PL176936B1 - Method of fighting against insects on plants - Google Patents
Method of fighting against insects on plantsInfo
- Publication number
- PL176936B1 PL176936B1 PL94310599A PL31059994A PL176936B1 PL 176936 B1 PL176936 B1 PL 176936B1 PL 94310599 A PL94310599 A PL 94310599A PL 31059994 A PL31059994 A PL 31059994A PL 176936 B1 PL176936 B1 PL 176936B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sequence
- patatin
- plant
- plants
- promoter
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/12—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield
- A01H1/122—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- A01H1/1245—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, e.g. pathogen, pest or disease resistance
- A01H1/127—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, e.g. pathogen, pest or disease resistance for insect resistance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
- A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
- A01N65/38—Solanaceae [Potato family], e.g. nightshade, tomato, tobacco or chilli pepper
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Botany (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Mycology (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Przedmiotem wynalazkujest sposób zwalczania owadów na roślinach i sposób wytwarzania genetycznie transformowanych roślin. Wynalazek realizuje się dzięki białku, które można nakładać bezpośrednio na roślinę albo może być ono wytwarzane na niej przez mikroorganizmy lub przez samą roślinę dzięki genetycznej modyfikacji.The present invention relates to a method for controlling insects on plants and a method for producing genetically transformed plants. The invention is practiced thanks to the protein which can be applied directly to the plant or can be produced there by microorganisms or by the plant itself by genetic modification.
Zastosowanie produktów naturalnych, w tym białek, jest dobrze znanym sposobem zwalczania wielu szkodliwych owadów. Np., endotoksyny Bacillus thuringiensis (B. t.) stosuje się do zwalczania zarówno szkodliwych motyli, jak i tęgopokrywych. Geny wytwarzające te endotoksyny wprowadzano i poddawano ekspresji w różnych roślinach, w tym bawełnie, tytoniu i pomidorach.The use of natural products, including proteins, is a well-known way to combat many harmful insects. For example, Bacillus thuringiensis (B. t.) Endotoxins have been used to control both harmful moths and heavy moths. Genes that produce these endotoxins have been introduced and expressed in a variety of plants, including cotton, tobacco, and tomatoes.
Istnieje jednak kilka ekonomicznie ważnych szkodliwych owadów, które nie są wrażliwe na endotoksyny B. t.. Przykłady takich ważnych szkodników to ryjkowiec (BWV), Anthonomus grandis i gatunki Diabrotica (CRW). Ponadto posiadanie innych produktów genetycznych do zwalczania owadów podatnych na endotoksyny B. t. jest ważne, a nawet doniosłe, z punktu widzenia problemów uodparniania.However, there are several economically important pests that are insensitive to B. t. endotoxins. Examples of such important pests are weevil (BWV), Anthonomus grandis and Diabrotica species (CRW). Moreover, the possession of other genetic products to control insects susceptible to B.t. endotoxins is important, and even significant, from the point of view of immunization problems.
176 936176 936
W roślinach znajduje się kilka innych znanych białek owadobójczych. Obejmują one lektyny, inhibitory amylazy i inhibitory proteazy, które mogąwpływać na wzrost i rozwój owadów po spożyciu w dużych dawkach [Boulter i in., 1989; Broadway i Duffey, 1986; Czapla i Lang, 1990; Gatehouse i in., 1986; Heusing i in., 1991; Ishimoto i K. Kitamura, 1989; Murdock i in., 1990; Shukle i Murdock, 1983), ale nie bywają przyczyną ostrej śmiertelności wywoływanej przez białka B. t.Several other known insecticidal proteins are found in plants. These include lectins, amylase inhibitors, and protease inhibitors that can affect the growth and development of insects when ingested at high doses [Boulter et al., 1989; Broadway and Duffey, 1986; Czapla and Lang, 1990; Gatehouse et al., 1986; Heusing et al., 1991; Ishimoto and K. Kitamura, 1989; Murdock et al., 1990; Shukle and Murdock, 1983), but they are not the cause of the acute deaths caused by B.t.
Celem wynalazkujest zatem wytworzenie takich białek które byłyby zdolne do zwalczania BWV, CRW, lub innych szkodliwych owadów, i geny przydatne do wytwarzania takich białek. Ponadto celem wynalazku było wytworzenie genetycznych konstruktów i sposobu insercji materiału genetycznego do mikroorganizmów i komórek roślinnych.It is therefore an object of the invention to produce such proteins that would be capable of combating BWV, CRW, or other harmful insects, and genes useful for the production of such proteins. Furthermore, the object of the invention was to generate genetic constructs and a method for inserting genetic material into microorganisms and plant cells.
Odkryto, że patatyny, główne białko magazynowe bulw ziemniaka, zwalczają różne owady, w tym Diabrotica virgifera (WCRW), Diabrotica undecimpunctata (SCRW) i ryjkowca (BWV), Anthonomus grandis. Patatyny zabijają niektóre larwy i wstrzymują wzrost pozostałych, a więc zapobiegają ich dojrzewaniu lub poważnieje opóźniają, co uniemożliwia reprodukcję. Białka te, wykazujące znanąaktywność esterazową(lipidowąactlohydrolazową), można podawać (SCRW), podawać bezpośrednio na rośliny lub wprowadzać w inny sposób, np. stosując kolonizujące rośliny mikroorganizmy przetransformowane tak, aby wytwarzały enzymy, lub poddając podobnej transformacji same rośliny.Patatin, the major storage protein of potato tubers, was found to control a variety of insects, including Diabrotica virgifera (WCRW), Diabrotica undecimpunctata (SCRW) and weevil (BWV), Anthonomus grandis. Patatins kill some larvae and inhibit the growth of others, thus preventing their maturation or delaying them severely, preventing reproduction. These proteins, showing known esterase (lipidactlohydrolase) activity, can be applied (SCRW), applied directly to plants, or otherwise introduced, e.g. by using plant-colonizing microorganisms transformed to produce enzymes, or by subjecting the plants themselves to a similar transformation.
Patatyny sąrodzinąbiałek występujących w ziemniakach (Gaillaird, 1971; Racusen, 1984; Andrews i in., 1988) i innych roślinach, szczególnie psiankowatych [Ganal i in., 1991; Vancanneyt i in., 1989]. W ziemniakach patatyny znajduje się głównie w bulwach, ale także w znacznie mniejszej ilości w innych organach rośliny [Hofgen i Willmitzer, 1990]. Badano specyficzność esterazową kilku izozymów patatyny [Hofgen i Willmitzer, 1990; Racusen, 1986].Patatins are a family of proteins found in potatoes (Gaillaird, 1971; Racusen, 1984; Andrews et al., 1988) and other plants, especially nightshade [Ganal et al., 1991; Vancanneyt et al., 1989]. In potatoes, patatin is found mainly in tubers, but also in a much smaller amount in other plant organs [Hofgen and Willmitzer, 1990]. The esterase specificity of several patatin isozymes was investigated [Hofgen and Willmitzer, 1990; Racusen, 1986].
Geny kodujące patatyny wydzielił uprzednio Mignery i in., 1984, Mingnery i in., 1988, Stiekema i in., 1988 i inni badacze. Rosahl i in., 1987, przenieśli je do tytoniu i zaobserwowali ekspresję patatyny. Pokazuje to, że geny patatyny mogą ulegać ekspresji heterologicznej w roślinach.The genes encoding the patatin were previously isolated from Mignery et al., 1984, Mingnery et al., 1988, Stiekema et al., 1988 and other researchers. Rosahl et al., 1987, transferred them to tobacco and observed the expression of patatin. This shows that the patatin genes can be expressed heterologously in plants.
Geny patatyn można wydzielić w podobny sposób i wprowadzić do odpowiednich kaset wektorów transformacji, które następnie (1) stosuje się do transformacji kolonizujących rośliny mikroorganizmów, które umieszczone na roślinach pozwalają na ekspresję genów wytwarzających patatynę i w ten sposób zwalczają owady, lub (2) wprowadza się do genomu rośliny, która następnie chroni się sama przed atakiem owadów dzięki ekspresji genu i wytwarzaniu patatyny. Ponadto roślinę można także przekształcić lub wyhodować tak, aby wykazywała współekspresjęjednego lub wielu genów B. t. kodujących białka zwalczające owady. Dzięki temu otrzyma się rośliny, które (1) są zabezpieczone przed wieloma szkodnikami i/lub (2) wykazują dwojakie działanie zwalczające pewne szkodniki, co stanowi ważne narzędzie z punktu widzenia problemów uodparniania. Przykłady roślin transformowanych w celu wykazywania ekspresji genów B. t. opisano w europejskim opisie patentowym nr 0385962, odpowiadającym zgłoszeniu patentowemu Stanów Zjednoczonych Ameryki nr kolejny 476661, złożonemu 12 lutego 1990, [Fischhoff i in.], dołączonemu niniejszym jako odnośnik literaturowy. Ponadto roślinę można także transformować lub hodować tak, aby wykazywała współekspresję genu inhibitora proteinazy, takiego jak kodujący inhibitor papainy ziemniaka [Rodis i Hofff, 1984] lub inhibitor trypsyny soi [przegląd u Ryana, 1990], ponieważ inhibitory proteinaz wykazały wzmacnianie aktywności innych owadobójczych białek.Patatin genes can be similarly isolated and inserted into appropriate transformation vector cassettes, which are then (1) used to transform plant-colonizing microorganisms that, when placed on plants, allow expression of patatin-producing genes and thus control insects, or (2) introduce into the plant's genome, which then protects itself from insect attack by gene expression and patatin production. In addition, the plant may also be engineered or bred to co-express one or more B. t genes encoding insect control proteins. Thereby, plants will be obtained which (1) are protected against many pests and / or (2) have a dual action of controlling certain pests, which is an important tool in view of immunization problems. Examples of plants transformed to express B. t genes are described in European Patent No. 0385962, corresponding to United States Patent Application Serial No. 476,661, filed February 12, 1990, [Fischhoff et al.], Incorporated herein by reference. Furthermore, the plant may also be transformed or bred to co-express a proteinase inhibitor gene, such as that encoding a potato papain inhibitor [Rodis and Hofff, 1984] or a soybean trypsin inhibitor [reviewed in Ryan, 1990], since proteinase inhibitors have shown to potentiate the activity of other insecticidal proteins. .
Przedmiotem wynalazkujest sposób zwalczania owadów na roślinach, polegający na tym, że stosuje się skutecznąilość owadobójczej patatyny. W sposobie korzystnie stosuje się patatynę wytwarzaną przez kolonizujące roślinę mikroorganizmy wytwarzające patatynę po umieszczeniu ich na roślinie. Rośliny korzystnie sąprzetransformowane tak aby wykazywały ekspresję patatyny wytwarzaną dzięki ekspresji genu patatyny wstawionego w roślinę metodą wcześniejszej transformacji genetycznej macierzystej komórki rośliny.The present invention relates to a method of controlling insects on plants which comprises using an effective amount of an insecticidal patatin. The method preferably uses patatin produced by the plant colonizing patatin producing microorganisms when applied to the plant. Plants are preferably transformed to exhibit patatin expression produced by expression of a patatin gene inserted into the plant by prior genetic transformation of the plant parent cell.
W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku jako roślinę stosuje się bawełnę, kukurydzę, pomidor lub ziemniak.In a preferred embodiment of the method according to the invention, the plant is cotton, corn, tomato or potato.
176 936176 936
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania genetycznie transformowanych, roślin odpornych na owady i wydzielających w wyniku ekspresji owadobójczo skuteczną ilość patatyny w którym transformuje się komórki gospodarza genem kodującym pożądane białko, otrzymuje się transformowane komórki roślinne oraz regeneruje się z tych transformowanych komórek roślinnych rośliny wykazujące ekspresję owadobójczo skutecznej ilości patatyny, polegający na tym, że wstawia się do genomu komórki roślinnej rekombinacyjną, dwułańcuchową cząsteczkę DN A zawieraj ącąpromotor powoduj ący powstawanie w komórkach rośliny sekwencji RNA; strukturalną, sekwencję kodującąpatatynę; nietranslowany region 3' powodujący dodanie w komórce rośliny nukleotydów poliadenylujących do końca 3' sekwencji RNA, przy czym promotorjest heterologiczny w odniesieniu do strukturalnej sekwencji kodującej orazjest operatywnie połączony ze strukturalną sekwencją kodującą, która jest z kolei operatywnie połączona ze wspomnianym nietranslowanym regionem; przy czym promotorjest heterologiczny w odniesieniu do strukturalnej sekwencji kodującej, a rośliny wybiera się spośród bawełny, kukurydzy, pomidora i ziemniaka.The invention also relates to a method for producing genetically transformed, insect-resistant plants expressing an insecticidally effective amount of patatin, in which the host cells are transformed with a gene encoding the desired protein, transformed plant cells are obtained, and plants that are insecticidally expressed are regenerated from these transformed plant cells. an effective amount of patatin by inserting into the genome of the plant cell a recombinant, double-chain DN A molecule containing a promoter causing the formation of an RNA sequence in plant cells; structural, patatin coding sequence; a 3 'untranslated region for causing the addition of polyadenylation nucleotides in a plant cell to the 3' end of an RNA sequence, the promoter being heterologous to a structural coding sequence and operably linked to a structural coding sequence which is in turn operably linked to said untranslated region; wherein the promoter is heterologous with respect to the structural coding sequence, and the plants are selected from cotton, corn, tomato and potato.
Korzystnie jako strukturalną sekwencję kodującą stosuje się sekwencję nr id. 30 lub · sekwencję nr id. 31. Jeżeli jako korzystne wykonanie wynalazku jako roślinę stosuje się kukurydzę, korzystną sekwencjąjest strukturalna sekwencję o numerze identyfikacyjnym id. 33.Preferably, sequence no. Id is used as the structural coding sequence. 30 or · sequence no. 31. When a maize plant is used as a plant as a preferred embodiment of the invention, the preferred sequence is the structural sequence SEQ ID NO. 33.
Korzystnie roślina wykazuje ekspresję patatyny w ilości stanowiącej około 0,1-0,5% całkowitego białka.Preferably, the plant expresses patatin in an amount of about 0.1-0.5% of the total protein.
W niniejszym opisie, termin „zwalczanie owadów“ oznacza zmniejszanie liczby owadów zmniejszających wydajność roślin, dzięki zwiększonej śmiertelności, opóźnieniu rozwoju larw (zahamowaniu rozwoju), lub obniżeniu zdolności do reprodukcji. W niniejszym opisie, termin „owadobójczy“oznacza zdolny zmniejszenia liczby owadów zmniejszających wydajność roślin, dzięki zwiększonej śmiertelności, opóźnieniu rozwoju larw (zahamowaniu rozwoju), lub obniżeniu zdolności do reprodukcji.As used herein, the term "insect control" means reducing the number of insects that reduce plant productivity through increased mortality, retardation of larval development (inhibition of development), or decreased reproductive capacity. As used herein, the term "insecticide" means the ability to reduce the number of insects that reduce the productivity of plants through increased mortality, retardation of larval development (inhibition of development), or reduced reproductive capacity.
W niniejszym opisie, termin „strukturalna sekwencja kodująca“ oznacza sekwencję DNA kodującą polipeptyd, który można otrzymać w komórce dzięki kolejnej transkrypcji DNa do mRNA, i następnie translacji do żądanego polipeptydu.As used herein, the term "structural coding sequence" means a DNA sequence encoding a polypeptide that can be obtained in a cell by sequentially transcribing DNa into mRNA, followed by translation into the desired polypeptide.
W niniejszym opisie, termin „patatyna“ oznacza roślinne białko wykazujące 75% lub więcej homologii do białka kodowanego przez sekwencję nr identyfikacyjny 31, pokazaną dalej, korzystniej co najmniej 80% homologii, a najkorzystnej co najmniej 85% homologii. Termin ten obejmuje także białka wytwarzane przy pomocy syntetycznych sekwencji DNA zaprojektowanych z punktu widzenia polepszonej ekspresji w roślinach jednoliściennych.As used herein, the term "patatin" means a vegetable protein having 75% or more homology to the protein encoded by SEQ ID NO: 31, shown hereinafter, more preferably at least 80% homology, and most preferably at least 85% homology. The term also includes proteins produced with synthetic DNA sequences designed for improved expression in monocotyledons.
Patatyny są rodziną esteraz występujących w ziemniakach (Gaillaird, 1971; Racusen, 1984; Andrews i in., 1988) i innych roślinach, szczególnie psiankowatych [Ganal i in., 1991; Vancanneyt i in., 1989]. W ziemniakach patatyny znajduje się głównie w bulwach, ale także w znacznie mniejszej ilości w innych organach rośliny [Hofgen i Willmitzer, 1990]. Badano specyficzność esterazową kilku izozymów patatyny [Hofgen i Willmitzer, 1990; Racusen, 1986] i stwierdzono ich szeroką specyficzność na substrat, wskazującą na ograniczone wymagania enzymów wobec substratów. Stosowanie wszystkich pochodzących z roślin patatyn i ich równoważników, zarówno opisanych tutaj szczegółowo, jak i białek homologicznych, niezależnie od pochodzenia z naturalnych czy syntetycznych sekwencji DNA, do celów zwalczania plag owadów na roślinach mieści się w zakresie wynalazku.Patatins are a family of esterases found in potatoes (Gaillaird, 1971; Racusen, 1984; Andrews et al., 1988) and other plants, especially nightshades [Ganal et al., 1991; Vancanneyt et al., 1989]. In potatoes, patatin is found mainly in tubers, but also in a much smaller amount in other plant organs [Hofgen and Willmitzer, 1990]. The esterase specificity of several patatin isozymes was investigated [Hofgen and Willmitzer, 1990; Racusen, 1986] and their broad substrate specificity was found, indicating limited enzyme requirements for the substrates. The use of all plant-derived patatins and their equivalents, both described in detail herein, and homologous proteins, whether derived from natural or synthetic DNA sequences, for the purposes of controlling insect infestation on plants are within the scope of the invention.
Surowe preparaty patatyny z ziemniaków są dostępne w handlu. Np. Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, oferuje preparaty białka ziemniaka określane przez firmę jako kwaśna fosfataza (P-1146 i P-3752) lub apiraza (A-9149). Można także wytworzyć ekstrakty białka z bulw ziemniaczanych sposobami opisanymi w literaturze (Racusen i Foote, 1980; Park i in., 1983).Raw potato patatin preparations are commercially available. For example, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, offers potato protein preparations referred to by the company as acid phosphatase (P-1146 and P-3752) or apyrase (A-9149). Protein extracts of potato tubers can also be prepared by methods described in the literature (Racusen and Foote, 1980; Park et al., 1983).
Testy skuteczności biologicznejBiological effectiveness tests
Testy biologiczne przy diecie sztucznejBiological tests in an artificial diet
Przeprowadzono testy aktywności wobec larw SCRW, BWV, stonki ziemniaczanej (CPB), Leptinotarsa decemlineata, i europejskiego gatunku Ostrinia nubilalis (ECB) nakładając badaną próbkę na pokarm agarowy, podobnie jak opisał dla SCRW Marrone i in., 1985. Badane próbkiActivity tests were carried out against SCRW larvae, BWV, Colorado potato beetle (CPB), Leptinotarsa decemlineata, and the European species Ostrinia nubilalis (ECB) by applying the test sample to food agar, as described for SCRW by Marrone et al., 1985. Test samples
176 936 wytworzono rozpuszczając białko w 4-5 ml 10 mM HEPES, pH 7,5, i dializując w tym samym buforze stosując układ rurek odcinających przy masie cząsteczkowej 3500. Świeżo wylęgnięte larwy karmi się pokarmem z próbkąw temperaturze 26°C i bada śmiertelność oraz zahamowanie rozwoju po 5 lub 6 dniach. Wyniki testów P-3752 (Sigma) podano w tabeli 1. Ten surowy preparat ziemniaczany wykazał szerokie spektrum działania owadobójczego.176,936 was prepared by dissolving the protein in 4-5 ml of 10 mM HEPES, pH 7.5, and dialyzing in the same buffer using a cut-off tube system at a molecular weight of 3500. Freshly hatched larvae are fed with the sample at 26 ° C and tested for mortality and inhibition of development after 5 or 6 days. The results of the tests P-3752 (Sigma) are given in Table 1. This crude potato preparation showed a broad spectrum of insecticidal activity.
Tabela 1Table 1
= nieznaczne zahamowanie rozwoju (około 30-40% zmniejszenie rozmiarów) t(= umiarkowane zahamowanie rozwoju (około 50-80% zmniejszenie rozmiarów) = ostre zahamowanie rozwoju (ponad 90% zmniejszenie rozmiarów)= slight development inhibition (approx. 30-40% size reduction) t ( = moderate development inhibition (approx. 50-80% size reduction) = acute development inhibition (more than 90% size reduction)
Dokonano dokładnych ważeń SCRW (tabela 2) po 5 dniach testu i ECB (tabela 3) po 6 dniach testu i przedstawiono je poniżej. Larwy SGRW rozwijające się na pokarmie zawierającym P-3752 wykazały 92% zmniejszenie masy w porównaniu z kontrolnymi, a larwy ECB wykazały 62% Zmniejszenie masy w porównaniu ' z kontrolnymi.The exact weightings of the SCRW (table 2) after 5 days of testing and the ECB (table 3) after 6 days of testing were performed and are summarized below. The SGRW larvae developing on the food containing P-3752 showed a 92% weight reduction compared to the controls, and the ECB larvae showed a 62% weight reduction compared to the controls.
Tabela 2Table 2
średnia masa przeżywających znacząco różna na poziomie 95% (jeden czynnik ANOYA).the mean mass of survivors was significantly different at the level of 95% (one ANOVA factor).
Tabela 3Table 3
średnia masa przeżywających znacząco różna na poziomie 95% (jeden czynnik ANOYA).the mean mass of survivors was significantly different at the level of 95% (one ANOVA factor).
Białkową naturę składnika owadobójczego P-3752 aktywnie działającego na SCRW i BWV określono dzięki nietrwałości na ogrzanie, wytrącanie siarczanem amonu, frakcjonowanie względem masy cząsteczkowej i eksperymenty z podatnością na proteazę.The protein nature of the insecticide component P-3752 active against SCRW and BWV was determined by heat instability, ammonium sulphate precipitation, molecular weight fractionation and protease susceptibility experiments.
Aby potwierdzić, że działanie P-3752jest bezpośrednio związane ze spożyciem patatyny, a nie jest pośrednim efektem reakcji na pokarm, przeprowadzono studium doboru pokarmu z ECB i SCRW. Wyniki tego studium wskazują, że larwy spożywały pokarm zarówno z P-3752, jak i Tris, bez wyraźnych preferencji. Nie zauważono unikania pokarmu z P-3752 w porównaniu z pokarmem z Tris.To confirm that the effect of P-3752 is directly related to the consumption of patatin and not an indirect effect of the food reaction, a food selection study with ECB and SCRW was performed. The results of this study indicated that the larvae consumed food from both P-3752 and Tris, with no apparent preference. Avoidance of food from P-3752 compared to food from Tris was not observed.
176 936176 936
Długoterminowy (25 dni) test działania P-3752 na SCRW wykorzystywał larwy po 2 wylince i kilkakrotne przenoszenie przeżywających owadów na świeżo poddany obróbce pokarm. Na koniec studium wszystkie larwy kontrolne przeszły w poczwarki. W przeciwieństwie do tego 50% larw po zabiegu nie żyło, a pozostałe 50% zwiększyło masę ciała tylko o 16% początkowej (2,48 mg wobec 2,14 mg). Wskazuje to na zatrzymanie, a nie tylko spowolnienie rozwoju larw. Jest to bardzo ważne z punktu widzenia zwalczania owadów, ponieważ larwy nie osiągają dojrzałości. Liczba Diabrotica undecimpunctata będzie mniejsza w przyszłych pokoleniach.The long-term (25 days) test of P-3752 for SCRW utilized 2 instar larvae and repeated transfer of surviving insects to freshly treated food. At the end of the study, all control larvae became pupae. In contrast, 50% of the larvae after the procedure were dead, and the remaining 50% increased their body weight by only 16% of the initial weight (2.48 mg versus 2.14 mg). This indicates a halt, not just a slowing down of the development of the larvae. This is very important from the insect control point of view as the larvae do not reach maturity. The number of Diabrotica undecimpunctata will be lower in future generations.
Larwy Diabrotica virgifera (WCRW) można stosować w laboratoryjnych eksperymentach tylko w stanie po 2 wylince. W celu zbadania działania P-3752 na WGRW zaprojektowano równoległy test z użyciem larw SCRW po 2 wylince. Działanie P-3752 spowodowało tylko odpowiednio 13% i 11% przyrostu masy larw po 2 wylince SCRW i WcRw. Kontrolne larwy SCRW zwiększyły masy o 474%, a WCRW o 200% w ciągu 7 dni. Wskazuje to, że» aktywność patatyny wobec WCRW i SCRW jest w przybliżeniu jednakowa.Diabrotica virgifera (WCRW) larvae can be used in laboratory experiments only in the 2-moulted state. In order to test the effect of P-3752 on WGRW, a parallel test was designed using SCRW larvae after 2 instars. The action of P-3752 caused only 13% and 11% weight gain of SCRW and WcRw larvae after the 2nd instar, respectively. The control SCRW larvae increased weight by 474% and the WCRW larvae by 200% in 7 days. This indicates that »the activity of patatin against WCRW and SCRW is approximately the same.
P-3752 wykazywał niewielką aktywność wobec Heliothis virescens (TBW), Spodoptera exigua (BAW), Helicoverpa zea, Pectinophora gossypiella i Manduca sexta, dając wskaźnik zahamowania rozwoju od 1 to 1,5 przy tych smych stężeniach, przy których SCRW wykazywał wskaźnik zahamowania rozwoju 3. P-3752 dał wskaźnik zahamowania rozwoju 2,5 dla Agrotis ipsilon. (Wskaźniki zahamowania rozwoju zdefiniowano powyżej w tabeli 1.) Nie wykazał aktywności wobec mszycy Myzus persicae w badanych stężeniach.P-3752 showed little activity against Heliothis virescens (TBW), Spodoptera exigua (BAW), Helicoverpa zea, Pectinophora gossypiella and Manduca sexta, giving a growth inhibition index of 1 to 1.5 at those low concentrations at which SCRW showed an inhibition index 3. P-3752 gave a growth inhibition index of 2.5 for Agrotis ipsilon. (Growth inhibition indices are defined above in Table 1.) He showed no activity against Myzus persicae at the tested concentrations.
Testy biologiczne przy diecie roślinnej (1) Ziemniak: 1 g surowego P-3752 rozpuszczono w 4 ml 25 mM Tris, bufora o pH 7,5, następnie dializowano i przesączono przez membranę 0,2 gm. Dodano Triton®X-100 w celu utworzenia roztworu 0,1%. Liście ziemniaków zanurzono w preparacie enzymu i umieszczono na zwilżonym sączku bibułowym w szalce Petriego. Dodano larwy CPB i szalki poddano inkubacji w temperaturze 27°C przez 3 dni. Obróbka liści ziemniaka P-3752 pozwoliła na zahamowanie rozwoju i spowolnione odżywianie larw CPB. Na końcu testu, znacznie mniej tkanki listnej pozostało na liściach kontrolnych w porównaniu z traktowanymi P-3752.Plant-based bioassay (1) Potato: 1 g of crude P-3752 was dissolved in 4 ml of 25 mM Tris, pH 7.5 buffer, then dialyzed and filtered through a 0.2 gm membrane. Triton®X-100 was added to form a 0.1% solution. Potato leaves were dipped in the enzyme preparation and placed on a moist filter paper in a petri dish. CPB larvae were added and the dishes were incubated at 27 ° C for 3 days. The treatment of the potato P-3752 leaves inhibited the development and slowed down the feeding of CPB larvae. At the end of the test, significantly less leaf tissue remained on the control leaves compared to those treated with P-3752.
(2) Kukurydza i bawełna: Callus czarnej meksykańskiej słodkiej kukurydzy (BMS) lub bawełny zdjęto z płytek agarowych i przeniesiono do 50 ml probówek do wirownia. Callus odwirowano w wirówce klinicznej IEC przez 5 minut przy nastawie 8 i supernatant zdekantowano. Do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 15 ml granulek calłusa dodano 30 ml ciekłego 2% agaru. Po starannym zmieszaniu pokarm pipetowano na miejsce testu biologicznego owadów. Pokarm pokryto dializowanym P-3752 (20% objętościowych) i test prowadzono tak, jak opisano powyżej.(2) Corn and Cotton: Callus of black Mexican sweet corn (BMS) or cotton was removed from agar plates and transferred to 50 ml centrifuge tubes. The callus was centrifuged in an IEC clinical centrifuge for 5 minutes at setting 8 and the supernatant decanted. 30 ml of liquid 2% agar was added to a 50 ml tube containing 15 ml of calf granules. After thorough mixing, the food was pipetted onto the insect bioassay site. The food was covered with dialyzed P-3752 (20 vol.%) And the test was performed as described above.
Ucięte korzenie i pędy kukurydzy nasączono pod zmniejszonym ciśnieniem (nas.) surowym P-3752 lub 25 mM Tris, buforem o pH 7,5. Próbkę kontrolną zanurzono w buforze Tris. W studzienkach umieszczono około 10-15 kawałków korzenia lub 3 kawałki pędu na płytce do hodowli z 24 studzienkami, co powtórzono 4 razy. Do każdej studzienki dodano cztery właśnie wylęgnięte larwy SCRW. Testowe płytki poddano inkubacji w temperaturze 26°C przez 4 dni, po czym określono śmiertelność i przeciętnąmasę larwy. Wyniki testów pokazano w tabeli 4.The cut corn roots and shoots were soaked under reduced pressure (sat) crude P-3752 or 25 mM Tris, pH 7.5 buffer. A control sample was immersed in Tris buffer. Approximately 10-15 pieces of root or 3 pieces of shoot were placed in the wells in a 24-well culture plate which was repeated 4 times. The four newly hatched SCRW larvae were added to each well. The test plates were incubated at 26 ° C for 4 days, and the mortality and average larvae weight were determined. The test results are shown in Table 4.
Tabela 4Table 4
176 936 cd. tabeli 4176,936 cont. table 4
Tak więc działanie owadobójcze na wszystkie cztery gatunki (SCRW, BWV, CPB, i ECB) zachowuje się, gdy P-3752jest spożywany razem z tkanką rośliny. Powyższe studia pokarmowe wykazują, że patatyny są aktywne owadobójczo w testach pokarmów, których składniki są wyłącznie tkanką roślinny (korzenie, pędy, callus lub liście).Thus, the insecticidal activity against all four species (SCRW, BWV, CPB, and ECB) is preserved when P-3752 is ingested with plant tissue. The above nutritional studies show that patatins are insecticidally active when tested with foods whose ingredients are purely plant tissue (roots, shoots, callus or leaves).
Badania sposobu działaniaMode of action studies
Poniższe badania sugerują, że patatyna, owadobójczo aktywny składnik P-3752, oddziaływuje bezpośrednio na owada i że działanie ukazane w doświadczeniach opisanych powyżej nie może być przypisane działaniu składnika aktywnego na pokarm owada przed spożyciem.The following studies suggest that patatin, the insecticidally active ingredient of P-3752, acts directly on the insect and that the effect shown in the experiments described above cannot be attributed to the effect of the active ingredient on the insect's food before ingestion.
Studium wpływu pokarmuFood effect study
Rozpuszczono 1 g P-3752 w 10 ml 25 mM Tris, bufora o pH 7,6, następnie dializowano go w układzie rurek MWCO 12-14000 wobec tego samego bufora. Po filtracji 0,2 μη, porcje 50 pl dodano do studzienek z pokarmem owada na dwu płytkach na 4 dni przed dodaniem owadów. Obie płytki poddano inkubacji w temperaturze 27°C przez 4 dni. Po inkubacji, jedną płytkę ogrzano do temperatury 80°C przez 1 godzinę w celu deaktywacji enzymów. Na trzecią płytkę nałożono porcje 50 pl. Do testu z SCRW wykorzystano więc płytki inkubowane, inkubowane i ogrzane oraz nieinkubowane.1 g of P-3752 was dissolved in 10 ml of 25 mM Tris, pH 7.6 buffer, then dialyzed in a MWCO 12-14000 tube system against the same buffer. After 0.2 µη filtration, 50 µl aliquots were added to the insect food wells of two plates 4 days prior to the addition of the insects. Both plates were incubated at 27 ° C for 4 days. After incubation, one plate was heated to 80 ° C for 1 hour to deactivate the enzymes. 50 µl portions were applied to the third plate. Thus, for the SCRW test, incubated, incubated and warmed as well as non-incubated plates were used.
Aktywność wobec SCRW w studium preinkubacyjnym była następująca: nieinkubowane P-3752 - 6*** inkubowane P-3752 - 0** inkubowane, ogrzewane P-3752 - 0Activity against SCRW in the pre-incubation study was as follows: unincubated P-3752 - 6 *** incubated P-3752 - 0 ** incubated, heated P-3752 - 0
Chociaż część aktywności uległa utracie w czasie inkubacji pokarmu, całkowitąutratę spowodowało ogrzewanie. Dane te są zgodne z teorią bezpośredniego działania po spożyciu, a rozpatrywane w połączeniu z testami z tkanką roślinną i zmiennością działania wobec różnych owadów wskazują, że działanie białka na SCRW i inne owady nie polega na efekcie pokarmowym.Although some activity was lost during food incubation, heating resulted in total loss. These data are consistent with the theory of direct effect upon ingestion, and when considered in conjunction with plant tissue testing and variability in action against different insects, indicate that the action of the protein on SCRW and other insects is not based on the food effect.
Identyfikacja białkaProtein identification
Składnik owadobójczo aktywny z P-3752 oczyszczono, częściowo sekwencjonowano, i scharakteryzowano. Czynniki aktywne zidentyfikowano jako patatynę, rodzinę lipidowych acylohydrolaz z ziemniaka.The insecticide active ingredient from P-3752 was purified, partially sequenced, and characterized. The active factors were identified as patatin, a family of potato lipid acylhydrolases.
Wydzielenie białkaIsolation of protein
W celu oczyszczenia bioaktywnego wobec SCRW składnika P-3752 zastosowano cztery różne protokoły.Four different protocols were used to purify the SCRW bioactive component P-3752.
Oczyszczanie aktywnego wobec SCRW składnika metodą chromatografii anionowymiennej. Aktywny wobec SCRW składnik z P-3752 oczyszczono metodą chromatografii anionowymiennej na Q-Sepharose (Pharmacia), a następnie na MONO-Q (HR 5/5, Pharmacia). Ilości białka w aktywnych wobec SCRW frakcjach wskazały, że zaobserwowane ** zahamowanie rozwoju osiągnięto przy stężeniu białka w pokarmie wynoszącym 31 ppm. Chromatografia SDS-PAGE wskazała, że w aktywnych frakcjach były obecne 3 główne pasma białka (Mr 42000, ~26000 i ~ 16000).Purification of SCRW active component by anion exchange chromatography. The SCRW active component from P-3752 was purified by anion exchange chromatography on Q-Sepharose (Pharmacia) followed by MONO-Q (HR 5/5, Pharmacia). The amounts of protein in the SCRW-active fractions indicated that the observed ** growth inhibition was achieved at a dietary protein concentration of 31 ppm. SDS-PAGE chromatography indicated that 3 major protein bands (M r 42,000, ~ 26,000, and ~ 16,000) were present in the active fractions.
176 936176 936
Pięcioetapowe oczyszczanie aktywnego wobec SCRW składnika - Zastosowano 5 kolejnych etapów oczyszczania aktywnego wobec SCRW składnika z P-3752. Było to odsiewanie na membranie, wytrącanie siarczanem amonu, chromatografia jonowymienna na Q-Sepharose, chromatografia jonowymienna na S-Sepharose i chromatografia z wykluczaniem rozmiarów na P-200. Chromatografia SDS-PAGE najczystszych aktywnych wobec SCRW frakcji wykazała pasma białka Mr 42000, ~26000 i ~ 16000.Five Step Purification of SCRW Active Component - 5 successive steps of purification of SCRW active component from P-3752 were used. These were membrane sieving, ammonium sulfate precipitation, Q-Sepharose ion exchange chromatography, S-Sepharose ion exchange chromatography, and P-200 size exclusion chromatography. SDS-PAGE chromatography of the purest SCRW active fractions showed Mr 42,000, ~ 26,000, and ~ 16,000 protein bands.
Oczyszczanie bioaktywnego składnika metodą ogniskowania izoelektrycznego - Bioaktywnych wobec SCRW białka ziemniaka oczyszczono w dwu kolejnych przebiegach na frakcjonatorze białek RF3 (Rainin) zgodnie z instrukcją producenta. Profil uzyskany metodą SDS-PAGE aktywnych wobec SCRW frakcji był bardzo podobny do profilu obserwowanego dla aktywnych frakcji z 5-etapowego oczyszczania i anionowymiennego oczyszczania. Metoda IEF na żelu wykazała, że białka ulegają frakcjonowaniu przy pH od 4,6 to 5,1, zgodnie z publikowanym zakresem pl dla patatyny (Racusen i Foote, 1980).Purification of the bioactive component by isoelectric focusing - Potato proteins bioactive against SCRW were purified in two successive runs on an RF3 protein fractionator (Rainin) according to the manufacturer's instructions. The SDS-PAGE profile of the SCRW active fractions was very similar to that observed for the active fractions from the 5-step purification and anion exchange purification. The IEF gel method showed that proteins were fractionated at a pH of 4.6 to 5.1, consistent with the published pl range for patatin (Racusen and Foote, 1980).
Zastosowano kolejne ogniskowania izoelektryczne na RF3 w wąskim zakresie pH (4-5) w próbie rozdzielenia izozymów patatyny. Zgodnie z oczekiwaniami pik frakcji bioaktywnych zauważono u białek o pl 4,6-5,1. Frakcje te mająodrębny układ izozymów i inne zawartości składnika bioatywnego. Bioaktywność we frakcjach wahała się od zerowej śmiertelności do **** zahamowania rozwoju przy dawkach 80-512 ppm. Niektóre z bioaktywnych frakcji majątylko 2 główne izozymy, co wskazuje, że bioktywność nie wymaga złożonego wzoru izozymów.Successive isoelectric focusing on RF3 was used in a narrow pH range (4-5) in an attempt to separate patatin isozymes. As expected, the peak of bioactive fractions was observed in proteins with a pl of 4.6-5.1. These fractions have a separate system of isozymes and different contents of the bioactive component. The bioactivity in the fractions ranged from zero mortality to **** growth inhibition at doses of 80-512 ppm. Some of the bioactive fractions have only 2 major isozymes, indicating that bioc activity does not require a complex isozyme pattern.
Oczyszczanie metodą rodzimą. PAGE - P-3752 poddano elektroforezie w rodzimych warunkach i wydzielono tryplet pasm o aktywności esterazy (stosując octana-naftylujako substrat). Oczyszczona na żelu substancja esterazowa wskazywała aktywność wobec SCRW dając zahamowanie rozwoju 1,5*. Chromatografia SDS-PAGe substancji wykazała główne pasma dla Mr 42000, ~26000 i ~16000, co jest profilem obserwowanym już przy innych oczyszczaniach. Potwierdza to dodatkowo, że patatyna jest owadobójczą substancją z ziemniaka.Cleansing with the native method. PAGE - P-3752 was electrophoresed under native conditions and a triplet of bands with esterase activity was isolated (using acetate-naphthyl as substrate). The gel-purified esterase material showed activity against SCRW giving a growth inhibition of 1.5 *. SDS-PAGe chromatography of the substance showed major bands for Mr 42,000, ~ 26,000 and ~ 16,000, which is the profile already observed in other purifications. This further confirms that patatin is an insecticidal substance from potatoes.
Sekwencje aminokwasoweAmino acid sequences
NH2-terminalną sekwencję amihokwasową otrzymano dla wszystkich białkowych pasm (Mr 42000, ~26000 i ~16000) w aktywnej wobec SCRW frakcji z oczyszczania anionowymiennego i oczyszczania pięcioetapowego. Ogólnie, dane sekwencyjne wygenerowano dla wszystkich pasm aktywnych frakcji. Większość pasm wykazała >85% homologii z 15-aminokwasową sekwenciąna końcu NH2 (sekw. nr id. 1) lub wewnętrzną sekwencją (sekw. nr id. 7) izozymu patatyny (Stiekema i in., 1988). Jedno z pasm 7 kD wykazało 75% homologii z początkowymi ośmioma aminokwasami opublikowanej sekwencji NH2-teminalnej patatyny. Inne pasmo 7 kD wykazało >85% homologii z początkowymi ośmioma aminokwasami opublikowanej sekwencji wewnętrznej. Pasma te reprezentująproteolizowane produkty patatyny. Na obecność izozymów jasno wskazuje zmienność aminokwasów w pozycjach 1 i 3 zarówno dla NH2-terminalnej, jak i wewnętrznej sekwencji.The NH2-terminal amino acid sequence was obtained for all protein bands (Mr 42,000, ~ 26,000 and ~ 16,000) in the SCRW-active fraction from anion exchange purification and five step purification. Overall, sequence data was generated for all bands of active fractions. Most of the bands showed> 85% homology with the 15 amino acid sequence at the NH2-terminus (SEQ ID NO: 1) or with the inner sequence (SEQ ID NO: 7) of the patatin isozyme (Stiekema et al., 1988). One of the 7 kD bands showed 75% homology with the initial eight amino acids of the published NH2-teminal patatin sequence. The other 7 kD band showed> 85% homology with the starting eight amino acids of the published internal sequence. These bands represent the proteolyzed patatin products. The presence of isozymes is clearly indicated by the variation of amino acids at positions 1 and 3 for both the NH2-terminal and the internal sequence.
opubl. sekw.: (sekw. nr id. 1) pasmo 1 (42 kD):published Seq: (Seq ID No. 1) Band 1 (42 kD):
(sekw. nr id. 2) pasmo 2 (28 kD):(sequence ID no. 2) band 2 (28 kD):
(sekw. nr id. 3) pasmo 3 (26 kD):(sequence ID no. 3) band 3 (26 kD):
(sekw?. nr id. 4) pasmo 4 (24 kD):(SEQ ID No. 4) band 4 (24 kD):
(sekw. nr id. 5) pasmo 5a(17 kD) (sekw. nr id. 6)(SEQ ID NO 5) 5a band (17 kD) (SEQ ID NO 6)
N-terminalna sekwencja aminokwasowa KLEEMVTVLSIDGGGN-terminal amino acid sequence of KLEEMVTVLSIDGGG
XLGMVTVI^SIf^(](^GXLGMVTVI ^ SIf ^ (] (^ G
T L G Μ V Τ V L SID G G GT L G Μ V Τ V L SID G G G
T L G Μ V Τ V L SID G G GT L G Μ V Τ V L SID G G G
KLXMVTVLSIDGGGKLXMVTVLSIDGGG
XXEEMVTXXEEMVT
176 936176 936
Wewnętrzna sekwencja (pozycja aminokwasowa 224) opubl. sekw.: (sekw. nr id. 7)Internal sequence (amino acid position 224) published SEQ: (SEQ ID NO. 7)
Pasmo 5b (17 kD) (sekw. nr id. 8) Pasmo 6 (16 kD):Band 5b (17 kD) (SEQ ID No. 8) Band 6 (16 kD):
(sekw. nr id. 9) Pasmo 7 (15 kD):(SEQ ID No. 9) Band 7 (15 kD):
(sekw. nr id. 10)(SEQ ID No. 10)
SLDYKQMLLLSLGTG KLDYKQML SLXYKQMLLL SLGTG SLNYKQMLLLSLGTGSLDYKQMLLLSLGTG KLDYKQML SLXYKQMLLL SLGTG SLNYKQMLLLSLGTG
Aktywność esierazowaTranscription activity
Wykonano kilka doświadczeń w celu zbadania the esterazowej aktywności we frakcjach aktywnych wobec SCRW.Several experiments were performed to test the esterase activity in SCRW active fractions.
Substrat - octan α-naftylu: Wykorzystano chromatografię SDS-PAGE (10-20%) do określenia, czy frakcje aktywne wobec SCRW (z 5-etapowego oczyszczania) wykazywały aktywność esterazową [Racusen, 1984]. Na dwie jednakowe porcje żelu nałożono ogrzewane i nieogrzewane frakcje aktywne wobec SCRW. Zaobserwowano pojedyncze esterazopozytywne pasmo w nieogrzewanej próbce przy Mr 55000.Substrate - α-naphthyl acetate: SDS-PAGE chromatography (10-20%) was used to determine if the fractions active against SCRW (from the 5-step purification) showed esterase activity [Racusen, 1984]. Heated and unheated fractions active against SCRW were applied to two equal portions of the gel. A single esterase-positive band was observed in the unheated sample at Mr 55000.
Próbka ogrzewana wykazała oryginalne pasmo Mr 42000 i jednoczesną nieobecność pasma 55000. Wynik tenjest zgodny z doniesieniami literaturowymi na temat elektroforetycznej ruchliwości frakcji aktywnych esterazy patatyny (Racusen, 1984). Pasma Mr 55000 nie zaobserwowano w ogrzanej próbce, co wskazuje, że obróbka cieplna SDS eliminuje aktywność esterazową. Pod nieobecność pasma Mr 55000 w ogrzanej próbce oryginalne pasmo Mr 42000 zaobserwowano przy pomocy barwienia barwnikiem coomassie.The heated sample showed the original Mr 42,000 band and the simultaneous absence of the 55,000 band. This result is consistent with the literature reports on the electrophoretic mobility of patatin esterase active fractions (Racusen, 1984). The Mr 55,000 band was not observed in the heated sample, indicating that the SDS heat treatment eliminated the esterase activity. In the absence of the Mr 55,000 band in the heated sample, the original Mr 42,000 band was observed by coomassie staining.
Studium specyficzności substratup-nitrofenylowego: Zbadano serię estrów p-nitrofenylowych (estry C-2, C-4, C-6, C-8, C-10, C-12, C-14, i C-16) w celu określenia specyficzności substratu. Estry nitrofenylowe C-8 i C-10 były w porównaniu z innymi konsekwentnie najlepszymi substratami dla esterazowej aktywności większości badanych patatyn.Up-Nitrophenyl Substrate Specificity Study: A series of p-nitrophenyl esters (C-2, C-4, C-6, C-8, C-10, C-12, C-14, and C-16 esters) were tested to determine substrate specificity. The C-8 and C-10 nitrophenyl esters were consistently the best substrates for the esterase activity of the majority of the patatins tested, compared to the other consistently.
Substraty - estry lipidowe: Oczyszczoną frakcję aktywną wobec SCRW (z 5-etapowego oczyszczania) przetestowano pod względem zdolności do hydrolizowania kilku lipidów. Każdy lipid rozpuszczono i inkubowano z porcją oczyszczonej frakcji aktywnej wobec SCRW. Próbki zanalizowano metodąchromatografii cienkowarstwowej rozwij aj ąc układem trzech rozpuszczalników (Pemes i in., 1980). Cztery lipidy wykazały w tej analizie znaczące modyfikacje. Była to oleilolizolecytyna, dioleilo-L-a-fosfatydylocholina, 1-monolinoleilo-rac-gliceryna i dioleina (Sigma). Nowa plamka w analizie cienkowarstwowej przy Rf 0,37 dla ekstraktu organicznego mieszaniny reakcyjnej lipid/aktywna frakcja zidentyfikowano jako wolny kwas tłuszczowy przez porównanie ze standardami kwasu tłuszczowego linolowego i oleinowego. Tak więc substancja aktywna wobec SCRW wykazuje działanie esterazowe na te cztery estry lipidów.Substrates - Lipid Esters: The purified SCRW-active fraction (from 5-step purification) was tested for the ability to hydrolyze several lipids. Each lipid was dissolved and incubated with an aliquot of the purified SCRW active fraction. The samples were analyzed by thin layer chromatography by developing with a three-solvent system (Pemes et al., 1980). The four lipids showed significant modifications in this analysis. It was oleylolysolecithin, dioleyl-L-α-phosphatidylcholine, 1-monolinoleyl-rac-glycerin and diolein (Sigma). The new spot in the thin layer analysis at Rf 0.37 for the organic extract of the lipid / active fraction reaction mixture was identified as free fatty acid by comparison with linoleic and oleic fatty acid standards. Thus, the substance active against SCRW has an esterase effect on these four lipid esters.
U sunięto j elita cienkie WCRW z larw po trzeciej wylince karmionych korzeniami kukurydzy. Lipidy z jelit ekstrahowano, rozpuszczono i inkubowano w warunkach pH jelita (pH 6,55) z oczyszczoną frakcją aktywną wobec SCRW. Próbki zanalizowano metodą chromatografii cienkowarstwowej w wyżej opisany sposób. Oczyszczona frakcja aktywna wobec SCRW wykazała aktywność esterazową wobec lipidów z jelita WCRW przy pH jelita. Ilustruje to przypuszczalny sposób owadobójczego działania patatyny.Thin WCRW elites were removed from the third instar larvae fed with corn roots. Intestinal lipids were extracted, dissolved and incubated under gut pH conditions (pH 6.55) with the purified SCRW active fraction. Samples were analyzed by thin layer chromatography as described above. The purified SCRW-active fraction showed esterase activity against WCRW gut lipids at gut pH. This is illustrated by the presumptive mode of insecticidal activity of patatin.
Alternatywne źródła patatynyAlternative sources of patatin
Ponieważ wszystkie początkowe doświadczenia prowadzono z P-3752, handlowo dostępnym preparatem enzymowym (Sigma) z bulw ziemniaka Minnesota Russet var. Kranz, pożądane było wykazanie, że owadobójczo aktywne patatyny można odzyskać ze świeżej tkanki bulw ziemniaka. Ekstrakty bulw wytworzono dokładnie w sposób opisany w literaturze (Racusen i Foote, 1980; Park i in., 1983). Zbadano trzy handlowo dostępne odmiany S. tuberosum (Russet, Desiree, i LaChipper) i siedem dzikich gatunków (S. kurtzianum, S. berthaultii, S. tarijense, S. acaule, S. demissum, S. cardiophyllum i S. raphanifolium, wszystkie z Inter-Regional Potato IntroductionSince all initial experiments were conducted with P-3752, a commercial enzyme preparation (Sigma) from potato tubers Minnesota Russet var. Kranz, it was desirable to demonstrate that the insecticidally active patatins could be recovered from fresh potato tuber tissue. Tuber extracts were prepared exactly as described in the literature (Racusen and Foote, 1980; Park et al., 1983). Three commercially available varieties of S. tuberosum (Russet, Desiree, and LaChipper) and seven wild species (S. kurtzianum, S. berthaultii, S. tarijense, S. acaule, S. demissum, S. cardiophyllum and S. raphanifolium, all from Inter-Regional Potato Introduction
176 936176 936
Station, USDA, ARS, Sturgeon Bay, WI). Wszystkie ekstrakty zawierały patatynę zgodnie z testami SDS-PAGE i Western biot; wszystkie zawierały esterazę zgodnie z testem esterazowym C-10 i wszystkie wykazywały działanie owadobójcze wobec SCRW, to jest wskaźnik zahamowania rozwoju 2-3. Patrz tabela 5. Wynika z tego, że owadobójczo aktywne patatyny można wydzielić z bulw kilku gatunków i wielu członków tej całej klasy białek może wykazywać owadobójcze właściwości.Station, USDA, ARS, Sturgeon Bay, WI). All extracts contained patatin as tested by SDS-PAGE and Western blot; all contained esterase according to the C-10 esterase test and all showed insecticidal activity against SCRW, that is, a growth inhibition index of 2-3. See Table 5. It follows that insecticidally active patatins can be isolated from tubers of several species and many members of this entire class of proteins may exhibit insecticidal properties.
Tabela 5Table 5
“Aktywność wobec SCRW wyrażono w kategoriach zahamowania rozwoju larw:“Activity against SCRW was expressed in terms of inhibition of larval development:
= słabe zahamowanie rozwoju (zmniejszenie rozmiarów 30-40%), = umiarkowane zahamowanie rozwoju (zmniejszenie rozmiarów 50-80%), = ostre zahamowanie rozwoju (zmniejszenie rozmiarów >90%).= mild growth inhibition (size reduction 30-40%), = moderate growth retardation (size reduction 50-80%), = acute growth inhibition (size reduction> 90%).
Ekstrakty S. berthaultii, S. kurtzianum i S. tarijense poddano biologicznym testom wobec dwu innym owadom, CPB i ECB. Dane testowe podsumowano poniżej w tabeli 6. Stwierdzono słabe działanie tych ekstraktów na CPB, a u larw ECB umiarkowane do ostrego zahamowanie rozwoju przy dawce 1X. Jednak larwy ECB sąnieco mniej wrażliwe na te ekstrakty ziemniaka w porównaniu z larwami SCRW, na co wskazuje całkowity brak działania na EBC przy dawce 0,1X.Extracts of S. berthaultii, S. kurtzianum, and S. tarijense were biologically tested against two other insects, CPB and ECB. The test data are summarized in Table 6 below. These extracts showed a weak effect on CPB and moderate to severe growth inhibition in ECB larvae at the 1X dose. However, ECB larvae are slightly less sensitive to these potato extracts compared to SCRW larvae as indicated by a complete lack of activity on EBC at 0.1X.
Tabela 6Table 6
“Zahamowanie rozwoju larw“Inhibition of larvae development
Genomowy DNA z dziewięciu różnych roślin poddano testowi metodąanalizy Southern na białka homologiczne z patatyną. Plamki Southern z sondą znaczoną a-32P sekwencji nr id. 11 wskazały na istnienie homologicznych sekwencji w kilku innych gatunkach roślin. Silne sygnały otrzymano dla kukurydzy, pomidora, buraka cukrowego, ryżu i ziemniaka. Indywidualne pasma nie nadawały się do rozdzielenia w tym doświadczeniu, jednak rozmiar plam i ich intensywności były podobne dla wszystkich tych gatunków. Słabsze sygnały otrzymano także dla cukini, soi i kanoli, a pojawiły się one jako mała liczba pojedynczych pasm w DNA z każdego gatunku. Ogórek i Arabidopsis nie wykazały wykrywalnej hybrydyzacji z sondą patatynową w warunkachGenomic DNA from nine different plants was tested by Southern analysis for proteins homologous to patatin. Specks Southern probe labeled with a- 32 P Sequence ID NO. 11 showed the existence of homologous sequences in several other plant species. Strong signals were obtained for maize, tomato, sugar beet, rice and potato. The individual bands were not separable in this experiment, however the size of the spots and their intensity were similar for all these species. Weaker signals were also obtained for zucchini, soybeans, and canola, and these appeared as a small number of single strands in the DNA of each species. Cucumber and Arabidopsis showed no detectable hybridization with the patatin probe under the conditions
176 936 tego doświadczenia, być może wskutek niewielkiej ilości użytego DNA na co wskazywało zabarwienie żelu bromkiem etydyniowym.This experiment, perhaps due to the small amount of DNA used, as indicated by the staining of the gel with ethidium bromide.
Fachowiec może łatwo wytworzyć sekwencje DNA tych homologicznych białek i wprowadzić je do roślin lub innych organizmów znanymi środkami. Owadobójcze właściwości takich białek można najlepiej przetestować po heterologicznej ekspresji, np. z wirusa pałeczkowatego lub E. coli. Tak więc inne białka, które można stosować w sposobie według wynalazku można otrzymać po zwykłej liczbie eksperymentów stosując znane sposoby, a następnie stosować do zapewniania roślinom ochrony przed plagą owadów.One skilled in the art can easily generate the DNA sequences of these homologous proteins and introduce them into plants or other organisms by known means. The insecticidal properties of such proteins can best be tested after heterologous expression, e.g. from rod virus or E. coli. Thus, other proteins that can be used in the method of the invention can be obtained after the usual number of experiments using known methods and then used to provide protection to plants against insect infestation.
Identyfikacja genetycznaGenetic identification
Geny dla patatyn klonowało kilku badaczy. Sekwencję opisanąprzez Mignery i in., 1984, określono nazwą GM203. Zawierała ona niekompletną sekwencję sygnałową. Mignery i in., 1988, zidentyfikowali genomowy klon, oznaczony P520, obejmujący GM203 i zawierający kompletną sekwencję sygnałową. Sekwencję nr id. 11 skonstruowano z sekwencją sygnał owąP520 i kodującącDNA część GM203, dalej określanąjako PatA+. Zawiera także miejsce restrykcji an Ncol i miejsce EcoRI zaraz za kodonem zakończenia translacji.Several researchers have cloned the patin genes. The sequence described by Mignery et al., 1984 was named GM203. It contained an incomplete signal sequence. Mignery et al., 1988, identified a genomic clone, designated P520, comprising GM203 and containing a complete signal sequence. Sequence no. 11 was constructed with the signal sequence owaP520 and encoding the DNA portion of GM203, hereinafter referred to as PatA +. It also contains an NcoI restriction site and an EcoRI site immediately downstream of the translation termination codon.
Solanum tuberosum odmiana Russet BurbankSolanum tuberosum variety Russet Burbank
Dwadzieścia łańcuchów cDNA wydzielono z bulw ziemniaka odmiany Russet Burbank i sekwencjonowano. Wydedukowane sekwencje aminokwasowe pokazują, że te cDNA kodująjedenaście różnych izozymów patatyny. Jedenaście białek wykazuje od około 82% do 100% identyczności z PatA+, sekw. nr id. 11, z różnicami występującymi na różnych pozycjach na długości cDNa. Sekwencje dla jedenastu różnych reprezentatywnych cDNA kodujących jedenaście różnych izozymów patatyn nazywają się w sposób podany w tabeli 7. Sekwencje cDNA poddano obróbce procedurami PCR stosując jako primery sekwencje nr id. 26 i nr id. 27, odpowiadające nukleotydom 5' kodującym kilka pierwszych kodonów sekwencji sygnałowej i końcowi 3' sekwencji kodującej, dla potrzeb dalszych klonowań. Symbol „+“ wskazuje, że na zawieranie rodzimej sekwencji sygnałowej. Niektóre cDNA nie zawierają kompletnej rodzimej kodującej sekwencji sygnałowej i tylko sekwencję kodującądojrzałe białko otrzymano przy pomocy podobnej procedury PCR stosując primery z sekwencji nr id. 32 i nr id. 27. Oznaczono je dolnym indeksem „m“.Twenty cDNA strands were isolated from potato tubers of Russet Burbank cv. And sequenced. The deduced amino acid sequences show that these cDNAs code for eleven different patatin isozymes. Eleven proteins share from about 82% to 100% identity with PatA +, SEQ. id no. 11, with differences at different positions along the length of the cDNa. The sequences for eleven different representative cDNAs encoding eleven different patatin isozymes are named as given in Table 7. The cDNA sequences were processed by PCR procedures using sequences id. 26 and no. 27, corresponding to the 5 'nucleotides encoding the first few codons of the signal sequence and the 3' end of the coding sequence, for further cloning purposes. The symbol "+" indicates that it contains a native signal sequence. Some cDNAs do not contain the complete native coding signal sequence and only the mature protein coding sequence was obtained by a similar PCR procedure using primers from sequence id. 32 and no. 27. They are marked with the subscript "m".
Tabela 7Table 7
176 936176 936
Solasram berthaultiiSolasram berthaultii
Sekwencje cDNA patatyn z diploidalnego ziemniaka S. berthaultii wydzielono metodąodwrotnej transkrypcji mRNA bulwy, a następnie PCR z primerami o sekwencjach nr id. 26 i nr id. 27, opisanych powyżej. Przeprowadzono wiele niezależnych reakcji PCR, aby uniknąć wydzielania duplikowanych klonów wskutek procesu wzmacniania.Patatin cDNA sequences from the S. berthaultii diploid potato were isolated by reverse transcription of tuber mRNA followed by PCR with primers SEQ ID NO. 26 and no. 27, described above. Multiple independent PCR reactions were performed to avoid shedding of duplicate clones due to the amplification process.
Częściowo sekwencjonowano łącznie 14 cDNA patatyn. Wszystkie sekwencje cDNA (nazwane Patl do Pat14) wydają się mieć unikalne sekwencje nukleotydowe, co sugeruje, że co najmniej 14 różnych mRNA patatyn ulega ekspresji w bulwach S. berthaultii. Sekwencjądla Pat3+ jest sekwencja nr id. 28. Sekwencjądla Pat10+jest sekwencja nr id. 29. Wydedukowana sekwencja aminokwasowa pokazuje, że 14 cDNA kodująco najmniej 11 różnych białek. Ogólnie, sekwencje cDNA z bulw S. berthaultii były bardzo podobne. Tylko 12 pozycji aminokwasów na 367 reszt (3%) wykazało zmienność sekwencji. Reszty aminokwasowe obecne w każdej z tych pozycji pokazano w tabeli 8. Na 5 z tych pozycji istnieje tylko pojedynczy wariant klonu z unikalną resztą. Zmiany te mogą odzwierciedlać rzeczywiste różnice pomiędzy mRNA lub wynikać z błędów procesu PCR. W pozostałych 7 pozycjach zmienność była większa; co najmniej dwa cDNA miały alternatywny aminokwas. Każdy z 9 różnych grup sekwencji aminokwasowych miała różny wzór reszt w tych siedmiu pozycjach. W pewnych przypadkach zmiany były konserwatywne, takie jak zmiana Tre na Ser w pozycji 164. W innych przypadkach występowały znacznie istotniejsze różnice, takie jak wprowadzenie proliny w pozycji 148.A total of 14 patatin cDNAs were partially sequenced. All cDNA sequences (named Pat1 to Pat14) appear to have unique nucleotide sequences, suggesting that at least 14 different patatin mRNAs are expressed in S. berthaultii tubers. The sequence for Pat3 + is sequence ID No. 28. The sequence for Pat10 + is sequence ID NO. 29. The deduced amino acid sequence shows that 14 cDNAs coding for at least 11 different proteins. Overall, the cDNA sequences from S. berthaultii tubers were very similar. Only 12 amino acid positions out of 367 residues (3%) showed sequence variation. The amino acid residues present at each of these positions are shown in Table 8. Out of 5 of these positions, only a single clone variant with a unique residue exists. These changes may reflect actual mRNA differences or may be due to errors in the PCR process. In the remaining 7 items the volatility was greater; at least two cDNAs had an alternative amino acid. Each of the 9 different groups of amino acid sequences had a different pattern of residues at these seven positions. In some cases, the changes were conservative, such as changing from Tre to Ser at position 164. In other cases, there were much more significant differences, such as introducing proline at position 148.
Tabela 8 cDNA Pozycje różnic aminokwasowychTable 8 cDNA Positions of Amino Acid Differences
Solanum cardiophyllumSolanum cardiophyllum
Dziesięć klonów cDNA wygenerowano metodą PCR stosując mRNA wydzielony z bulw Solanum cardiophyllum w sposób opisany powyżej. Otrzymano sekwencję nukleotydową co najmniej 75% długości każdego klonu. Pełnej długości sekwencją. klonu nazwanego Pat17+jest sekwencja nr id. 30. Sekwencja nr id. 31 jest otrzymaną inżynieryjnie formą dojrzałą, Pat17m. Klony S. cardiophyllum były prawie identyczne, tylko z przypadkowymi zmianami sekwencji nukleotydowych, które mogły być różnicami rzeczywistymi lub błędami PCR. Jednak w pozycjach 54 i 519 zaobserwowano kilka klonów z identycznymi zmianami, co sugeruje, że nie sąone związane z procesem wzmacniania. Wzory nukleotydów w tych pozycjach wskazały, że reprezentują one co najmniej 4 różne mRNA. mRNA dwu z tych grup wyizolowano kilkakrotnie, a mRNA dwu pozostałych tylko raz w tym zestawie klonów cDNA.Ten cDNA clones were generated by PCR using mRNA isolated from Solanum cardiophyllum tubers as described above. A nucleotide sequence of at least 75% of the length of each clone was obtained. Full-length sequence. the clone named Pat17 + is sequence id. 30. Sequence no. 31 is an engineered mature form, Pat17 m . The S. cardiophyllum clones were nearly identical, only with random nucleotide sequence changes that could be real differences or PCR errors. However, at positions 54 and 519, several clones with identical changes were observed, suggesting that they are not related to the enhancement process. The nucleotide patterns at these positions indicated that they represent at least 4 different mRNAs. The mRNA of two of these groups was isolated several times and the mRNA of the two remaining only once in this set of cDNA clones.
Wydedukowane sekwencje aminokwasowe klonów S. cardiophyllum były także niezwykle podobne. Wystąpiło 8 unikalnych grup sekwencji aminokwasów, każda różniąca się od in176 936 nych sekwencji jedną resztą. Klony cDNA kodujące sekwencję aminokwasową identyczną z sekwencjąPat 17+ uzyskano dwu&rotaie, a f^c^^c^^’ćłłe 7 cDNA (Pat18+, 19+, 20+, 21+, 22+, 23+ i 24+) zawierały jedną unikalną resztę.The deduced amino acid sequences of S. cardiophyllum clones were also remarkably similar. There were 8 unique groups of amino acid sequences, each one differing from other 936 sequences by one residue. The cDNA clones encoding the amino acid sequence identical to the Pat 17+ sequence were obtained two & rotaie, af ^ c ^^ c ^^ 'cDNA 7 (Pat18 +, 19+, 20+, 21+, 22+, 23+ and 24+) contained one unique residue .
Przykład realizacji sposobu wytwarzania genetycznie transformowanych roślinAn embodiment of a method for producing genetically transformed plants
Transformacja genetycznaGenetic transformation
Jak opisano powyżej, geny patatyny można wydzielić z różnych źródeł roślinnych. Jeden lub więcej takich genów można następnie zastosować do transformacji komórek bakteryjnych lub roślinnych, aby umożliwić wytwarzanie patatyny.As described above, the patatin genes can be isolated from a variety of plant sources. One or more of these genes can then be used to transform bacterial or plant cells to allow the production of patatin.
Przykład dokonywania tego przy pomocy różnych sekwencji patatyny podano poniżej.An example of doing this with different patatin sequences is given below.
Wytwarzanie cDNA patatynyProduction of patatin cDNA
W celu włączenia genu patatyny w wektory odpowiednie dla ekspresji patatyny w heterologicznych komórkach gospodarza, konieczne było wprowadzenie odpowiednich miejsc restrykcji w pobliżu końców genu. Celem mutagenezy było utworzenie kasety obejmującej sekwencję kodującą białko z minimalnymi niekodującymi sekwencjami flankującymi i włączenie przydatnych miejsc restrykcji w celu zmobilizowania kaset. Kasety zaprojektowano tak, aby pozwalały na mobilizację nietkniętej sekwencji kodującej wraz z peptydem sygnałowym lub tylko dojrzałej sekwencji kodującej. Dla PatAm zaprojektowano dwa primery mutagenezy w celu stworzenia takich kaset. Mutageneza sekwencją nr id. 12 spowodowała podstawienie dwu aminokwasów (metionina-alanina) za lizynę naN-końcu dojrzałego białka i wprowadzenie miejsca Ncol, a sekwencja nr id. 13 dodała drugi kodon terminacji i miejsce EcoRI.In order to incorporate the patatin gene into vectors suitable for expression of patatin in heterologous host cells, it was necessary to introduce appropriate restriction sites near the ends of the gene. The goal of mutagenesis was to create a cassette containing the protein coding sequence with minimal non-coding flanking sequences and to include useful restriction sites to mobilize the cassettes. The cassettes were designed to allow the mobilization of the intact coding sequence together with the signal peptide or only the mature coding sequence. M designed for PATA two mutagenesis primers in order to create such tapes. Mutagenesis by sequence no. 12 resulted in the substitution of two amino acids (methionine-alanine) for lysine at the N-terminus of the mature protein and the introduction of an NcoI site, and sequence id. 13 added a second termination codon and an EcoRI site.
Powstałą zmodyfikowaną sekwencję zidentyfikowano jako PatAm sekw. nr id. 14. Dla wszystkich innych cDNA dokonano podobnych modyfikacji i wprowadzenia miejsc restrykcji z zastosowaniem metody PCR i albo primerów z sekwencji nr id. 26 i sekwencji nr id. 27, albo primerów z sekwencji nr id. 32 i ' sekwencji nr id. 27, jak opisano poprzednio.The resulting modified sequence was identified as PatAm SEQ. id no. 14. For all other cDNAs, similar modifications were made and restriction sites were introduced using the PCR method and either the primers in sequence ID NO. 26 and sequence no. 27, or the primers of SEQ ID NO. 32 and 'sequence ID no. 27 as previously described.
Ekspresja patatym w E. coliExpression of patate in E. coli
Sekwencję kodującą DNA dla PatAm (sekwencja nr id. 14) wprowadzono do pMON5766, wektor ekspresji E. coli pochodzący z pBR327 (Soberon i in., 1980) z promotorem recA i sekwencjąpoczątkowąG10 (Olins i in, 1989). Powstały wektor, pMON 19714i zostoi zmobiiizowany w szczepie E. coli JM 101, który następnie wytworzył PatAm, co potwierdziła analiza Western i działanie esterazowe na p-nitrofenylowy ester C-10. Sekwencję kodującąDNA dla Pat 17m, a także dla PatAm wprowadzono w wektor ekspresji E. coli pochodzący z pMON6235 z promotorem AraBAD (indukowalny, gdy komórki hodowano w arabinozie), sekwencję początkową G10 i gen znacznikowy oporności na ampicylinę. Powstałe wektory, pMON25213, zawierający Pat17m, oraz pMON25216, zawierający PatAm, wprowadzono w szczep JM101 E. coli.The DNA coding sequence for PatAm (SEQ ID NO. 14) was inserted into pMON5766, an E. coli expression vector derived from pBR327 (Soberon et al., 1980) with the recA promoter and G10 start sequence (Olins et al., 1989). The resulting vector, pMON 19714i, was mobilized into the E. coli JM 101 strain, which was then produced by PatAm, as confirmed by Western blot analysis and the esterase effect on C-10 p-nitrophenyl ester. The DNA coding sequence for Pat 17m and also for PatAm was inserted into an E. coli expression vector derived from pMON6235 with the AraBAD promoter (inducible when cells were grown in arabinose), a G10 start sequence and an ampicillin resistance marker gene. The resulting vectors, pMON25213, containing Pat17m, and pMON25216, containing PatAm, were introduced into E. coli strain JM101.
Patatyna ulega ekspresji w transformowanej E. coli; jednak gromadzi się ciałkach załamujących światło (RB). W testach SCRW zastosowano nietknięte komórki i rozpuszczone RB. Wyniki pokazano w tabeli 9.Patatin is expressed in transformed E. coli; however, light refracting bodies (RB) accumulate. Intact cells and dissolved RB were used in the SCRW assays. The results are shown in Table 9.
Tabela 9Table 9
'Aktywność wobec SCRW wyrażono w kategoriach zahamowania rozwoju larw:'Activity against SCRW was expressed in terms of inhibition of larval development:
= słabe zahamowanie rozwoju (zmniejszenie rozmiarów 30-40%), = umiarkowane zahamowanie rozwoju (zmniejszenie rozmiarów 50-80%), = ostre zahamowanie rozwoju (zmniejszenie rozmiarów >90%). śmiertelność w tej próbce wynosiła 81%.= mild growth inhibition (size reduction 30-40%), = moderate growth retardation (size reduction 50-80%), = acute growth inhibition (size reduction> 90%). the mortality in this sample was 81%.
Ekspresja patatyn w bakteriach kolonizujących roślinyExpression of patathins in plant colonizing bacteria
Przy zwalczaniu owadów może być pożądana ekspresja jednej lub wielu patatyn w bakteriach kolonizujących rośliny i następnie nałożenie tych bakterii na rośliny. Gdy owad żywi się rośliną, wchłania toksyczną dawkę patatyny wytworzonej przez kolonistów rośliny. Bakterie takie mogą zamieszkiwać powierzchnię roślin, takjak gatunki Pseudomonas lub Agrobacterium, albo być endofitami zamieszkującymi układ naczyniowy roślin, takimi jak gatunki Clavibacter. W przypadku bakterii kolonizujących powierzchnię gen patatyny można wprowadzać w wiele wektorów zdolnych do replikacji w Gram-ujemnych gospodarzach. Przykładami takich wektorów sąpKT231 z grupy niedopasowania IncQ [Bagdasarian i in., 1981] lub pVK100 z grupy IncP [Knauf, 1982]. W przypadku endofytów gen patatyny można wprowadzać w chromosom metodą homologicznej rekombinacji lub metodą inkorporacji genu w odpowiedni transpozon zdolny do insercji chromosomalnej w bakteriach endofitycznych.In controlling insects, it may be desirable to express one or more patinates in the plant colonizing bacteria and then apply these bacteria to the plants. When the insect feeds on the plant, it absorbs a toxic dose of patatin produced by the plant's colonists. Such bacteria can inhabit the surface of plants, such as Pseudomonas or Agrobacterium species, or be endophytes inhabiting the plant vascular system, such as Clavibacter species. In the case of surface-colonizing bacteria, the patatin gene can be engineered into many vectors capable of replication in gram-negative hosts. Examples of such vectors are pKT231 from the IncQ mismatch group [Bagdasarian et al., 1981] or pVK100 from the IncP group [Knauf, 1982]. In the case of endophytes, the patatin gene can be introduced into a chromosome by homologous recombination or by incorporation of the gene into an appropriate transposon capable of chromosomal insertion in endophytic bacteria.
Ekspresja patatyny w bakulowirusieExpression of patatin in baculovirus
Geny patatyny klonowano w donorowy wektor bakulowirusa pMON4327, opisany w jednoczesnym zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/941363, złożonym 4 września 1992, dołączanym niniejszymjako odnośnik literaturowy, jako fragmenty Ncol/EcoRI. Donorowy wektor pMON14327 zawiera gen oporności na ampicylinę, lewe i prawe ramię transpozona Tn7, i, pomiędzy ramionami, gen oporności na gentamycynę, silny polihedrynowy promotor bakulowirusa i polilinker. 'Wektor typu shuttle bakulowirusa, albo bakmid, składa się z miejsca miniattTn7 w ramce wewnątrz genu lacZ i genu oporności na kanamycynę rekombinowanego w genom wiralny AcNPV. Z pomocą pomocniczego plazmidu oporności na tetracyklinę, pMON7124, wytworzono rekombinacyjny wirus AcNPV metodą transpozycji genów patatyny lub GUS i genów znacznikowych w genom wirusa (Lucków i in., 1993). W pMON14327 włączono następujące geny: geny wymienione w tabeli 7 i Pat3+, Pat10+ i Pat17+.The patatin genes were cloned into the baculovirus donor vector pMON4327 described in co-pending US patent application No. 07/941363, filed September 4, 1992, incorporated herein by reference as NcoI / EcoRI fragments. The donor vector pMON14327 contains an ampicillin resistance gene, the left and right arm of the Tn7 transposon, and, between the arms, a gentamicin resistance gene, a strong polyhedrin baculovirus promoter and a polylinker. The baculovirus shuttle vector, or bacmid, consists of a miniattTn7 site in frame inside the lacZ gene and a kanamycin resistance gene recombined in the AcNPV viral genome. With the help of the tetracycline resistance helper plasmid, pMON7124, recombinant AcNPV virus was generated by transposing the patatin or GUS genes and marker genes into the viral genome (Lucków et al., 1993). The following genes are included in pMON14327: the genes listed in Table 7 and Pat3 +, Pat10 + and Pat17 +.
Zgodnie z procedurami zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/941363 i publikacji Luckowa i in., wytworzono z powyższych genów pewne ilości patatyny. Obecność patatyny potwierdzono metodą analizy Western i esterazowym działaniem na p-nitrofenylowy ester C-10. Za wyjątkiem PatAm, który izozym był wzmacniany co najmniej dwukrotnie dla potrzeb biotestu SCRW. Podczas gdy hodowle PatE+ i PatEm spójnie wykazywały niewielką lub żadną ekspresję patatyny, wszystkie inne izozymy wydawały się być poddawane ekspresji w zadawalającej ilości dla potrzeb biotestu. Jednak nie określono natury potranslacyjnego przetwarzania patatyny w bakulowirusach w porównaniu z ziemniakiem. Bioaktywność izozymów poddanych ekspresji w bakulowirusie wobec SCRW zaobserwowano w przypadku Pat 17+, PatB+, PatDm, PaIIm, PatL+ i Pat3+.In accordance with the procedures of United States Patent Application No. 07/941363 and Luckow et al., Some amounts of patatin were produced from the above genes. The presence of patatin was confirmed by Western blot analysis and the esterase action of the C-10 p-nitrophenyl ester. Except for PatA m , which isozyme was amplified at least twice for the SCRW biotest. While the PatE + and PatEm cultures consistently showed little or no expression of patatin, all other isozymes appeared to be expressed in a satisfactory amount for a bioassay. However, the nature of the post-translational processing of patatin in baculoviruses as compared to potato has not been established. Bioactivity of the baculovirus expressed isozymes against SCRW was observed for Pat 17+, PatB +, PatD m , PaII m , PatL + and Pat3 +.
Określono efekty działania wielokrotnych izozymów (wytwarzanych przez bakulowirus) na wzrost i rozwój owadów. Próbki 11 izozymów Russeta połączono wjedną dla biotestu wobec SGRW, ECB, gąsienicy rolnicy zbożówki i TBW. Połączono 10 do 15 mg każdego oczyszczonego na Q-Sepharose izozymu poza PatDm, dostępnego w ilości tylko 1,7 mg. Powstała mieszanina wykazywała 100% śmiertelności w testach TBW i 93% redukcji masy wobec ECB. Tak więc każdy izozym poddano oddzielnie testowi wobec TBW i ECB. W porównaniu z larwami kontrolnymi larwy TBW i ECB karmione pokarmem traktowanym izozymami PatC+, PatL+ i PatIm wykazały znaczące zahamowanie rozwoju (>75%) i/lub śmiertelność. Pat B+ i PatDm także hamowały rozwój TBW, odpowiednio o 69 i 78%.The effects of multiple isozymes (produced by baculovirus) on the growth and development of insects were determined. Samples of 11 Russet isozymes were pooled into one for a bioassay against SGRW, ECB, farmer caterpillar, and TBW. 10 to 15 mg of each Q-Sepharose purified isozyme except PatDm, available in only 1.7 mg, was combined. The resulting mixture showed 100% lethality in TBW tests and 93% weight reduction versus ECB. Thus, each isozyme was separately tested against TBW and ECB. Compared to control larvae, TBW and ECB larvae fed food treated with PatC +, PatL + and PatIm areozymes showed significant inhibition of development (> 75%) and / or mortality. Pat B + and PatDm also inhibited TBW development by 69 and 78%, respectively.
Konstrukcja genu roślinyPlant gene construction
Ekspresja genu rośliny występującego w postaci dwułańcuchowego DNA wymaga transkrypcji informacyjnego RNA (mRNA) z jednego łańcucha DNA działaniem polimerazy RNA i następnie przetwarzania pierwotnego transkryptu w jądrze. Takie przetwarzanie obejmuje nietranslowany region 3', dodający poliadenylujące nukleotydy do końca 3' RNA. Transkrypcja DNA w mRNA jest regulowana przez region DNA nazywany zwykle „promotorem“. Region promotora zawiera sekwencję zasad sygnalizujących polimerazie RNA wiązanie z DNA z inicjację transkrypcji mRNA na podstawie jednego z łańcuchów DNA jako wzorca z utworzeniem odpowiedniego łańcucha RNA.Expression of a plant gene as double-stranded DNA requires the transcription of messenger RNA (mRNA) from one DNA strand by the action of RNA polymerase and subsequent processing of the primary transcript in the nucleus. Such processing involves the 3 'untranslated region adding polyadenylating nucleotides to the 3' end of the RNA. DNA transcription in mRNA is regulated by a region of DNA commonly referred to as a "promoter". The promoter region contains a base sequence signaling RNA polymerase to bind to DNA to initiate mRNA transcription from one of the DNA strands as a template to form the appropriate RNA strand.
176 936176 936
W literaturze opisano pewną liczbę promotorów aktywnych w komórkach roślinnych. Takie promotory można otrzymać z roślin lub wirusów roślinnych i obejmują one między innymi promotory takie jak syntazę nopaliny (NOS) i syntazę oktopiny (OCS) (naniesione na plazmidach indukujących nowotwór Agrobacterium tumefaciens), promotory 19S i 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), indukowalny światłem promotor z małej podjednostki 1,5-bis-fosfaoranokarboksylazy rybulozy (ssRUBISCO, występujący w dużych ilościach polipeptyd roślinny), oraz promotor 35S wirus mozaiki Fig-worta (FM^’), Wszystkie te promotory zastosowano do wytworzenia różnych typów konstruktów DNA, które poddano ekspresji w roślinach (patrz np. publikacja PCT WO 84/02913). Może być również konieczne ograniczanie ekspresji do pewnych części roślin podatnych na atak owada. Np., można zastosować specyficzny wobec korzenia promotor do ograniczenia ekspresji do rejonu korzenia lub promotor ułatwiający ekspresję w korzeniu do zwiększenia poziomu aktywnego białka w korzeniach. Jest to sposób korzystny w przypadku roślin atakowanych przez owady zjadające korzeń.A number of promoters active in plant cells have been described in the literature. Such promoters can be obtained from plants or plant viruses and include, but are not limited to, promoters such as nopaline synthase (NOS) and octopine synthase (OCS) (plated on Agrobacterium tumefaciens tumor-inducing plasmids), cauliflower mosaic virus (CaMV) 19S and 35S promoters, inducible light, the promoter from the small subunit of ribulose 1,5-bis-phosphorane carboxylase (ssRUBISCO, an abundant plant polypeptide), and the 35S promoter Fig-wort mosaic virus (FM ^ '). All these promoters were used to generate various types of DNA constructs that have been expressed in plants (see, e.g., PCT publication WO 84/02913). It may also be necessary to limit expression to certain parts of the plant susceptible to insect attack. For example, a root-specific promoter can be used to limit expression to the root region or a promoter to facilitate expression in the root to increase the level of active protein in the roots. This method is beneficial for plants attacked by root-eating insects.
Pewne promotory roślin są także bardziej skuteczne w roślinach jednoliściennych. Na przykład promotor aktynowy ryżu opisany w publikacji WO 91/09948 jest skuteczny do ekspresji w kukurydzy. Promotor ubikwityny kukurydzy, opisany w europejskim opisie patentowym Ep 0342926, można stosować także w roślinach jednoliściennych.Certain plant promoters are also more effective in monocots. For example, the rice actin promoter described in WO 91/09948 is effective for expression in maize. The maize ubiquitin promoter described in EP 0342926 can also be used in monocotyledonous plants.
Promotory stosowane w konstruktach DNA (to jest chimeryczne geny roślin) można modyfikować w razie potrzeby w celu wpłynięcia na ich charakterystykę sterującą. Np., promotor CaMV35S można ligować do części genu ssRUBISCO tłumiącego ekspresję ssRUBISCO pod nieobecność światła w celu wytworzenia promotora aktywnego w liściach, ale nie w korzeniach. Powstający chimeryczny promotor można zastosować w sposób opisany powyżej.The promoters used in the DNA constructs (i.e., chimeric plant genes) can be modified as needed to affect their driving characteristics. For example, the CaMV35S promoter can be ligated to the portion of the ssRUBISCO gene suppressing the expression of ssRUBISCO in the absence of light to produce a promoter active in leaves but not in roots. The resulting chimeric promoter can be used as described above.
Dla celów niniejszego opisu termin „promotor CaMV35S“ obejmuje odmiany promotora CaMV35S, np., promotory pochodzące z ligacji z regionami operacyjnymi, przypadkowe lub kontrolowane mutacje i tym podobne. Ponadto promotory można zmieniać tak, aby zawierały wielokrotne „sekwencje ulepszające41, podwyższające ekspresję genu. Przykłady takich sekwencji ulepszających podaje Kay i in. (1987).For the purposes of this specification, the term "CaMV35S promoter" includes variants of the CaMV35S promoter, eg, promoters ligated to operational regions, random or controlled mutations, and the like. In addition, promoters may be altered to contain multiple "enhancement sequences 41 to enhance gene expression." Examples of such improvement sequences are provided by Kay et al. (1987).
Konkretny wybrany promotor powinien być zdolny do spowodowania dostatecznej ekspresji sekwencji kodującej enzym, co powoduje wytwarzanie skutecznej ilości patatyny. Korzystnym promotorem jest promotor CaMV E35S (ulepszony CaMV35S).The particular promoter selected should be capable of causing sufficient expression of the enzyme coding sequence to result in the production of an effective amount of patatin. A preferred promoter is the CaMV E35S (enhanced CaMV35S) promoter.
RNA powstający z konstruktu DNA także zawiera nietranslowaną sekwencję początkową 5'. Sekwencja ta może pochodzić z promotora wybranego do ekspresji genu i może być poddana specyficznej modyfikacji, aby podwyższyć translację mRNA. Nietranslowane regiony 5' można także otrzymać z wirusowych RNA, z odpowiednich eukariotycznych genów lub z syntetycznej sekwencji genowej. Wynalazek nie jest ograniczony do konstruktów, w których nietranslowany region pochodzi z nietranslowanej sekwencji towarzyszącej sekwencji promotora.The RNA resulting from the DNA construct also contains a 5 'untranslated starting sequence. This sequence may be derived from a promoter selected for expression of the gene and may be specifically modified to enhance translation of the mRNA. The 5 'untranslated regions can also be obtained from viral RNAs, from suitable eukaryotic genes, or from a synthetic gene sequence. The invention is not limited to constructs in which the untranslated region is derived from the untranslated sequence adjacent promoter sequence.
Jak zauważono powyżej, nietranslowany region 3' chimerycznego genu roślinnego zawiera sygnał poliadenylacji, który służy w roślinach do spowodowania dołączenia adenylanowych nukleotydów do końca 3' RNA. Przykłady korzystnych regionów 3' to (1) transkrybowane nietranslowane regiony 3' zawierające sygnał poliadenylacji genów plazmidowych indukujących nowotwór (Ti) Agrobacterium, takie jak gen syntazy nopaliny (NOS) i (2) geny roślinne takie jak geny białka magazynowego 7s soi oraz gen ssRUBISCO E9 groszku [Fischhoff i in.]As noted above, the 3 'untranslated region of a chimeric plant gene contains a polyadenylation signal which serves in plants to cause adenylate nucleotides to be added to the 3' end of the RNA. Examples of preferred 3 'regions are (1) transcribed untranslated 3' regions containing the polyadenylation signal of Agrobacterium tumor-inducing (Ti) plasmid genes, such as the nopaline synthase (NOS) gene and (2) plant genes such as the soy 7s storage protein genes and the ssRUBISCO gene E9 peas [Fischhoff et al.]
LokalizacjaLocation
Wektory zawierające kasety patatyny opisane powyżej pozwalajjąna ekspresję aktywnego białka w cytoplazmie lub wakuolach komórek roślinnych. Może być pożądane skierowanie większej części lub całości patatyny do układu wydzielniczego rośliny. Aby to osiągnąć, korzystne może być zastosowanie sekwencji sygnałowej pochodzącej z genu bakteryjnego lub roślinnego, ale prawdopodobnie korzystny jest gen roślinny. Przykłady takich sekwencji sygnałowych są sekwencje pochodzące z genu endoproteinazy B (Koehler i Ho) i genu tytoniu PR1b (Comelissen i in.). pMON 10824, opisany w publikacji EP 0385962, jest wektorem transformacji roślin zaprojektowanym dla ekspresji białka B. t. kurstaki aktywnego wobec motyli. W pMON10824, sekwencję kodującą B. t. k. skleja się z sekwencją sygnałową PR1b i 10 aminokwasami dojrzałejThe vectors containing the patatin cassettes described above allow the expression of the active protein in the cytoplasm or vacuoles of plant cells. It may be desirable to direct most or all of the patatin into the plant's secretory system. To achieve this, it may be advantageous to use a signal sequence derived from a bacterial or plant gene, but a plant gene is probably preferable. Examples of such signal sequences are those derived from the endoproteinase B gene (Koehler and Ho) and the tobacco PR1b gene (Comelissen et al.). pMON 10824, described in EP 0385962, is a plant transformation vector designed to express the butterfly-active B. t. kurstaki protein. In pMON10824, the B. t. K. Coding sequence is aligned with the signal sequence of PR1b and the 10 amino acids of mature
176 936 sekwencji kodującej PR1b. W celu utworzenia wektora, w którym sygnał PR1b jest sklejony z genem patatyny, pMON10824 odcina się Bg1II iNcoI i wydziela mały fragment Bg1II-NcoI zawieraj ący sygnał PR1b. W reakcj i ligowania mały fragment Bg1 II-Ncol pMON 10824 miesza się z fragmentem 1000 par zasad NcoI-EcoRI z pMON19714 i trawionym BamHI-EcoRI pMON19470 (Brown i in.). W reakcji powstaje plazmid, w którym sekwencja kodująca patatyny jest sklejona z sygnałem wydzielania z genu PRIb i napędzana promotorem CaMv35S i intron do ekspresji w roślinachjednoliściennych. Do potrzeb ekspresji w roślinach dwuliściennych można przeprowadzić podobną reakcję. Fragment NotI-NotI wektora ekspresji w roślinach dwuliściennych można wstawić do wektora transformacji w roślinach dwuliściennych w sposób opisany poniżej i zmobilizować w rozbrojonym gospodarzu Agrobacterium w celu transformacji roślin dwuliściennych. Tak więc można otrzymać rośliny wytwarzające patatynę wydzielaną w przestrzeń międzykomórkową.176,936 of the PR1b coding sequence. To create a vector in which the PR1b signal is fused to the patatin gene, pMON10824 is cleaved with BglII and NcoI and the small BglII-NcoI fragment containing the PR1b signal is isolated. In the ligation reaction, the small BglII-NcoI fragment of pMON 10824 is mixed with the 1000 bp NcoI-EcoRI fragment of pMON19714 and the BamHI-EcoRI digested pMON19470 (Brown et al.). The reaction produces a plasmid in which the patatin coding sequence is fused to the secretion signal from the PRIb gene and driven by the CaMv35S promoter and the intron for expression in monocots. For expression in dicots, a similar reaction can be performed. The NotI-NotI fragment of the dicotyledon expression vector can be inserted into the dicotyledonous transformation vector as described below and mobilized in a disarmed Agrobacterium host to transform dicotyledons. Thus, plants can be obtained that produce patatin secreted into the intercellular space.
Fragment NotI-NotI tego plazmidu dla roślinjednoliściennych można wprowadzić do wektora transformacji dla kukurydzy (takiego jak pMON18181 opisany powyżej) w celu wytworzenia kukurydzy wydzielającej patatynę.The NotI-NotI fragment of this monocot plasmid can be inserted into a maize transformation vector (such as pMON18181 described above) to generate patatin secreting maize.
Mogłoby być korzystne skierowanie lokalizacji patatyny do innej przestrzeni komórkowej, chloroplastu. Białka można kierować do chloroplastu przez wprowadzenie naN-końcu tranzytowego peptydu chloroplastu (CTP). Jednym z opracowanych CTP, który kieruje heterologiczne białka do chloroplastu, jest CTP otrzymany z małej genowej podjednostki RUBISCO Arabidopsis, oznaczanej ats1A. Skonstruowano wariant tego peptydu tranzytowego kodujący peptyd tranzytowy, 23 aminokwasy dojrzałej sekwencji RUBISCO, plus a reiterację miejsca odcinania peptydu tranzytowego, do korzystnej localizacji chloroplastowej białka B. t. k. pMON19643, opisany przez Browna i in., zawiera peptyd tranzytowy ats1A Arabidopsis sklejony z genem GOX, i można go stosować jako podstawę do konstruowania wektora dla chloroplastowej lokalizacji patatyny. Przeprowadza się całkowite trawienie EcoRI i częściowe NcoI pMON19643 i wydziela się duży fragment (4000 par zasad). W reakcji ligacji, fragment NcoI-EcoRI z pMON 19714 miesza się z dużym fragmentem pMON19643. W reakcj i po wstaj e plazmid, w którym patatynowa sekwencja kodująca jest sklejona z peptydem tranzytowym Arabidopsis z 23 aminokwasami dojrzałego RUBISCO i napędzana promotorem CaMV E35S. Alternatywnie, podobny plazmid można skonstruować w celu zastąpienia promotora promotorem FMV35S. Takie plazmidy mobilizuje się w rozbrojonym gospodarzu Agrobacterium w celu transformowania roślin dwuliściennych. Alternatywnie, fragment NotI-NotI klonuje się do wektora transformacji kukurydzy w sposób opisany powyżej. Można w ten sposób otrzymywać rośliny wytwarzające patatynę lokalizowaną, w chloroplastach.It might be beneficial to direct the localization of patatin to another cell space, the chloroplast. Proteins can be targeted to the chloroplast by introducing at the N-terminus of the chloroplast transit peptide (CTP). One of the CTPs developed which directs heterologous proteins to the chloroplast is the CTP obtained from the small gene subunit of RUBISCO Arabidopsis, designated ats1A. A variant of this transit peptide encoding a transit peptide, 23 amino acids of the mature RUBISCO sequence, plus a reiteration of the transit peptide cleavage site was constructed for the preferred chloroplast localization of the B. tk pMON19643 protein, described by Brown et al., Contains the Arabidopsis ats1A transit peptide fused to the GOX gene, and can be used as a basis for constructing a vector for the chloroplast localization of patatin. Complete EcoRI digestion and partial NcoI digestion of pMON19643 are performed and the large fragment (4000 bp) is isolated. In a ligation reaction, the NcoI-EcoRI fragment from pMON 19714 is mixed with the large fragment of pMON19643. The reaction results in a plasmid in which the patatin coding sequence is fused to the Arabidopsis 23 amino acid mature RUBISCO transit peptide and driven by the CaMV E35S promoter. Alternatively, a similar plasmid can be constructed to replace the promoter with the FMV35S promoter. Such plasmids are mobilized in a disarmed Agrobacterium host to transform dicots. Alternatively, the NotI-NotI fragment is cloned into the maize transformation vector as described above. Plants which produce localized patatin in chloroplasts can thus be obtained.
Transformacja i ekspresja w roślinachTransformation and expression in plants
Chimeryczny gen roślinny zawierający strukturalną sekwencję kodującą można wprowadzić w genom rośliny w dowolny dogodny sposób. Odpowiednie wektory transformacji roślin obejmują wektory pochodzące z plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens, jak też opisane, np., przez Herrerę-Estrella (1983), Bevana (1983), Klee (1985) i w publikacji EPO 0120516 (Schilperoort i in.). Poza wektorami transformacji roślin pochodzącymi z plazmidów Ti lub indukującymi w korzeniu (Ri) Agrobacterium, można zastosować alternatywne sposoby insercji konstruktów DNA według wynalazku w komórki roślin. Takie sposoby mogą obejmować np. zastosowanie liposomów, electroporację, związki chemiczne zwiększające pobór wolnego DNA, dostarczanie wolnego DNA przez mikrobombardowanie oraz transformację przy pomocy wirusów lub pyłku.A chimeric plant gene containing a structural coding sequence may be inserted into the plant genome by any convenient means. Suitable plant transformation vectors include those derived from the Ti plasmid Agrobacterium tumefaciens as also described, for example, by Herrera-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee (1985) and EPO publication 0120516 (Schilperoort et al.). In addition to plant transformation vectors derived from Ti plasmids or inducing in the Agrobacterium root (Ri), alternative methods for inserting the DNA constructs of the invention into plant cells can be used. Such methods may include, for example, the use of liposomes, electroporation, chemicals to increase free DNA uptake, delivery of free DNA by microbombardment, and transformation with viruses or pollen.
Przejściowa ekspresja patatyny w komórkach tytoniuTransient expression of patatin in tobacco cells
Szczególnie przydatnym plazmidowym kasetowym wektorem transformacji rośliny dwuliściennej jest pMON11794. Kaseta ekspresji pMON11794 składa się z promotora CaMVE35S, nietranslowanej sekwencji początkowej petunii Hsp70 5' i końca 3' obejmującego sygnały poliadenylacji z genu NOS. pMON11794 obejmuje miejsca NcoI i EcoRI do insercji sekwencji kodujących i miejsca NotI-NotI flankujące kasetę ekspresji genu rośliny.A particularly useful plasmid cassette transformation vector for a dicotyledonous plant is pMON11794. The pMON11794 expression cassette consists of the CaMVE35S promoter, the untranslated Hsp70 initial 5 'petunia sequence and the 3' end containing polyadenylation signals from the NOS gene. pMON11794 includes NcoI and EcoRI sites for insertion of coding sequences and NotI-NotI sites flanking the plant gene expression cassette.
176 936176 936
PatA+ (sekw. nr id. 11), PatB+ (sekw. nr id. 16), PatC+ (sekw. nr id. 17) i PatG+ (sekw. nr id. 22) wstawiono w pMON11794 w celu wytworzenia odpowiednio pMON 19745, pMON19742, pMON19743 i pMO'N19744. Każdy z wektorów poddano elektroporacji w protoplastach tytoniu. Ekspresję patatyny w transformowanych komórkach tytoniu potwierdzono metodą analizy Western.PatA + (SEQ ID No. 11), PatB + (SEQ ID No. 16), PatC + (SEQ ID No. 17) and PatG + (SEQ ID No. 22) were inserted in pMON11794 to generate pMON 19745, pMON19742 respectively , pMON19743 and pMO'N19744. Each of the vectors was electroporated in tobacco protoplasts. Patatin expression in transformed tobacco cells was confirmed by Western analysis.
Trwała transformacja roślin dwuliściennychPermanent transformation of dicotyledons
Trwałą transformację roślin dwuliściennych genem patatyny opisał Rosahl i in. Tytoń transformowano genem patatyny pod kontrolą promotora specyficznego wobec liści i łodyg. Patatyna uległa ekspresji.The permanent transformation of dicots with the patatin gene is described by Rosahl et al. The tobacco was transformed with the patatin gene under the control of a leaf and stem specific promoter. Patatin is expressed.
Fragment Notl-Notl z pMON19745 wprowadzono do pMON17227, wektora plazmidowego Ti opisanego przez Barry'ego i in. w publikacji WO 92/04449, dołączonej niniejszym jako odnośnik literaturowy, w celu wytworzenia pMON22566. Wektor ten zawiera glifosanowy gen oporności opisany przez Barr/ego dla selekcji transformowanych roślin. Podobnie zastosowano sekwencje nr id. 16, 17i22dowytworzeniaodpowiedniowektorapMON22563,22564, i 22565.The NotI-NotI fragment from pMON19745 was inserted into pMON17227, a Ti plasmid vector described by Barry et al. in WO 92/04449, incorporated herein by reference, to prepare pMON22566. This vector contains the glyphosate resistance gene described by Barr for selection of transformed plants. Sequences ID no. 16, 17 and 22 to generate the corresponding vectors MON22563, 2564, and 22565.
Wektor wprowadzono do rozbrojonego gospodarza Agrobacterium ABI w celu transformacji eksplantowanych pomidorów w kulturze tkankowej. Po selekcji na oporność glifozanowąi regeneracji roślin, otrzymano pełne rośliny wykazujące ekspresję genu patatyny. Ekspresję genu patatyny potwierdzono metodą analizy Western, a wstępne wyniki wskazują na ekspresję na poziomie od 0,1 do 0,5% łącznej ilości białka. Biotesty z larwami owadów są prowadzone.The vector was introduced into a disarmed Agrobacterium ABI host to transform explanted tomatoes into tissue culture. After selection for glyphosan resistance and plant regeneration, whole plants expressing the patatin gene were obtained. The expression of the patatin gene was confirmed by Western blot analysis, and preliminary results show an expression of 0.1 to 0.5% of the total protein. Insect larvae bioassays are underway.
Przejściowa ekspresja patatyny w komórkach kukurydzyTransient expression of patatin in corn cells
Fragment 1000 par zasad Ncol-EcoRI pMON19729, opisany powyżej, wprowadzono do pMON19433, opisanego w publikacji WO 93119189 i wspólnie złożonym zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/855857, złożonym 19 marca 1992 (Brown i in.), dołączanym niniejszym jako odnośnik literaturowy. Powstały plazmid, pMON19731, trawiono Notl, a powstały fragment wstawiono w pMON10081, także opisany przez Browna i in., otrzymując pMON 19740. Plazmid ten poddano elektroporacji w protoplastę liści kukurydzy zgodnie’ z opisem Sheena, 1991. Ekspresję patatyny w transformowanych komórkach protoplastów kukurydzy potwierdzono metodą analizy Western.The 1000 bp NcoI-EcoRI fragment of pMON19729, described above, was introduced into pMON19433 described in WO 93119189 and co-pending U.S. Patent Application No. 07/855857, filed March 19, 1992 (Brown et al.), Incorporated herein by reference . The resulting plasmid, pMON19731, was digested with NotI and the resulting fragment was inserted into pMON10081, also described by Brown et al., Yielding pMON 19740. This plasmid was electroporated into a maize leaf protoplast according to Sheen, 1991. Expression of patatin in transformed maize protoplast cells confirmed by Western analysis.
W celu osiągnięcia cytoplazmatycznej ekspresji patatyny fragment Ncol-EcoRI pMON 19714 wprowadzono do pMON19433 otrzymując pMON19730. Fragment Notl pMON19730 wprowadzono do pMON10081 i powstały plazmid, pMON 19739, poddano elektroporacji w protoplastę liści kukurydzy, które wytworzyły patatynę, co potwierdzono metodą analizy Western.To achieve cytoplasmic expression of patatin, the NcoI-EcoRI fragment of pMON 19714 was introduced into pMON19433 to give rise to pMON19730. The NotI fragment of pMON19730 was introduced into pMON10081 and the resulting plasmid, pMON 19739, was electroporated to protoplast of corn leaves that produced patatin, as confirmed by Western blot analysis.
Pat17, w obecności i bez sygnałów lokalizujących, poddano także ekspresji w protoplastach kukurydzy. pMON19761 skonstruowano wstawiając fragment 1100 par zasad NcoI-EcoRI (sekw. nr id. 30) kodujący białko Pat17+ (dojrzałe białko Pat17 i jego własna sekwencja sygnałowa dla lokalizacji w wakuolach) do pMON19648. Tak więc pMON19761 zawiera promotor CaMV E35S, intron Hsp 70, gen Pat17+ i terminator NOS dla ekspresji w komórkach kukurydzy.Pat17, in the presence and absence of locating signals, was also expressed in maize protoplasts. pMON19761 was constructed by inserting a 1100 bp fragment of NcoI-EcoRI (SEQ ID NO. 30) encoding the Pat17 + protein (mature Pat17 protein and its own signal sequence for vacuole localization) into pMON19648. Thus, pMON19761 contains the CaMV E35S promoter, the Hsp 70 intron, the Pat17 + gene and the NOS terminator for expression in maize cells.
W celu otrzymania wektora dla cytoplazmatycznej ekspresji, sekwencję Pat17+ w pMON 19761 zastąpiono fragmentem NcoI-EcoRI kodującym białko PatI7m (sekw. nr id. 31) z pMON25213 w celu otrzymania konstruktu pMON25223.In order to obtain a vector for cytoplasmic expression, the Pat17 + sequence in pMON 19761 was replaced with the NcoI-EcoRI fragment encoding the PatI7 m protein (SEQ ID NO: 31) from pMON25213 to obtain the pMON25223 construct.
pMON25224 otrzymano wstawiając dwa fragmenty, fragment 300 par zasad XbaINcoI zawierający chloroplastowy peptyd tranzytowy (CTP) z genu SSU 1 a Arabidopsis thaliana (Timko i in.) z pMON19643 (Brown i in.) oraz fragment 1000 par zasad NcoI-EcoRI dla Pat17m z pMON25213, wstawiony w pMON19761 (XbaI-EcoRI). Tak więc pMON25224 zawiera promotor CaMV E35S, intron Hsp 70, sekwencję kodującą CTP/Pat17m i terminator NOS.pMON25224 was obtained by inserting two fragments, a 300 bp XbaINcoI fragment containing a chloroplast transit peptide (CTP) from the SSU 1 a Arabidopsis thaliana gene (Timko et al.) from pMON19643 (Brown et al.) and a 1000 bp NcoI-EcoRI fragment for Pat17 m from pMON25213, inserted into pMON19761 (XbaI-EcoRI). Thus, pMON25224 contains the CaMV E35S promoter, the Hsp 70 intron, the CTP / Pat17m coding sequence and the NOS terminator.
Dla lokalizacji pozakomórkowej koniec 5' endoproteinazy B cDNA (Koehler i Ho) kodujący pozakomórkowy peptyd sygnałowy wydzielanego białka połączono z genem Pat17m z pMON25213. Fragment BgUI-EcoRI zawierający chimeryczny gen otrzymano techniką splata18For extracellular localization, the 5 'end of endoproteinase B cDNA (Koehler and Ho) encoding the extracellular signal peptide of secreted protein was fused to the Pat17m gene from pMON25213. The BgUI-EcoRI fragment containing the chimeric gene was obtained by the splicing technique18
176 936 nia nakładających się zakończeń (Horton i in.) i wstawiono w pMON19761 (BamHI-EcoRI) otrzymując pMON25225.176,936 overlapping ends (Horton et al.) And inserted into pMON19761 (BamHI-EcoRI) to give pMON25225.
Wszystkie te konstrukty poddano elektroporacji w protoplastę liści kukurydzy, a ekspresję Pat17m potwierdzono metodą analizy Western.All of these constructs were electroporated into corn leaf progenitor and m Pat17 expression was confirmed by Western blot.
Trwała transformacja kukurydzy genem patatynyPersistent transformation of maize with the patatin gene
Wektor transformacji kukurydzy, pMON18181, skonstruowano z pMON19653 i pMON19643 (Brown i in.). Konstrukt ten zawiera kasetę promotora CaMV E35S, intronHsp70, glifosanowy znacznik selekcyjny CP4 i terminator NOS; kasetę promotora CaMV E35S, intron Hsp70, glifosanowy znacznik selekcyjny GOX i terminator NOS; oraz pojedyncze miejsce NotI dla insercji kasety ekspresji genu zawierającej gen patatyny. Sekwencję nr id. 11 i sekwencję nr id. 30 wprowadzono jako fragmenty NotI-NotI do pMON 18181 w celu wytworzenia odpowiednio pMON 19746 i pMON 19764.The maize transformation vector, pMON18181, was constructed from pMON19653 and pMON19643 (Brown et al.). This construct contains the CaMV E35S promoter cassette, the Hsp70 intron, the glyphosate selection marker CP4, and the NOS terminator; CaMV E35S promoter cassette, Hsp70 intron, GOX glyphosate selection tag and NOS terminator; and a single NotI site for insertion of a gene expression cassette containing the patatin gene. Sequence no. 11 and sequence no. The 30 were introduced as NotI-NotI fragments into pMON 18181 to generate pMON 19746 and pMON 19764, respectively.
Wektory te wprowadzono metodą bombardowania zarodkowej kultury tkankowej stosując biolistyczną wyrzutnię opisaną przez Browna i in. Transformowane komórki selekcjonowano ze względu na oporność na glifosan i pełne rośliny zregenerowano. Odporne na owady rośliny wykazująekspresję genu 0,1 -0,5% łącznej ilości białka w analizie metodą Western, działaniu esterazowym i/lub teście odporności na owady.These vectors were introduced by bombarding the embryonic tissue culture using the biolistic launcher described by Brown et al. Transformed cells were selected for glyphosate resistance and whole plants were regenerated. The insect resistant plants express 0.1-0.5% of the total protein gene by Western blot analysis, esterase treatment and / or insect resistance test.
Syntetyczne geny do ulepszonej ekspresji roślin jednoliściennychSynthetic genes for improved expression of monocots
Otrzymano modyfikacje sekwencji kodującej polepszające ekspresję innych genów owadobójczych białek takich jak sekwencje delta endotoksyny z Bacillus thuringiensis (Fischhoff i Perlak; publikacja WO 93/07278, Ciba-Geigy). Zaprojektowano w ten sposób zmodyfikowaną, sekwencję kodującąulepszającąekspresję patatyn w roślinach, szczególnie kukurydzy. Zmodyfikowaną sekwencję Pat17+ pokazano jako sekwencję nr id. 33. Fragment DNA zawierający sekwencję nr id. 33 można zsyntetyzować i wprowadzić w wektor kasety ekspresji kukurydzy taki jak pMON19470 (Bown i in.). Kasetę ekspresji kukurydzy wstawia się następnie do pMON18181 lub innego wektora transformacji kukurydzy zawierającego gen wybieralnego znacznika w celu transformacji kukurydzy, otrzymując pełnąkukurydzę wytwarzając ąPat17+.Coding sequence modifications have been obtained to improve the expression of other insecticidal protein genes such as the Bacillus thuringiensis delta endotoxin sequence (Fischhoff and Perlak; WO 93/07278, Ciba-Geigy). The coding sequence modified in this way was designed to improve the expression of patins in plants, especially in maize. The modified sequence Pat17 + is shown as sequence ID No. 33. A DNA fragment containing the sequence ID NO. 33 can be synthesized and inserted into a vector corn expression cassette such as pMON19470 (Bown et al.). The maize expression cassette is then inserted into pMON18181 or other maize transformation vector containing a selectable tag gene for maize transformation, yielding complete maize to produce ąPat17 +.
Wszystkie wymienione w opisie publikacje i opisy patentowe dołączane są niniejszym jako odnośniki literaturowe, tak jakby każda z nich była odrębnie opisana jako dołączana w charakterze odnośnika.All publications and patents mentioned in the specification are hereby incorporated by reference as if each had been separately described as being incorporated herein by reference.
LiteraturaLiterature
Andrews, i in. Biochem. J. 252: 1988.Andrews, et al. Biochem. J. 252: 1988.
Bagdasarian i in., Gen, 16: 237-47,1981.Bagdasarian et al., Gen, 16: 237-47, 1981.
Barry i in. WO 92/04449.Barry et al. WO 92/04449.
Bevan, M. i in., Naturę, 304:184,1983.Bevan, M. et al., Nature, 304: 184, 1983.
D. Boulter, A. M. R. Gatehouse i V. Hilder, Biotech Adv. 7: 489, 1989.D. Boulter, A. M. R. Gatehouse, and V. Hilder, Biotech Adv. 7: 489, 1989.
Broadway i Duffey, J. Insect Physiol. 23: 827,1986.Broadway and Duffey, J. Insect Physiol. 23: 827.1986.
Brown i in. WO 93/19189 i jednocześnie złożone zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr kolejny 07/855857, złożone 19 marca 1992.Brown et al. WO 93/19189 and co-pending United States Patent Application Serial No. 07/855857, filed March 19, 1992.
Cornelissen, B. J. C., i in. EMBO Journal, 5: 37-40,1986.Cornelissen, B. J. C., et al. EMBO Journal, 5: 37-40,1986.
Czapla i Lang, J. Econ. Entomol. 83: 2480,1990.Czapla and Lang, J. Econ. Entomol. 83: 2480,1990.
Fischhoff, D. A. i Perlak, F. J. Europejskie zgłoszenie patentowe, nr 0385962, 1990.Fischhoff, D. A. and Perlak, F. J. European Patent Application, No. 0385962, 1990.
Fischhoff i in., Bio/Technol. 5: 807, 1987.Fischhoff et al., Bio / Technol. 5: 807,187.
176 936176 936
Gaillaird, T. Biochem. J. 121: 379-390,1971.Gaillaird, T. Biochem. J. 121: 379-390, 1971.
Ganal i in., Mol. Gen. Genetics, 225: 501-509,1991.Ganal et al., Mol. Gen. Genetics, 225: 501-509, 1991.
Gatehouse i in., J. Sci. Agric. 37: 727,1986.Gatehouse et al., J. Sci. Agric. 37: 727.1986.
Herrera-Estrella, L. i in., Nature, 303:209, 1983.Herrera-Estrella, L. et al., Nature, 303: 209, 1983.
Heusing i in., Plant Physiol. 96: 993, 1991.Heusing et al., Plant Physiol. 96: 993,1991.
Hofgen, R., i Willmitzer, L. Plant Science, 66: 221-230, 1990.Hofgen, R., and Willmitzer, L. Plant Science, 66: 221-230,1990.
Horton i in., Gen, 77: 61-68, 1989.Horton et al., Gen, 77: 61-68, 1989.
Ishimoto i K. Kitamura, Appl. Ent. Zool. 24: 281,1989.Ishimoto and K. Kitamura, Appl. Ent. Zool. 24: 281.1989.
Kay, R. i in., Science, 236: 1299-1302, 1987.Kay, R. et al., Science, 236: 1299-1302, 1987.
Klee, H. J. i in., Bio/Technology, 3: 637-642, 1985.Klee, H. J. et al., Bio / Technology, 3: 637-642, 1985.
Knauf, V. C. i Nester, E. Plasmid, 8: 43-54,1982.Knauf, V. C. and Nester, E. Plasmid, 8: 43-54, 1982.
Koehler, S., i Ho., T. -H. D., Plant Cell, 2: 769-783,1990.Koehler, S., and Ho., T. -H. D., Plant Cell, 2: 769-783, 1990.
Luckow, V. A., i in., J. Virol. 67:4566-4579,1993.Luckow, V. A., et al., J. Virol. 67: 4566-4579, 1993.
Marrone, P. G., i in. J. Econ. Entom., 78: 290-3,1985.Marrone, P. G., et al. J. Econ. Entom., 78: 290-3.1985.
Mignery, i in., Nucleic Acids Research, 12: 7987^^^(^(^, 1984.Mignery, et al., Nucleic Acids Research, 12: 7987 ^^^ (^ (^, 1984.
Mignery, i in., Gene, 62: 27-44, 1988.Mignery, et al., Gene, 62: 27-44, 1988.
Murdock i in., Phytochemistry, 29: 85, 1990.Murdock et al., Phytochemistry, 29: 85,1990.
Olins, P., i in., J. Biol. Chem., 264: 16973-16976,1989.Olins, P., et al., J. Biol. Chem., 264: 16973-16976, 1989.
Park, W. D., i in., Plant Physiol., 71: 156-160, 1983.Park, W. D., et al., Plant Physiol., 71: 156-160, 1983.
Pernes, J. F., i in., J. Chromatography, 181: 254-258,1980.Pernes, J. F., et al., J. Chromatography, 181: 254-258, 1980.
Racusen, D., Can. J. Bot., 62: 1640-1644,1984.Racusen, D., Can. J. Bot., 62: 1640-1644, 1984.
Racusen, D., Can. J. Bot., 64: 2104-2106,1986.Racusen, D., Can. J. Bot., 64: 2104-2106, 1986.
Racusen i Foote, J. Food Biochem., 4: 43-52,1980.Racusen and Foote, J. Food Biochem., 4: 43-52, 1980.
Rodis, P. i Hoff, J. E., Plant Physiol., 74: 907-911 1984.Rodis, P. and Hoff, J. E., Plant Physiol., 74: 907-911 1984.
Rosahl i in., The EMBO Journal, 6(5): 1155-1159.Rosahl et al., The EMBO Journal, 6 (5): 1155-1159.
Ryan, Ann. Rev. Phytopath., 28: 425-449,1990.Ryan, Ann. Rev. Phytopath., 28: 425-449, 1990.
Schilperoort, i in., Publikacja EPO nr 0120516.Schilperoort, et al., EPO Publication No. 0120516.
Sheen, Jen, Plant Cell, 3: 225-245, 1991.Sheen, Jen, Plant Cell, 3: 225-245, 1991.
Shukle i Murdock, Environ. Ent. 12: 787, 1983.Shukle and Murdock, Environ. Ent. 12: 787, 1983.
Soberon, X., i in., Gene, 9: 287-305, 1980.Soberon, X., et al., Gene, 9: 287-305, 1980.
Stiekema i in., Plant Mol. Biol., 11: 255-269, 1988.Stiekema et al., Plant Mol. Biol., 11: 255-269,188.
Timko i in. The Impact of Chemistry on Biotechnology, ACS Books, 1988, 279-295. Vancanneyt i in., Plant Cell, 1: 533-540, 1989.Timko et al. The Impact of Chemistry on Biotechnology, ACS Books, 1988, 279-295. Vancanneyt et al., Plant Cell, 1: 533-540, 1989.
176 936176 936
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:SEQUENCE LIST (1) GENERAL INFORMATION:
(1) ZGŁASZAJĄCY:(1) APPLICANTS:
CA) NAZWA: Monsanto Company (B) ULICA: 800 North Lindbergh Boulevard (C) MIASTO: St. Louis (D) STAN: Missouri (E) KRAJ: St. Zjedn. Ameryki (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 63167 (G) TELEFON: (314)694-3131 (H) TELEFAX: (314)694-5435 (ii) NAZWA WYNALAZKU: Sposób zwalczania owadów (iii) LICZBA SEKWENCJI: 33 (iv) POSTAĆ DLA KOMPUTERA:CA) NAME: Monsanto Company (B) STREET: 800 North Lindbergh Boulevard (C) CITY: St. Louis (D) STATE: Missouri (E) COUNTRY: St. US Americas (F) ZIP CODE (ZIP): 63167 (G) TELEPHONE: (314)694-3131 (H) TELEFAX: (314)694-5435 (ii) NAME OF THE INVENTION: Insect Control Method (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 33 ( iv) FORM FOR COMPUTER:
(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka elastyczna (B) KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: PatentIn Release 1.0,(A) MEDIA TYPE: floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Release 1.0,
1.25 (EPO) (vi) DANE O WCZEŚNIEJSZYCH ZGŁOSZENIACH:1.25 (EPO) (vi) PREVIOUS NOTIFICATION DATA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/031146 (B) DATA ZŁOŻENIA: 12 MARCA 1993 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 1:(A) APPLICATION NUMBER: US 08/031146 (B) FILING DATE: MARCH 12, 1993 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów(A) LENGTH: 15 Amino Acids
Wersj aVersion a
176 936 (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYi CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:1176 936 (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) THYi PARTICLES: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1
Liz Leu Glu Glu Met Wal Tre Wal Leu Ser Ile Asp GliLiz Leu Glu Glu Met Wal Tre Wal Leu Ser Ile Asp Gli
Gli GliGli Gli
10 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 2 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:10 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 2 (1) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYi: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYi CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID. : 2.·.(A) LENGTH: 15 amino acids (B) TYi: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) THESEi PARTICLES: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO. : 2. ·.
Xaa Leu Gli Glu Met Wal Tre Wal Leu Ser Ile Asp Gli Gli GliXaa Leu Gli Glu Met Wal Tre Wal Leu Ser Ile Asp Gli Gli Gli
10 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 3:10 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów(A) LENGTH: 15 Amino Acids
176 936 (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYi CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIP SEKEKNEJI: SEEKEECCA NR ID.: 3:176 936 (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) THYi PARTICLES: protein (xi) SEEKNEJI OPIP: SEEKEECCA ID NO .: 3:
Tre Leu Gli Glu Met Eal Tre Eal Leu Ser Ile Asp GliTre Leu Gli Glu Met Eal Tre Eal Leu Ser Ile Asp Gli
Gli GliGli Gli
10 (2) IRFORMACJA DLA SEKWENCJI jr id.: 4:10 (2) IRFORMATION FOR SEQUENCES jr id .: 4:
(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(1) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYi: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYi CZĄSTECZKI: białko (xi) OPOi SEEWEECJI: SSKKENJCA EJ ID.: 4:(A) LENGTH: 15 amino acids (B) TYi: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) THESE MOLECULES: protein (xi) SEEEWEECTION OPTIONS: EJ ID .: 4:
Tre Leu Gli Glu Met Eal Tre Eal Leu Ser Ile Asp Gli Gli GliTre Leu Gli Glu Met Eal Tre Eal Leu Ser Ile Asp Gli Gli Gli
10 (2) INFORMACJA DLA SEKEERCJI CR ID.: 5:10 (2) INFORMATION FOR SECTION CR ID .: 5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKEERCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SECTION:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów(A) LENGTH: 15 Amino Acids
176 936 (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 5:176 936 (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF PARTICLE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 5:
Liz Leu Xaa Glu Met Wal Tre Wal Leu Ser Ile Asp GliLiz Leu Xaa Glu Met Wal Tre Wal Leu Ser Ile Asp Gli
Gli GliGli Gli
10 (2) INFORMACJĄ DLA SEKWENCJI NR ID.: 6:10 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 6:
(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(1) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 6:(A) LENGTH: 8 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF PARTICLE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 6:
Xaa Xaa Glu Glu Met Wal Tre WalXaa Xaa Glu Glu Met Wal Tre Wal
5 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 7:5 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa(A) LENGTH: 15 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
176 936 (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 7:176 936 (ii) PARTICLE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 7:
Ser Leu Asp Tyr Liz Gln Met Leu Leu Leu Ser Leu GliLeu Asp Tyr Cheese Liz Gln Met Leu Leu Leu Cheese Leu Gli
Tre GliTre Gli
10 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 8:10 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 8:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 8:
Liz Leu Asp Tyr Liz Gln Met LeuLiz Leu Asp Tyr Liz Gln Met Leu
5 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 9:5 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 9:(A) LENGTH: 15 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF PARTICLE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 9:
176 936176 936
Ser Leu Xaa Tyr Liz Gln Met Leu Leu Leu Ser Leu Gli Tre GliCheese Leu Xaa Tyr Liz Gln Met Leu Leu Leu Cheese Leu Gli Tre Gli
10 (2) INFORMACJA DRA SEKWENCJI NR ID.: :3.0:10 (2) INFORMATION DRA SEQUENCE ID NO .:: 3.0:
(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(1) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTCCZKI: białOo (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 10:(A) LENGTH: 15 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF PARTICLE: white (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 10:
Ser Leu Asn Tyr Liz Gln Met Leu Leu Leu Ser Leu GliLeu Asn Tyr Liz Gln Met Leu Leu Leu Cheese Leu Gli Cheese
Tre GliTre Gli
10 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: :11:10 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .:: 11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(AA) DŁUGOŚĆ: 1171 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CCASTECCKI: cDNA(AA) LENGTH: 1171 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) CCASTEK TYPE: cDNA
176 936 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 11:176 936 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 11:
CCATGGCAACCCATGGCAAC
ACTACTAGTTACTACTAGTT
CAACATGTGCCAACATGTGC
GGTGGAATTAGGTGGAATTA
AGGGAATCATAGGGAATCAT
GAAGTGGACAGAAGTGGACA
ATAATAAAGAATAATAAAGA
AGTACAGGAGAGTACAGGAG
GTTTATTGACGTTTATTGAC
GCTGCTGCCAGCTGCTGCCA
AAGATATTGTAAGATATTGT
AGTGGTTCAAAGTGGTTCAA
TTATTGGCCCTTATTGGCCC
AAACTTGGAGAAACTTGGAG
AAACTCGTGTAAACTCGTGT
ATCAAAACAAATCAAAACAA
ATAAGCCAGTATAAGCCAGT
GATGCTAAGAGATGCTAAGA
TGTATGACATTGTATGACAT
CATTACTTTACATTACTTTA
TTACTCATACTTACTCATAC
GGTGTTGCTAGGTGTTGCTA
CTGTTGGTGACTGTTGGTGA
CAAGAGGATCCAAGAGGATC
CAGCATTTTCCAGCATTTTC
TCATTAGGCATCATTAGGCA
TACTAAATCTTACTAAATCT
TTTTTAATTTTTTTTAATTT
TATTTTTTATTATTTTTTAT
TAAGTTGGAATAAGTTGGAA
TCCAGCTATCTCCAGCTATC
TGCAAGACTTTGCAAGACTT
TGCTATGATATGCTATGATA
ACCCTTTTACACCCTTTTAC
AATGTATGATAATGTATGAT
GCATCAAGCTGCATCAAGCT
AATATTCACTAATATTCACT
ATGCTATTCCATGCTATTCC
TAGTAATGGTTAGTAATGGT
TCCGGCGTTATCCGGCGTTA
TTCAATTAAGTTCAATTAAG
GAAATGGTGAGAAATGGTGA
ATTCTCGAATATTCTCGAAT
GCAGATTACTGCAGATTACT
ACTACTCCAAACTACTCCAA
TTCGAACATGTTCGAACATG
GGAAAATATCGGAAAATATC
TTGACAGAAGTTGACAGAAG
AAGTCAAATTAAGTCAAATT
ACAGCAGCAGACAGCAGCAG
GATATATATGGATATATG
TTATCCCTTATTATCCCTTA
TCATTGGATTTCATTGGATT
CTGTTCTTAGCTGTTCTTAG
TTCTTGAAGGTTCTTGAAGG
TTGATGTAATTTGATGTAAT
ATGAAAACAAATGAAAACAA
GCCCTCATATGCCCTCATAT
TTCTGCAAGTTTCTGCAAGT
TTGCCATCTCTTGCCATCTC
TAGCAAAGTCTAGCAAAGTC
CTCCAATATACTCCAATATA
AGTTCAATCTAGTTCAATCT
GCGTTGCAACGCGTTGCAAC
ACAAGCAAATACAAGCAAAT
GATATTAGCAGATATTAGCA
TATTGATGGATATTGATGGA
120120
ACAACTTCAGACAACTTCAG
180180
TGGAGGAACATGGAGGAACA
240240
TCGACCCTTTTCGACCCTTT
300300
TTTTAATTATTTTTAATTAT
360360
TCTTCAAGAATCTTCAAGAA
420420
AAGCTTTGACAAGCTTTGAC
480480
TCCAGAATTGTCCAGAATTG
540540
TTTTCCTCCATTTTCCTCCA
600600
TGTTGATGGTTGTTGATGGT
66606660
GAGACTTGCAGAGACTTGCA
7^C7 ^ C
GTTGTTGCTCGTTGTTGCTC
780780
176 936176 936
(2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 12:(2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 37 par zasad (B) TYi: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (syntetyczny) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 12:(A) LENGTH: 37 base pairs (B) TYi: nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF PARTICLE: DNA (synthetic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 12:
CATGTGCTCT AGAAGATCTC CACCATGGCG TTGGAAG (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 13:CATGTGCTCT AGAAGATCTC CACCATGGCG TTGGAAG (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 13:
176 936 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:176 936 (1) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (syyteeyczny) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKKWNNCA NR ID.: 13:(A) LENGTH: 26 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF PARTICLE: DNA (syityic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 13:
GCTTCTTATT GATAGAATTC AAGGTC 2 6 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 34:GCTTCTTATT GATAGAATTC AAGGTC 2 6 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 34:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 3305 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: NR 110.: 13:(A) LENGTH: 3305 bp (B) TYPE: Nucleic acid (C) CHAIN: Single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF PARTICLE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: NO.110: 13:
GGAGGTTTATGGAGGTTTAT
130130
176 936176 936
TGACTGCTATTGACTGCTAT
GCCAAAGATA τaGTACccaa ^AATTATTGGCCAAAGATA τaGTACccaa ^ AATTATTG
GCCCAATGTAGCCCAATGTA
GGAGAAACTCGGAGAAACTC
GTGTGCATCAGTGTGCATCA
ACAAATAAGCACAAATAAGC
CAGTAATATTCAGTAATATT
AACATCTATGAACATCTATG
ACATATGCTA ^TATTACTCACATATGCTA ^ TATTACTC
ATACTAGTAAATACTAGTAA
GCTACTGTTGGCTACTGTTG
GTGATCCGGCGTGATCCGGC
GATCCAGCATGATCCAGCAT
TTTCTTCAAaTTTCTTCAAa
GGCACTGGCAGGCACTGGCA
CT^ATTCAGACT ^ ATTCAGA
GGTCCTCTACGGTCCTCTAC
GAaGGATGaTGAaGGATGaT
ACrGATTATTACrGATTATT
ACATTTCTACACATTTCTAC
GTTCAAGAAAGTTCAAGAAA
ATGCATTAACATGCATTAAC
ATGGAATTATATGGAATTAT
TAGTACAAGTTAGTACAAGT
GATAACTACTGATAACTACT
TTACTTCG^ATTACTTCG ^ A
TGATGGAAAATGATGGAAAA
AGCTTTGACAAGCTTTGACA
CACTAAGTCACACTAAGTCA
TTCCACAGCA aGGTGAaAaATTCCACAGCA aGGTGAaAaA
GTTATTATCC aAAGacAτaGGTTATTATCC aAAGacAτaG
GTTTGATAAAGTTTGATAAA
AGCTATACAG aGTTTTTCAAAGCTATACAG aGTTTTTCAA
AGGCACAACTAGGCACAACT
TGGTGAAACATGGTGAAACA
CCAAATGAAACCAAATGAAA
CATGCCCCTCCATGCCCCTC
GAAGTTGCCAGAAGTTGCCA
AATTTAGCAAAATTTAGCAA
GCAGCTCCAAGCAGCTCCAA
TATGAGTTCATATGAGTTCA
CaTAGCGaTGCaTAGCGaTG
GATTACAAGCGATTACAAGC
ACATATACAGACATATACAG
CAAATGACTACAAATGACTA
GCTCGTCATaGCTCGTCATa
ACTGAAATGGACTGAAATGG
TTATTGAAGATTATTGAAGA
CCTGAAACCTCCTGAAACCT
ACAATCGACCACAATCGACC
AaAaaτττAAAaAaaτττAA
AACTTCTTCAAACTTCTTCA
TCTCiAGCTTTCTCiAGCTT
AGTCTCCAGA aAaATττaccAGTCTCCAGA aAaATττacc
ATcaaGaaGAATcaaGaaGA
CAACGAGACTCAACGAGACT
AftATCTTCTTAftATCTTCTT
CACAAGAGGCCACAAGAGGC
ATGCAGCAAGATGCAGCAAG
CACAAAACAACACAAAACAA
ATGATGCG^ATGATGCG ^
AACCAGTTTC cττaGcaGCτAACCAGTTTC cττaGcaGCτ
240240
TTATAGTGGTTTATAGTGGT
300300
AGAAAAACTTAGAAAAACTT
360360
TGACATCAAATGACATCAAA
420420
ATTGGATGCTATTGGATGCT
480480
TCCACATTACTCCACATTAC
540 aGGaGGTGTT540 aGGaGGTGTT
600600
TGCACAAGAGTGCACAAGAG
660660
GCTCTCATTAGCTCTCATTA
720720
AGCTAAATGGAGCTAAATGG
780780
TTCTTACATGTTCTTACATG
840840
TTACCTCAGCTTACCTCAGC
00
TGAGGCTAATTGAGGCTAAT
960960
CAAAGACAGTCAAAGACAGT
10201020
176 936176 936
ATGAGGAAGC TCTAAAGAGG TTTGCAAAAT TGCTCTCTGA TAGGAAGAAAATGAGGAAGC TCTAAAGAGG TTTGCAAAAT TGCTCTCTGA TAGGAAGAAA
CTCCGAGCAA 1080CTCCGAGCAA 1080
ACAAAGCTTC TTATTGATAG AATTC 1105 (2) INFORMACJA DLA SEKEERCJI RR ID.: 15:ACAAAGCTTC TTATTGATAG AATTC 1105 (2) INFORMATION FOR RR SECTION ID .: 15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKE/ERCJ! :(i) CHARACTERISTICS OF THE SEKE / ERCJ! :
(A) DŁUGOŚĆ: 1106 par zasad (B) TYi: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOiOLOGIA: liniowa (ii) TYi CZĄSTECZKI: cDRA (xi) OiIS SE^^OJI: SEKEERCJA RR ID.: 15:(A) LENGTH: 1106 bp (B) TYi: nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOiology: linear (ii) THESEi PARTICLES: cDRA (xi) OiIS SE ^^ OJI: RR SEQ ID .: 15:
176 936176 936
(2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 16:(2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 16:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 1172 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy(A) LENGTH: 1172 base pairs (B) TYPE: Nucleic acid (C) CHAIN: single
176 936 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 10:176 936 (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF PARTICLE: cDNA (ci) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 10:
CCATGGCAACCCATGGCAAC
ACTACTAGTTACTACTAGTT
CAACATGTGCCAACATGTGC
GGTGGAATTAGGTGGAATTA
AGGGAATCATAGGGAATCAT
GAAGTGGACAGAAGTGGACA
ATAATAAAGAATAATAAAGA
AGTACAGGAGAGTACAGGAG
GTTTATTGACGTTTATTGAC
GCTGCTGCCAGCTGCTGCCA
AAGATATTGTAAGATATTGT
AGTGGTTCAAAGTGGTTCAA
TTTTTGGCCCTTTTTGGCCC
AAACTTGGAGAAACTTGGAG
AAACTCGTGTAAACTCGTGT
ATCAAAACAAATCAAAACAA
ATAAGCCAGTATAAGCCAGT
GATGCTAAGAGATGCTAAGA
TGAATGACATTGAATGACAT
CATTACTTTGCATTACTTTG
TTACTCATACTTACTCATAC
GCTGTTGCTAGCTGTTGCTA
CTGTTGGTGACTGTTGGTGA
CAAGTGGATCCAAGTGGATC
TACTAAATCTTACTAAATCT
GTTTTAGTTTGTTTTAGTTT
TATTTTTTATTATTTTTTAT
TACGTTGGGATACGTTGGGA
GAAATGGTGAGAAATGGTGA
CTGTTCTTAGCTGTTCTTAG
TCCGGCTACCTCCGGCTACC
TGCAAGACTTTGCAAGACTT
TGCTATGATATGCTATGATA
ACCTTTTTACACCTTTTTAC
AATGTATGATAATGTATGAT
GCATCAAGCTGCATCAAGCT
AATATTCACTAATATTCACT
ATGCTATTCCATGCTATTCC
TAGTAATGGATAGTAATGGA
TCCGGCGTTATCCGGCGTTA
ATTCTCGAATATTCTCGAAT
GCAGATTACTGCAGATTACT
ACTACTCCAAACTACTCCAA
TTCGAACATGTTCGAACATG
GGAAAATATTGGAAAATATT
TTGACAGAAGTTGACAGAAG
AAGTCAAATTAAGTCAAATT
ACAGCAGCAGACAGCAGCAG
GATAAATATGGATAAATATG
TTATCCCTTATTATCCCTTA
TTCTTGAAGGTTCTTGAAGG
TTGATGTAATTTGATGTAAT
ATGAAAACAAATGAAAACAA
GCCCTCATATGCCCTCATAT
TTCTGCAAGTTTCTGCAAGT
TTGCCATCTCTTGCCATCTC
TAGCAAAGTCTAGCAAAGTC
CTCCAACATACTCCAACATA
AGTTCAATCTAGTTCAATCT
GCGTTCGAACGCGTTCGAAC
GATATTAGCAGATATTAGCA
TATTGATGGATATTGATGGA
120120
ACAACTTCAGACAACTTCAG
180180
TGGAGGAACATGGAGGAACA
240240
TCGACCCTTTTCGACCCTTT
30Ό30Ό
TTTTAATTCTTTTTAATTCT
6060
TCTTCAAGAATCTTCAAGAA
020020
AAGCTTTGACAAGCTTTGAC
080080
TCCAGAATTGTCCAGAATTG
540540
TTTTCCTCCATTTTCCTCCA
000000
TGTTGATGGTTGTTGATGGT
060060
GAAACTTGCAGAAACTTGCA
720720
176 936176 936
(2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 17:(2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 17:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 1175 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CCASTECCKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 17:(A) LENGTH: 1175 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) CCASTEK TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 17:
CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTTTAATTT TAATTGTTAT GATATTAGCACCATGGCAAC TACTAAATCT TTTTTAATTT TAATTGTTAT GATATTAGCA
ACTACTAGTT 60ACTACTAGTT 60
176 936176 936
CAACATTTGCCAACATTTGC
GGTGGAATTAGGTGGAATTA
AGGGAATCATAGGGAATCAT
AAAATGGACAAAAATGGACA
ATAATGCAGAATAATGCAGA
AGTACAGGAGAGTACAGGAG
GTTTATTGACGTTTATTGAC
GCTGCTGCCAGCTGCTGCCA
ATGAAATTGTATGAAATTGT
AGGTACTGGCAGGTACTGGC
CAATTTTTTGCAATTTTTTG
GAAAACCTTGGAAAACCTTG
GAGAAACTCGGAGAAACTCG
GACATCAAAAGACATCAAAA
CAAATAAGCCCAAATAAGCC
TTGGATGCTATTGGATGCTA
AGATGTATGAAGATGTATGA
CCACATTACTCCACATTACT
TTACTACTAATTACTACTAA
GGTGCTGTTGGGTGCTGTTG
CTACTGTTGCCTACTGTTGC
GCAGAAAAGGGCAGAAAAGG
ATCCAGCATTATCCAGCATT
CTCTCATTAGCTCTCATTAG
GCACTGGCACGCACTGGCAC
GCTAAATGGGGCTAAATGGG
GTGCTATACAGTGCTATACA
TCTTACATGATCTTACATGA
TTCGTTGGAATTCGTTGGAA
TCCGGGTACCTCCGGGTACC
TGCAAGACTTTGCAAGACTT
TTCTATGATATTCTATGATA
ACCTTTTTACACCTTTTTAC
GCCAAAATATGCCAAAATAT
TGTGCATCAATGTGCATCAA
AGTAATATTCAGTAATATTC
CATATGTTATCATATGTTAT
TACTATTAATTACTATTAAT
TGATCCGGCGTGATCCGGCG
TGCTTCAATTTGCTTCAATT
TACTTCAGAGTACTTCAGAG
ATGGATGTTGATGGATGTTG
GAAATGGTGAGAAATGGTGA
ATTCTCGAATATTCTCGAAT
GCAGATTACTGCAGATTACT
ACTACTCCAAACTACTCCAA
TTCGAACATGTTCGAACATG
GATGGAAAATGATGGAAAAT
GCTTTGACTGGCTTTGACTG
ACCAAGTCAAACCAAGTCAA
TCCACAGCAGTCCACAGCAG
GGAGATAAATGGAGATAAAT
TTATTATCCATTATTATCCA
AGGTCATTGAAGGTCATTGA
TTTGATAAAATTTGATAAAA
GTTATACAGCGTTATACAGC
CTGTTCTTAGCTGTTCTTAG
TTCTTGAAGGTTCTTGAAGG
TTGATGTAATTTGATGTAAT
ATGAAAACAAATGAAAACAA
GCCCTCATATGCCCTCATAT
ATCTTATGCAATCTTATGCA
AAGTTGCCATAAGTTGCCAT
ATTTAGCAAAATTTAGCAAA
CAGCTCCAACCAGCTCCAAC
ATGAGTTCAAATGAGTTCAA
TTAGCGTTGCTTAGCGTTGC
ATTACAAAAAATTACAAAAA
CATATACAGCCATATACAGC
GAATGACTGAGAATGACTGA
TATTGATGGATATTGATGGA
120120
ACAACTTCAGACAACTTCAG
0000
TGGAGGAACATGGAGGAACA
200200
TCGACCCTTTTCGACCCTTT
300300
TTTTAATTCTTTTTAATTCT
360360
AGTTCTTCAAAGTTCTTCAA
420420
CTCAAGCTTTCTCAAGCTTT
480480
GTCTCCAGAAGTCTCCAGAA
540540
ATATTTTCCTATATTTTCCT
600600
TCTTGTTGATTCTTGTTGAT
660660
AACGAGACTTAACGAGACTT
720720
AATGTTGTTGAATGTTGTTG
780780
AGAAGAGACAAGAAGAGACA
040040
TGCAGCAAGTTGCAGCAAGT
900900
176 936176 936
(2) INFORMACJA DLA SEKEERCJI JR ID.: 10:(2) INFORMATION FOR SECTION JR ID .: 10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKEERCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SECTION:
176 936176 936
TTGTACCTTTTTGTACCTTT
TCAATTTTTGTCAATTTTTG
GCCCAATGTAGCCCAATGTA
GGAGAAACTCGGAGAAACTC
GTGTGCATCAGTGTGCATCA
ACAAATAAGCACAAATAAGC
CAGTAATATTCAGTAATATT
AAGATGTATGAAGATGTATG
ACATATGTTAACATATGTTA
TTTGTTACTCTTTGTTACTC
ATACTAGTAAATACTAGTAA
GCTACTGTTGGCTACTGTTG
GTGATCCGGCGTGATCCGGC
GATCCAAAATGATCCAAAAT
TTGCTTCAATTTGCTTCAAT
GGCACTGGCAGGCACTGGCA
CTAATTCAGACTAATTCAGA
GGTCCTCTACGGTCCTCTAC
GATGGATATT actgattattGATGGATATT actgattatt
ACCTTTCTACACCTTTCTAC
GTTCAAGAAAGTTCAAGAAA
ATGCATTAACATGCATTAAC
ATGGAATTATATGGAATTAT
TAGTACAAGTTAGTACAAGT
CCTGAAACCTCCTGAAACCT
ATGAGGAAGCATGAGGAAGC
CTCCGAGCAACTCCGAGCAA
TTACTTCGAATTACTTCGAA
TGATGGAAAATGATGGAAAA
AGCTTTGACAAGCTTTGACA
CACTAAGTCACACTAAGTCA
TTCCACAGCATTCCACAGCA
TGGAGATAAATGGAGATAAA
GTTATTATCCGTTATTATCC
TAAGTCATTGTAAGTCATTG
GTTTGATAAAGTTTGATAAA
AGCTATACAGAGCTATACAG
TGTTTTTCAATGTTTTTCAA
AGGCATAACTAGGCATAACT
TGGTGAAAAATGGTGAAAAA
TCTAAAGAGGTCTAAAGAGG
CATGGCCCTCCATGGCCCTC
TATTTTCTGCTATTTTCTGC
GAAGTTGCCAGAAGTTGCCA
AATTTAGCAAAATTTAGCAA
GCAGCTCCAAGCAGCTCCAA
TATGAGTTCATATGAGTTCA
CTTAGCGTTGCTTAGCGTTG
AATTACAAGCAATTACAAGC
ACATATACAGACATATACAG
CAAATGACTACAAATGACTA
GCTCGTCATTGCTCGTCATT
ACTGAAATGGACTGAAATGG
TTATTGAAGATTATTGAAGA
TTTGCAAAATTTTGCAAAAT
ATATTTTTAA.ATATTTTTAA.
AAGTTCTTCAAAGTTCTTCA
TCTCAAGCTTTCTCAAGCTT
AGTCTCCAGAAGTCTCCAGA
CATATTTTCCCATATTTTCC
ATCTTGTTGAATCTTGTTGA
CAACGAAACTCAACGAAACT
AAATGTTGTTAAATGTTGTT
CAGAAGAGGCCAGAAGAGGC
ATGCAGCAAGATGCAGCAAG
CACAAAACAACACAAAACAA
ATGATGCGTCATGATGCGTC
AACCAGTTTCAACCAGTTTC
TGCTCTCTGATGCTCTCTGA
TTCTAGTGGTTTCTAGTGGT
300300
AGAAAAACTTAGAAAAACTT
33003300
TGACATCAAATGACATCAAA
420420
ATTGGATGCTATTGGATGCT
400400
TCCACATTACTCCACATTAC
540540
TGGTGCTGTTTGGTGCTGTT
660660
TGCACAAGTGTGCACAAGTG
660660
GCTCTCATTAGCTCTCATTA
770770
AGCTAAATGGAGCTAAATGG
8 08 0
TTCTTACATGTTCTTACATG
88^088 ^ 0
TTACCTCAGGTTACCTCAGG
900900
TGAGGCTAATTGAGGCTAAT
990990
CAAAGACAGTCAAAGACAGT
11001100
TAGGAAGAAATAGGAAGAAA
11801180
176 936176 936
ACAAAGCTTC TTATTAATGA GAATTC 1106 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 19:ACAAAGCTTC TTATTAATGA GAATTC 1106 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 19:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 1172 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 19:(A) LENGTH: 1172 base pairs (B) TYPE: Nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF PARTICLE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 19:
176 936176 936
ATAAGCCAGTATAAGCCAGT
GATGCTAAGAGATGCTAAGA
TGTATGACATTGTATGACAT
CATCACTTTGCATCACTTTG
TTACTCATACTTACTCATAC
GCTGTTGCTAGCTGTTGCTA
CTGTTGGTGACTGTTGGTGA
CAAGAGGATCCAAGAGGATC
CAGCATTTTCCAGCATTTTC
TCATTAGGCATCATTAGGCA
CTGGCACTAACTGGCACTAA
AAATGGGGTCAAATGGGGTC
CTCTACGATGCTCTACGATG
TACATGACTGTACATGACTG
ATTATTACATATTATTACAT
CTCAGGGTTCCTCAGGGTTC
AAGAAAATGCAAGAAAATGC
GCTAATATGGGCTAATATGG
AATTATTAGTAATTATTAGT
GACAGTCCTGGACAGTCCTG
AAACCTATGAAAACCTATGA
AAGAAACTCCAAGAAACTCC
GAGCAAACAAGAGCAAACAA
AATATTCACTAATATTCACT
ATGCTATTCCATGCTATTCC
TAGTAATGGTTAGTAATGGT
TCCGGCGTTATCCGGCGTTA
TTCAATTAAGTTCAATTAAG
TTCAGAGTTTTTCAGAGTTT
GATGTTAGCTGATGTTAGCT
TTCTACTGTTTTCTACTGTT
ATTAAATGGCATTAAATGGC
ACAAGTTGGTACAAGTTGGT
GGAAGCTCTAGGAAGCTCTA
AGCTTCTTATAGCTTCTTAT
AAGTCAAATTAAGTCAAATT
ACAGCAGCAGACAGCAGCAG
GCTAGATATGGCTAGATATG
TTATCCCTTATTATCCCTTA
TCATTGGATTTCATTGGATT
GATAAAACATGATAAAACAT
ATACAGCAAAATACAGCAAA
TTTCAAGCTCTTTCAAGCTC
ACAACTACTGACAACTACTG
GAAACATTATGAAACATTAT
AAGAGATTTGAAGAGATTTG
TAATGAGAATTAATGAGAAT
TAGCAAAGTCTAGCAAAGTC
CTCCAATATACTCCAATATA
AGTTCAATCTAGTTCAATCT
GCGTTGCAACGCGTTGCAAC
ACAAGCAAATACAAGCAAAT
ATACAGCAGAATACAGCAGA
TGACTAATGCTGACTAATGC
GTCATTCACAGTCATTCACA
AAATGGATGAAAATGGATGA
TGAAGAAACCTGAAGAAACC
CAAAATTGCTCAAAATTGCT
TCTC
TCCAGAATTGTCCAGAATTG
540540
TTTTCCTCCATTTTCCTCCA
600600
TGTTGATGGTTGTTGATGGT
600600
GAGACTTGCAGAGACTTGCA
720720
GTTGTTGCTCGTTGTTGCTC
780780
AGAGGCAGCTAGAGGCAGCT
800800
AGCAAGTTCTAGCAAGTTCT
900900
AAACAATTACAAACAATTAC
960960
TGCGTCTGAGTGCGTCTGAG
10201020
AGTCTCCAAAAGTCTCCAAA
11801180
CTCTGATAGGCTCTGATAGG
11401140
1112 (2) INFORMACJA DLA SEKEERCJI JR ID.: 20:1112 (2) INFORMATION FOR JR SECTION ID .: 20:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKEEJCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEEKING:
(A) DŁUGOŚĆ: 1100 par zasad(A) LENGTH: 1100 base pairs
176 936 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 20:176 936 (B) TYPE: nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF PARTICLE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 20:
CCATGGCGTTCCATGGCGTT
ATTAAGGGAAATTAAGGGAA
TCATTCCGGCTCATTCCGGC
GACAATAATGGACAATAATG
CAGATGCAAGCAGATGCAAG
GGAGGTTTATGGAGGTTTAT
TGACTGCTATTGACTGCTAT
GCTAAAGATAGCTAAAGATA
TTATACCTTTTTATACCTTT
TCAATTTTAGTCAATTTTAG
GCCCAATGTAGCCCAATGTA
GGAGAAACTCGGAGAAACTC
GTGTGCATCAGTGTGCATCA
ACAAATAAGCACAAATAAGC
CAGTAATATTCAGTAATATT
AAGATGTATGAAGATGTATG
ACATATGCTAACATATGCTA
TTTGTTACTCTTTGTTACTC
ATACTAGTAAATACTAGTAA
GCTACTGTTGGCTACTGTTG
GTGATCCGGCGTGATCCGGC
GATCCAGCATGATCCAGCAT
GGAAGAAATGGGAAGAAATG
TACCATTCTCTACCATTCTC
ACTTGCAGATACTTGCAGAT
GATAACTACTGATAACTACT
TTACTTCGAATTACTTCGAA
TGATGGAAAATGATGGAAAA
AGCTTTGACAAGCTTTGACA
CACTAAGTCACACTAAGTCA
TTCCACAGCATTCCACAGCA
TGGTGCTAGATGGTGCTAGA
GTTATTATCCGTTATTATCC
GTGACTGTTCGTGACTGTTC
GAATTTCTTGGAATTTCTTG
TACTTTGATGTACTTTGATG
CCAAATGAAACCAAATGAAA
CACGGCCCTCCACGGCCCTC
TATCTTCTGCTATCTTCTGC
GAAGTTGCCAGAAGTTGCCA
AATTTAGCAAAATTTAGCAA
GCAGCTCCAAGCAGCTCCAA
TATGAGTTCATATGAGTTCA
CTTAGCGTTGCTTAGCGTTG
TTAGTATTGATTAGTATTGA
AAGGACAACTAAGGACAACT
TAATTGGAGGTAATTGGAGG
ACAATCGACCACAATCGACC
ATATTTTTAAATATTTTTAA
AAGTTCTTCAAAGTTCTTCA
TCTCAAGCTTTCTCAAGCTT
AGTCTCCAGAAGTCTCCAGA
TATATTTTCCTATATTTTCC
ATCTTGTTGAATCTTGTTGA
CAACGAGACTCAACGAGACT
TGGAGGTGGATGGAGGTGGA
TCAGGAAGTGTCAGGAAGTG
120120
AACAGGTACAAACAGGTACA
180180
TTTTGCTGCTTTTTGCTGCT
240240
TTATAGTGGTTTATAGTGGT
300300
AGAAAAACTTAGAAAAACTT
360360
TGACATCAAATGACATCAAA
020020
ATTGGATGCTATTGGATGCT
080080
TCCACATCACTCCACATCAC
500500
TGGTGCTGTTTGGTGCTGTT
000000
TGCACAAGAGTGCACAAGAG
000000
176 936176 936
(2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 21:(2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 21:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 1109 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 21:(A) LENGTH: 1109 bp (B) TYPE: nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF PARTICLE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 21:
CCAaGGCGTa GGAAGAAATG GaGGCTGTaC TTACTATTGA TGGAGGTGGACCAaGGCGTa GGAAGAAATG GaGGCTGTaC TTACTATTGA TGGAGGTGGA
ATTAAGGGAAATTAAGGGAA
176 936176 936
TCATTCCGGGTCATTCCGGG
GACAATAATGGACAATAATG
CAGATGCAAGCAGATGCAAG
GGAGGTTTATGGAGGTTTAT
TGACTGCTATTGACTGCTAT
GCCAATGAAAGCCAATGAAA
TTGTACCTTTTTGTACCTTT
TGGCCAATTTTGGCCAATTT
TTTGGCCAAATTTGGCCAAA
CTTGGAGAAACTTGGAGAAA
CTCGTGTGCACTCGTGTGCA
AAAACAAATAAAAACAAATA
AGCCAGTAATAGCCAGTAAT
GCTAAGACGTGCTAAGACGT
ATGACATATGATGACATATG
TACTTTGCTATACTTTGCTA
CTAATACTATCTAATACTAT
GTTGCTACTGGTTGCTACTG
TTGCTGATCCTTGCTGATCC
GAGGATCCAGGAGGATCCAG
CATTTGCTTCCATTTGCTTC
TTAGGCACTGTTAGGCACTG
GCACTACTTCGCACTACTTC
TGGGGTGCTCTGGGGTGCTC
TACAATGGATTACAATGGAT
ATGACTGATTATGACTGATT
ATTACCTTTCATTACCTTTC
AGGGTTCAAGAGGGTTCAAG
TACCATTCTCTACCATTCTC
ACTTGCAGATACTTGCAGAT
GATAACTACTGATAACTACT
TTACTTCGAATTACTTCGAA
ATATGATGGAATATGATGGA
TCAAGCTTTGTCAAGCTTTG
ATTCACTAAGATTCACTAAG
TTATTCGACATTATTCGACA
TAATGGAGATTAATGGAGAT
GGCGTTATTAGGCGTTATTA
AATTAGGTCAAATTAGGTCA
AGAGTTTGATAGAGTTTGAT
GTTGGTTATAGTTGGTTATA
TACTGTTTTTTACTGTTTTT
GAATTTCTTGGAATTTCTTG
TACTTTGATGTACTTTGATG
CCAAATGAAACCAAATGAAA
CATGGCCCTCCATGGCCCTC
AAATATCTTAAAATATCTTA
ACAGAAGTTGACAGAAGTTG
TCAAATTTGGTCAAATTTGG
GCAGCAGCTCGCAGCAGCTC
AAATATGAGTAAATATGAGT
TCCGTTAGCGTCCGTTAGCG
TTGAATTACATTGAATTACA
AAAACACATAAAAACACATA
CAGCAAATGACAGCAAATGA
CAAGATCTTCCAAGATCTTC
AAGGACAACTAAGGACAACT
TAATTGGAGGTAATTGGAGG
ACAATCGACCACAATCGACC
ATATTTTTAAATATTTTTAA
TGCAAGTTCTTGCAAGTTCT
CCATCTCAAGCCATCTCAAG
CAAAGTCTCCCAAAGTCTCC
CAACATATTTCAACATATTT
TCAATCTTGTTCAATCTTGT
TTGCAACGAGTTGCAACGAG
AAAAAATGTTAAAAAATGTT
CAGCAGAAGACAGCAGAAGA
CTGAGGCAGCCTGAGGCAGC
ATTCACAAAAATTCACAAAA
TCAGAAAATGTCAGAAAATG
120120
AACAAGTACA oAACAAGTACA Fr.
CTTTGCTGCTCTTTGCTGCT
240240
TTCTAGGTACTTCTAGGTAC
300300
TCAAGAAAAATCAAGAAAAA
360360
CTTTGACATCCTTTGACATC
420420
AGAATTGGATAGAATTGGAT
00
TCCTCCACATTCCTCCACAT
540540
TGATGGTGCTTGATGGTGCT
600600
ACGTGCACAAACGTGCACAA
660660
GTTGCTCTCAGTTGCTCTCA
720720
GACAGCTAAAGACAGCTAAA
780780
AAGTTCTTACAAGTTCTTAC
840840
CAATTACCTCCAATTACCTC
600600
176 936176 936
AAAATGCATT AACAGGCACA ACTACTAAAG CGGATGATGC TTCTGAGGCTAAAATGCATT AACAGGCACA ACTACTAAAG CGGATGATGC TTCTGAGGCT
AATATGGAAT 996AATATGGAAT 996
TATTAGCACA AGTTGGTGAA AATTTATTGA AGAAACCAGT TTCCAAAGACTATTAGCACA AGTTGGTGAA AATTTATTGA AGAAACCAGT TTCCAAAGAC
AATCCTGAAA 1322)AATCCTGAAA 1322)
CCTATGAGGA AGCTCTAAAG AGGTTTGCAA AATTGCTTTC TGATAGGAAGCCTATGAGGA AGCTCTAAAG AGGTTTGCAA AATTGCTTTC TGATAGGAAG
AAACTTCGAG 1300AAACTTCGAG 1300
CAAACAAAGC TTCTTATTAA TGAGAATTC 133^^ (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 22:CAAACAAAGC TTCTTATTAA TGAGAATTC 133 ^^ (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 22:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 3372 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 22:(A) LENGTH: 3,372 bp (B) TYPE: Nucleic acid (C) CHAIN: Single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF PARTICLE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 22:
176 936176 936
AAGATATTGTAAGATATTGT
AGTGGTTCAAAGTGGTTCAA
TTTTAGGCCCTTTTAGGCCC
AAACTTGGAGAAACTTGGAG
AAACTCGTGTAAACTCGTGT
ATCAAAACAAATCAAAACAA
ATAAGCCAGTATAAGCCAGT
GATGCTAAGAGATGCTAAGA
TGTATGACAlTTGTATGACAlT
CATCACTTTGCATCACTTTG
TTACTCATACTTACTCATAC
GCTGTTGCTAGCTGTTGCTA
CTGTTGGTGACTGTTGGTGA
CAAGAGGATCCAAGAGGATC
CAGCATTTTCCAGCATTTTC
TCATTAGGCATCATTAGGCA
CTGGCACTAACTGGCACTAA
AAATGGGGTCAAATGGGGTC
CTCTACGATGCTCTACGATG
TACATGACTGTACATGACTG
ATTATTACATATTATTACAT
CTCAGGGTTCCTCAGGGTTC
AAGAAAATGCAAGAAAATGC
GCTAATATGGGCTAATATGG
AATTATTAGTAATTATTAGT
GACAGTCCTGGACAGTCCTG
AAACCTATGAAAACCTATGA
ACCCTTTTACACCCTTTTAC
AATGTATGATAATGTATGAT
GCATCAAGCTGCATCAAGCT
AATATTCACTAATATTCACT
ATGCTATTCCATGCTATTCC
TAGTAATGGTTAGTAATGGT
TCCGGCGTTATCCGGCGTTA
TTCAATTAAGTTCAATTAAG
TTCAGAGTTTTTCAGAGTTT
GATGTTAGCTGATGTTAGCT
TTCTACTGTTTTCTACTGTT
ATTAAATGGCATTAAATGGC
ACAAGTTGGTACAAGTTGGT
GGAAGCTCTAGGAAGCTCTA
TTCGAACATGTTCGAACATG
GGAAAATATCGGAAAATATC
TTGACAGAAGTTGACAGAAG
AAGTCAAATTAAGTCAAATT
ACAGCAGCAGACAGCAGCAG
GCTAGATATGGCTAGATATG
TTATCCCTTATTATCCCTTA
TCATTGGATTTCATTGGATT
GATAAAACATGATAAAACAT
ATACAGCAAAATACAGCAAA
TTTCAAGCTCTTTCAAGCTC
ACAACTACTGACAACTACTG
GAAACATTATGAAACATTAT
AAGAGATTTGAAGAGATTTG
GCCCTCATATGCCCTCATAT
TTCTGCAAGTTTCTGCAAGT
TTGCCATCTCTTGCCATCTC
TAGCAAAGTCTAGCAAAGTC
CTCCAATATACTCCAATATA
AGTTCAATCTAGTTCAATCT
GCGTTGCAACGCGTTGCAAC
ACAAGCAAATACAAGCAAAT
ATACAGCAGAATACAGCAGA
TGACTAATGCTGACTAATGC
GTCATTCACAGTCATTCACA
AAATGGATGAAAATGGATGA
TGAAGAAACCTGAAGAAACC
CAAAATTGCTCAAAATTGCT
TTTTAATTATTTTTAATTAT
360360
TCTTCAAGAATCTTCAAGAA
422422
AAGCTTTGACAAGCTTTGAC
420420
TCCAGAATTGTCCAGAATTG
540540
TTTTCCTCCATTTTCCTCCA
660660
TGTTGATGGTTGTTGATGGT
660660
GAGACTTGCAGAGACTTGCA
770770
GTTGTTGCTCGTTGTTGCTC
770770
AGAGGCAGCTAGAGGCAGCT
880880
AGCAAGTTCTAGCAAGTTCT
990990
AAACAATTACAAACAATTAC
966966
TGCGTCTGAGTGCGTCTGAG
102 0102 0
AGTTTCCAAAAGTTTCCAAA
108 0108 0
CTCTGATAGGCTCTGATAGG
AAGAAACTCCAAGAAACTCC
11201120
176 936176 936
GAGCAAACAA AGCTTCTTAT TAATGAGAAT TC (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 23:GAGCAAACAA AGCTTCTTAT TAATGAGAAT TC (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 23:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 1100 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 23:(A) LENGTH: 1100 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF PARTICLE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 23:
CCATGGTTGG AAGAAATGGT GACTGTTCTA AGTATTGATGCCATGGTTGG AAGAAATGGT GACTGTTCTA AGTATTGATG
TAAGGGAATCTAAGGGAATC
ATTCCAGCTA TCATTCTCGA ATTTCTTGAA GGACAACTTCATTCCAGCTA TCATTCTCGA ATTTCTTGAA GGACAACTTC
CAATAATAAACAATAATAAA
GATGCAAGAC TTGCAGATTA CTTTGATGTA ATTGGAGGAAGATGCAAGAC TTGCAGATTA CTTTGATGTA ATTGGAGGAA
AGGTTTATTGAGGTTTATTG
ACTGCTATGA TAACTACTCC AAATGAAAAC AATCGACCCTACTGCTATGA TAACTACTCC AAATGAAAAC AATCGACCCT
CAAAGATATTCAAAGATATT
GTACCCTTTT ACTTCGAACA TGGCCCTCAT ATTTTTAATTGTACCCTTTT ACTTCGAACA TGGCCCTCAT ATTTTTAATT
AATTTTAGGCAATTTTAGGC
CCAATGTATG ATGGAAAATA TCTTCTGCAA GTTCTTCAAGCCAATGTATG ATGGAAAATA TCTTCTGCAA GTTCTTCAAG
AGAAACTCGTAGAAACTCGT
GTGCATCAAG CTTTGACGGA AGTTGCCATC TCAAGCTTTGGTGCATCAAG CTTTGACGGA AGTTGCCATC TCAAGCTTTG
AAATAAGCCAAAATAAGCCA
GTAATATTCA CTAAGTCAAA TTTAGCAAAG TCTCCAGAATGTAATATTCA CTAAGTCAAA TTTAGCAAAG TCTCCAGAAT
GATGTATGACGATGTATGAC
11721172
GAGGTGGAATGAGGTGGAAT
AGGAAGTGGAAGGAAGTGGA
120120
CAAGTACAGGCAAGTACAGG
180180
TTGCTGCTGCTTGCTGCTGC
240240
ATAGTGGTTCATAGTGGTTC
300300
AAAAACTTGGAAAAACTTGG
33003300
ACATCAAAACACATCAAAAC
400400
TGGATGCTAATGGATGCTAA
400400
176 936176 936
ATATGCTATT CCACAGCAGC AGCTCCAATA TAaτaaCCTC CACATCACTTATATGCTATT CCACAGCAGC AGCTCCAATA TAaτaaCCTC CACATCACTT
TGTaACTCAa 540TGTaACTCAa 540
ACTAGTAATG GTGCTAGATA TGAGTTCAAT CTTGTTGATG GTGCTGTTGCACTAGTAATG GTGCTAGATA TGAGTTCAAT CTTGTTGATG GTGCTGTTGC
TACTGTTGGT 6(00TACTGTTGGT 6 (00
GATCCGGCGT TATTATCCCT TAGCGTTGCA ACGAGACTTG CACAAGAGGAGATCCGGCGT TATTATCCCT TAGCGTTGCA ACGAGACTTG CACAAGAGGA
TCCAGCATaa 660 τcaacAAaτA agtcattgga ttacaagcaa atgttgttgc tctcattaggTCCAGCATaa 660 τcaacAAaτA agtcattgga ttacaagcaa atgttgttgc tctcattagg
CACTGGCACT 72oCACTGGCACT 72o
AATTCAGAGT TTGATAAAAC ATATACAGCA GAAGAGGCAG CTAAATGGGGAATTCAGAGT TTGATAAAAC ATATACAGCA GAAGAGGCAG CTAAATGGGG
TCCTCTACGA 730TCCTCTACGA 730
TGGATGTTAG CTATACAGCA AATGACTAAT GCAGCAAGTT TTTACATGACTGGATGTTAG CTATACAGCA AATGACTAAT GCAGCAAGTT TTTACATGAC
TGATTATTAC 84 0TGATTATTAC 84 0
ATTTCTACTG TTTTTCAAGC TCGTCATTCA CAAAACAATT ACCTCAGGGTATTTCTACTG TTTTTCAAGC TCGTCATTCA CAAAACAATT ACCTCAGGGT
TCAAGAAAAT 900TCAAGAAAAT 900
GCATTAAATG GCACAACTAC TGAAATGGAT GATGCGTCTG AGGCTAATATGCATTAAATG GCACAACTAC TGAAATGGAT GATGCGTCTG AGGCTAATAT
GGAATTATTA 9(50GGAATTATTA 9 (50
GTACAAGTTG GTGAAACATT ATTGAAGAAA CCAGTTTCCA GAGACAGTCCGTACAAGTTG GTGAAACATT ATTGAAGAAA CCAGTTTCCA GAGACAGTCC
TGAAACCTAT 1020TGAAACCTAT 1020
GAGGAAGCTC TAAAGAGATT TGCAAAATTG CTCTCTGATA GGAAGAAACTGAGGAAGCTC TAAAGAGATT TGCAAAATTG CTCTCTGATA GGAAGAAACT
CCGAGCAAAC 1080CCGAGCAAAC 1080
AAAGCTTCTT ATTAATGAGA ATTC 1104 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 24:AAAGCTTCTT ATTAATGAGA ATTC 1104 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 24:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 1172 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy(A) LENGTH: 1172 base pairs (B) TYPE: Nucleic acid (C) CHAIN: single
176 936 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYi CZĄSTECZKI: cDJA (xi) OPIS SEK^EJCJ]: SEKEERCJA JR ID.: 20:176 936 (D) TOPOLOGY: linear (ii) THESE PARTICLES: cDJA (xi) SECTION DESCRIPTION]: SECTION JR ID .: 20:
CCATGGCAACCCATGGCAAC
ACTACTAGTTACTACTAGTT
CAACATGTGCCAACATGTGC
GGTGGAATTAGGTGGAATTA
AGGGAATCATAGGGAATCAT
GAAGTGGACAGAAGTGGACA
ATAATAAAGAATAATAAAGA
AGTACAGGAGAGTACAGGAG
GTTTATTGACGTTTATTGAC
GCTGCTGCCAGCTGCTGCCA
AAGATATTGTAAGATATTGT
AGTGGTTCAAAGTGGTTCAA
TTTTAGGCCCTTTTAGGCCC
AAACTTGGAGAAACTTGGAG
AAACTCGTGTAAACTCGTGT
ATCAAAACAAATCAAAACAA
ATAAGCCAGTATAAGCCAGT
GATGCTAAGAGATGCTAAGA
TGTATGACATTGTATGACAT
CATCACTTTGCATCACTTTG
TTACTCATACTTACTCATAC
GCTGTTGCTAGCTGTTGCTA
CTGTTGGTGACTGTTGGTGA
CAAGAGGATCCAAGAGGATC
TACTAAATCTTACTAAATCT
TTTTTAATTTTTTTTAATTT
TATTTTTTATTATTTTTTAT
TAAGTTGGAATAAGTTGGAA
GAAATGGTTAGAAATGGTTA
CTGTTCTAAGCTGTTCTAAG
TCCAGCTATCTCCAGCTATC
TGCAAGACTTTGCAAGACTT
TGCTATGATATGCTATGATA
ACCCT.TTTACACCCT.TTTAC
AATGTATGATAATGTATGAT
GCATCAAGCTGCATCAAGCT
AATATTCACTAATATTCACT
ATGCTATTCCATGCTATTCC
TAGTAATGGTTAGTAATGGT
TCCGGCGTTATCCGGCGTTA
ATTCTCGAATATTCTCGAAT
GCAGATTACTGCAGATTACT
ACTACTCCAAACTACTCCAA
TTCGAACATGTTCGAACATG
GGAAAATATCGGAAAATATC
TTGACAGAAGTTGACAGAAG
AAGTCAAATTAAGTCAAATT
ACAGCAGCAGACAGCAGCAG
GCTAGATATGGCTAGATATG
TTATCCCTTATTATCCCTTA
TTCTTGAAGGTTCTTGAAGG
TTGATGTAATTTGATGTAAT
ATGAAAACAAATGAAAACAA
GCCCTCATATGCCCTCATAT
TTCTGCAAGTTTCTGCAAGT
TTGCCATCTCTTGCCATCTC
TAGCAAAGTCTAGCAAAGTC
CTCCAATATACTCCAATATA
AGTTCAATCTAGTTCAATCT
GCGTTGCAACGCGTTGCAAC
GATATTAGCAGATATTAGCA
TATTGATGGATATTGATGGA
120120
ACAACTTCAGACAACTTCAG
1.801.80
TGGAGGAACATGGAGGAACA
240240
TCGACCCTTTTCGACCCTTT
300300
TTTTAATTATTTTTAATTAT
6060
TCTTCAAGAATCTTCAAGAA
420420
AAGCTTTGACAAGCTTTGAC
480480
TCCAGAATTGTCCAGAATTG
540540
TTTTCCTCCATTTTCCTCCA
600600
TGTTGATGGTTGTTGATGGT
660660
GAGACTTGCAGAGACTTGCA
720720
176 936176 936
(2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 25:(2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 25:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 1175 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 25:(A) LENGTH: 1175 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF PARTICLE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 25:
CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTACAATTT TAATTTTTAT GATGTTAGCACCATGGCAAC TACTAAATCT TTTACAATTT TAATTTTTAT GATGTTAGCA
ACTACTAGTT 66ACTACTAGTT 66
176 936176 936
CAACATTTGCCAACATTTGC
GGTGGAATTAGGTGGAATTA
AGGGAATCATAGGGAATCAT
GAAGTGGACAGAAGTGGACA
ATAATGCAGAATAATGCAGA
GGTACAGGAGGGTACAGGAG
GTTTATTGACGTTTATTGAC
GCTGCTGCTAGCTGCTGCTA
AAGATATTATAAGATATTAT
AGTGGTTTTCAGTGGTTTTC
ACCTTTTTGAACCTTTTTGA
GAAAAACTTGGAAAAACTTG
GAGAAACTCGGAGAAACTCG
GACATCAAAAGACATCAAAA
CAAATAAGCCCAAATAAGCC
TTGGATGCTATTGGATGCTA
AGATGTATGAAGATGTATGA
CCACATTACTCCACATTACT
TTGCTACTAATTGCTACTAA
GGCGATGTTGGGCGATGTTG
CTGCTGGTGACTGCTGGTGA
CAAGAGGATCCAAGAGGATC
CAGCATTTGCCAGCATTTGC
TCATTAGGCATCATTAGGCA
CTGGCACTAACTGGCACTAA
AAATGGGGTAAAATGGGGTA
TTCTACAATGTTCTACAATG
TCTTACATGATCTTACATGA
TACATTGGGATACATTGGGA
TCCGGCTACCTCCGGCTACC
TGCAAGACTTTGCAAGACTT
TGCTATGATATGCTATGATA
ACCTTTTTACACCTTTTTAC
GCCAAAATATGCCAAAATAT
TGTGCATCAATGTGCATCAA
AGTAATATTCAGTAATATTC
CATATGTTATCATATGTTAT
TACTAGTAATTACTAGTAAT
TCCGTCGTTATCCGTCGTTA
TTCAATTAAGTTCAATTAAG
TTCAGAGTTTTTCAGAGTTT
GGTATTCTCAGGTATTCTCA
GAAATGGTGAGAAATGGTGA
ATTCTCGAATATTCTCGAAT
GCAGATTACTGCAGATTACT
ACTACTCCAAACTACTCCAA
TTCGATCATGTTCGATCATG
GATGGAAAATGATGGAAAAT
GCTTTGACAGGCTTTGACAG
ACTAAGTCAAACTAAGTCAA
TCCACAGCAGTCCACAGCAG
GGAGATCAATGGAGATCAAT
TTATCCATTATTATCCATTA
TCATTGAATTTCATTGAATT
GCTAAAAACTGCTAAAAACT
CCTTTATGGGCCTTTATGGG
CTGTTCTTAGCTGTTCTTAG
TTCTTGAAGGTTCTTGAAGG
TTGATGTAATTTGATGTAAT
ATGAAAACAAATGAAAACAA
GCCCTAAGATGCCCTAAGAT
ATCTTATGCAATCTTATGCA
GAGTTGCCATGAGTTGCCAT
GTTTAGCAAAGTTTAGCAAA
CAGCTCCAACCAGCTCCAAC
ATGACCTCAAATGACCTCAA
GCGTTGCAACGCGTTGCAAC
ACAAACAAATACAAACAAAT
ATACAGCAGAATACAGCAGA
AAATGAGAAGAAATGAGAAG
TATTGATGGATATTGATGGA
31203120
ACAACTTCAGACAACTTCAG
318 0318 0
TGGAGGAACATGGAGGAACA
240240
TCGACCTTTTTCGACCTTTT
33003300
TTTTGAACCTTTTTGAACCT
0000
AGTTCTTCAAAGTTCTTCAA
400400
CTCAAGCTTTCTCAAGCTTT
400400
AACTCCAGAAAACTCCAGAA
500500
ATATTTTCCTATATTTTCCT
000000
TCTTGTTGATTCTTGTTGAT
600600
GAGACTTGCAGAGACTTGCA
720720
GTTGTTGCTCGTTGTTGCTC
700700
AGAGGCAGCTAGAGGCAGCT
00
TGCAGCAAGTTGCAGCAAGT
900900
176 936176 936
(2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 26:(2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 26:
(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(1) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (syntetyczny) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 26:(A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF PARTICLE: DNA (synthetic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 26:
GTTAGATCTC ACCATGGCAA CTACTAAATC TTT 33 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 27:GTTAGATCTC ACCATGGCAA CTACTAAATC TTT 33 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 27:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 33 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy(A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: Nucleic acid (C) CHAIN: single
176 936 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZK:: DNA (syntetyczny) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 27:176 936 (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF PARTICLES :: DNA (synthetic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 27:
CCAGAATTCT CATTAATAAG AAGCTTTGTT TGC 33 (2) INFOfRMACJA DUA SEIKIENCJI NR ID.: 28:CCAGAATTCT CATTAATAAG AAGCTTTGTT TGC 33 (2) BACKGROUND INFORMATION ID NO .: 28:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 1172 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 28:(A) LENGTH: 1172 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF PARTICLE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 28:
AGTGGTCTTC 360AGTGGTCTTC 360
176 936176 936
AAATTTTTGGAAATTTTTGG
GAAAAACTTGGAAAAACTTG
GAGAAACTCGGAGAAACTCG
GACATCAAAAGACATCAAAA
CAAATAAGCCCAAATAAGCC
TTGGATGCTATTGGATGCTA
AGATGTATGAAGATGTATGA
CCACATTACTCCACATTACT
TTGCTACTAATTGCTACTAA
GGTGATGTTGGGTGATGTTG
CTGCTGGTGACTGCTGGTGA
CAAGAGGATCCAAGAGGATC
CAGCATTTGCCAGCATTTGC
TCATTAGGCATCATTAGGCA
CTGGCACTACCTGGCACTAC
AAATGGGGTAAAATGGGGTA
TTCTACAATGTTCTACAATG
TACATGAATG attattacctTACATGAATG attattacct
CTCAGGGTTCCTCAGGGTTC
AAGAAAATGCAAGAAAATGC
GCTAATATGAGCTAATATGA
TATTATTAGTTATTATTAGT
GACAATCATGGACAATCATG
AAACCTATGAAAACCTATGA
AAGAAACTCCAAGAAACTCC
CCCAAAATATCCCAAAATAT
TGTGCATCAATGTGCATCAA
AGTAATATTCAGTAATATTC
CATATGTTATCATATGTTAT
TACTAGTAATTACTAGTAAT
TCCGTCGTTATCCGTCGTTA
TTCAATTAGGTTCAATTAGG
TTCAGAGTTTTTCAGAGTTT
GCTGTTACCTGCTGTTACCT
TTCTACTGTTTTCTACTGTT
ATTAACAGGCATTAACAGGC
ACAAGTTGGTACAAGTTGGT
GGTAGCTCTAGGTAGCTCTA
GATGGAAAATGATGGAAAAT
GCTTTGACAGGCTTTGACAG
ACTAAGTCAAACTAAGTCAA
TCCACAGCAGTCCACAGCAG
GGAGATCAATGGAGATCAAT
TTATCCATTATTATCCATTA
TCGTTGAATTTCGTTGAATT
TATAAAAACTTATAAAAACT
TTACAGGAAATTACAGGAAA
TTTCAAGGCTCTTTCAAGGCTC
ACAGCTACTAACAGCTACTA
GAAAACTTATGAAAACTTAT
AAGAGGTTTGAAGAGGTTTG
ATCTTATGCAATCTTATGCA
AAGTTGCCATAAGTTGCCAT
ATTTAGCAAAATTTAGCAAA
CAGCTCCAACCCAGCTCCAACC
ATGACTTCAAATGACTTCAA
GCGTTGCAACGCGTTGCAAC
ACAAACAAATACAAACAAAT
ATACAGCAGAATACAGCAGA
TGAGAAGTGCTGAGAAGTGC
TTGATTCACATTGATTCACA
AATTTGATGAAATTTGATGA
TGAAGAAATCTGAAGAAATC
CAAAATTGCTCAAAATTGCT
AGTTCTTCAAAGTTCTTCAA
420420
CTCAAGCTTTCTCAAGCTTT
480480
AACTCCAGAAAACTCCAGAA
540540
ATATTTTCCTATATTTTCCT
600600
TCTTGTTGATTCTTGTTGAT
660660
GAGACTTGCAGAGACTTGCA
770770
GTTGTTGCTCGTTGTTGCTC
770770
AGAGGCAGCTAGAGGCAGCT
804804
AGCAAGTTCTAGCAAGTTCT
990990
AAACAATTTACAAACAATTTAC
996996
TGCTTCTGTGTGCTTCTGTG
10021002
AGTTTCTGAAAGTTTCTGAA
H00H00
CTCCGATAGGCTCCGATAGG
11141114
GAGCAAACAA AGCTTCTTAT TAATGAGAAT TCGAGCAAACAA AGCTTCTTAT TAATGAGAAT TC
11121112
176 936 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 26:176 936 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 26:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 1172 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CCASTECCKI: cDNA (cif OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 26:(A) LENGTH: 1172 base pairs (B) TYPE: Nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) CCASTEK TYPE: cDNA (cif SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 26:
176 936176 936
AGATGTATGAAGATGTATGA
CCACATTACTCCACATTACT
TTGCTACTAATTGCTACTAA
GGTGATGTTGGGTGATGTTG
CTGCTGGTGACTGCTGGTGA
CAAGAGGATCCAAGAGGATC
CAGCATTTGCCAGCATTTGC
TCATTAGGCATCATTAGGCA
CTGGCACTACCTGGCACTAC
AAATGGGGTAAAATGGGGTA
TTCTACAATGTTCTACAATG
TACATGAATGTACATGAATG
ATTATTACCTATTATTACCT
CTCAGGGTTCCTCAGGGTTC
AAGAAAATGCAAGAAAATGC
GCTAATATGAGCTAATATGA
TATTATTAGTTATTATTAGT
GACAATCATGGACAATCATG
AAACCTATGAAAACCTATGA
AAGAAACTCCAAGAAACTCC
GAGCAAACAAGAGCAAACAA
11721172
CATATGTTATCATATGTTAT
TACTAGTAATTACTAGTAAT
TCCGTCGTTATCCGTCGTTA
TTCAATTAGGTTCAATTAGG
TTCAGAGTTTTTCAGAGTTT
GCTGTTACCTGCTGTTACCT
TTCTACTGTTTTCTACTGTT
ATTAACAGGCATTAACAGGC
ACAAGTTGGTACAAGTTGGT
GGTAGCTCTAGGTAGCTCTA
AGCTTCTTATAGCTTCTTAT
TCCACAGCAGTCCACAGCAG
GGAGATCAATGGAGATCAAT
TTATCCATTATTATCCATTA
TCGTTGAATTTCGTTGAATT
TATAAAAACTTATAAAAACT
TTACAGGAAATTACAGGAAA
TTTCAAGCTCTTTCAAGCTC
ACAGCTACTAACAGCTACTA
GAAAACTTATGAAAACTTAT
AAGAGGTTTGAAGAGGTTTG
TAATGAGAATTAATGAGAAT
CAGCTCCAACCAGCTCCAAC
ATGACTTCAAATGACTTCAA
GCGTTGCAACGCGTTGCAAC
ACAAACAAATACAAACAAAT
ATACAGCAGAATACAGCAGA
TGAGAAGTGCTGAGAAGTGC
TTGATTCACATTGATTCACA
AATTTGATGAAATTTGATGA
TGAAGAAATCTGAAGAAATC
CAAAATTGCTCAAAATTGCT
TC (2) INFORMACJA DLA SEK^EJCJ] JR ID.: 00:TC (2) INFORMATION FOR SEC ^ EJCJ] JR ID .: 00:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKEEJCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEEKING:
(A) DŁUGOŚĆ: 1122 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy(A) LENGTH: 1122 base pairs (B) TYPE: Nucleic acid
ATATTTTCCTATATTTTCCT
600)600)
TCTTGTTGATTCTTGTTGAT
600600
GAGACTTGCAGAGACTTGCA
720720
GTTGTTGCTCGTTGTTGCTC
720720
AGAGGCAGCTAGAGGCAGCT
800800
AGCAAGTTCTAGCAAGTTCT
990990
AAACAATTACAAACAATTAC
990990
TGCTTCTGTGTGCTTCTGTG
11021102
AGTTTCTGAAAGTTTCTGAA
11001100
CTCCGATAGGCTCCGATAGG
11101110
176 936 (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 30:176 936 (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) PARTICLE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 30:
CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTTTAATTT TAATATTTAT GATATTAGCACCATGGCAAC TACTAAATCT TTTTTAATTT TAATATTTAT GATATTAGCA
ACTACTAGTT 60ACTACTAGTT 60
CAACATTTGC TCAGTTGGGA GAAATGGTGA CTGTTCTTAG TATTGATGGACAACATTTGC TCAGTTGGGA GAAATGGTGA CTGTTCTTAG TATTGATGGA
GGTGGAATTA 120GGTGGAATTA 120
GAGGGATCAT TCCGGCTACC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAGGAGGGATCAT TCCGGCTACC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG
GAAATGGACA 180GAAATGGACA 180
ATAATGCAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGAGGAACAATAATGCAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGAGGAACA
AGTACAGGAG 240AGTACAGGAG 240
GTTTATTGAC TGCTATGATA AGTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCCTTTGTTTATTGAC TGCTATGATA AGTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCCTTT
GCTGCTGCCA 300GCTGCTGCCA 300
AAGAAATTGT ACCTTTTTAC TTCGAACATG GCCCTCAGAT TTTTAATCCTAAGAAATTGT ACCTTTTTAC TTCGAACATG GCCCTCAGAT TTTTAATCCT
AGTGGTCAAA 360AGTGGTCAAA 360
TTTTAGGCCC AAAATATGAT GGAAAATATC TTATGCAAGT TCTTCAAGAATTTTAGGCCC AAAATATGAT GGAAAATATC TTATGCAAGT TCTTCAAGAA
AAACTTGGAG 220AAACTTGGAG 220
AAACTCGTGT GCATCAAGCT TTGACAGAAG TTGTCATCTC AAGCTTTGACAAACTCGTGT GCATCAAGCT TTGACAGAAG TTGTCATCTC AAGCTTTGAC
ATCAAAACAA 280ATCAAAACAA 280
ATAAGCCAGT AATATTCACT AAGTCAAATT TAGCAAACTC TCCAGAATTGATAAGCCAGT AATATTCACT AAGTCAAATT TAGCAAACTC TCCAGAATTG
GATGCTAAGA 52 0GATGCTAAGA 52 0
TGTATGACAT AAGTTATTCC ACAGCAGCAG CTCCAACATA TTTTCCTCCGTGTATGACAT AAGTTATTCC ACAGCAGCAG CTCCAACATA TTTTCCTCCG
CATTACTTTG 600CATTACTTTG 600
TTACTAATAC TAGTAATGGA GATGAATATG AGTTCAATCT TGTTGATGGTTTACTAATAC TAGTAATGGA GATGAATATG AGTTCAATCT TGTTGATGGT
GCTGTTGCTA 660GCTGTTGCTA 660
176 936176 936
CTGTTGCTGACTGTTGCTGA
CAAAAGGATCCAAAAGGATC
CAGCATTTGCCAGCATTTGC
TCATTAGGCATCATTAGGCA
CTGGCACTACCTGGCACTAC
ACCTGGACTGACCTGGACTG
CTGTACATTGCTGTACATTG
TACATGACTGTACATGACTG
ATTATTACCTATTATTACCT
CTCAGGGTTCCTCAGGGTTC
AAGAAAATGCAAGAAAATGC
GCTAATATGGGCTAATATGG
AATTATTAGTAATTATTAGT
GACAATCCTGGACAATCCTG
AAACCTATGAAAACCTATGA
AAGAAACTCCAAGAAACTCC
GAGCAAACAAGAGCAAACAA
TCCGGCGTTATCCGGCGTTA
TTCAATTAGGTTCAATTAGG
TTCAGAGTTTTTCAGAGTTT
GATGTTAGTTGATGTTAGTT
TTCTACTGCTTTCTACTGCT
ATTAACAGGCATTAACAGGC
ACAAGTTGGTACAAGTTGGT
GGAAGCTCTAGGAAGCTCTA
AGCTTCTTATAGCTTCTTAT
TTATCCATTATTATCCATTA
TCATTGAATTTCATTGAATT
GATAAAACATGATAAAACAT
ATACAGAAAAATACAGAAAA
TTTCAAGCTCTTTCAAGCTC
ACAACTACTGACAACTACTG
GAAAACTTATGAAAACTTAT
AAGAGGTTTGAAGAGGTTTG
TAATGAGAATTAATGAGAAT
GCGTTGCAACGCGTTGCAAC
ACAAAAAAATACAAAAAAAT
ATACAGCAAAATACAGCAAA
TGACTGATGCTGACTGATGC
TTGATTCAAATTGATTCAAA
AAATGGATGAAAATGGATGA
TGAAGAAACCTGAAGAAACC
CAAAATTGCTCAAAATTGCT
TCTC
GAGACTTGCAGAGACTTGCA
73207320
GCTGTTGCTCGCTGTTGCTC
00
AGAGGCAGCTAGAGGCAGCT
8-408-40
AGCAAGTTCTAGCAAGTTCT
900900
AAACAATTACAAACAATTAC
960960
TGCTTCTGAGTGCTTCTGAG
10201020
AGTTTCCGAAAGTTTCCGAA
10801080
CTCTGATAGGCTCTGATAGG
11401140
1172 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 31:1172 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 31:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 1106 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 31:(A) LENGTH: 1106 bp (B) TYPE: nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF PARTICLE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 31:
176 936176 936
CCATGGCGTTCCATGGCGTT
ATTAGAGGGAATTAGAGGGA
TCATTCCGGCTCATTCCGGC
GACAATAATGGACAATAATG
CAGATGCAAGCAGATGCAAG
GGAGGTTTATGGAGGTTTAT
TGACTGCTATTGACTGCTAT
GCCAAAGAAAGCCAAAGAAA
TTGTACCTTTTTGTACCTTT
CAAATTTTAGCAAATTTTAG
GCCCAAAATAGCCCAAAATA
GGAGAAACTCGGAGAAACTC
GTGTGCATCAGTGTGCATCA
ACAAATAAGCACAAATAAGC
CAGTAATATTCAGTAATATT
AAGATGTATGAAGATGTATG
ACATAAGTTAACATAAGTTA
TTTGTTACTATTTGTTACTA
ATACTAGTAAATACTAGTAA
GCTACTGTTGGCTACTGTTG
CTGATCCGGCCTGATCCGGC
GATCCAGCATGATCCAGCAT
TTGCTTCAATTTGCTTCAAT
GGCACTGGCAGGCACTGGCA
CTACTTCAGACTACTTCAGA
ACTGCTGTACACTGCTGTAC
ATTGGATGTTATTGGATGTT
ACTGATTATTACTGATTATT
GGAAGAAATGGGAAGAAATG
TACCATTCTCTACCATTCTC
ACTTGCAGATACTTGCAGAT
GATAAGTACTGATAAGTACT
TTACTTCGAATTACTTCGAA
TGATGGAAAATGATGGAAAA
GGCTTTGACAGGCTTTGACA
CACTAAGTCACACTAAGTCA
TTCCACAGCATTCCACAGCA
TGGAGATGAATGGAGATGAA
GTTATTATCCGTTATTATCC
TAGGTCATTGTAGGTCATTG
GTTTGATAAAGTTTGATAAA
AGTTATACAGAGTTATACAG
GTGACTGTTCGTGACTGTTC
GAATTTCTTGGAATTTCTTG
TACTTTGATGTACTTTGATG
CCAAATGAAACCAAATGAAA
CATGGCCCTCCATGGCCCTC
TATCTTATGCTATCTTATGC
GAAGTTGTCAGAAGTTGTCA
AATTTAGCAAAATTTAGCAA
GCAGCTCCAAGCAGCTCCAA
TATGAGTTCATATGAGTTCA
ATTAGCGTTGATTAGCGTTG
AATTACAAAAAATTACAAAA
ACATATACAGACATATACAG
AAAATGACTGAAAATGACTG
TTAGTATTGATTAGTATTGA
AAGGACAACTAAGGACAACT
TAATTGGAGGTAATTGGAGG
ACAATCGACCACAATCGACC
AGATTTTTAAAGATTTTTAA
AAGTTCTTCAAAGTTCTTCA
TCTCAAGCTTTCTCAAGCTT
ACTCTCCAGAACTCTCCAGA
CATATTTTCCCATATTTTCC
ATCTTGTTGAATCTTGTTGA
CAACGAGACTCAACGAGACT
AAATGCTGTTAAATGCTGTT
CAAAAGAGGCCAAAAGAGGC
ATGCAGCAAGATGCAGCAAG
TGGAGGTGGATGGAGGTGGA
TCAGGAAATGTCAGGAAATG
112112
AACAAGTACAAACAAGTACA
110110
CTTTGCTGCTCTTTGCTGCT
220220
TCCTAGTGGTTCCTAGTGGT
300300
AGAAAAACTTAGAAAAACTT
35603560
TGACATCAAATGACATCAAA
420420
ATTGGATGCTATTGGATGCT
08800880
TCCGCATTACTCCGCATTAC
00
TGGTGCTGTTTGGTGCTGTT
600600
TGCACAAAAGTGCACAAAAG
600600
GCTCTCATTAGCTCTCATTA
720720
AGCTACCTGGAGCTACCTGG
780780
TTCTTACATGTTCTTACATG
840840
176 936176 936
ACCTTTCTAC TGCTTTTCAA GCTCTTGATT CAAAAAACAA TTACCTCAGGACCTTTCTAC TGCTTTTCAA GCTCTTGATT CAAAAAACAA TTACCTCAGG
GTTCAAGAAA 900GTTCAAGAAA 900
ATGCATTAAC AGGCACAACT ACTGAAATGG ATGATGC-TTC TGAGGCTAATATGCATTAAC AGGCACAACT ACTGAAATGG ATGATGC-TTC TGAGGCTAAT
ATGGAATTAT 960ATGGAATTAT 960
TAGTACAAGT TGGTGAAAAC TTATTGAAGA AACCAGTTTC CGAAGACAATTAGTACAAGT TGGTGAAAAC TTATTGAAGA AACCAGTTTC CGAAGACAAT
CCTGAAACCT lC^^OCCTGAAACCT lC ^^ O
ATGAGGAAGC TCTAAAGAGG TTTGCAAAAT TGCTCTCTGA TAGGAAGAAAATGAGGAAGC TCTAAAGAGG TTTGCAAAAT TGCTCTCTGA TAGGAAGAAA
CTCCGAGCAA 1080CTCCGAGCAA 1080
ACAAAGCTTC TTATTAATGA GAATTC 11^06 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 32:ACAAAGCTTC TTATTAATGA GAATTC 11 ^ 06 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 32:
(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(1) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CĄĄSTCCZKI : ^]^A (syntttyczyy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 32:(A) LENGTH: 25 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF POT: ^] ^ A (synthetically) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO. : 32:
CCATCTAGAA GASCTCCACC AGGCGSTGGP GGGAAAGGS P GASGP 45 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 33:CCATCTAGAA GASCTCCACC AGGCGSTGGP GGGAAAGGS P GASGP 45 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO .: 33:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCES:
(G) DŁUGOŚĆ: 1162 pary zasad (B) SYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy(G) LENGTH: 1162 base pairs (B) SYP: nucleic acid (C) CHAIN: single
176 936 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: CDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 33:176 936 (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF PARTICLE: CDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO .: 33:
ATGGCCACCAATGGCCACCA
CACCAGCAGCCACCAGCAGC
ACCTTCGCCCACCTTCGCCC
TGGCATCAGGTGGCATCAGG
GGCATCATCCGGCATCATCC
GATGGACAACGATGGACAAC
AACGCCGACGAACGCCGACG
CACCGGCGGTCACCGGCGGT
CTCCTGACCGCTCCTGACCG
CGCTGCGAAGCGCTGCGAAG
GAGATCGTCCGAGATCGTCC
GGGTCAAATCGGGTCAAATC
CTGGGCCCCACTGGGCCCCA
GCTGGGCGAGGCTGGGCGAG
ACTAGGGTGCACTAGGGTGC
CAAGACCAACCAAGACCAAC
AAGCCAGTCAAAGCCAGTCA
CGCTAAGATGCGCTAAGATG
TACGACATCTTACGACATCT
CTACTTCGTCCTACTTCGTC
ACCAACACCAACCAACACCA
GGTGGCTACGGGTGGCTACG
GTGGCGGACCGTGGCGGACC
GAAGGATCCAGAAGGATCCA
CCAAGAGCTTCCAAGAGCTT
CCTCATCCTGCCTCATCCTG
ATCTTCATGAATCTTCATGA
AGCTCGGCGAAGCTCGGCGA
GATGGTGACCGATGGTGACC
GTGCTCTCCAGTGCTCTCCA
CGGCCACCATCGGCCACCAT
CCTGGAGTTCCCTGGAGTTC
CTGGAGGGCCCTGGAGGGCC
CCCGCCTGGCCCCGCCTGGC
CCATGATCTCCCATGATCTC
CGTTCTACTTCGTTCTACTT
AGTACGACGGAGTACGACGG
ACCAGGCGCTACCAGGCGCT
TCTTCACCAATCTTCACCAA
CCTACTCCACCCTACTCCAC
GCAACGGCGAGCAACGGCGA
CGGCGCTCCTCGGCGCTCCT
CGACTACTTCCGACTACTTC
CACTCCGAACCACTCCGAAC
CGAACACGGCCGAACACGGC
CAAGTACCTTCAAGTACCTT
GACCGAGGTCGACCGAGGTC
GTCCAACCTGGTCCAACCTG
TGCTGCCGCTTGCTGCCGCT
CGAGTACGAGCGAGTACGAG
GTCCATCAGCGTCCATCAGC
GACGTGATCGGACGTGATCG
GAGAACAACCGAGAACAACC
CCTCAGATTTCCTCAGATTT
ATGCAAGTGCATGCAAGTGC
GTCATCTCCAGTCATCTCCA
GCCAACAGCCGCCAACAGCC
CCCACGTACTCCCACGTACT
TTCAACCTTGTTCAACCTTG
GTCGCCACGCGTCGCCACGC
TCCTGGCCACTCCTGGCCAC
TCGACGGCGGTCGACGGCGG
00
AACTCCAGGAAACTCCAGGA
180180
GTGGCACCAGGTGGCACCAG
240240
GCCCCTTCGCGCCCCTTCGC
300300
TCAACCCCTCTCAACCCCTC
33603360
TTCAGGAGAATTCAGGAGAA
420420
GCTTCGACATGCTTCGACAT
480480
CGGAGCTGGACGGAGCTGGA
540540
TCCCTCCGCATCCCTCCGCA
600600
TTGACGGTGCTTGACGGTGC
660660
GCCTGGCCCAGCCTGGCCCA
720720
176 936176 936
GCCTTCGCTAGCCTTCGCTA
CCTGGGCACTCCTGGGCACT
GGCACGACCTGGCACGACCT
CTGGACCGCCCTGGACCGCC
GTCCATTGGAGTCCATTGGA
CATGACCGACCATGACCGAC
TACTACCTCTTACTACCTCT
CCGTGTTCAGCCGTGTTCAG
GAGAATGCCCGAGAATGCCC
CAACATGGAGCAACATGGAG
CTGCTCGTCCCTGCTCGTCC
CAATCCCGAGCAATCCCGAG
ACCTATGAGGACCTATGAGG
GAAACTCCGCGAAACTCCGC
GCTAACAAGGGCTAACAAGG
GCATTAGGAG CCTCAACTACGCATTAGGAG CCTCAACTAC
CCGAGTTCGACCGAGTTCGA
TGCTGGTCATTGCTGGTCAT
CCACTGCGTTCCACTGCGTT
TCACTGGCACTCACTGGCAC
AGGTGGGTGAAGGTGGGTGA
AAGCGCTCAAAAGCGCTCAA
CAAGACCTACCAAGACCTAC
CCAGAAGATGCCAGAAGATG
CCAGGCGCTTCCAGGCGCTT
CACGACCGAGCACGACCGAG
GAACCTCCTGGAACCTCCTG
GCGCTTTGCCGCGCTTTGCC
CCAGCTACTA ATGACCAGCTACTA ATGA
AAGAAGATGCAAGAAGATGC
ACTGCCAAGGACTGCCAAGG
ACGGACGCCGACGGACGCCG
GACTCCAAGAGACTCCAAGA
ATGGACGATGATGGACGATG
AAGAAGCCCGAAGAAGCCCG
AAGCTGCTCTAAGCTGCTCT
TGCTGCTCAGTGCTGCTCAG
700700
AGGCCGCTACAGGCCGCTAC
800800
CTTCCAGCTACTTCCAGCTA
900900
ACAACTACCTACAACTACCT
960960
CCTCCGAGGCCCTCCGAGGC
10201020
TCTCCGAAGATCTCCGAAGA
10801080
CTGATAGGAACTGATAGGAA
11401140
11641164
Monsanto CompanyMonsanto Company
Castępca:Deputy:
176 936176 936
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.Publishing Department of the UP RP. Circulation of 70 copies. Price PLN 6.00.
Claims (8)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US3114693A | 1993-03-12 | 1993-03-12 | |
PCT/US1994/002306 WO1994021805A2 (en) | 1993-03-12 | 1994-03-02 | Method of controlling insects in plants |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL310599A1 PL310599A1 (en) | 1995-12-27 |
PL176936B1 true PL176936B1 (en) | 1999-08-31 |
Family
ID=21857879
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL94310599A PL176936B1 (en) | 1993-03-12 | 1994-03-02 | Method of fighting against insects on plants |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0688363A1 (en) |
JP (1) | JPH08507692A (en) |
KR (1) | KR960701210A (en) |
CN (1) | CN1119027A (en) |
AU (1) | AU677389B2 (en) |
BR (1) | BR9406586A (en) |
CA (1) | CA2155430A1 (en) |
CZ (1) | CZ285629B6 (en) |
HU (1) | HUT72479A (en) |
NZ (1) | NZ263327A (en) |
PL (1) | PL176936B1 (en) |
UA (1) | UA27966C2 (en) |
WO (1) | WO1994021805A2 (en) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5824864A (en) * | 1995-05-25 | 1998-10-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize gene and protein for insect control |
JP3186774B2 (en) | 1996-06-18 | 2001-07-11 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノート・シャープ | Enzymatic esterification method |
US6080913A (en) * | 1996-09-25 | 2000-06-27 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Binary methods of increasing accumulation of essential amino acids in seeds |
US6057491A (en) * | 1997-05-29 | 2000-05-02 | Borad Of Regents For University Of Oklahoma | Protein having insecticidal activities and method of use |
AU1612901A (en) * | 1999-11-15 | 2001-05-30 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel proteins having insecticidal activities and method of use |
WO2001049834A2 (en) | 2000-01-06 | 2001-07-12 | Monsanto Technology Llc | Preparation of deallergenized patatin proteins and patatin permutein proteins |
FR2807756A1 (en) * | 2000-04-13 | 2001-10-19 | Rhobio | New plant polypeptide useful for improving plant resistance to pathogen attack and for identifying specific inducers comprises a polypeptide with phospholipase A2 activity |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BR9007159A (en) * | 1989-02-24 | 1991-12-10 | Monsanto Co | SYNTHETIC GENES OF PLANTS AND PROCESS FOR THE PREPARATION OF THE SAME |
DE4013144A1 (en) * | 1990-04-20 | 1991-10-24 | Inst Genbiologische Forschung | NEW PLASMIDES, CONTAINING DNA SEQUENCES, CHANGES IN CARBOHYDRATE AND PROTEIN CONCENTRATION AND CARBOHYDRATE AND PROTEIN COMPOSITION IN POTATO BULBS, AND CELLS IN A POTATO PLANT PLANT |
-
1994
- 1994-03-02 CN CN94191451A patent/CN1119027A/en active Pending
- 1994-03-02 HU HU9502646A patent/HUT72479A/en unknown
- 1994-03-02 BR BR9406586A patent/BR9406586A/en not_active Application Discontinuation
- 1994-03-02 UA UA95094087A patent/UA27966C2/en unknown
- 1994-03-02 JP JP52106394A patent/JPH08507692A/en active Pending
- 1994-03-02 CZ CZ952194A patent/CZ285629B6/en not_active IP Right Cessation
- 1994-03-02 AU AU64034/94A patent/AU677389B2/en not_active Ceased
- 1994-03-02 KR KR1019950703878A patent/KR960701210A/en not_active Application Discontinuation
- 1994-03-02 NZ NZ263327A patent/NZ263327A/en unknown
- 1994-03-02 PL PL94310599A patent/PL176936B1/en unknown
- 1994-03-02 CA CA 2155430 patent/CA2155430A1/en not_active Abandoned
- 1994-03-02 WO PCT/US1994/002306 patent/WO1994021805A2/en not_active Application Discontinuation
- 1994-03-02 EP EP19940911451 patent/EP0688363A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR9406586A (en) | 1996-01-02 |
AU6403494A (en) | 1994-10-11 |
KR960701210A (en) | 1996-02-24 |
HU9502646D0 (en) | 1995-11-28 |
CZ219495A3 (en) | 1996-05-15 |
HUT72479A (en) | 1996-04-29 |
UA27966C2 (en) | 2000-10-16 |
WO1994021805A3 (en) | 1994-12-22 |
CN1119027A (en) | 1996-03-20 |
JPH08507692A (en) | 1996-08-20 |
NZ263327A (en) | 1997-01-29 |
CA2155430A1 (en) | 1994-09-29 |
EP0688363A1 (en) | 1995-12-27 |
WO1994021805A2 (en) | 1994-09-29 |
PL310599A1 (en) | 1995-12-27 |
CZ285629B6 (en) | 1999-10-13 |
AU677389B2 (en) | 1997-04-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5804184A (en) | Transgenic pathogen-resistant organism | |
CA2110169A1 (en) | Nematode-responsive plant promoters | |
Alan et al. | Expression of a magainin-type antimicrobial peptide gene (MSI-99) in tomato enhances resistance to bacterial speck disease | |
NZ335358A (en) | CryIC protein fragment from Bacillus thuringiensis for insecticidal activity against Lepidopteran insects | |
US6339144B1 (en) | Proteins having insecticidal activities and method of use | |
IL98331A (en) | Antifungal compositions their preparation and process for obtaining plants with decreased susceptibility to fungi | |
AU718274B2 (en) | Antifungal proteins, DNA coding therefore, and hosts incorporating same | |
KR20060132442A (en) | Novel environmental stress resistance transcription factor and method for enhancing the environmental stress resistance of plants using the same | |
US5629469A (en) | Thiol protease inhibitor | |
AU677389B2 (en) | Method of controlling insects in plants | |
AU2009212130A1 (en) | Methods and compositions for plant pest control | |
US6927322B2 (en) | Cabbage proteinase inhibitor gene confers resistance against plant pests | |
Pourhosseini et al. | Agrobacterium-mediated transformation of chitinase gene in Rosa damascene cv. Ghamsar | |
US6291647B1 (en) | Antifungal proteins, DNA coding therefor, and hosts incorporating same | |
US20230225331A1 (en) | Plant Endophytic Bacteria And Methods To Control Plant Pathogens And Pests | |
Mackey | Resistance to Verticillium in Tomatoes: The Root-Stem Controversy | |
MXPA99010882A (en) | Proteins having insecticidal activities and method of use | |
CA2358161A1 (en) | Organisms containing insecticidal proteins |