PL176690B1

PL176690B1 - Improved method of determining the content of silalic acid bound to lipids present in blood plasma and serum

Info

Publication number: PL176690B1
Application number: PL95308413A
Authority: PL
Inventors: Nonda Katopodis
Original assignee: Onco Medics International Inc
Priority date: 1995-04-28
Filing date: 1995-04-28
Publication date: 1999-07-30
Also published as: PL308413A1

Abstract

Sposób oznaczania kwasu sialikowego związanego z lipidami w plazmie lub surowicy ludzkiej krwi, umożliwiający wykrywanie raka u ludzi i monitorowanie postępu tej choroby, polegający na rozcieńczeniu wodą próbki plazmy lub surowicy, wymieszaniu, ekstrakcji mieszaninąchlorowcopochodnej niższego węglowodoru alkilowego i niższego alkoholu alkilowego oraz na pomiarze intensywności zabarwieniawytworzonego przez dodanie odczynnika tworzącego w podwyższonej temperaturze barwny kompleks z kwasem sialikowym wyekstrahowanym do fazy organicznej, znamienny tym, że stosunek objętościowy składników mieszaniny ekstrakcyjnej zawierającej niższy węglowodór alkilowy i niższy alkohol alkilowy wynosi około 1:1, przy czym reakcję tworzenia zabarwienia z kwasem sialikowym przeprowadza się bezpośrednio w fazie organicznej, powstającej podczas ekstrakcji kwasu sialikowego z rozcieńczonej próbki plazmy lub surowicy:Method for the determination of lipid-bound sialic acid in plasma or serum human blood to detect cancer in humans and monitor the progression of the disease consisting in diluting a plasma or serum sample with water, mixing, extraction a mixture of a halogenated lower alkyl hydrocarbon and a lower alkyl alcohol and on measuring the intensity of the color produced by adding the reagent forming a colored complex with sialic acid at an elevated temperature extracted into the organic phase, characterized in that the volume ratio of the components an extraction mixture containing a lower alkyl hydrocarbon and a lower alkyl alcohol is about 1: 1 with a color forming reaction with sialic acid is carried out directly in the organic phase that is formed during the extraction of the acid sieve from a diluted plasma or serum sample:

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania kwasu sialikowego związanego z lipidami w plazmie lub surowicy ludzkiej krwi, umożliwiający wykrywanie raka u ludzi i monitorowanie postępu tej choroby, polegający na rozcieńczeniu wodą próbki plazmy lub surowicy, wymieszaniu, ekstrakcji mieszaniną chlorowcopochodnej niższego węglowodoru alkilowego i niższego alkoholu alkilowego oraz na pomiarze intensywności zabarwienia wytworzonego przez dodanie odczynnika tworzącego w podwyższonej temperaturze barwny kompleks z kwasem sialikowym wyekstrahowanym do fazy organicznej.The subject of the invention is a method for the determination of sialic acid associated with lipids in plasma or human blood serum, enabling the detection of cancer in humans and monitoring of the progress of this disease, consisting in diluting a plasma or serum sample with water, mixing, extracting with a halogenated lower alkyl hydrocarbon and lower alkyl alcohol mixture and on measuring the intensity of the color produced by the addition of a reagent which forms a colored complex at an elevated temperature with the sialic acid extracted into the organic phase.

Wiele prac wskazuje na to, że podwyższona zawartość kwasu sialikowego w surowicy krwi pacjentów jest wskazówką obecności raka. Na przykład Davidson i współtwórcy w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4 146 603 ujawniają i zastrzegają dość skomplikowaną serię procedur, według których podwyższona zawartość kwasu sialikowego jest wskaźnikiem określającym specyficzne rodzaje raka.Many studies indicate that the increased content of sialic acid in the blood serum of patients is an indication of the presence of cancer. For example, Davidson et al. In U.S. Patent No. 4,146,603 disclose and claim a rather complicated series of procedures in which elevated sialic acid levels are indicative of specific types of cancer.

MacBeth i Bekesi w Cancer Res. 22,1170-1176 (1962) mierzyli ilość glikoprotein w plazmie i stwierdzili obecność galaktozy i mannozy w przypadkach raka piersi bez przerzutów. Kloppeli współautorzy w Proc. Natl. Acad. Sc. 74,3011-3013 (1977) donosząo2,5 krotnym wzroście glikolipidów kwasu sialikowego u mysz z przeszczepionym rakiem gruczołów mlecznych i 2-krotny wzrost u ludzi chorych na raka. Kloppel i współautorzy w Am. J.Vet. Res. 39, 1377-1380 (1978) donieśli również o wzroście poziomu kwasu sialikowego u 93% z 24 psów. W przypadku białaczki AKR/J u myszy, Lengle w J. Natl. Cancer Inst. 62, 1565-1567 (1979) stwierdził wzrost poziomu kwasu sialikowego związanego z lipidami w ich plazmie i grasiczych limfocytach. Zwiększony poziom kwasu sialikowego związanego z lipidami wykryto w plazmie i erytrocytach ludzi cierpiących na czerniaka. Portouklian i współautorzy w Biochem. Biophys. Res. Commun. 85 916-920 (1978) mówiąo chromatograficznym rozdzieleniu i oczyszczeniu na kolumnach, po którym następowała ocena na płytkach chromatograficznych. Silver i współauto176 690 rzy w Cancer 41. 1497-1499 (1978) i Cancer Res. 39, 5036-5042 (1979) donoszą o związanym z obecnością nowotworu podwyższonym poziomie kwasu sialikowego w surowicy pacjentów cierpiących na czerniaka. Jednakże, 36% pacjentów z nowotworami nie wykazywało podwyższonego poziomu kwasu sialikowego w surowicy. Hogan-Ryan i współautorzy omawiając w Br. J. Cancer 41, 587-592 (1980) całkowitą ilość związanego kwasu sialikowego w surowicy pacjentek z rakiem piersi stwierdzili, że jego podwyższony poziom odpowiada stadium nowotworu.MacBeth and Bekesi in Cancer Res. 22, 1170-1176 (1962) measured the amount of glycoproteins in the plasma and found the presence of galactose and mannose in cases of non-metastatic breast cancer. Kloppeli co-authors in Proc. Natl. Acad. Sc. 74, 3011-3013 (1977) reported a 2.5-fold increase in sialic acid glycolipids in mice transplanted with mammary gland cancer and a 2-fold increase in human cancer patients. Kloppel and co-authors in Am. J.Vet. Res. 39, 1377-1380 (1978) also reported an increase in sialic acid levels in 93% of 24 dogs. For AKR / J leukemia in mice, Lengle in J. Natl. Cancer Inst. 62, 1565-1567 (1979) found an increase in the level of sialic acid associated with lipids in their plasma and thymic lymphocytes. Increased levels of lipid-associated sialic acid have been detected in the plasma and red blood cells of people suffering from melanoma. Portouklian et al. At Biochem. Biophys. Res. Commun. 85,916-920 (1978) talks about chromatographic separation and column purification followed by evaluation on chromatographic plates. Silver et al. 176 690 at Cancer 41, 1497-1499 (1978) and Cancer Res. 39, 5036-5042 (1979) report a tumor-associated elevated serum level of sialic acid in melanoma patients. However, 36% of cancer patients did not show elevated serum levels of sialic acid. Hogan-Ryan and co-authors discussing in Br. J. Cancer 41, 587-592 (1980) the total amount of bound sialic acid in the serum of patients with breast cancer found that its elevated level corresponds to the stage of the tumor.

Specyficzny sposób oznaczania kwasu sialikowego jest opisany przez Katopodisa i współautorów w American Association for Cancer Research Annual Meeting Proceedings Vol 21, marzec 1980, Abstrakt nr 728. Według tego sposobu 100 μΐ plazmy ekstrahuje się 6 ml mieszaniny chloroformu z metanolem (w stosunku objętościowy 2:1). Ekstrakt lipidowy uzyskany z plazmy jest poddany podziałowi między fazą organiczną i wodną przez dodanie 0,2 objętości wody. Fazę wodną odparowuje się całkowicie i pozostałość ponownie rozpuszcza się w wodzie. Następnie oczyszcza się związany z lipidami kwas sialikowy, przez wytrącanie kwasem trój chlorooctowym i kwasem wolframofosforowym. Po oddzieleniu cieczy od powstałego osadu, osad ten jest oznaczany metodą Svennerholma i Miettiena (Svennerholm). Ilościowe oznaczanie kwasu sialikowego..., Biochem. Biophys. Acta, 24, str. 604-611 (1957)).A specific method for determining sialic acid is described by Katopodis et al. In the American Association for Cancer Research Annual Meeting Proceedings Vol 21, March 1980, Abstract No. 728. According to this method, 100 μΐ of plasma is extracted with 6 ml of a mixture of chloroform and methanol (in a volume ratio of 2: 1). The lipid extract obtained from the plasma is partitioned between the organic and the aqueous phases by adding 0.2 volumes of water. The aqueous phase is completely evaporated and the residue is redissolved in water. The lipid bound sialic acid is then purified by precipitation with trichloroacetic acid and tungsten phosphoric acid. After the liquid is separated from the sludge formed, the sludge is determined by the method of Svennerholm and Miettien (Svennerholm). Quantitative determination of sialic acid ..., Biochem. Biophys. Acta, 24, pp. 604-611 (1957)).

Inny sposób ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4 342 567. Sposób ten jest podobny do poprzedniego omówionego, ale wymaga próbki jedynie o objętości około 50 μ!. Ponadto wyeliminowano etap suszenia i stosowanie kwasu trójchlorooctowego. Konieczne jest jednak stosowanie kwasu wolframofosforowego.Another method is disclosed in U.S. Patent No. 4,342,567. This method is similar to the previous one discussed, but only requires a sample volume of about 50 µm. In addition, the drying step and the use of trichloroacetic acid are eliminated. However, it is necessary to use tungsten phosphoric acid.

Sposób ten wykazuje szereg niedogodności, zwłaszcza konieczność ściśle określonej objętości próbki wyjściowej wynoszącej 44,7 μΕ przy czym związany z lipidami kwas sialikowy tracony jest na etapie inwersji probówki, co powoduje zmniejszoną wartość końcową oznaczenia, ponadto strącanie związanego z lipidami kwasu sialikowego nie jest całkowite, co jest szczególnym problemem przy obróbce próbek, w których nadmiarowa ilość kwasu w stosunku do ilości normalnej jest niewielka (na przykład we wczesnym okresie rozwoju raka). Ponadto szybkość wykonania testu jest ograniczona 5 minutowym oczekiwaniem po dodaniu kwasu wolframofosforowego, a koszt wykonania oznaczenia jest stosunkowo wysoki.This method has a number of disadvantages, in particular the need for a strictly defined volume of the initial sample of 44.7 μΕ, where the lipid-bound sialic acid is lost at the tube inversion stage, which results in a reduced final value of the assay, moreover, the precipitation of sialic acid associated with lipids is not complete which is of particular concern when treating samples where excess acid over the normal amount is small (for example early in cancer development). Moreover, the speed of the test is limited by the waiting 5 minutes after the addition of Tungsten Phosphoric Acid and the cost of the test is relatively high.

Inny sposób oznaczenia kwasu sialikowego, ujawniony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4 748 128, składa się z następujących etapów:Another method for determining sialic acid, disclosed in U.S. Patent No. 4,748,128, consists of the following steps:

a) rozcieńczenie określonej objętości plazmy lub surowicy krwi wodą destylowaną do objętości około cztery razy większej od objętości początkowej;a) diluting the specified volume of plasma or serum with distilled water to a volume approximately four times the original volume;

b) mieszanie rozcieńczonej próbki przez odpowiedni czas, aż do uzyskania zasadniczo zhomogenizowanej próbki;b) mixing the diluted sample for an appropriate amount of time until a substantially homogenized sample is obtained;

c) oziębianie wymieszanej, rozcieńczonej próbki do 0° - 5°C;c) cooling the mixed diluted sample to 0 ° - 5 ° C;

d) dodawanie do oziębionej próbki mieszaniny chlorowcopochodnej niższego węglowodoru alkilowego i niższego alkoholu alkilowego, przy czym objętość dodawanej mieszaniny jest około sześćdziesięciokrotnie większa niż objętość próbki plazmy lub surowicy krwi, a stosunek objętości chlorowanego węglowodoru do alkoholu wynosi około 2:1, zaś temperatura 0° do 5°C;d) adding to a cooled sample of a mixture of a halogenated lower alkyl hydrocarbon and a lower alkyl alcohol, the volume of the added mixture being about sixty times the volume of the plasma or serum sample, and the volume ratio of chlorinated hydrocarbon to alcohol is about 2: 1, and the temperature is 0 ° up to 5 ° C;

e) mieszanie powstałej mieszaniny przez odpowiedni czas, w celu rozpuszczenia materiału obecnego w próbce w roztworze chlorowcopochodnej węglowodoru i alkoholu;e) agitating the resultant mixture for a suitable time to dissolve the material present in the sample in the halogenated hydrocarbon and alcohol solution;

f) rozcieńczanie powstałej mieszaniny destylowaną wodą dejonizowaną w temperaturze od 0°C do 5°C, przy czym dodawana objętość wody jest około dziesięciokrotnie większa od objętości próbki plazmy lub surowicy krwi;f) diluting the resulting mixture with distilled deionized water at a temperature of 0 ° C to 5 ° C, the added volume of water being about ten times the volume of the plasma or blood serum sample;

g) obróbka rozcieńczonej mieszaniny przez odpowiedni czas, aż do wytworzenia zasadniczo klarownej fazy górnej;g) treating the diluted mixture for a suitable time until an essentially clear upper phase is formed;

h) pobranie określonej objętości ze sklarowanej fazy górnej;h) taking a defined volume from the clarified upper phase;

i) dodanie do pobranej objętości fazy górnej pewnej ilości mieszaniny środka wytrącającego białka i materiału adsorbującego, przy czym ilość dodawanej mieszaniny musi powodować skuteczne wytrącenie kwasu sialikowego związanego z lipidami i zaadsorbowanie wytrąconego kwasu sialikowego związanego z lipidami;i) adding an amount of the mixture of protein precipitating agent and adsorbent material to the taken volume of the top phase, the amount of the added mixture must effectively precipitate lipid bound sialic acid and adsorb the precipitated lipid bound sialic acid;

j) mieszanie powstałej mieszaniny;j) mixing the resulting mixture;

176 690176 690

k) pobranie powstałego zaadsorbowanego osadu;k) taking the resulting adsorbed sludge;

l) wytworzenie zawiesiny osadu w odpowiedniej ilości destylowanej wody; orazl) suspending the precipitate in an appropriate amount of distilled water; and

m) dodanie do zawiesiny osadu określonej objętości odczynnika zawierającego rezorcynę, mieszanie, a następnie gotowanie przez 15 minut, oziębianie przez 10 minut na łaźni z lodem, odwirowanie, dodanie mieszaniny octanu i n-butanolu (stosunek objętości 85:15) o objętości około dwukrotnie większej od objętości odczynnika zawierającego rezorcynę, mieszanie, odwirowywanie, oddzielanie warstwy organicznej, pomiar intensywności wyekstrahowanego zabarwienia niebieskiego warstwy organicznej przy długości fali 580 nm i określenie ilości kwasu sialikowego związanego z lipidami przez porównanie odczytów gęstości optycznej uzyskanych w tych samych warunkach przy długości fali 580 nm z krzywą wzorcową znanej próbki kwasu n-acetyloneuraminowego (KNAN).m) adding a specified volume of a reagent containing resorcinol to the sediment suspension, stirring and then boiling for 15 minutes, cooling for 10 minutes in an ice bath, centrifugation, adding a mixture of acetate and n-butanol (volume ratio 85:15) with a volume of about twice greater than the volume of the reagent containing resorcinol, stirring, centrifuging, separating the organic layer, measuring the intensity of the extracted blue color of the organic layer at a wavelength of 580 nm and determining the amount of lipid bound sialic acid by comparing the optical density readings obtained under the same conditions at a wavelength of 580 nm with the standard curve of a known sample of n-acetylneuraminic acid (KNAN).

Podobne sposoby oznaczania kwasu sialikowego związanego z lipidami są znane z europejskich opisów patentowych nr 0 159 563 i nr 0 159 564. W obu tych rozwiązaniach w sposobie oznaczania kwasu sialikowego wymagane jest jego strącanie, w pierwszym przypadku kwasem wolframofosforowym, a w drugim przypadku mieszaniną kwasu wolframofosforowego i kwasu trichlorooctowego. Wskutek wytrącania kwasem wolframofosforowym następuje uszkadzanie naturalnych białek plazmy lub surowicy. W obu tych opisach patentowych wymaga się ekstrahowania kwasu sialikowego mieszaniną chlorowcopochodnej niższego węglowodoru i alkoholu o wzajemnym stosunku 15:1 do 5:1 w patencie europejskim nr 159 563 i 2:1 w patencie europejskim 159 564.Similar methods for the determination of lipid-bound sialic acid are known from European patents 0 159 563 and 0 159 564. In both of these solutions, the method for determining sialic acid requires its precipitation, in the first case with tungstenophosphoric acid, and in the second case with a mixture of tungstenophosphoric acid. and trichloroacetic acid. The natural plasma or serum proteins are damaged by precipitation with tungstenophosphoric acid. Both of these patents require sialic acid to be extracted with a mixture of a halogenated lower hydrocarbon and alcohol in a ratio of 15: 1 to 5: 1 in European Patent No. 159,563 and 2: 1 in European Patent No. 159,564.

Celem wynalazku jest uproszczenie sposobu oznaczania kwasu sialikowego i obniżenie kosztu tego oznaczania. Cel ten osiągnięto przez zmianę sposobu ekstrakcji kwasu sialikowego związanego z lipidami i zmianę sposobu przygotowania próbek plazmy i surowicy krwi przed pomiarem kolorymetrycznym. Najbardziej istotne jest wyeliminowanie konieczności wytrącania kwasu sialikowego związanego z lipidami, osiągnięte dzięki właściwemu doborowi mieszaniny ekstrakcyjnej.The aim of the invention is to simplify the method of determining sialic acid and reduce the cost of this determination. This goal was achieved by changing the method of extracting lipid-bound sialic acid and changing the preparation of plasma and blood serum samples prior to colorimetric measurement. The most important thing is to eliminate the need for lipid-related sialic acid precipitation, achieved by the appropriate selection of the extraction mixture.

Sposób oznaczania kwasu sialikowego związanego z lipidami charakteryzuje się tym, że stosunek objętościowy składników mieszaniny ekstrakcyjnej zawierającej niższy węglowodór alkilowy i niższy alkohol alkilowy wynosi około 1:1, przy czym reakcję tworzenia zabarwienia z kwasem sialikowym przeprowadza się bezpośrednio w fazie organicznej, powstającej podczas ekstrakcji kwasu sialikowego z rozcieńczonej próbki plazmy lub surowicy'. .The method for determining lipid bound sialic acid is characterized by the fact that the volume ratio of the components of the extraction mixture containing lower alkyl hydrocarbon and lower alkyl alcohol is approximately 1: 1, the color formation reaction with sialic acid being carried out directly in the organic phase formed during the extraction of the acid sieve from a diluted plasma or serum sample. .

Korzystnie stosowana objętość mieszaniny chlorowcopochodnej niższego węglowodoru alkilowego i niższego alkoholu alkilowego jest około dwudziestokrotnie większa od objętości pierwotnej próbki plazmy lub surowicy krwi. Przykładowo, jeśli początkowa objętość próbki wynosi 50 μΐ, to objętość dodawanej mieszaniny wynosi około 1,0 ml.Preferably the volume of the mixture of the halogenated lower alkyl hydrocarbon and the lower alkyl alcohol used is about twenty times the volume of the original plasma or serum sample. For example, if the initial sample volume is 50 μΐ, the volume of the mixture added is approximately 1.0 ml.

W korzystnym rozwiązaniu wynalazku jako niższy alkohol alkilowy stosuje się metanol, a jako niższą chlorowcopochodną węglowodoru alkilowego chloroform.In a preferred embodiment of the invention, methanol is used as the lower alkyl alcohol and chloroform is used as the lower halogenated alkyl hydrocarbon.

Sposób według wynalazku jest prostszy, tańszy, szybszy i łatwiejszy do automatyzacji. Ponadto wymaga mniej odczynników chemicznych oraz jest bardziej specyficzny i czulszy niż znane sposoby. Zaletą sposobu według wynalazku jest wyeliminowanie użycia czynnika strącającego białka, takiego jak kwas wolframofosforowym, i materiału absorbującego (kwas krzemowy) wytrącany kwas sialikowy, co jest nieoczekiwanym efektem zastosowania do ekstrakcji mieszaniny o stosunku chlorowcopochodnej węglowodoru do alkoholu w przybliżeniu 1:1.The method according to the invention is simpler, cheaper, faster and easier to automate. Moreover, it requires fewer chemicals and is more specific and sensitive than known methods. An advantage of the process of the invention is that the use of a protein precipitating agent, such as tungsten phosphoric acid, and the absorbing material (silicic acid) of the precipitated sialic acid (silicic acid), is an unexpected effect of using a mixture with a halogenated hydrocarbon to alcohol ratio of approximately 1: 1 for extraction.

Znaczącym osiągnięciem niniejszego wynalazku jest sposób przygotowania czystej frakcji organicznej (górna faza), która po liofilizacji stanowi podstawowy materiał do wytwarzania monoklonowych przeciwciał, co jest możliwe dlatego, że naturalne białka plazmy lub surowicy nie sąniszczone przez ekstrakcję i wytrącanie kwasem wolframofosforowym, tak jak się to dzieje w znanych sposobach.A significant achievement of the present invention is the method of preparing a pure organic fraction (upper phase), which after lyophilization is the basic material for the production of monoclonal antibodies, which is possible because the natural plasma or serum proteins are not destroyed by extraction and precipitation with tungstenophosphoric acid as it is done. happens in known ways.

Wreszcie, w sposobie według wynalazku eliminuje się potrzebę stosowania mieszaniny octanu butylu i n-butanolu, tak jak to się dzieje w znanych sposobach. Oprócz obniżenia kosztu oznaczenia, eliminuje to konieczność pracy z tą mieszaniną, mającą odrażający zapach i powodującą podrażnienie błon nosowych u ludzi.Finally, the process of the invention obviates the need for a mixture of butyl acetate and n-butanol as is the case with known methods. In addition to reducing the cost of the assay, it eliminates the need to work with this mixture, which has a foul odor and causes irritation to the nasal membranes in humans.

176 690176 690

Oznaczenie kwasu sialikowego związanego z lipidami opisano poniżej:The determination of lipid bound sialic acid is described below:

Próbkę plazmy lub surowicy uzyskuje się z krwi pobieranej od pacjenta. Do oznaczenia kwasu sialikowego wykorzystano próbkę o objętości 50 μΐ, rozcieńczono jąwodą destylowaną o objętości 250 μΙ i po wymieszaniu dodano 1 ml mieszaniny chloroformu i metanolu o stosunku objętościowym 1:1. Po wstępnym wymieszaniu przez około 10 s, umożliwiającym ekstrakcję kwasu sialikowego związanego z lipidami, mieszaninę odwirowywano przez około 5 minut przy około 3500 obr./min. aż do uzyskania klarownej fazy górnej. Z uzyskanej fazy górnej pobrano 200 μΙ cieczy, dodano do niej 1 ml roztworu rezorcyny i mieszaninę gotowano na łaźni wodnej przez 15 minut, po czym oziębiono ją przez umieszczenie w zimnej wodzie na 5 minut. Następnie mieszaninę odwirowywano przez 5 minut przy 3500 obr./min. Stężenie kwasu sialikowego związanego z lipidami oznaczano przez pomiar intensywności niebieskiego zabarwienia fazy organicznej przy długości fali 580 nm i wyliczano przez porównanie odczytu przy 580 nm dla próbki badanej i dla wzorca, zawierającego znane stężenie kwasu sialikowego związanego z lipidami, przy zastosowaniu wzoru LSA [mg/100 ml plazmy] = A x B/C, gdzie A = znane stężenie wzorca, B = optyczna gęstość próbki i C = optyczna gęstość wzorca.A plasma or serum sample is obtained from blood collected from the patient. For the determination of sialic acid, a 50 μΐ sample was used, diluted with distilled water of 250 μΙ volume, and after mixing, 1 ml of a 1: 1 mixture of chloroform and methanol was added. After pre-mixing for about 10 seconds to extract lipid bound sialic acid, the mixture was centrifuged for about 5 minutes at about 3500 rpm. until a clear upper phase is obtained. 200 μL of liquid was taken from the obtained upper phase, 1 ml of resorcinol solution was added thereto, and the mixture was boiled in a water bath for 15 minutes and then cooled by placing it in cold water for 5 minutes. The mixture was then centrifuged for 5 minutes at 3500 rpm. The concentration of lipid bound sialic acid was determined by measuring the intensity of the blue color of the organic phase at a wavelength of 580 nm and was calculated by comparing the reading at 580 nm for the test sample and the standard containing the known concentration of lipid bound sialic acid using the LSA formula [mg / 100 ml of plasma] = A x B / C, where A = known standard concentration, B = optical density of the sample and C = optical density of the standard.

Jako wzorzec stosowano dostępny w handlu kwas n-acetyloneuraminowy (KNAN), który poddano identycznej obróbce i w tym samym czasie jak badana próbka.Commercially available n-acetylneuraminic acid (KNAN) was used as a standard, which was processed in the same way and at the same time as the test sample.

Badanie które doprowadziły do wynalazku pozwoliły stwierdzić, że użycie do ekstrakcji mieszaniny metanolu i chloroformu w stosunku objętościowym 1:1, sprawia, iż oznaczenie staje się czulsze i wyeliminowana jest konieczność używania reagentu wytrącającego białka. Przyczyną tego jest fakt, że mieszanina o tym stosunku wytwarza fazę górną o dużo większej objętości i praktycznie pozbawioną zanieczyszczeń. Duża objętość klarowej fazy górnej daje możliwość wykonania kilku oznaczeń z tej samej fazy górnej. Z tabeli I wynika wzrost czułości oznaczenia według wynalazku w przypadku stosowania mieszaniny metanolu do chloroformu w stosunku objętościowym 1: 1 oraz zmniejszenie czułości w przypadku zmiany tego stosunku do wartości 45: 55. Jeśli stosunek metanolu do chloroformu zostaje zwiększony do 60:40, obserwuje się bardzo słabe oddzielenie zanieczyszczonej górnej fazy, którą nie można wykorzystać do przeprowadzenia oznaczenia sposobem według wynalazku. Natomiast, jeśli stosunek metanolu do chloroformu zwiększony jest do 70:30, w ogóle nie następuje rozdzielenie faz, jak to wynika z tabeli I.The investigation that led to the invention showed that using a 1: 1 v / v mixture of methanol and chloroform for extraction makes the determination more sensitive and eliminates the need for a protein-precipitating reagent. The reason for this is that a mixture with this ratio produces an upper phase with a much larger volume and practically free from impurities. The large volume of the clear upper phase makes it possible to perform several determinations from the same upper phase. Table I shows the increase in sensitivity of the assay according to the invention with a 1: 1 v / v mixture of methanol and chloroform and a decrease in sensitivity when the ratio is changed from 45:55. If the methanol: chloroform ratio is increased to 60:40, the following is observed. very poor separation of the impure upper phase, which cannot be used for the determination according to the invention. On the other hand, if the ratio of methanol to chloroform is increased to 70:30, no phase separation occurs at all, as shown in Table I.

W tabeli II pokazano wpływ stosunku metanolu do chloroformu na objętość fazy górnej, dla objętości próbki wynoszącej 1300 μΐ. Jak to wynika z tabeli II, przy stosunku 50:50 objętość klarownej fazy górnej mieszaniny wynosi 700 μΐ, a fazy dolnej 600 μΐ. Gdy stosunek metanolu do chloroformu wynosi 52,5 : 47,5 objętości tych dwóch faz są w przybliżeniu takie same, natomiast przy stosunku 55:45, objętość górnej fazy wzrasta do 760 μΐ, a przy stosunku do 60:40 objętość wzrasta do 840 μΐ, lecz rozdzielenie faz jest bardzo słabe, przy czym faza górna nie jest klarowna. Przy stosunku 70:30 w ogóle nie występuje rozdzielenie. Na odwrót, przy zmniejszeniu wartości stosunku metanolu do chloroformu do 48:52, objętość górnej fazy zmniejsza się do 600 μΐ, a objętość dolnej fazy zwiększa się do 700 μΐ, zaś przy stosunku 45:55, objętość górnej fazy zmniejsza się do 500 μΐ, a objętość fazy dolnej wzrasta do 800 μΐ. Z danych tabeli I i tabeli II wynika więc, że zwiększoną czułość oznaczania kwasu sialikowego związanego z lipidami, przy największej objętości klarownej fazy górnej, występuje przy stosunku metanolu do chloroformu 50:50 czyli 1:1.Table II shows the effect of the methanol to chloroform ratio on the volume of the upper phase for a sample volume of 1300 μΐ. As shown in Table II, for a 50:50 ratio the volume of the clear upper phase of the mixture is 700 µΐ and the lower phase is 600 µΐ. When the ratio of methanol to chloroform is 52.5: 47.5, the volumes of the two phases are approximately the same, while at the ratio of 55:45, the volume of the upper phase increases to 760 μΐ, and with the ratio of 60:40, the volume increases to 840 μΐ but the phase separation is very weak with the upper phase not clear. At a ratio of 70:30, there is no separation at all. Conversely, when the ratio of methanol to chloroform is reduced to 48:52, the volume of the upper phase is reduced to 600 μΐ and the volume of the lower phase is increased to 700 μΐ, and with a ratio of 45:55, the volume of the upper phase is reduced to 500 μΐ. and the volume of the lower phase increases to 800 μΐ. The data from Table I and Table II therefore show that the increased sensitivity of the determination of lipid-bound sialic acid with the highest volume of the clear upper phase occurs at a methanol to chloroform ratio of 50:50, i.e. 1: 1.

W tabeli III pokazano wzrost czułości sposobu oznaczania według wynalazku, wyrażonej wyższym procentem pozytywnych rezultatów u pacjentów chorych na raka, w porównaniu ze sposobami znanymi. W tabeli tej zebrano wyniki testów na różnego typu nowotwory u 532 pacjentów, u których innego typu testy potwierdziły obecność nowotworu w 343 przypadkach. Testy według niniejszego wynalazku zidentyfikowały 79% pacjentów mających nowotwory, podczas gdy test według opisu patentowego Stanów Zjednoczonych nr 4 748 128 zidentyfikował tylko 52% przypadków. Tak więc, test według niniejszego wynalazku wykazał wzrost wykrywalności nowotworów o 27% w porównaniu z testem znanym (patrz tabele I, II i III).Table III shows the increase in sensitivity of the assay method according to the invention, expressed as a higher percentage of positive results in cancer patients, compared to the known methods. This table summarizes the results of tests for various types of cancer in 532 patients, in whom other types of tests confirmed the presence of cancer in 343 cases. The tests of the present invention identified 79% of the cancer patients, while the test of US Patent No. 4,748,128 identified only 52% of the cases. Thus, the test according to the present invention showed a 27% increase in the detection of tumors compared to the known test (see tables I, II and III).

Sposób według wynalazku może być wykorzystany do rozpoznawania raka u ludzi przez oznaczanie ilości kwasu sialikowego związanego z lipidami w próbce plazmy lub surowicy krwiThe method of the invention can be used to diagnose cancer in humans by determining the amount of lipid bound sialic acid in a plasma or blood serum sample.

176 690 i porównywanie oznaczonej w ten sposób ilości kwasu z wartościami uzyskanymi dla pacjentów, o których wiadomo, iż są chorzy na raka, albo alternatywnie, porównywanie w ten sposób oznaczonej ilości kwasu z wartościami uzyskiwanymi u tego samego pacjenta w ciągu dłuższego czasu.176 690 and comparing the amount of acid so determined with values obtained for patients known to have cancer, or alternatively, comparing the amount of acid so determined with values obtained in the same patient over a longer period of time.

Sposób według wynalazku może być również stosowany do regularnego oznaczania ilości kwasu sialikowego obecnego w plazmie lub surowicy krwi chorych i w ten sposób do monitorowania postępów leczenia przez porównywanie z poprzednią ilością kwasu oznaczoną w ten sam sposób.The method according to the invention can also be used to regularly determine the amount of sialic acid present in the plasma or serum of the patients' blood and thus to monitor the progress of treatment by comparing it with the previous amount of acid determined in the same way.

Sposób według wynalazku może być wykorzystany do monitorowania rozwoju raka u pacjentów, obejmujący oznaczanie w regularnych odstępach czasu ilości kwasu sialikowego związanego z lipidami w próbkach plazmy lub surowicy krwi pacjentów i porównywanie ilości kwasu w ten sposób oznaczonej z ilością oznaczoną poprzednio u tego samego pacjenta.The method of the invention can be used to monitor the development of cancer in patients, comprising determining at regular intervals the amount of lipid bound sialic acid in the patient's plasma or serum samples and comparing the amount of acid thus determined with the amount previously determined in the same patient.

Tabela ITable I.

Wpływ stosunku metanol/chloroform na wartości LSAEffect of methanol / chloroform ratio on LSA values

Stosunek metanolu do chloroformu (metanol/chloroform) Methanol to chloroform ratio (methanol / chloroform) Próbka A sample 45/55 45/55 48/52 48/52 50/50 50/50 52,5/47,5 52.5 / 47.5 55/45 55/45 60/40 60/40 70/30 70/30 #1 # 1 8,0* 8.0 * 8,3 8.3 8,9 8.9 7,2 7.2 5,1 5.1 rozdzielenie faz phase separation nie ma there is no #2 # 2 10,3 10.3 12,2 12.2 13,4 13.4 12,0 12.0 10,4 10.4 słabe do wyko- weak to perform rozdzielenia separation #3 # 3 20,7 20.7 23,9 23.9 24,3 24.3 21,2 21.2 17,6 17.6 nania testu taking the test #4 # 4 22,0 22.0 25,5 25.5 26,9 26.9 20,3 20.3 18,5 18.5 #5 # 5 43,1 43.1 46,5 46.5 48,3 48.3 39,7 39.7 27,9 27.9

**

Stężenie kwasu sialikowego związanego z lipidami w próbkach (mg/100 ml)Concentration of lipid bound sialic acid in samples (mg / 100 ml)

Tabela IITable II

Wpływ stosunku metanolu do chloroformu na objętość górnej fazy 1300 mikrolitrowej próbkiEffect of the methanol to chloroform ratio on the upper phase volume of a 1300 microlitre sample

Stosunek metanolu do chloroformu The ratio of methanol to chloroform 45:55 45:55 48:52 48:52 50:50 50:50 52,5:47,5 52.5: 47.5 55:45 55:45 60:40 60:40 70:30 70:30 objętość fazy górnej w μΐ upper phase volume in μΐ 500 500 600 600 700 700 700 700 760 760 słabe rozdzielenie 460 weak separation 460 nie ma rozdzielenia 1300 there is no separation of 1300 objętość fazy dolnej w μΐ lower phase volume in μΐ 800 800 700 700 600 600 600 600 540 540 540 540 nie ma rozdzielenia 1300 there is no separation of 1300

Tabela IIITable III

Wzrost czułości sposobu według wynalazku identyfikowania przypadków raka u pacjentów, o których wiadomo z innych testów, że cierpią na tę chorobęIncreased sensitivity of the method of the invention for identifying cancer cases in patients known to be suffering from this disease from other tests

Rodzaj nowotworu Type cancer Liczba testowanych pacjentów number tested patients Liczba pacjentów chorych number patients sick Procent pozytywnie zidentyfikowanych przypadków choroby Percentage of positively identified cases of the disease Wcześniej znany test Previously known test Test według wynalazku Test according to the invention piersi breasts 168 168 62 62 37% 37% 66% 66% okrężnicy colon 92 92 71 71 38 38 56 56 jajnika the ovary 70 70 53 53 66 66 91 91 płuc spit 55 55 40 40 75 75 87 87 prostaty prostate 45 45 39 39 59 59 79 79 policzka cheek 24 24 5 5 20 twenty 80 80 różne various 78 78 73 73 68 68 95 95 Całkowite Complete 532 532 343 343 52% (średnio) 52% (medium) 79% (średnio) 79% (medium)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.Publishing Department of the UP RP. Circulation of 70 copies

Cena 2,00 zł.Price PLN 2.00.

Claims

Patent claims

1.A method for the determination of lipid-bound sialic acid in plasma or human serum, which enables the detection of cancer in humans and the monitoring of the progress of this disease, by diluting a plasma or serum sample with water, mixing, extracting with a halogenated lower alkyl hydrocarbon and lower alkyl alcohol mixture, and measuring the intensity of the color produced by adding a reagent at an elevated temperature to form a colored complex with sialic acid extracted into the organic phase, characterized in that the volume ratio of the components of the extraction mixture containing the lower alkyl hydrocarbon and the lower alkyl alcohol is approximately 1: 1, the color forming reaction with sialic acid is carried out directly in the organic phase that is formed during the extraction of sialic acid from a diluted plasma or serum sample.

2. The method according to p. The method of claim 1, wherein the volume of the halogenated lower alkyl hydrocarbon and lower alkyl alcohol mixture used is about twenty times the volume of the original plasma or blood serum sample.

3. The method according to p. The process of claim 1, wherein the lower alkyl alcohol is preferably methanol.

4. The method according to p. A process as claimed in claim 1, wherein chloroform is preferably used as the lower halogen derivative of the alkyl hydrocarbon.