG ATGGATGATG TCAGCTGG 313 (2) Information on SEQ ID NO: 14:
(i) Charakterystyka sekwencji:(i) Characteristics of the sequence:
(A) Długość: 40 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: Oligonukleotyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 14:(A) Length: 40 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Strandedness: single (D) Topology: linear (ii) Molecular type: Oligonucleotide (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 14:
GCGGGCAGAG GATCCTGGGG CTGTCTGGCC. TCACAGCACT 40GCGGGCAGAG GATCCTGGGG CTGTCTGGCC. TCACAGCACT 40
185 293185 293
185 293185 293
TCGGCCTCC GAAACC ATG AAC TTT CTGTCGGCCTCC GAAACC ATG AAC TTT CTG
Met Asn Phe LeuMet Asn Phe Leu
Fig. Ki)Fig. Ki)
185 293185 293
CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC 49CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC 49
Leu Ser Trp Val His Trp SerLeu Ser Trp Val His Trp Ser
1010
CAT GCC AAG TGG TCC CAG GCT GCA 97CAT GCC AAG TGG TCC CAG GCT GCA 97
Fig. Kii)Fig. Kii)
185 293185 293
Fig. 1 (iii)Fig. 1 (iii)
185 293185 293
GAAGG AGCCTCCCTC AGCGTTTCGG 629GAAGG AGCCTCCCTC AGCGTTTCGG 629
Fig.1 (i v)Fig. 1 (i v)
649649
185 293185 293
185 293185 293
CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGCCC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC
Fig.2(i)Fig. 2 (i)
185 293185 293
Fig. 2 Fu)Fig. 2 Fu)
185 293185 293
180180
576 GCT GCC GCT GCC GAC GCC GCA GCT Ala Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala576 GCT GCC GCT GCC GAC GCC GCA GCT Ala Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala
195195
Fig. 2 (iii)Fig. 2 (iii)
185 293185 293
Fig.2(iv)Fig. 2 (iv)
185 293185 293
Fig.2(v)Fig. 2 (v)
185 293185 293
Fig. 2 (vi)Fig. 2 (vi)
185 293185 293
14/5214/52
Fig. 3 (ι)Fig. 3 (ι)
15/5215/52
Fig 3 (ii)Fig 3 (ii)
185 293 >VEGF_ LUDZKI VEGF_ PREKURSOR LUDZKIEGO NACZYNIOWEGC (NACZYNIOWY 215 AA.185 293> VEGF_HUMAN VEGF_ PRECURSOR OF HUMAN VASCULAR (VASCULAR 215 AA.
DŁUGOŚĆ = 215LENGTH = 215
OCENA = 181 (92.4 BITY), OCZEKIW. = 6.4e-20, IDENTYCZNE = 33/75 (44%), DODATNIE = 48/75RATING = 181 (92.4 BITS), STANDBY = 6.4e-20, IDENTICAL = 33/75 (44%), POSITIVE = 48/75
PRZEDMIOTSUBJECT
Fig.3 (i)Fig. 3 (i)
185 293185 293
NABŁON KOWEGO CZYNNIKA WZROSTU (VEGF)CUBIC GROWTH FACTOR (VEGF)
P = 6.4e-20 (64%)P = 6.4e-20 (64%)
MGTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLECV 90 + PSCV + RCGGCC D+GLECVMGTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLECV 90 + PSCV + RCGGCC D + GLECV
PDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECV 9 5PDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECV 9 5
POISSON P(2) = 9.1e-12 (84%)POISSON P (2) = 9.1e-12 (84%)
POISSON P(3) = 3.6e-18 (71%)POISSON P (3) = 3.6e-18 (71%)
POISSON P(4) = 7.3e-10 (90%)POISSON P (4) = 7.3e-10 (90%)
Fig. 3(i)Fig. 3 (i)
185 293185 293
185 293185 293
Przedział ważony : 3.00 Długość ważona .-0.100Weighted range : 3.00 Weighted length.-0.100
Jakość :100.9 Stosunek .-0.175Quality: 100.9 Ratio.-0.175
Procent podobieństwa .-69.70:Percent Similarity. -69.70:
Średnie dopasowanie ; 1. o 0 0 Średnie niedopasowanie: - 0.9 00Medium fit ; 1.o 0 0 Average mismatch: - 0.9 00
Długość ; 7 3 9 Szczeliny 3 0Length ; 7 3 9 Rifts 3 0
Procent identyczności :69.703Percent identity: 69,703
8 ATGAGCCCTCTGCTCCGCCGCCTGC8 ATGAGCCCTCTGCTCCGCCGCCTGC
ATGAACTTTCTGCT.....GTCT. .ATGAACTTTCTGCT ..... GTCT. .
TGCAGCTGGCCCCCGCCCAGGCCCCTGCAGCTGGCCCCCGCCCAGGCCCC
III III II I III IIIIII III II I III III
TGCTGCTCTACCTCCACCATGCCAATGCTGCTCTACCTCCACCATGCCAA
118 CACCAGAGGA...............118 CACCAGAGGA ...............
muhim
106 AGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCAC106 AGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCAC
140 GTGTATACTCGC.GCTACCTGCCAG140 GTGTATACTCGC.GCTACCTGCCAG
II III III INI llllllII III III INI III
152 GTCTATCAGCGCAGCTA. CTGCCAT152 GTCTATCAGCGCAGCTA. CTGCCAT
194 T .... GA.....CTGTGGAGCTCAT194 T .... GA ..... CTGTGGAGCTCAT
I II III III III II III III II
201 TCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGA201 TCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGA
235 CCCAGCTGCGTGACTGTGCAGCGCT235 CCCAGCTGCGTGACTGTGCAGCGCT
II III III I II III III III III I II III I
239 CCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGAT239 CCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGAT
285 CCTGGAGTGTGTGCCCACTGGGCAG285 CCTGGAGTGTGTGCCCACTGGGCAG
CCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAG
Fig. 4(i)Fig. 4 (i)
289289
185 293185 293
TGCTCGCCGCACT..........CC 67TGCTCGCCGCACT .......... CC 67
I I III I II I III I I
...TGGGTGCATTGGAGCCTTGCCT 56... TGGGTGCATTGGAGCCTTGCCT 56
TGTCTCCCAGCCTGATGCCCCTGGC 117TGTCTCCCAGCCTGATGCCCCTGGC 117
GTGGTCCCAGGCTGCA.CCCATGGC 105 .AAGTGGTG....TCATGGATAGAT 147 llllllll lilii IIIGTGGTCCCAGGCTGCA.CCCATGGC 105 .AAGTGGTG .... TCATGGATAGAT 147 llllllll lily III
GAAGTGGTGAAGTTCATG....GAT 151GAAGTGGTGAAGTTCATG .... GAT 151
CCCCGGGAG...GTGGTGGTGCCCT 193CCCCGGGAG ... GTGGTGGTGCCCT 193
CCAATCGAGACCCTGGTGGACATCT 200CCAATCGAGACCCTGGTGGACATCT 200
GGGCACCGTGGCCAAACAGCTGGTG 234GGGCACCGTGGCCAAACAGCTGGTG 234
GTACATCTT . . . CAA.........G 238GTACATCTT. . . CAA ......... G 238
GTGGTGGCTGCTGCCCTGACGATGG 284GTGGTGGCTGCTGCCCTGACGATGG 284
GCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGG 288GCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGG 288
CACCAAGTCCGGATGCAGAT..... 329CACCAAGTCCGGATGCAGAT ..... 329
I I II llllllllI I II IIIlll
TCCAACATCACCATGCAGATTATGC 338TCCAACATCACCATGCAGATTATGC 338
Fig4(ii)Fig4 (ii)
185 293185 293
3 0 CCTCATGATCCGGTACC3 0 CCTCATGATCCGGTACC
INN IOTHERS
3 9 GGATCAAACCTCA...........C3 9 GGATCAAACCTCA ........... C
369 GTCCCTGGAAGAACACAGCCAGTGT369 GTCCCTGGAAGAACACAGCCAGTGT
III II INI I I IIIIII II INI I I III
376 GAGCTTCCTACAGCACAACAAATGT376 GAGCTTCCTACAGCACAACAAATGT
419 GTGCTGTGAAGCCAGACAGGGCTGC419 GTGCTGTGAAGCCAGACAGGGCTGC
I III lilii II III lily I
423 G........AGCAAGAC AAG.....423 G ........ AGCAAGAC AAG .....
469 CGTTCTGTTCCGGGCTGGGACTCTG469 CGTTCTGTTCCGGGCTGGGACTCTG
443 ...TGTGGGCCTTGCTCAGA.....443 ... TGTGGGCCTTGCTCAGA .....
519 CATCACCCATCCCACTCCAGCCCCA519 CATCACCCATCCCACTCCAGCCCCA
468 .........................468 .........................
569 GC..........ACCACCAGCGCCC569 GC .......... ACCACCAGCGCCC
469 GCATTTGTTTGTACAA.........469 GCATTTGTTTGTACAA .........
609 TGCCGACGCCGCAGCTTCCTCCGTT609 TGCCGACGCCGCAGCTTCCTCCGTT
II I I I III II INIII I I I III II INI
509 TG.CAAAAACACAGACTC..GCGTT509 TG.CAAAAACACAGACTC..GCGTT
657 AACCCAGACACCTGCAGGTGCCGGA657 AACCCAGACACCTGCAGGTGCCGGA
554 AACGAACGTACTTGCAGATGTGACA554 AACGAACGTACTTGCAGATGTGACA
FgFg
185 293185 293
CGAGCAGTCAGC...TGGGGGAGATCGAGCAGTCAGC ... TGGGGGAGAT
CAAG. .GCCAGCACATAGGAGAGATCAAG. .GCCAGCACATAGGAGAGAT
GAATGCAGACCTAAAAAAAAGGACA iiiiiiimi m ii ιι iGAATGCAGACCTAAAAAAAAGGACA iiiiiiimi m ii ιι i
GAATGCAGACC . . . AAAGAAAGATAGAATGCAGACC. . . AAAGAAAGATA
CACTCCCCACCACCGTCCCCAGCCCCACTCCCCACCACCGTCCCCAGCCC
...........AAAATCCC................. AAAATCCC ......
CCCCCGGAGCACCCTCCCCAGCTGA . . .GCGGAGAA..............CCCCCGGAGCACCCTCCCCAGCTGA. . .GCGGAGAA ..............
GGCCCCTCTGCCCACGCTGCACCCAGGCCCCTCTGCCCACGCTGCACCCA
........................A........................AND
TGACCCCCGGACCTGCCGCTGCCGC .GATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGACCCCCGGACCTGCCGCTGCCGC .GATCCGCAGACGTGTAAATGTTCC
GCCAAGGGCGGGGC..TTAGAGCTCGCCAAGGGCGGGGC..TTAGAGCTC
GC..AAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAGC..AAGGCGAGGCAGCTTGAGTTA
AGCTGCGAAGGTGAAGCTGCGAAGGTGA
AGCCGAGGCGGTGAAGCCGAGGCGGTGA
Fig.4(iv)Fig. 4 (iv)
368368
375375
418418
422422
468468
442442
518518
467467
568568
468468
608608
508508
656656
553553
695695
592592
185 293185 293
185 293185 293
165SOMSQ.MSF.msf MSF.-687 Typ : D Wtorek, 20 czerwca 1995165SOMSQ.MSF.msf MSF.-687 Type: D Tuesday, June 20, 1995
Fig.5(i)Fig. 5 (i)
185 293185 293
CATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCCATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACC
CTGCTCGCCGCACTCCTGCAGCTGGCCCCTGCTCGCCGCACTCCTGCAGCTGGCCC
CTGCTCGCCGCACTCCTGCAGCTGGCCCCTGCTCGCCGCACTCCTGCAGCTGGCCC
CTGCTCGCCGCACTCCTGCAGCTGGCCCCTGCTCGCCGCACTCCTGCAGCTGGCCC
CTGCTCGCCGCACTCCTGCAGCTGGCCCCTGCTCGCCGCACTCCTGCAGCTGGCCC
AGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCAT
GGTGTCATGGATAGATGTGTATACTCGCGGTGTCATGGATAGATGTGTATACTCGC
GGTGTCATGGATAGATGTGTATACTCGCGGTGTCATGGATAGATGTGTATACTCGC
GGTGTCATGGATAGATGTGTATACTCGCGGTGTCATGGATAGATGTGTATACTCGC
GGTGTCATGGATAGATGTGTATACTCGCGGTGTCATGGATAGATGTGTATACTCGC
TTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGT GCTCATGGGCACCGTGGCCAAAC..AGC GCTCATGGGCACCGTGGCCAAAC..AGC GCTCATGGGCACCGTGGCCAAAC..AGC GCTCATGGGCACCGTGGCCAAAC..AGCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGT GCTCATGGGCACCGTGGCCAAAC..AGC GCTCATGGGCACCGTGGCCAAAC..AGC GCTCATGGGCACCGTGGCCAAAC..AGC GCTCATGGGCACCAACGTAGGC
TGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTTGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACT
TGACGATGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTTGACGATGGCCTGGAGTGTGTGCCCACT
TGACGATGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTTGACGATGGCCTGGAGTGTGTGCCCACT
TGACGATGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTTGACGATGGCCTGGAGTGTGTGCCCACT
TGACGATGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTTGACGATGGCCTGGAGTGTGTGCCCACT
Fig.5(ii)Fig. 5 (ii)
185 293185 293
TCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTG.TCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTG.
CCGCCCAGGCCCCTGTCTCCCAGCCTGACCGCCCAGGCCCCTGTCTCCCAGCCTGA
CCGCCCAGGCCCCTGTCTCCCAGCCTGACCGCCCAGGCCCCTGTCTCCCAGCCTGA
CCGCCCAGGCCCCTGTCTCCCAGCCTGACCGCCCAGGCCCCTGTCTCCCAGCCTGA
CCGCCCAGGCCCCTGTCTCCCAGCCTGACCGCCCAGGCCCCTGTCTCCCAGCCTGA
160160
GGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCAT
G.....CTACCTGC . CAGCC . CCGGGAGG ..... CTACCTGC. CAGCC. CCGGGAG
G.....CTACCTGC . CAGCC . CCGGGAGG ..... CTACCTGC. CAGCC. CCGGGAG
G.....CTACCTGC . CAGCC . CCGGGAGG ..... CTACCTGC. CAGCC. CCGGGAG
G.....CTACCTGC . CAGCC . CCGGGAGG ..... CTACCTGC. CAGCC. CCGGGAG
240240
ACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCT
TGGTGCCCAG......CTGCGTGACTGTTGGTGCCCAG ...... CTGCGTGACTGT
TGGTGCCCAG......CTGCGTGACTGTTGGTGCCCAG ...... CTGCGTGACTGT
TGGTGCCCAG......CTGCGTGACTGTTGGTGCCCAG ...... CTGCGTGACTGT
TGGTGCCCAG......CTGCGTGACTGTTGGTGCCCAG ...... CTGCGTGACTGT
320320
GAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATTA GGGCAGCACCAAGTCCGGATGCAGATCC GGGCAGCACCAAGTCCGGATGCAGATCC GGGCAGCACCAAGTCCGGATGCAGATCC GGGCAGCACCAAGTCCGGATGCAGA...GAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATTA GGGCAGCACCAAGTCCGGATGCAGATCC GGGCAGCACCAAGTCCGGATGCAGATCC GGGCAGCACCAAGTCCGGATGCAGATCC GGGCAGCACCAAGTCCGGATGCAGA ...
Fig. 5 (iii)Fig. 5 (iii)
185 293185 293
VEGF165VEGF165
SOM175SOM175
SOM175-e6SOM175-e6
SOMl75-e6&7SOMl75-e6 & 7
SOMl75-e4SOMl75-e4
VEGF165VEGF165
SOM175SOM175
SOMl75-e6SOMl75-e6
SOM175-e6&7SOM175-e6 & 7
SOMl75-e4SOMl75-e4
VEGF165VEGF165
SOM175SOM175
SOMl75-e6SOMl75-e6
SOMl75-e6&7SOMl75-e6 & 7
SOMl75-e4SOMl75-e4
VEGF165VEGF165
SOM175SOM175
SOM175-E6SOM175-E6
SOMl75-e6&7SOMl75-e6 & 7
SOMl75-e4SOMl75-e4
VEGF165VEGF165
SOM175SOM175
SOMl75-e6SOMl75-e6
SOMl75-e6&7SOMl75-e6 & 7
SOM175-e4SOM175-e4
321321
TGCGGATCAAACCTCACCAAGGCC TCATGATCCGG...TACCCGAGCA TCATGATCCGG...TACCCGAGCA TCATGATCCGG...TACCCGAGCATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCC TCATGATCCGG ... TACCCGAGCA TCATGATCCGG ... TACCCGAGCA TCATGATCCGG ... TACCCGAGCA
401401
AAGAAAGATAG........AGCAAAAGAAAGATAG ........ AGCAA
AAAAAGGACAGTGCTGTGAAGCCAAAAAAGGACAGTGCTGTGAAGCCA
AAAAAGGACAGTGCTGTGAAGCCAAAAAAGGACAGTGCTGTGAAGCCA
AAAAAGGACAGTGCTGTGAAGCCAAAAAAGGACAGTGCTGTGAAGCCA
AAAAAGGACAGTGCTGTGAAGCCAAAAAAGGACAGTGCTGTGAAGCCA
481481
...........AAGCA................... AAGCA ........
CTCTGCCCCCGGAGCACCCTCCCCCTCTGCCCCCGGAGCACCCTCCCC
CTCTGCCCCCGGAGCACCCTCCCCCTCTGCCCCCGGAGCACCCTCCCC
561561
A...............GATCCGCAA ............... GATCCGCA
GCACCACCAGCGCCCTGACCCCCGGCACCACCAGCGCCCTGACCCCCG
GCACCACCAGCGCCCTGACCCCCGGCACCACCAGCGCCCTGACCCCCG
GCACCACCAGCGCCCTGACCCCCGGCACCACCAGCGCCCTGACCCCCG
641641
TTGAGTTAAACGAACGTACTTGCATTGAGTTAAACGAACGTACTTGCA
TAGAGCTCAACCCAGACACCTGCATAGAGCTCAACCCAGACACCTGCA
TAGAGCTCAACCCAGACACCTGCATAGAGCTCAACCCAGACACCTGCA
TAGAGCTCAACCCAGACACCTGCATAGAGCTCAACCCAGACACCTGCA
Fig5(iv)Fig5 (iv)
185 293185 293
AGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACA
GTCAGCTGGGGGAGATGTCCCTGGAAGAGTCAGCTGGGGGAGATGTCCCTGGAAGA
GTCAGCTGGGGGAGATGTCCCTGGAAGAGTCAGCTGGGGGAGATGTCCCTGGAAGA
GTCAGCTGGGGGAGATGTCCCTGGAAGAGTCAGCTGGGGGAGATGTCCCTGGAAGA
GACAAGAA....AATCCCTGTGG.....GACAAGAA .... AATCCCTGTGG .....
GACAGGGCTGCCACTCCCCACCACCGTCGACAGGGCTGCCACTCCCCACCACCGTC
GATAG.......................GATAG .......................
GATAG.......................GATAG .......................
GACAGGGCTGCCACTCCCCACCACCGTCGACAGGGCTGCCACTCCCCACCACCGTC
AGCTGACATCACCCATCCCACTCCAGCC ..........................CCAGCTGACATCACCCATCCCACTCCAGCC .......................... CC
AGCTGACATCACCCATCCCACTCCAGCCAGCTGACATCACCCATCCCACTCCAGCC
GACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAAC.AC GACCTGCCGCTGCCGCTGCCGACGCCGC GACCTGCCGCTGCCGCTGCCGACGCCGCGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAAC.AC GACCTGCCGCTGCCGCTGCCGACGCCGC GACCTGCCGCTGCCGCTGCCGACGCCGC
GACCTGCCGCTGCCGCTGCCGACGCCGCGACCTGCCGCTGCCGCTGCCGACGCCGC
687687
GATGTGACAAGCCGAGGCGGTGAGATGTGACAAGCCGAGGCGGTGA
GGTGCCGGAAGCTGCGAAGGTGAGGTGCCGGAAGCTGCGAAGGTGA
GGTGCCGGAAGCTGCGAAGGTGAGGTGCCGGAAGCTGCGAAGGTGA
GTGCCGGAAGCTGCGAAGGTGAGTGCCGGAAGCTGCGAAGGTGA
GGTGCCGGAAGCTGCGAAGGTGAGGTGCCGGAAGCTGCGAAGGTGA
Fig.5(v)Fig. 5 (v)
185 293185 293
400400
GCACAACAAATGTGAATGCAGACC...A ACACAGCCAGTGTGAATGCAGACCTAAA ACACAGCCAGTGTGAATGCAGACCTAAA ACACAGCCAGTGTGAATGCAGACCTAAA ......................CCTAAAGCACAACAAATGTGAATGCAGACC ... A ACACAGCCAGTGTGAATGCAGACCTAAA ACACAGCCAGTGTGAATGCAGACCTAAA ACACAGCCAGTGTGAATGCAGACCTAAA ...................... CCTAAA
480480
.........GCCTTGCTCAGAGCGGAGA......... GCCTTGCTCAGAGCGGAGA
CCCAGCCCCGTTCTGTTCCGGGCTGGGACCCAGCCCCGTTCTGTTCCGGGCTGGGA
CCCAGCCCCGTTCTGTTCCGGGCTGGGACCCAGCCCCGTTCTGTTCCGGGCTGGGA
560560
.........TTTGTT.....TGTAC . . A......... TTTGTT ..... TGTAC. . AND
CCAGGCCCCTCTGCCCACGCTGCACCCACCAGGCCCCTCTGCCCACGCTGCACCCA
CCAGGCCCCTCTGCCCACGCTGCACCCACCAGGCCCCTCTGCCCACGCTGCACCCA
CCAGGCCCCTCTGCCCACGCTGCACCCACCAGGCCCCTCTGCCCACGCTGCACCCA
640640
AGACTCG..CGTTGCAAGGCGAGGCAGC AGCTTCCTCCGTTGCCAAGGGCGGGGCT AGCTTCCTCCGTTGCCAAGGGCGGGGCTAGACTCG..CGTTGCAAGGCGAGGCAGC AGCTTCCTCCGTTGCCAAGGGCGGGGCT AGCTTCCTCCGTTGCCAAGGGCGGGGCT
AGCTTCCTCCGTTGCCAAGGGCGGGGCTAGCTTCCTCCGTTGCCAAGGGCGGGGCT
Fig.5(vi)Fig. 5 (vi)
185 293185 293
RjRj
Fig 6(ι) 'Χ.Fig 6 (ι) 'Χ.
Fig 6 (ii) fs/ofFig 6 (ii) fs / of
Fig 6 (iii)Fig 6 (iii)
J-nJ-n
185 293185 293
K CUK CU
O X > CL XO X> CL X
XX
XX
CLCL
x iJ X > > u u cn cn CL CL xx iJ X>> u u cn cn CL CL x
x >x>
ωω
X o > X w u cn H < X < w < 2 Q X < w < X < o < X (<X o> X w u cn H <X <w <2 Q X <w <X <o <X (<
x x x <x x x <
Eł3 ϊη σ < o · cn · 3:Eł3 ϊη σ <o cn 3:
χ αχ α
σ x > x xσ x> x x
X < >X <>
cn X cu 2 θ' x 4 « >cn X cu 2 θ 'x 4 «>
> > o u cn cn x x>> o u cn cn x x
ZETHAT
-O-ABOUT
I—AND-
XX
X EH o cn cn x o < X < u X cn X X 2X EH o cn cn x o <X <u X cn X X 2
X O 2 cn X X α w x w x x ο» X > · X · X · X X χ α x x x x w α cn h zeX O 2 cn X X α w x w x x ο »X> · X · X · X X χ α x x x x w α cn h ze
ΌΌ
u.at.
£tn hU X r-ł 0 2 W O >£ tn hU X r-ł 0 2 W O>
cn in \jOLDcn in \ jOLD
X ,-ι O S x O > cnX, -ι O S x O> cn
o>o>
s ‘Nn u?u 1 s' Nn u? u 1
X £} 0 & X o > cn σ>X £} 0 & X o> cn σ>
□ r-łO χ d 0 w o > cn□ r-łO χ d 0 w o> cn
185 293185 293
H CN σ> cn 1-I CNH CN σ> cn 1-I CN
O LO LO LOAbout LO LO LO
O (ΛAbout (Λ
CC (C a o O CC > <CC (C a o O CC> <
• CL fc H fc CL fc fc £ Eh PC H PC Q W < CO CL U CO• CL fc H fc CL fc fc £ Eh PC H PC Q W <CO CL U CO
CL CLCL CL
O < U OO <U O
Q CLQ CL
HZE d > E- > 'fc fc~ H PCHZE d> E-> 'fc fc ~ H PC
O O • fc • CL • OO O • fc • CL • O
CL • <CL • <
CL CL £ <CL CL £ <
£ > |q q| |pc ££> | q q | | pc £
Fig. 6 (ii) pc pc pc pc CL fc £ £ Q PC o o PC PC u o Eh Ęh PC Q W CL £ £ fc j ω ω fc fcl o o ;PC PC < o £ o o óFig. 6 (ii) pc pc pc CL fc £ £ Q PC o o PC PC u o Eh Ęh PC Q W CL £ fc j ω ω fc fcl o o; PC PC <o o o o
PC PCPC PC
185 293185 293
Obszary o 100% homologii sąw ramkach, a reszry zachowane pomimo udziału w homodimeryzacji są podkreślone.Regions with 100% homology are boxed, and the residues retained despite participating in homodimerization are underlined.
Przedstawiona sekwencja VEGF zawiera sekwenc liderową o 26 aminokwasach (której usunięcie prowadzi do dojrzałego VEGF165), tak żem jej całkowita długość wynosi 191 aminokwasów.The depicted VEGF sequence contains a leader sequence of 26 amino acids (deletion of which leads to mature VEGF 165 ), and has a total length of 191 amino acids.
Homologia SOM175 z VEGF wynosi 27% (33%) na poziomie 165 białka, choć znajdują się w niej bloki o homologii 100%.SOM175 homology with VEGF is 27% (33%) at the 165th protein level, although there are blocks with 100% homology.
W szczególności wiele reszt strukturalnych zostało zachowanych, w: tym te, które mimo to odgrywają rolę w homodimeryzacjiIn particular, many structural residues have been retained, including those that nevertheless play a role in homodimerization
VEGF (przez porównanie z PDGF) np. Cysteina-47VEGF (by comparison to PDGF) e.g. Cysteine-47
Prolina-70, Cysteina-72, Waliba-74 Arginina-77, Cysteina-78, Glicyna-80, Cysteiny 81 i 82 Cystein-89, Prolina-91Proline-70, Cysteine-72, Waliba-74, Arginine-77, Cysteine-78, Glycine-80, Cysteine 81 and 82, Cystein-89, Proline-91
Cysteina 122 i 124Cysteine 122 and 124
185 293 m185 293 m
rOrO
WIN
LU £LU £
OABOUT
ZWITH
LULU
N £N £
N rNo.
z <with <
tr <tr <
I 1And 1
Ί u-) i coΊ u-) and what
sjsj
LULU
CDCD
Z oWith o
NN
OABOUT
LU ωLU ω
ZWITH
ID hFig.7ID hFig. 7
185 293185 293
GENOMOWA STRUKTURA LUDZKIEGO SOM175GENOMIC STRUCTURE OF HUMAN SOM175
185 293 cn fd cn u (T5 td cn o>185 293 cn fd cn u (T5 td cn o>
u cn o u cd rd 0 j_) (du cn o u cd rd 0 j_) (d
Cn cdCn cd
O O <O O <
o <at <
u <u <
O 0At 0
O OO
σι (d uσι (d u
cn ucn u
u uu u
id uid u
rd urd u
o uo u
<<
CĆCĆ
ΓΩΓΩ
OABOUT
Ε» <Ε »<
oabout
LOLO
S}ł lo cnS} ł lo cn
Ol coOl co
GG.
OABOUT
XX
WIN
-K-K
GG.
OABOUT
X ωX ω
G oG o
x wx in
GG.
OABOUT
XX
WIN
GG.
OABOUT
X ωX ω
G oG o
X w10th century
r~~r ~~
GG.
OABOUT
X w10th century
ooo. o
GG.
OABOUT
XX
W oIn o
o <at <
Et (4 aEt (4 a
Lf)Lf)
EhEh
UAT
O uAbout u
UAT
O cn <d υO cn <d υ
td utd u
υ υυ υ
η uη u
EhEh
OABOUT
H oH o
OABOUT
Ε» td υΕ »td υ
υ uυ u
4J υ4J υ
cn jo ucn jo u
uat
Eh uEh u
uat
Eh śEh late
EhEh
OABOUT
Cn Cn fd rd υ id td uCn Cn fd rd υ id td u
40 td 40 id -u40 td 40 id -u
Cn -uCn -u
-u u u (d u-u u u (d u
OABOUT
EhEh
OABOUT
O td jo cn υO td jo cn υ
υ uυ u
u υu υ
u oat o
o <at <
u υu υ
u uu u
cn td ucn td u
υ uυ u
υ rd υυ rd υ
u uu u
O oO
oabout
OABOUT
Eh oEh o
Cn rd υCn rd υ
uat
Cn uCn u
u υu υ
185 293185 293
185 293185 293
-163 gcacgagctcaggccgtcgctgcggcgc tg -103 gggggccgcggaggagccgccccctgcgcc-163 gcacgagctcaggccgtcgctgcggcgc tg -103 gggggccgcggaggagccgccccctgcgcc
-43 ggcggctctggctgacccccccccacaccg-43 ggcggctctggctgacccccccccacaccg
CGTCGCCTGCTGCTTGTTGCACTGCTGCAG RRLLLVALLQCGTCGCCTGCTGCTTGTTGCACTGCTGCAG RRLLLVALLQ
IAND
6 TTTGATGGCCCCAGTCACCAGAAGAAAGTG FDGPSHQKKV6 TTTGATGGCCCCAGTCACCAGAAGAAAGTG FDGPSHQKKV
136 ACATGCCAGCCCAGGGAGGTGGTGGTGCCT TCQPREVVVP136 ACATGCCAGCCCAGGGAGGTGGTGGTGCCT TCQPREVVVP
196 AAACAACTAGTGCCCAGCTGTGTGACTGTG KQLVPSCVTV196 AAACAACTAGTGCCCAGCTGTGTGACTGTG KQLVPSCVTV
256 GGCCTGGAATGTGTGCCCACTGGGCAACAC GLECVPTGQH256 GGCCTGGAATGTGTGCCCACTGGGCAACAC GLECVPTGQH
316 TACCCGAGCAGTCAGCTGGGGGAGATGTCC YPSSQLGEMS316 TACCCGAGCAGTCAGCTGGGGGAGATGTCC YPSSQLGEMS
6 CCTAAAAAAAAGGAGAGTGCTGTGAGGCCA PKKKESAVRP6 CCTAAAAAAAAGGAGAGTGCTGTGAGGCCA PKKKESAVRP
436 CAGCCCCGCTCTGTTCCGGGCTGGGACTCT QPRSVPGWDS436 CAGCCCCGCTCTGTTCCGGGCTGGGACTCT QPRSVPGWDS
Fig.9(i)Fig. 9 (i)
185 293 cgttgcgctgcctgcgcccagggctcggga ccgccccgggtccccgggtccgcgccatgg ccgggctagggcccgATGAGCCCCCTGCTG185 293 cgttgcgctgcctgcgcccagggctcggga ccgccccgggtccccgggtccgcgccatgg ccgggctagggcccgATGAGCCCCCTGCTG
M S P L L -17 (M S P L L -17 (
CTGGCTCGCACCCAGGCCCCTGTGTCCCAG LARTQAPVSQ 4CTGGCTCGCACCCAGGCCCCTGTGTCCCAG LARTQAPVSQ 4
GTGCCATGGATAGACGTTTATGCACGTGCC VPWIDVYARA 24GTGCCATGGATAGACGTTTATGCACGTGCC VPWIDVYARA 24
CTGAGCATGGAACTCATGGGCAATGTGGTC LSMELMGNVV 44CTGAGCATGGAACTCATGGGCAATGTGGTC LSMELMGNVV 44
CAGCGCTGTGGTGGCTGCTGCCCTGACGAT QRCGGCCPDD 64CAGCGCTGTGGTGGCTGCTGCCCTGACGAT QRCGGCCPDD 64
CAAGTCCGAATGCAGATCCTCATGATCCAG QVRMQILMIQ 84CAAGTCCGAATGCAGATCCTCATGATCCAG QVRMQILMIQ 84
IAND
CTGGGAGAACACAGCCAATGTGAATGCAGA LGEHSQCECR 104CTGGGAGAACACAGCCAATGTGAATGCAGA LGEHSQCECR 104
IAND
GACAGGGTTGCCATACCCCACCACCGTCCC D R V A I PHHRP 124GACAGGGTTGCCATACCCCACCACCGTCCC D R V A I PHHRP 124
ACCCCGGGAGCACCCTCCCCAGCTGACATC TPGAPSPADI 144ACCCCGGGAGCACCCTCCCCAGCTGACATC TPGAPSPADI 144
Fig.9(ii)Fig. 9 (ii)
185 293 ł185 293
496 ATCCATCCCACTCCAGCCCCAGGATCCTCT IHPTPAPGSS496 ATCCATCCCACTCCAGCCCCAGGATCCTCT IHPTPAPGSS
S P R I LS P R I L
556 CTGACCCCCGGACCTGCCGTTGCCGCTGTA LTPGPAVAAV556 CTGACCCCCGGACCTGCCGTTGCCGCTGTA LTPGPAVAAV
PDPRTCRCRCPDPRTCRCRC
616 GGGGCTTAGAGCTCAACCCAGACACCTGTA GA*616 GGGGCTTAGAGCTCAACCCAGACACCTGTA GA *
RGLELNPDTCRGLELNPDTC
676676
736736
796796
856856
916916
976976
1036 ctttccagactccacgggcccggctgcttt agcacaggcgtaacctcctcagtctgggag gagctctctcgccatcttttatctcccaga atgtctcacctcaggggccagggtactctc ttctggctggctgtctcccctcactatgaa gggttctgttatgataactgtgacacacac gacactaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1036 ctttccagactccacgggcccggctgcttt agcacaggcgtaacctcctcagtctgggag gagctctctcgccatcttttatctcccaga atgtctcacctcaggggccagggtactctc ttctggctaacctactattaacacgcactatgaacta gggctactattaacacgcactatgaacta
Fig.9 (iii)Fig. 9 (iii)
185 293185 293
GCCCGCCTTGCACCCAGCGCCGCCAACGCC ARLAPSAANA 164GCCCGCCTTGCACCCAGCGCCGCCAACGCC ARLAPSAANA 164
CPPCTQRRQR 130CPPCTQRRQR 130
GACGCCGCCGCTTCCTCCATTGCCAAGGGC DAAASSIAKG 184GACGCCGCCGCTTCCTCCATTGCCAAGGGC DAAASSIAKG 184
RRRRFLHCQG 150 iRRRRFLHCQG 150 i
GGTGCCGGAAGCCGCGAAAGTGĄcaagctgGGTGCCGGAAGCCGCGAAAGTGĄcaagctg
186186
RCRKPRK* 167 acacac tatggccctgcttcacagggagaagagtgg gtcactgccccaggacctggaccttttaga gctgccatctaacaattgtcaaggaacctc tcacttaaccaccctggtcaagtgagcatc aaccccaaacttctaccaataacgggattt iltcacactctgataaaagagatgga aaaaaaaaaaaaRCRKPRK * 167 acacac tatggccctgcttcacagggagaagagtgg gtcactgccccaggacctggaccttttaga gctgccatctaacaattgtcaaggaacctc tcacttaaccaccctggtcaagtgagcatc aaccccaaacttaagaagaaaacttacaagaagataacgcgaagaactaa
Fi g.9(iv)Fi g. 9 (iv)
185 293185 293
47/5247/52
Fig 10(i)Fig 10 (i)
42/5242/52
Fig (0(H)Fig (0 (H)
185 293185 293
AAND
IAND
ΒΒ
185 293185 293
VSQPDAPGHQRKWSWIDVYTRATCQPR 2 9VSQPDAPGHQRKWSWIDVYTRATCQPR 2 9
VSQFDGPSHQKKWPWIDVYARATCQPR 2 9VSQFDGPSHQKKWPWIDVYARATCQPR 2 9
VTVQRCGGCCPDDGLECVPTGQHQVRMQ 7 9VTVQRCGGCCPDDGLECVPTGQHQVRMQ 7 9
111II11IIIIII11IIIII11II11II111II11IIIIII11IIIII11II11II
VTVQRCGGCCPDDGLECVPTGQHQVRMQ 7 9VTVQRCGGCCPDDGLECVPTGQHQVRMQ 7 9
ECRPKKKDSAVKPDSPRPLCPRCTQHHQ 129 lilii Ml MIII II III MMECRPKKKDSAVKPDSPRPLCPRCTQHHQ 129 lilies Ml MIII II III MM
ECRPKKKESAVRPDSPRILCPPCTQRRQ 129ECRPKKKESAVRPDSPRILCPPCTQRRQ 129
GLELNPDTCRCRKLRR* 167GLELNPDTCRCRKLRR * 167
111111111111111:111111111111111:
GLELNPDTCRCRKPRK* 167GLELNPDTCRCRKPRK * 167
APSPADITHPTPAPGPSAHAAPSTTSAL 165APSPADITHPTPAPGPSAHAAPSTTSAL 165
APSPADIIHPTPAPGSSARLAPSAANAL 165APSPADIIHPTPAPGSSARLAPSAANAL 165
186186
186186
Fig.Odi)Fig. Odi)
185 293185 293
44/5244/52
Fig (((ι)Fig (((ι)
45/5245/52
Fig ((ii)Fig ((ii)
185 293185 293
Fig.11(i)Figure 11 (i)
185 293 ł185 293
188188
Fig. (((ii)Fig. (((Ii)
185 293185 293
Fig. 12 <Ν W&a co 2Ζ223 σ} ππνΛ <?μ νππη <νFig. 12 <Ν W & a co 2Ζ223 σ} ππνΛ <? Μ νππη <ν
185 293185 293
SERCE sHEART p
s<s <
oabout
ZDZD
UAT
0.0.
UJOf the Jagiellonian University
CO urCO born
*3 .3kb* 3 .3kb
Fig.(3Fig. (3
185 293185 293
185 293185 293
Fig. 15Fig. 15
185 293185 293
ŚREDNIA DŁUGOŚĆ NEURYTU (um) % PRZEROSTU NEURYTUAVERAGE NEURITE LENGTH (um)% NEURITE EXTENSION
185 293185 293
60006000
5000 „ 4000 ε5000 "4000 ε
30003000
20002000
1000 glej mózgowy cns nl1000 cerebral glia cns nl
OLIGODENDROCYTYOLIGODENDROCITES
i 00 ngand 00 ng
185 293185 293
MYSIE KOMÓRKI ASTROGLEJOWEMOUSE ASTROGLE CELLS
MYSIE KOMÓRKI OLIGODENDROGLEJOWEMOUSE OLIGODENDROGLE CELLS
MYSIE NEURONY PRZEDMÓZGOWIAMOUSE NEURONS IN THE PRE-BRAIN
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.Publishing Department of the UP RP. Circulation of 70 copies
Cena 6,00 zł.Price PLN 6.00.
Claims (36)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AUPN1457A AUPN145795A0 (en) | 1995-03-02 | 1995-03-02 | A novel growth factor and a genetic sequence encoding same |
PCT/AU1996/000094 WO1996027007A1 (en) | 1995-03-02 | 1996-02-22 | A novel growth factor and a genetic sequence encoding same |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL322067A1 PL322067A1 (en) | 1998-01-05 |
PL185293B1 true PL185293B1 (en) | 2003-04-30 |
Family
ID=3785813
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL96322067A PL185293B1 (en) | 1995-03-02 | 1996-02-22 | Novel growth factor and genetic sequence encoding same |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
AU (1) | AUPN145795A0 (en) |
PL (1) | PL185293B1 (en) |
-
1995
- 1995-03-02 AU AUPN1457A patent/AUPN145795A0/en not_active Abandoned
-
1996
- 1996-02-22 PL PL96322067A patent/PL185293B1/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PL322067A1 (en) | 1998-01-05 |
AUPN145795A0 (en) | 1995-03-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20070135344A1 (en) | Novel growth factor and a genetic sequence encoding same | |
DE69734359T2 (en) | RECOMBINANT VASCULAR ENDOTHELIAL CELL GROWTH FACTOR D (VEGF-D) | |
DE69636752T2 (en) | HUMAN GROWTH FACTOR 2, SPECIFIC FOR VASCULAR ENDOTHELIAL CELLS | |
Kocher et al. | Analysis of α-smooth-muscle actin mRNA expression in rat aortic smooth-muscle cells using a specific cDNA probe | |
Nedivi et al. | Numerous candidate plasticity-related genes revealed by differential cDNA cloning | |
DE69534351T2 (en) | Motor neuron life support gene: a gene for spinal muscular atrophy | |
KR100640265B1 (en) | Ly6h gene | |
Foster et al. | Nucleotide sequence of the complementary DNA for turkey growth hormone | |
PL185293B1 (en) | Novel growth factor and genetic sequence encoding same | |
AU707513B2 (en) | A novel growth factor and a genetic sequence encoding same | |
US7160991B1 (en) | Vascular endothelial growth factor polypeptides | |
Khoo | Isolation and characterization of the putative MIH gene sequence from the lobster Jasus edwardsii. | |
WO2001012126A2 (en) | Cardiomyocyte regeneration | |
JPH09294589A (en) | Dna coding for membrane protein of bovine macrophage and vector and transformant containing the dna |