Technika wspólczesna stosuje rozmaite procesy biochemiczne, a zwlaszcza procesy fermentacyjne, np. fermentacje weglowo¬ danów pod wplywem drozdzy i bakteryj, w celu wytwarzania etanolu, izopropanolu, butanolu, acetonu, kwasu mlekowego, ma¬ slowego i t. d. Fermentacje te prowadzi sie zapomoca czystych hodowli posizczególnych gatunków, albo zapomoca ich mieszanin symbiotyczmych.Do uzyskiwania czynników wzbudzaja¬ cych te znane procesy sluza powszechnie znane metody bakterjologicizne (metoda rozcienczania Koch'a, metoda plytkowa, sposób tuszowy wedlug Burri'ego, kultura kroplowa i t d.), W ten sposób wyosobnio¬ no bakterje typu Bacillus butylicus Fitz do jednoczesnego wytwarzania acetonu i wyz¬ szych alkoholi. Sposób ten nie jest tech¬ nicznie doskonaly, poniewaz bakterje te sa nadzwyczaj wrazliwe na infekcje, przy ma- lem stezeniu materjalu fermentujacego daja bardzo zle wydajnosci, moga praco¬ wac wylacznie bez dostepu powietrza (anaerobioza), nie trawia bialek z mate¬ rjalu fermentujacego, wymagaja przeto kosztownego dodatku bialka drozdzy roz¬ lozonego zapomoca Tyrothrix tenuis. Wa¬ dy podobne wykazuje wiele innych bakte¬ ryj (Zentralblatt fur Bakteriologie, czesc II, tom XXIII, str. 385 — 568); wymagaja one przedewsizystkiem uprzedniego roz¬ kladu bialka calego materjalu fermenta¬ cyjnego zapomoca Aspergillus oryzae wciagu S — 4 dni, w celu uzyskania sred¬ niej wydajnosci przy malem stezeniu.* ,' Ponadto "dc.,;wytwarzania butanolu i ace¬ tonu proponowano stosowanie bakteryj odpornych na dzialanie goraca (pat. niem.Nir 445982) prócz tego wczesniej nieco Schardinger wyosobnil bakterje typu Sac- ,charobutyricus mobilis non liauefaciens, wytwarzajace butanol (Zentralbl. f. Bakt., czesc II, toin XVIII, str. 748—767). Spo¬ sób ten nie jest doskonaly, poniewaz u- trudnia dobór najsprawniej dzialajacych bakteryj. Jesli np. 100 probówek, zawiera¬ jacych pozywke 5% -go zacieru z maki ku¬ kurydzowej, w temperaturze 90—100°C zaszczepic niewyjalowiona maka kukury- dzama, to zostaja zabite lub oslabione ga¬ tunki wrazliwe na dzialanie goraca, pomie¬ dzy któremi znajduja sie gatunki technicz¬ nie najcenniejsze. Jesli rurki te pozostawic przez kilka dni w warunkach odpowied¬ nich do rozwoju bakteryj, a nastepnie o- grzewac je, to wlasnie hodowle, które wy¬ tworzyly najwieksza ilosc produktów fer¬ mentacji, a ziatem zawierajace bakterje o najwiekszej sprawnosci fermentacyjnej, zo¬ staja najpredzej oslabione lub zabite, po¬ niewaz butanol w temperaturze wrzenia dziala jako silny srodek antyseptyczny; ogrzewanie moga przetrwac tylko hodowle, zawierajace malo bakteryj sprawnie dzia¬ lajacych, które zatem wytworzyly tak ma¬ lo produktów fermentacji (butanolu), ze ich antyseptyczne dzialanie w temperaturze wrzenia nie wystarcza do zabicia bakteryj.W rzeczywistosci regresywna ta metoda selekcyjna prowadzi do otrzymywania bak¬ teryj bardzo wrazliwych na zakazenie i mogacych przefermentowywac jedynie za¬ ciery o slabem stezeniu (np. 5—8% kuku¬ rydzy; Industrial and Engineering Che- mistry, pazdziernik 1927, str. 1147) z wy¬ dajnoscia okolo % zawartosci skrobi w ma- terjale fermentacyjnym. Dlatego tez i te sposoby sa kosztowne i wadliwe.Obecnie wykryto, ze do otrzymywania szczególnie sprawnych hodowli wywoluja¬ cych fermentacje, odpornych na dzialanie produktów fermentacji, nadaje sie opisana ponizej metoda selekcyjna, poniewaz u- mozliwia ona otrzymywanie bakteryj malo wrazliwych na zakazenie, które przy Wy¬ sokiem stezeniu materjalu fermentacyjne¬ go daja znacznie wieksze wydajnosci, niz wedlug dotychczas znanych sposobów, oraz moga przefermentowywac surowce dowol¬ nego pochodzenia, t. j. posiadaja wszelkie zalety drozdzy gorzelnianych. Sposób we¬ dlug wynalazku polega na tern, ze do prób¬ ki izacieru, przeznaczonej do selekcji, doda¬ je sie produktu, jakiLzamierza sie otrzymac przez fermentacje. Ten dodatek selekcyj¬ ny zapobiega rozwojowi bakteryj, wrazli¬ wych na jego dzialanie, natomiast sprzyja rozwojowi gatunków, mogacych wytwarzac zadany produkt. Przez odpowiednie steze¬ nie dodatku selekcyjnego mozna zapobiec rozwojowi mniej sprawnych gatunków od¬ pornych tylko na slabsze stezenia tego pro¬ duktu, oraz przyspieszyc rozwój odmian odpornych na wyzsze stezenia produktu fermentacji, a przytem zdolnych do wy¬ twarzania tego produktu w wysokich ste¬ zeniach, bez szkody dla dalszego przebie¬ gu procesu fermentacji. Poniewaz sposób ten nie wymaga stosowania wysokiej tem¬ peratury, zapewnia on przeto otrzymywa¬ nie szczególnie sprawnych, wrazliwych na goraco odmian. Samoczynnie przebiegajacy dobór uzupelnia sie jeszcze przez systema¬ tyczny wybór i przeszczepianie bakteryj szczególnie sprawnych, przy jednoczesnem wylaczaniu odmian nieodpowiednich zna- nemi metodami bakterjologicznemi.Ponadto w przeciwienstwie do stosowa¬ nia czystych hodowli oraz ich mieszanin symbiotyciznych korzystne jest stosowanie takich kultur mieszanych, których drobno¬ ustroje zyja w pseudosymbiozie i w meta- biozie, t. j. obok siebie, jednakze nie zawsze musza sobie towarzyszyc (pseudosymbio- za) i moga nawzajem przerabiac dalej swe - 2 —produkty rozkladu oraz przemiany mater ji (m&tabioza). Korzystne jest równiez calko¬ wite stosowanie hodowli lulb wiekszej ich czesci nie w stanie zawieszonym lub zwia¬ zanym z materjalami niestrawnemi, lecz wiazanie ich ze stalemi, biochemicznie strawneani nosnikami (np. czastkami ro¬ slin), które zreszta moga sie swobodnie poruszac, wskutek czego powstaje t. zw. mikropiknkton. W roztworach bakterje po¬ silkuja sie tylko materjalami rozpuszczo- nemi, natomiast w mikroplanktonie maja równiez materjaly nierozpuszczone, zwla¬ szcza substancje bialkowe, umozliwiajace wyzyskanie wszystkich fermentów bakte¬ ryjnych, a dzieki temu zapewniajace wiek¬ szy efekt fermentacji.Wedlug sposobu stanowiacego przed¬ miot niniejszego wynalazku stosuje sie wy¬ lacznie bakterje lub mieaziane hodowle pseudosymbiotyczne, odporne w wysokim stopniu na produkty fermentacji, a otrzy¬ mywane zapomoca metody selekcyjnej, która polega na tern, ze bakterjami, znaj- dujacemi sie ma nosnikach naturallnych (ziemia, nawóz, ziarna zbozowe) zasiewa sie wraz z naturalnemu ich nosnikami prób¬ ke zacieru, zmieszana z produktem fermen¬ tacji w charakterze dodatku selekcyjnego, nastepnie zaszczepione na zacierze bakte¬ rje hoduje sie, poczem wybiera takie prób¬ ki, które fermentuja najsilniej i zawieraja bakterje o normalnym wygladzie i posiada¬ ja nieziarnista protoplazme. Najwlasciwiej stosowac jest takie próbki, które wykazu¬ ja zaczatki powstawania planktonu, przy- czem w razie potrzeby przeszczepia sie wy¬ brane najsilniej fermentujace próbki za¬ cierowe na swieze takiez próbki, zmie¬ szane z tym samym dodatkiem selekcyj¬ nym, powtarza hodowanie zaszczepionych bakteryj i prowadzi w ciagu dalszym w tych samych warunkach ich selekcje oraz przeszczepianie, az do uzyskania jednako¬ wych technicznie wydajnych hodowli, od¬ pornych na produkty fermentacji.Jesli przy otrzymywaniu czynników, Wzbudzlajacych fermentacje, postepowac zgodnie z wylozonemi zasadami (unikanie ogrzewania/stosowanie produktu fermen¬ tacji — jako dodatku selekcyjnego, pseu- dosymlbioza, metabioza, niikroplankton) to, jak sie okazalo w porównaniu z dotychcfca- sowemi sposobami, osiaga sie nastepujace zalety przy prowadzeniu procesów fermen¬ tacyjnych oraz innych procesów bioche¬ micznych. 1. Otrzymane hodowle sa bardzo odpor¬ ne na wplywy zewnetrzne. Np. zarazki zo¬ staja natychmiast zaatakowane, a ich dzia¬ lanie infekcyjne odrazu na poczatku stlu¬ mione. 2. Zmieniajac odpowiednio ilosc do¬ datku selekcyjnego, mozna otrzymac pobu- dziajace fermentacje czynniki o róznej zdolnosci fermentacyjnej, reprezentujace obszerna skale naturalnych iprocesów roz¬ szczepiania i utleniania, i mogace pod wzgledem ilosciowym oraz jakosciowym w duzym stopniu wplywac na przebieg proce¬ sów biochemicznych. Dzieki temu umozli¬ wione jest równiez racjonalnie prowadze¬ nie tych procesów w celu otrzymywania zupelnie okreslonych produktów oraz zwiekszone wytwarzanie tychze kosztem innych niepozadanych produktów. 3. Dzieki metabiotycznym wlasciwo¬ sciom wywolujacych fermentacje hodowli, otrzymywanych metoda Bakony'iego, nie¬ uzyteczne produkty fermentacji usuwa sie albo przeksztalca w pozyteczne. 4. Dzieki bez porównania wiekszej sprawnosci tych Wzbudzajacych fermenta¬ cje hodowli czas trwania fermentacji jest bardzo krótki. 5. Odpornosc przeciwko produktom fermentacji, nabyta dzieki tej metodzie se¬ lekcyjnej, jak równiez zmazane z metabio¬ za usuwanie szkodliwych produktów prze¬ miany materji zapewniaja utrzymywanie znacznie wyzszych stezen, niz przy dotych¬ czasowych sposobach, poniewaz, jak yria- — 3 —domo, te szkodliwe produkty przemiany materji powoduja czestokroc przedwczesne zakonczenie procesów biochemicznych.Pfzy prowadzeniu innych (niz procesy fermentacyjne) procesów biochemicznych zastosowanie wyzej opisanych zasad za¬ pewnia te same korzysci.Przyklad I. Naturalne nosniki bakteryj (czesci roslin, humus, wydzielmy zwierzat roslinozernych i t. d.) zalewa sie woda z wodociagu lub wyjalowionym zacierem, po- czem dodaje sie niewielka ilosc, np. 1 do 2% srodka chemicznego, najlepiej produk¬ tu fermentacji, który zamierza sie otrzy¬ mac w drodze fermentacji, a wiec np. bu¬ tanolu. (Jesli zapomoca fermentacji ma sie otrzymac kilka produktów, to mozna do¬ dawac mieszanine tych produktów, zamiast produktu pojedynczego). Dodatek ten za¬ pobiega rozwojowi wszystkich bakteryj nieodpornych na dzialanie butanolu. Prób¬ ki materjalu posiadanego hoduje sie w cia¬ gu mniej wiecej 24 godzin. Mozna przy- tem stosowac temperatury do 70°C, naj¬ odpowiedniejsze sa jednak temperatury od 28° — do 38°C. Po 24 godzinach wszyst¬ kie przefermentowane próby stanowia mie¬ szanine rozmaitych odpornych na dziala¬ nie butanolu bakteryj, które w daltezym ciagu opisu nazywac sie beda ,,flora buta- noiowa" uzytego maturalnego nosnika bak¬ teryj. Wszystkie te próbki bada sie na¬ stepnie pod mikroskopem i wylacza wszyst¬ kie te, w których drobnoustroje stanowia w wiekszej ilosci mocno zdegenerowane (ziartiiste lub znieksztlalcone) indywidua.Do dalszego uzytku stosuje sie tylko takie „próbki flory", których bakterje posiadaja jednorodna protoplazme i ksztalty normal¬ ne — dwie cechy swiadczace o tern, ze roz¬ maite gatuaki moga przynajmniej istniec obok siebie. Przy poWtórnem badaniu mi- kroskopowem wybiera sie próbki flory, w których bakterje wykazuja daznosc do tworzenia zespolów planktonowych.Terafi próbkami flory zaszczepia sie wy¬ jalowione próbki zacieru, zawierajace rów¬ niez 1 — 2% stosowanego dodatku selek¬ cyjnego. Upnlzedniego ogrzewania tych prób, stosowanego przy pewnych dotych¬ czasowych sposobach hodowania (np. pat. niem. Nr 445982) nalezy starannie unikac, poniewaz, jak sie okazalo, prowadzi ono do oslabiania, a nawet zabicia bardzo waznych gatunków wrazliwych na goraco, oraz do calkowitego zniszczenia zalazków plankto¬ nu. Zaszczepione na zacierze bakterje ho¬ duje sie ponownie przez 24 godziny, po- czem powtarza sie wyzej opisany mikro¬ skopowy wybór wedlug normalnego wy¬ gladu oraz intensywnosci i czestosci two¬ rzenia planktonu. Wybrany materjal szcze¬ pi sie dalej w taki sam sposób na próbkach wyjalowionego zacieru z dodatkiem selek¬ cyjnym, i przefermentowane próby wybie¬ ra sie znowu pod mikroskopem. Zabiegi te powtarza sie az do otrizymania hodowli, wygladajacych zupelnie normalnie i wyka¬ zujacych silna daznosc do tworzenia plank¬ tonu, f ! Przy pomocy tych hodowli uskutecznia sie doswiadczenia fermentacyjne, przy- czem do zacieru dodaje sie uprzednio rów¬ niez okolo 1 — 2% dodatku selekcyjnego.Nastepnie z posród prób zacierowych wy¬ biera sie te, które przefermentoWaly naj¬ szybciej i w odpowiedni sposób okresla sie np. zapomoca destylacji jednej z tych pró¬ bek, pobranej aseptycznie, najwyzsza za¬ wartosc w nich zadanych produktów fer¬ mentacji, w tym przypadku butanolu. Te próby fermentacji stosuje sie do dafezych prób fermentowania, i doswiadczenia te po¬ wtarza sie az do osiagniecia najwiekszej wydajnosci w najkrótszym czasle fermen- towania.Nastepnie stopniowo obniza sie steze¬ nie dodatku selekcyjnego, az wyzej wspo¬ mniany cel da sie osiagnac zupelnie bez dodatku selekcyjnego.Wreszcie stezenie zacieru przeznaczo¬ nego do fermentacji, zwieksza sie, dopóki — 4 —to jest mozliwe, bez obnizenia wydajnosci i bez przedluzenia cziasu trwania fermen¬ tacji.Ostateczny wynik selekcji mozna oczy¬ wiscie jeszcze spotegowac przez dalsze wy¬ dzielanie hodowli mniej odpornych na za¬ kazenie.Przyklad II. Droge selekcyjna, podana w przykladzie I, mozna skrócic w sposób nastepujacy.Otrzymana flore, np. powyzsza flore buitanolowa, przerabia sie dalej zapomoca jakiejkolwiek metody hakterjoiogicznej, np. metoda plytkowa, t. j. poszczególne ko- lonje, znajdujace sie na plytkach bada sie w obecnosci srodka selekcyjnego, stosowa¬ nego do przygotowania danej flory, na ich sprawnosc w wyjalowionych próbach za¬ cierui tylko bardzo wydajne hodowle pod¬ daje sie w razie potrzeby dalszym zabie¬ gom selekcyjnym.Przyklad III. Prowadzenie fermentacji rozszczepiajacej w celu otrzymywania eta¬ nolu, propanolu, izopnopanolu, butanolu, izobutanolu, acetonu i t. d. lub ich miesza¬ nin zapomoca hodowli, otrzymanych we¬ dlug przykladów I i II odbywa sie w na¬ stepujacy sposób: Rozdrobnione materjaly, zawierajace skrobie lub cukier, zawiesza sie w wodzie, przyczem mozna zachowac zwykle steze¬ nie stosowane w gorzelniach. Skrobie zela¬ tynuje sie przez gotowanie i ochladza do temperatury odpowiedniej do selekcji ho¬ dowli fermentacyjnej. Nastepnie dodaje sie hodowle fermentacyjna, wywolujaca silna fermentacje, która konczy sie najpóz¬ niej po 40 godzinach. Otrzymywanie pro¬ duktów uskutecznia sie w drod"ze destyla¬ cji. Pnzy stezeniu np. 12 — 15% kukury¬ dzy (z 60% skrobi) wydajnosc alkoholi i ketonów wynosi 40 — 45% uzytej skro¬ bi.Roztwory cukrowe (np. melase) zadaje sie papka roslinna, aby umozliwic tworze¬ nie sie planktonu.Przyklad IV. Aby wywolac fermenta¬ cje utleniajaca, nalezy zmienic opisana me¬ tode selekcyjna, dodajac wolny kwas or¬ ganiczny (mlekowy, maslowy, octowy), za¬ leznie od rodzaju zadanego produktu.Prócz tego powstajacy kwas zobojetnia sie kreda, woda, amonjakiem i t. d, skoro stezenie tego kwasu przekroczy 2%.Wolny kwas, dzieki temu zawsze obec¬ ny, dziala jako swoisty dodatek selekcyj¬ ny i pmwadzi do otrzymywania hodowli wysokoodpoirnych na dzialanie kwasów.Przy prowadzeniu procesu otrzymywania kwasów organicznych dodaje sie taka utle¬ niajaca hodowle do zacieru i zobojetnia stale wytwarzajacy sie kwas, sikoro steze¬ nie jego przekroczy 2%. Praca aseptyczna jest tu zbyteczna, poniewaz hodowle o- trzymane opisana metoda selekcyjna sa bezwzglednie odporne na zakazenie. Wy¬ tworzone kwasy uwalnia sie i uzyskuje w stanie czystym w sposób zwykly. PL