PL178803B1 - Sposób otrzymywania ekstraktu o działaniu antypatogennym i mitogennym - Google Patents

Abstract

1. Sposób otrzymywania ekstraktu o działaniu antypatogennym i mitogennym, zwłaszcza w stosunku do limfocytów ludzkich, w którym jako materiał wyjściowy stosuje się materiał roślinny, znamienny tym, że ze świeżych korzeni, liści i pędów materiału roślinnego, Glistnikajaskółcze ziele (Chelidonium maius), pozyskanych w fazach intensywnego kwitnienia i/lub owocowania rośliny, wydziela się sokmleczny, który następnie zawiesza się w buforze ekstrakcyjnym, korzystnie chlorowodorku 2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propandiolu o pH od 7,0 do 7,8, wytrząsa i odwirowuje, następnie z supematantu, uzyskanego po odwirowaniu, izoluje się frakcje zawierające białka, korzystnie poprzez wysalanie siarczanem amonu, po czym wydziela się z nich, za pomocą znanych metod rozdziału, co najmniej jedną frakcję o aktywności DN-azowej i mitogennej. 3. Sposób otrzymywania ekstraktu o działaniu antypatogennym i mitogennym, zwłaszczaw stosunku do limfocytów ludzkich, zawierającego białka, znamienny tym, że ze świeżych korzeni, liści i pędów Glistnika jaskółcze ziele (Chelidonium maius) pozyskanych w fazach intensywnego kwitnienia i/lub owocowania rośliny, wydziela się sok mleczny, który zawiesza się- w buforze ekstrakcyjnym, korzystnie chlorowodorku 2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propandiolu o pH 7,0 do 7,8, a następnie poddaje się w znany sposób chromatografii powinowactwa na kolumnach równoważonych korzystnie tym samym buforem, po czym z wyciekuwyodrębnia się co najmniej jedną frakcję o aktywności DN-azowej i mitogennej.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania ekstraktu o działaniu antypatogennym i mitogennym, zwłaszcza w stosunku do limfocytów ludzkich, uzyskiwanego z materiału roślinnego.

Dotychczas dla uzyskania preparatów o działaniu mitogennym stosuje się wysokobiałkowe nasiona roślin. Do ich otrzymania wykorzystuje się znane sposoby izolacji białek z materiałów organicznych.

Istotą wynalazku jest to, że do otrzymywania ekstraktu o działaniu mitogennym stosuje się świeży sok mleczny Glistnikajaskółcze ziele (Chelidonium maius) uzyskany w fazach intensywnego kwitnienia i/lub owocowania rośliny. Zgodnie z wynalazkiem ze świeżych korzeni, liści i pędów Chelidonium Maius wydziela się sok mleczny, który następnie zawiesza się w buforze ekstrakcyjnym, korzystnie chlorowodorku 2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propandiolu (Tris-HCl) o pH od 7,0 do 7,8, wytrząsa i odwirowuje, po czym z supematantu, uzyskanego po odwirowaniu, izoluje się frakcje białek, korzystnie poprzez wysalanie siarczanem amonu, a następnie wydziela się z nich, za pomocąznanych metod rozdziału, co najmniej jednąfrakcję o aktywności DN-azowej i mitogennej. Do rozdziału tych białek korzystnie jest stosować sączenie na sitach molekularnych, elektroforezę w żelu poliakryloamidowym zawierającym siarczan dodecylu sodu, bufory elucyjne w środowisku wodnym lub chromatografię jonowymienną

178 803

W odmianie wynalazku ze świeżych korzeni, liści i pędów Glistnikajaskółcze ziele (Chelidonium maius) pozyskanych w fazach intensywnego kwitnienia i/lub owocowania rośliny, wydziela się sok mleczny, który zawiesza się w buforze Tris-HCl o pH 7,0 do 7,8, a następnie poddaj e się w znany sposób chromatografii powinowactwa na kolumnach równoważonych buforem Tris-HCl, po czym z wycieku wyodrębnia się co najmniej jedną frakcję o aktywności DN-azowej i mitogennej.

Tak w pierwszej, jak i w drugiej odmianie wynalazku korzystnie jest wyodrębnione frakcje, o aktywności DN-azowej i mitogennej, stabilizować za pomocą mieszaniny buforu Tris-HCl i wodnego roztworu glicerolu, przy czym pH mieszaniny wynosi od 7,0 do 8,0, a końcowe stężenie w niej glicerolu - do 30%.

Znane są dotychczas ekstrakty otrzymywane z Chelidonium maius, wykazujące silne działanie fizjologiczne. Jednak sposoby ich pozyskiwania - poprzez sporządzanie odwarów lub wyciągów etanolowych tak z roślin świeżychj ak i suszonych (w tym przez liofilizacj ę) powoduj ą utratę aktywności enzymatycznej materiału biologicznego, ponieważ denaturacja enzymów, która zachodzi podczas wymienionych procesów, nie jest w pełni odwracalna. Natomiast sposób według wynalazku pozwala na otrzymanie ekstraktu praktycznie pozbawionego alkaloidów, amin biogennych i innych substancji wpływających niekorzystnie na jego aktywność biologiczną.

Okazało się, że w ekstrakcie otrzymanym sposobem według wynalazku występują dezoksyrybonukleaza i lektyna o działaniu mitogennym. Enzymy te wykazują aktywność w szerokim zakresie pH i są odporne na szereg czynników zewnętrznych. Z uwagi na to, że białka zawarte w ekstrakcie otrzymanym sposobem według wynalazku działają w szerokim zakresie pH, mogą być stosowane w zwalczaniu infekcji wirusowej chorób kobiecych. Wykazano, że w 90% przypadków raka szyjki macicy przyczyną choroby są wirusy z rodzaju popilloma, których DNA ulega również trawieniu przez białka otrzymane jak w wynalazku. Ze względu na zmieniające się w szyjce macicy pH, ekstrakt ten może w istotny sposób zapobiegać infekcji wirusowej poprzez degradację wirusowego DNA, czy hamowanie jego replikacji. Białka te mogą być także stosowane w badaniu proliferacji limfocytów ludzkich, a otrzymana w ekstrakcie lektyna do testowania grup krwi. Lektyna ta bowiem aglutynuje krwinki ludzkie grupy B i AB. Działanie tych białek jest ponadto wspomagane przez szereg czynników występujących razem z nimi w ekstraktach wyizolowanych sposobem według wynalazku. Doświadczenia wykazują, że są one kofaktorami tych enzymów. Kofaktorami tymi mogą być znajdujące się w ekstrakcie alkaloidy i ich sole oraz kationy II-giej grupy układu okresowego. .

Stabilizacja ekstraktów otrzymanych z Chelidonum maius sposobem według wynalazku za pomocą glicerolu pozwala na zachowanie aktywności enzymatycznej przez około sześć miesięcy. Ma to duże znaczenie, ponieważ tylko aktywne białka ekstraktu mają silne właściwości biobójcze, bakteriostatyczne, grzybobójcze oraz antywirusowe.

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.

Przykład I

Do 5 cm³ soku mlecznego, wyizolowanego z korzeni, liści i pędów Chelidonium maius, dodano mieszaninę buforu Tris-HCl (pH 7,0 do 7,8,0,01 M) i wodnego roztworu glicerolu, przy czym glicerolu było w mieszaninie 30%. Roztwór umieszczono na kilka godzin w temperaturze 277 K, po czym wirowano przez 5 minut przy 12000 obrotów/min., zbierając po odwirowaniu supernatant, który następnie wysalano siarczanem amonu do stężenia 0,2 mol. Wysalanie prowadzono w temperaturze 277 K na mieszadle magnetycznym, dodając siarczan niewielkimi porcjami. Supernatant po wysoleniu pozostawiono przez kilka godzin w temperaturze 277 K. Ponownie roztwór wirowano przez 10 minut przy 12000 obr./min., zbierając po odwirowaniu supernatant (Ekstrakt I).

Ekstrakt I nakładano na kolumnę Sephadex G-100 zrównoważoną buforem Tris-HCl (pH 7,5,0,01 M), zawierającym 30% glicerolu. Nakolumnę o średnicy 1 cm i długości 1 mnakładano około 1 mg białka Ekstraktu I. Kolumnę przemywano buforem równoważącym z dodatkiem 0,5 M chlorku sodu i zbierano frakcje wycieku o objętościach 1 cm3 W każdej frakcji wycieku ozna4

178 803 czano aktywność DN-azową w oparciu o pomiar stopnia hydrolizy DNA oraz mitogeimą- oznaczając proliferację limfocytów ludzkich. Oznaczone frakcje, zawierające dezoksyrybonukleazę oraz lektynę, zbierano oddzielnie i umieszczano w temperaturze 253 K.

Przykład II

Od 100 do 300 pg białka ekstraktu I, otrzymanego jak w przykładzie I, rozdzielano w żelu poliakrylowamidowym zawieraj ącym 0,1% siarczanu dodecylu sodu. Przy rozdziale zastosowano grubość żelu - 3 mm, długość płyty od 17 do 20 cm, napięcie podczas elektroforezy 0,5 V na cm żelu, bufor rozdzielający Tris-Glicyna o pH 8,4 i 0,01 molowy, czas trwania elektroforezy do 20 godzin, przy ciągłym chłodzeniu buforu wodą, przy czym bufor rozdzielający także zawierał 0,1% siarczanu dodecylu sodu. Żel po rozdziale wybarwiano 0,01 molowym chlorkiem potasu, po czym rozdrabniano i zalewano buforem ekstrakcyjnym zawierającym 0,01 M Tris-HCl o pH 7,7, 0,5 M chlorku sodu, 10 mM ditiotreitolu oraz 40 pg albuminy jaja kurzego na 1 ml buforu. Ekstrakcję białek z żelu prowadzono w temperaturze,277 K przez 20 godzin. Następnie wirowano zbierając po odwirowaniu supernatant, który wytrącano 4 objętościami fazy wodnej acetonu o temperaturze 253 K. Wirowanie prowadzono w temperaturze 277 K przy 12000 obrotów na minutę, przez 3 minuty.

Osad białek wytrąconych acetonem zbierano przez wirowanie (10 minut przy 12000 obr./min.) po dziesięciu minutach ich wytrącania w temperaturze 203 K. Następnie przemywano 80% acetonem, suszono na powietrzu i frakcje wykazujące aktywność DN-azową oraz mitogenną, a więc zawierające dezoksyrybonukleazę oraz lektynę, rozpuszczono w mieszaninie buforu Tris-HCl (pH 7,5, 0,01 M) i wodnego roztworu glicerolu, przy czym glicerolu było w mieszaninie 30%, i przechowywano w temperaturze 252 K.

Przykład III

Do 5 cm³ soku mlecznego, wyizolowanego ze świeżych korzeni, liści i pędów Chelidonium maius pozyskanych w fazie intensywnego kwitnienia, dodano mieszaninę buforu Tris-HCl (pH 7,0 do 7,8, 0,01 M) i wodnego roztworu glicerolu, przy czym glicerolu było w mieszaninie 30%. Następnie roztwór poddano chromatografii powinowactwa na kolumnach z Con A - Sepharose zrównoważonych 0,02 M tris hydrochloride 2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propanediolhydrochloride o pH 7,4, zawierającym 0,5 M chlorek sodu. Kolumnę przemywano roztworem zawierającym metylowanąpochodną glukozy (liniowym gradientem a-D-metyloglukozydu) od 0 do 0,2 M w buforze równoważącym.

W każdej frakcji wycieku oznaczano aktywność nukleolitycznąw oparciu o stopień hydrolizy DNA oraz mitogenną - oznaczając proliferacje limfocytów ludzkich. Oznaczone frakcje o aktywności DN-azowej i mitogennej, a więc zawierające dezoksyrybonukleazę oraz lektynę, przechowywano w warunkach, jak podano w przykładzie II.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 2,00 zł.

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania ekstraktu o działaniu antypatogennym i mitogennym, zwłaszcza w stosunku do limfocytów ludzkich, w którym jako materiał wyjściowy stosuje się materiał roślinny, znamienny tym, że ze świeżych korzeni, liści i pędów materiału roślinnego, Glistnika jaskółcze ziele (Chelidonium maius), pozyskanych w fazach intensywnego kwitnienia i/lub owocowania rośliny, wydziela się sok mleczny, który następnie zawiesza się w buforze ekstrakcyjnym, korzystnie chlorowodorku 2-amino-2(hydroksymetylo')-1,3-propandiolu o pH od 7,0 do 7,8, wytrząsa i odwirowuje, następnie z supematantu, uzyskanego po odwirowaniu, izoluje się frakcje zawierające białka, korzystnie poprzez wysalanie siarczanem amonu, po czym wydziela się z nich, za pomocąznanych metod rozdziału, co najmniej jedną frakcję o aktywności DN-azowej i mitogennej.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wydzielone frakcje, o aktywności DN-azowej i mitogennej, stabilizuje się za pomocąmieszaniny buforu chlorowodorku 2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propandiolu i wodnego roztworu glicerolu, przy czym pH mieszaniny wynosi od 7.0 do 8,0, a końcowe stężenie w niej glicerolu - do 30%.
3. 3. Sposób otrzymywania ekstraktu o działaniu antypatogennym i mitogennym, zwłaszcza w stosunku do limfocytów ludzkich, zawierającego białka, znamienny tym, że ze świeżych korzeni, liści i pędów Glistnika jaskółcze ziele (Chelidonium maius) pozyskanych w fazach intensywnego kwitnienia i/lub owocowania rośliny, wydziela się sok mleczny, który zawiesza się w buforze ekstrakcyjnym, korzystnie chlorowodorku 2-amino-2(hydroksymet.ylo)-1,3-propandiolu o pH 7,0 do 7,8, a następnie poddaje się w znany sposób chromatografii powinowactwa na kolumnach równoważonych korzystnie tym samym buforem, po czym z wycieku wyodrębnia się co najmniej jedną frakcję o aktywności DN-azowej i mitogennej.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wydzielone frakcje o aktywności DN-azowej i mitogennej stabilizuje się za pomocąmieszaniny buforu chlorowodorku 2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propandiolu i wodnego roztworu glicerolu, przy czym pH mieszaniny wynosi od 7,0 do 8,0, a końcowe stężenie w niej glicerolu - do 30%.