PL175143B1 - Expression vectors and their application for generation of human cells resistant against hiv for therapeutic purposes - Google Patents
Expression vectors and their application for generation of human cells resistant against hiv for therapeutic purposesInfo
- Publication number
- PL175143B1 PL175143B1 PL93297945A PL29794593A PL175143B1 PL 175143 B1 PL175143 B1 PL 175143B1 PL 93297945 A PL93297945 A PL 93297945A PL 29794593 A PL29794593 A PL 29794593A PL 175143 B1 PL175143 B1 PL 175143B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- hiv
- promoter
- expression
- antisense rna
- cells
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
1 . Konstrukty wektora ekspresyjnego do ekspresji antysensownego RNA, znamienne tym, że zawierają a) sekwencje silnego kon stytutywnego promotora wybranego spośród promotora metalotioneiny i promotora CMV albo sekwencje hybrydowego promotora obejmującego wymienione silne promotory lub jeden z wymienionych silnych promo torów i promotor HIV-1 LTR oraz b)wiru- sowy DNA w orientacji antysensownej.1 . Constructs vector expressive down expression antisense RNA, significant this that contain and) sequences strong horse constitutive promoter chosen one out of promoter metallothioneins and promoter CMV or sequences hybrid promoter covering replaced strong promoters or one with listed strong promo tracks and promoter HIV-1 LTR and b) vortex Owls GOUT in orientation antisense.
Description
Przedmiotem wynalazku są konstrukty wektora ekspresyjnego do ekspresji antysensownego RNA.The invention relates to expression vector constructs for the expression of antisense RNA.
Wektory ekspresyjne według wynalazku służą do wytworzenia opornych na HIV komórek ludzkich do celów terapeutycznych. Wynalazek dotyczy celowanego blokowania informacji genetycznej i replikacji wirusa (na przykład HIV) w wirusowym informacyjnym kwasie rybonukleinowym (mRNA) w transfekowanych komórkach krwiotwórczych, przy pomocy specjalnych systemów ekspresyjnych, które wywołują ekspresję komplementarnego antysensownego RNA.The expression vectors of the invention serve to generate HIV resistant human cells for therapeutic purposes. The invention relates to the targeted blocking of the genetic information and replication of a virus (e.g. HIV) in viral messenger ribonucleic acid (mRNA) in transfected hematopoietic cells with the aid of special expression systems that induce the expression of complementary antisense RNA.
W szczególności wynalazek dotyczy wektorów ekspresyjnych, kodujących sekwencje antysensownego RNA, które w przeciwieństwie do stanu techniki, dają całkowite hamowanie replikacji HIV-1 i wyraźnie hamują replikację HIV-2 w ludzkich komórkach zmodyfikowanych przy pomocy inżynierii genetycznej. Opisane tu jednostki genetyczne wektorów ekspresyjnych są przeznaczone szczególnie do somatycznej terapii genowej schorzeń HIV/AIDS, ponieważ chronią one komórki krwiotwórcze przed indukowanymi HIV efektami cytopatycznymi. W ten sposób można uniknąć niewydolności immunologicznej u osób zakażonych HIV.In particular, the invention relates to expression vectors encoding antisense RNA sequences which, unlike the prior art, completely inhibit HIV-1 replication and markedly inhibit HIV-2 replication in genetically engineered human cells. The genetic units of the expression vectors described herein are especially intended for somatic gene therapy of HIV / AIDS disorders as they protect hematopoietic cells from HIV induced cytopathic effects. Thus, immune failure in HIV-infected individuals can be avoided.
Namnażanie się wirusa w zakażonej komórce jest sterowane przez geny genomu wirusowego. W tym procesie z wirusowych genów powstają poprzez transkrypcję i translację, produktyReproduction of the virus in an infected cell is controlled by genes of the viral genome. In this process, products are made from viral genes through transcription and translation
175 143 regulatorowe i białka strukturalne do budowy zakaźnych cząstek wirusowych do namnażania się wirusa. Istotnym pośrednikiem w tym procesie jest informacyjny kwas rybonukleinowy (mRNA), który przekazuje informację o budowie białek regulatorowych i strukturalnych.Regulatory and structural proteins to build infectious viral particles for virus multiplication. An important intermediary in this process is the messenger ribonucleic acid (mRNA), which transmits information about the structure of regulatory and structural proteins.
Blokowanie informacyjnego kwasu rybonukleinowego w sposób wysoce swoisty, który opiera się całkowicie na swoistości struktury molekularnej wirusowego mRNA, a mianowicie na swoistej dla wirusa sekwencji zasad nukleinowych tej cząsteczki można uzyskać za pomocą kwasu rybonukleinowego o komplementarnej sekwencji zasad. Przez swoiste dla sekwencji parowanie zasad nukleinowych, jak to opisano dla kwasu dezoksyrybonukleinowego, pierwotnie jednoniciowy mRNA zostaje skompleksowany w RNA dwuniciowy i informacja genetyczna zawarta w sekwencji zasad nukleinowych staje się częściowo niedostępna dla biosyntezy białka. Drugi etap ekspresji genu, translacja, jest tym samym zahamowany. Komplementarny kwas rybonukleinowy określa się jako RNA antysensowny.Blocking of messenger ribonucleic acid in a highly specific manner which relies entirely on the specificity of the molecular structure of the viral mRNA, namely the virus specific nucleobase sequence of this molecule, can be achieved with ribonucleic acid with a complementary base sequence. By sequence-specific nucleobase pairing as described for deoxyribonucleic acid, the primary single-stranded mRNA becomes complexed into double-stranded RNA and the genetic information contained in the nucleobase sequence becomes partially unavailable for protein biosynthesis. The second step in gene expression, translation, is thus inhibited. Complementary ribonucleic acid is referred to as antisense RNA.
Mechanizm hamowania ekspresji genu przez wzajemne oddziaływanie antysensownego RNA z docelowym mRNA jest złożony i w dużym stopniu nie wyjaśniony. Jednym wyjaśnieniem jest hamowanie cięcia i składania RNA i obróbki RNA w jądrze komórkowym, jednak dokładne badania na ten temat nie są znane. Opisana jest wymiana adenozyna - inozyna w dwuniciowym RNA i sugeruje się, że hamowanie translacji jest następstwem tej wymiany. Hamowanie transportu RNA przez błonę jądrową do miejsca biosyntezy białka oraz maskowanie wzajemnego oddziaływania rybosomów i RNA przez dwuniciowy RNA mogą być dalszą przyczyną hamowania ekspresji genów przez antysensowny RNA.The mechanism by which gene expression is inhibited by antisense RNA interacting with target mRNA is complex and largely unclear. One explanation is the inhibition of RNA cleavage and splicing and RNA processing in the cell nucleus, but exact studies are not known. An adenosine-inosine exchange in double-stranded RNA is described and translation inhibition is suggested to be a consequence of this exchange. Inhibition of RNA transport across the nuclear membrane to the protein biosynthesis site and masking the interaction of ribosomes and RNA by double-stranded RNA may be a further cause of antisense RNA inhibition of gene expression.
Opisano hamowanie procesów metabolicznych przez antysensowny RNA w naturalnie występujących układach biologicznych, takich jak bakterie i niektóre eukariotyczne organizmy wielokomórkowe (K.M. Takayamai M. Inouye, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular B iology 25,155 (1990), jak również w otrzymanych sztucznie przez transfer genów organizmach transgenicznych (J. Mol. i in. FEBS Letters 268 (1990)).Inhibition of metabolic processes by antisense RNA in naturally occurring biological systems such as bacteria and some eukaryotic multicellular organisms has been described (KM Takayamai M. Inouye, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular B iology 25,155 (1990), as well as in artificially derived organisms by gene transfer. transgenics (J. Mol. et al. FEBS Letters 268 (1990)).
Donoszono również o próbach wytworzenia opornych na wirus organizmów roślinnych (M.Cuozzo i in., Biotechnology 6,549 (1988) i zwierzęcych (T. Riiden i E. Golboa, J. Virol. 63, 677 (1989)), po wprowadzeniu genu kodującego antysensowny RNA. Jak podają sami autorzy tych publikacji, nie ma jednak przekonujących, naukowo stwierdzonych, zależności między ekspresją antysensownego RNA i opornością na wirus. W szczególności w przypadku plazmidów, które wprowadza się przez mikroiniekcję, warunkujących ekspresję antysensownego RNA z ekspresją przejściową, działanie przeciwwirusowe jest słabe albo nie daje się zdecydowanie ocenić (K. Rittner i in., Nucleic Acids Research 19, 1421 (1991)). Doniesiono także o zastosowaniu wektorów retrowirusowych, warunkujących ekspresję antysensownego RNA, do wytwarzania komórek opornych na wirus (R. Y-L., To i in. w: Gene Regulation: Biology of antisense RNA and DNA, wyd. R.P. Ericskon i J.G. Izant, Raben Press Ltd., New York 1992). Te retrowirusowe wektory niosą ryzyko wywołania złośliwego wzrostu nowotworowego, ponieważ zawierają sekwencje genów podobnych do onkogenów i istnieją liczne dowody na onkogenezę zależną od retrowirusów.Attempts to generate virus-resistant plant organisms (M.Cuozzo et al., Biotechnology 6,549 (1988) and animal organisms (T. Riiden and E. Golboa, J. Virol. 63, 677 (1989)) have also been reported after insertion of the gene encoding However, as the authors of these publications themselves state, there are no convincing, scientifically established relationships between antisense RNA expression and viral resistance, particularly in the case of plasmids introduced by microinjection, conditioning the expression of transiently expressed antisense RNA, antiviral activity is weak or undetectable (K. Rittner et al., Nucleic Acids Research 19, 1421 (1991)). The use of retroviral vectors conditioning antisense RNA expression to produce virus-resistant cells has also been reported (R. YL. , To et al. In: Gene Regulation: Biology of antisense RNA and DNA, RP Ericskon and JG Izant, Raben Press Ltd., New York 1992) These retroviral vectors carry the risk of inducing malignant tumor growth as they contain oncogen-like gene sequences and there is ample evidence of retrovirus-dependent oncogenesis.
W przeciwieństwie do publikowanych prac na temat antysensownego RNA w regulacji replikacji wirusa, w niniejszym wynalazku opisane są konstrukty ekspresyjne, które odznaczają się szczególnym rodzajem konstrukcji promotora w kombinacji ze specjalnie wybranymi regionami wirusowego DNA w orientacji antysensownej, i przez to wykazują działania przeciwwirusowe, które jakościowo i ilościowo są zaskakujące i daleko wykraczają poza dotychczas znany zakres. Kombinacja składników wektora ekspresyjnego: sekwencjaflankująca 5' DNA, promotor, wstawka/antysensowny DNA i 3' - sekwencje sygnałowe obróbki po raz pierwszy dała w zakażeniach retrowirusowych dającą się pewnie oznaczyć i wyraźnie wyrażoną oporność na wirus w transfekowanych komórkach wykazujących ekspresję antysensownego RNA. Natomiast według stanu techniki, z innymi systemami wektorowymi do endogennej ekspresji antysensownego RNA związane są słabe, tylko nieznaczne efekty przeciwwirusowe, pojawiające się przejściowo (na przykład T. Riiden i E. Gilboa, J. Virol., 63, 677 (1989)), opis patentowy EP 252 940, G. Sczakiel i in., Biochem. Biophys. Res. Com. 169, 643 (1990), O.i. Mirosknichenko i in., Gene 84, 83 (1989), T. Shimada i in., Antiviral Chemistry and Chemotherapy 2, (1991), G. Sczakiel i in. J. Virol. 66, 5576 (1992) albo są one obarczone wyżejContrary to published work on antisense RNA in the regulation of viral replication, the present invention describes expression constructs that exhibit a particular type of promoter design in combination with specially selected regions of the viral DNA in antisense orientation, and thus exhibit antiviral activities that qualitatively and quantitatively are surprising and are well beyond the heretofore known range. The combination of the expression vector components: 5 'DNA flanking sequence, promoter, insert / antisense DNA and 3' processing signal sequences for the first time in retroviral infections gave reliable and clearly expressed resistance to virus in transfected cells expressing antisense RNA. In contrast, in the prior art, weak, only slight, transient antiviral effects are associated with other vector systems for endogenous expression of antisense RNA (e.g. T. Riiden and E. Gilboa, J. Virol., 63, 677 (1989)), EP 252 940, G. Sczakiel et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 169, 643 (1990), O.i. Mirosknichenko et al., Gene 84, 83 (1989), T. Shimada et al., Antiviral Chemistry and Chemotherapy 2, (1991), G. Sczakiel et al. J. Virol. 66, 5576 (1992) or included above
1715 143 wspomnianym ryzykiem (transfer genu retrowirusowego), albo są niepraktyczne ponieważ wymagają mikroiniekcji.1715 143 of these risks (retroviral gene transfer), or are impractical because they require microinjection.
Wynalazek dotyczy konstruktów wektora ekspresyjnego do ekspresji antysensownego DNA, które zawierają a) sekwencje silnego konstytutywnego promotora wybranego spośród promotora metalotioneiny i promotora CMV albo sekwencje hybrydowego promotora obejmującego wymienione silne promotory lub jeden z wymienionych silnych promotorów i promotor HIV-1 LTR oraz b)wirusowy DNA w orientacji antysensownej.The invention relates to expression vector constructs for the expression of antisense DNA, which contain a) a strong constitutive promoter sequences selected from the metallothionein promoter and the CMV promoter, or hybrid promoter sequences comprising the said strong promoters or one of the strong promoters mentioned and the HIV-1 LTR promoter and b) viral DNA in antisense orientation.
Są to korzystnie takie konstrukty wektora ekspresyjnego, które zawierają subgenomowe sekwencje genowe patogennego wirusa w orientacji 3' —> 5' (orientacja antysensowna), pod kontrolą promotora ekspresji antysensownego RNA, którego sekwencja zasad nukleinowych jest komplementarna do mRNA patogennego wirusa.They are preferably such expression vector constructs which contain pathogenic virus subgenomic gene sequences in the 3 '-> 5' orientation (antisense orientation) under the control of an antisense RNA expression promoter whose nucleobase sequence is complementary to pathogenic virus mRNA.
Bardzo korzystne są takie konstrukty, które zawierają prowirusowy, subgenomowy DNA w orientacji antysensownej z retrowirusów takich jak HIV-1 albo HIV-2, onkowirusów, takich jak HTLV-I, HTLV-II, albo onkogenów takich jak abl, erb A, erb B, fms, fos, myb, myc, ras, sis, src.Constructs that contain proviral subgenomic DNA in antisense orientation from retroviruses such as HIV-1 or HIV-2, oncoviruses such as HTLV-I, HTLV-II, or oncogenes such as abl, erb A, erb B are very preferred. , fms, fos, myb, wash, ras, sis, src.
Korzystne są konstrukty wektora ekspresyjnego, które zawierają sekwencje promotora lub promotora hybrydowego, oraz prowirusowy DNA HIV-1 w orientacji antysensownej nukleotydów 7514 474, albo 5786 -> 474, albo 2096 474, albo 3925 681, albo 5786 -> 4158, albo 5746 4648, albo 2369 -> 1635, albo 3227 3003, albo 2099 -> 678, albo 3829 2099, albo 4647 ->^1^7, albo 4157 3830.Expression vector constructs that contain promoter or hybrid promoter sequences and HIV-1 proviral DNA in the antisense orientation of nucleotides 7514 474, or 5786 -> 474, or 2096 474, or 3925 681, or 5786 -> 4158, or 5746 4648, are preferred. , or 2369 -> 1635, or 3227 3003, or 2099 -> 678, or 3829 2099, or 4647 -> ^ 1 ^ 7, or 4157 3830.
Korzystne są również konstrukty wektora ekspresyjnego, które zawierają subgenowe, prowirusowe sekwencje genowe albo sekwencje onkogenowe w orientacji 3' —> 5', dla ekspresji krótszych transkryptów antysensownego RNA.Expression vector constructs that contain subgenic proviral gene sequences or oncogenic sequences in the 3 '-> 5' orientation are also preferred for the expression of shorter antisense RNA transcripts.
Korzystne są również takie konstrukty wektora ekspresyjnego, które zawierają prowirusowe sekwencje genowe z HIV-1, nukleotydów 605 155, albo 670 -> 440, albo 825 535, albo 6070 -> 5800, albo 5640 -> 5020, albo 5600 -> 5040, albo 8690 -> 8300, albo 9160 8800.Also preferred are expression vector constructs which contain HIV-1 proviral gene sequences, nucleotides 605 155, or 670 -> 440, or 825 535, or 6070 -> 5800, or 5640 -> 5020, or 5600 -> 5040, or 8690 -> 8300 or 9160 8800.
Korzystne są konstrukty wektora ekspresyjnego, które zawierają dwie, trzy lub więcej sekwencji subgenomowych z jednego wirusa albo z kilku wirusów.Expression vector constructs that contain two, three or more subgenomic sequences from one virus or from several viruses are preferred.
Konstruktem według wynalazku można transfekować komórki. Konstrukty wektorów ekspresyjnych nadają się też do wytwarzania środków leczniczych, w których substancję czynną stanowi jeden lub więcej konstruktów według wynalazku.Cells can be transfected with a construct of the invention. The expression vector constructs are also suitable for the production of medicaments in which the active ingredient is one or more constructs of the invention.
Stosując opisane tu konstrukty wektora ekspresyjnego w odpowiednich ludzkich komórkach gospodarza wykazano działanie przeciwwirusowe w stosunku do replikacji HIV-1, które zapewniało całkowitą ochronę przed replikacją HIV-1 w komórkach ludzkich przez ponad 60 dni, a prócz tego w sposób istotny hamowało replikację HIV-2.Using the expression vector constructs described herein in appropriate human host cells, an antiviral activity against HIV-1 replication was demonstrated, which provided complete protection against HIV-1 replication in human cells for more than 60 days and significantly inhibited HIV-2 replication. .
Konstrukty wektora ekspresyjnego według wynalazku wytwarzają w transfekowanych komórkach jako transkrypt informacyjny kwas rybonukleinowy, który jest komplementarny do sekwencji mRNA niepożądanych genów wirusowych, na przykład genów gAg, POL, VIF, REV, TAT i VPU ludzkiego wirusa niedoboru odporności, HIV-1 (W.A. Haseltine i in., Scientific American USA, 1988, 34 do 42). Ponadto opisana sekwencja antysensownego RNA jest wystarczająco homologiczna wobec HIV-2 (na przykład izolatu HIV-2 D194, w: Human retroviruses and AIDS, wyd. Myers i in., Los Alamos National Lab., 1992, oraz EMBL nr depozytu X52223) w zakresie genów GAG, POL i VIF, aby wywierać działanie przeciwwirusowe także na izolaty HIV-2. Konstrukty wektora ekspresyjnego według wynalazku wyróżniają się szczególnym rodzajem uszeregowania wybranych sekwencji promotora i sekwencji promotora hybrydowego (na przykład CMV-IE/metalotioneina I), z subgenowymi fragmentami DNA HIV-1 w orientacji antysensownej (3' — 5'), co daje w wyniku kilku transkryptów, antysensownych RNA, przez konstytutywne lub indukowane cięcie i łączenie RNA. Tak utworzone transkrypty antysensownego RNA wykazują nieoczekiwanie drastyczne albo całkowite hamowanie replikacji HIV-1 w komórkach ludzkich (HUT 78, U 937, naprzykład). Stwierdzono także wyraźne hamowanie replikacji HIV-2. HIV-2 wykazuje w opisywanych tu konstruktach wektora ekspresyjnego wystarczającą homologię sekwencji RNA, tak że dochodzi do hamowania replikacji wirusa przez antysensowny RNA. Stosując zatem konstrukty według wynalazku hamuje się replikację retrowirusów, np. HIV-1 i HIV-2, chroniąc w ten sposób komórki krwiotwórcze - a więc ważne komórki ludzkiej komórkowej reakcji odpornościowej (np. limfocyty T,The expression vector constructs of the invention produce in the transfected cells as a messenger transcript ribonucleic acid that is complementary to the mRNA sequence of unwanted viral genes, for example the gAg, POL, VIF, REV, TAT and VPU genes of the human immunodeficiency virus, HIV-1 (WA Haseltine et al. Scientific American USA, 1988, 34 to 42). In addition, the described antisense RNA sequence is sufficiently homologous to HIV-2 (e.g., HIV-2 isolate D194, in Human retroviruses and AIDS, Myers et al., Los Alamos National Lab., 1992, and EMBL Deposit No. X52223) in range of the GAG, POL and VIF genes to exert antiviral activity also on HIV-2 isolates. The expression vector constructs according to the invention are distinguished by a particular arrangement of selected promoter sequences and hybrid promoter sequences (e.g. CMV-IE / metallothionein I), with HIV-1 subgenic DNA fragments in antisense (3 '- 5') orientation, resulting in of several transcripts, antisense RNA, by constitutive or induced cleavage and RNA splicing. The antisense RNA transcripts so formed show surprisingly drastic or complete inhibition of HIV-1 replication in human cells (HUT 78, U 937, for example). There was also a clear inhibition of HIV-2 replication. HIV-2 exhibits sufficient RNA sequence homology in the expression vector constructs described herein such that antisense RNA inhibits viral replication. Thus, using the constructs according to the invention, the replication of retroviruses, e.g. HIV-1 and HIV-2, is inhibited, thus protecting the hematopoietic cells - and therefore important cells of the human cellular immune response (e.g. T cells,
175 143 monocyty) - przed szkodliwym i niszczącym komórki namnażaniem się wirusa, przez określony sposób ekspresji działającego przeciwwirusowo antysensownego RNA.175 143 monocytes) - against the harmful and cell-damaging multiplication of the virus, by a specific expression of antiviral antisense RNA.
Następująca procedura eksperymentalna została przeprowadzona w celu nadania komórkom układu odpornościowego oporności na uszkadzające działanie namnażania się retrowirusów, znane z zakażenia HIV-1 i HIV-2, za pomocą ekspresji przeciwwirusowego antysensownego RNA.The following experimental procedure was performed to render immune cells resistant to the damaging proliferative effects of retroviruses known to infect HIV-1 and HIV-2 by expression of antiviral antisense RNA.
Promotory:Promoters:
Skonstruowano wektory ekspresyjne, zawierające promotory, które w komórkach krwiotwórczych powinny zapewniać konstytutywną i wydajną ekspresję, jak na przykład promotor IE wirusa cytomegalii (CMVEE). Ponadto, skonstruowano także przez fuzję sekwencji kwasów nukleinowych, takie promotory, które przy inwazji wirusa powinny dodatkowo indukować amplifikowaną ekspresję. W szczególności składnikiem tych promotorów hybrydowych jest fragment promotora CMV-IE-metalotioneiny oraz fragment kwasu nukleinowego HTV-1 LTR od nukleotydów 289 do 474 albo 289 do 532 (numeracja nukleotydów: UWGCG GENEMBL Data Bank, File: HIVHXB2CG. VIRAL 25 września 1987), który przyczynia się do amplifikowanej, ewentualnie dającej się transaktywować, dodatkowej aktywności promotora.Expression vectors were constructed containing promoters which should provide constitutive and efficient expression in hematopoietic cells, such as the cytomegalovirus IE promoter (CMVEE). In addition, promoters were also constructed by fusing nucleic acid sequences, which should additionally induce amplified expression in the case of viral invasion. In particular, a component of these hybrid promoters is the CMV-IE-metallothionein promoter fragment and the HTV-1 LTR nucleic acid fragment from nucleotides 289 to 474 or 289 to 532 (nucleotide numbering: UWGCG GENEMBL Data Bank, File: HIVHXB2CG. VIRAL September 25, 1987), which contributes to the amplified, possibly transactivable, additional promoter activity.
Fragmenty antysensownego kwasu nukleinowego.Antisense nucleic acid fragments.
Dodatkowo konstrukty wektorów zawierają, pod kontrolą opisanych promotorów, subgenomowe prowirusowe fragmenty DNA w orientacji antysensownej, to znaczy nić (+) DNA ulega transkrypcji w kierunku 3' — 5'.Additionally, the vector constructs contain, under the control of the described promoters, subgenomic proviral DNA fragments in antisense orientation, i.e. the (+) strand of DNA is transcribed in the 3 '- 5' direction.
Ze względu na bezpieczeństwo nie stosuje się kompletnego prowirusowego genomowego fragmentu DNA retrowirusa. Stosuje się jednak raczej dłuższe, subgenomowe prowirusowe fragmenty DNA, a nie krótkie, subgenowe prowirusowe fragmenty DNA, głównie ponieważ większe jest prawdopodobieństwo cięcia i składania RNA w dłuższych transkryptach RNA i w ten sposób z prowirusowych fragmentów DNA można oczekiwać większej liczby transkryptów antysensownego RNA, zgodnie z wynalazkiem, co w wymienionych przykładach rzeczywiście stwierdzono. (Rodzaj i liczba transkryptów antysensownego mRNA po całkowitej obróbce, których można oczekiwać dla zastosowanych sekwencji HIV w orientacji antysensownej jest nie do przewidzenia, ponieważ nie ma wystarczająco zgodnych sekwencji do składania mRNA, które pozwoliłyby na zdecydowane przewidywanie).For safety reasons, the complete proviral genomic DNA fragment of the retrovirus is not used. However, longer subgenomic proviral DNA fragments are used rather than short subgenic proviral DNA fragments, mainly because longer RNA transcripts are more likely to be cleaved and spliced and thus more antisense RNA transcripts can be expected from proviral DNA fragments, according to invention, as actually found in the examples mentioned. (The type and number of fully processed antisense mRNA transcripts that can be expected for the HIV sequences used in antisense orientation is unpredictable as there are not enough consensus sequences for mRNA splicing to allow for robust prediction).
Wraz ze wzrastającą liczbą transkryptów antysensownego RNA, z przynależnymi im cechami, jak na przykład eksport z jądra albo stabilność w cytoplazmie, wzrasta również prawdopodobieństwo wytworzenia transkryptu antysensownego RNA o silnym działaniu przeciwwirusowym.As the number of antisense RNA transcripts increases, with traits associated with them, such as nuclear export or cytoplasmic stability, the likelihood of producing an antisense RNA transcript with potent antiviral activity also increases.
Wynalazek dotyczy konstruktów wektora ekspresyjnego, które zawierają sfuzowany fragment genu ulegającego transkrypcji do antysensownego RNA pod kontrolą silnego promotora. Sfuzowany fragment genu składa się z subgenomowych fragmentów DNA z dwu lub kilku różnych patogennych wirusów, na przykład HIV-1 i HIV-2. Stosując takie sfuzowane fragmenty genowe, które kodują transkrypt RnA zawierający kolejno kilka regionów sekwencji antysensownego RNA komplementarnych do regionów sekwencji mRNA z różnych wirusów, można skonstruować wektory ekspresyjne o szerszym działaniu przeciwwirusowym.The invention relates to expression vector constructs that contain a fused gene fragment that is transcribed into an antisense RNA under the control of a strong promoter. The fused gene fragment consists of subgenomic DNA fragments from two or more different pathogenic viruses, for example HIV-1 and HIV-2. By using such fused gene fragments that encode an RnA transcript containing sequentially several regions of antisense RNA sequence complementary to mRNA sequence regions from different viruses, expression vectors with broader antiviral activity can be constructed.
Słuszność tej zasady potwierdzają przykłady I, IV, V, X i XII. Na przykład konstrukty wektora ekspresyjnego KTX 11, pSXK1 i pSXK2 zawierają fragmenty antysensowego DNA z HIV-1 LAV/BRU, które ze swej strony zawierają krótsze odcinki, które są także komplementarne do mRNA z HIV-2 D194 (naprzykład nukleotydy 620-660 albo 837-899, albo 4868-5044).The validity of this principle is confirmed by Examples I, IV, V, X and XII. For example, the constructs of the expression vector KTX 11, pSXK1 and pSXK2 contain HIV-1 LAV / BRU antisense DNA fragments, which in turn contain shorter stretches that are also complementary to HIV-2 D194 mRNA (e.g. nucleotides 620-660 or 837 -899 or 4868-5044).
W ten sposób antysensowny RNA z KTX11, pSXK1 i pSXK2 jest przeciwwirusowy także wobec HIV-2.Thus, the antisense RNA from KTX11, pSXK1 and pSXK2 is antiviral also against HIV-2.
Można teraz kodującą antysensowny RNA sekwencję tych wektorów dodatkowo poddać fuzji z fragmentami prowirusowego DNA z innych wirusów w orientacji antysensownej (na przykład izolaty HIV-2, inne izolaty HIV-1) tak, że w wyniku segmentowo zoptymalizowanej komplementarności antysensownego RNA do sekwencji innych wirusów, można osiągnąć równocześnie lepsze lub całkowite hamowanie różnych wirusów jednym konstruktem wektora ekspresyjnego.The antisense RNA coding sequence of these vectors can now be additionally fused with proviral DNA fragments from other viruses in antisense orientation (e.g. HIV-2 isolates, other HIV-1 isolates) such that as a result of segmentally optimized complementarity of the antisense RNA to the sequences of other viruses, better or complete inhibition of different viruses can be achieved simultaneously with one expression vector construct.
17-514317-5143
Terminację transkryptów antysensownego RNA uzyskuje się przy pomocy sygnału poliadenylacji (na przykład z SV 40 albo z bydlęcego hormonu wzrostu), a celu wygenerowania wysoce stabilnego mRNA. Ponadto wektory zawierają pełny operon dla ekspresji odpowiedniego markera selekcyjnego. W przytoczonych przykładach wykorzystano oporność na antybiotyki TNR 5 neo (neomycyna, genetycyna, G 418, kanamycyna) w celu wyselekcj onowania komórek, które po transfekcji zawierają konstrukt genetyczny dla ekspresji antysensownego DNA.Termination of antisense RNA transcripts is achieved with a polyadenylation signal (e.g. from SV 40 or bovine growth hormone) to generate a highly stable mRNA. Furthermore, the vectors contain a complete operon for the expression of an appropriate selectable marker. In these examples, resistance to the neo TNR antibiotics (neomycin, geneticin, G 418, kanamycin) was used to select cells which, after transfection, contain a genetic construct for expression of antisense DNA.
Ten marker selekcyjny okazał się przydatny dla ludzkich komórek krwiotwórczych. Można było zastosować także inne markery selekcyjne, jak na przykład puromycynę albo higromycynę albo metotreksat, w połączeniu z transfekcją genu dla reduktazy dihydrofolianowej.This selectable marker has proven useful for human hematopoietic cells. Other selectable markers, such as for example puromycin or hygromycin or methotrexate, could also be used in conjunction with the transfection of the gene for dihydrofolate reductase.
Szczególnie przydatne jako antysensowne sekwencje nukleotydowe są sekwencje z regionu POL/VIF genu HIV, między nukleotydami 2100-5800. Zwłaszcza antysensowne sekwencje nukleotydów 5786-4158 wykazały wyróżniającą się aktywność przeciwwirusową. Można również stosować inne fragmenty z tego regionu, na przykład 5746 -> 4648 albo 4647 -> 4157, albo 5880 -> 3880, albo 5850 -> 4158, albo 5150 -> 3200.Particularly useful as antisense nucleotide sequences are sequences from the POL / VIF region of the HIV gene between nucleotides 2100-5800. Especially the antisense sequences of nucleotides 5786-4158 showed outstanding antiviral activity. Other fragments from this region can also be used, for example 5746-> 4648 or 4647-> 4157, or 5880-> 3880, or 5850-> 4158, or 5150-> 3200.
W celu wykazania działania przeciwwirusowego antysensownego RNA, na przykład przeciw HIV-1 linie komórek ludzkich, które mogą być zakażone HIV-1, transfekowano wyżej wspomnianymi konstruktami wektora ekspresyjnego. Celem było wykazanie na szeregu typów ludzkich komórek krwiotwórczych, że endogenna ekspresja antysensownego RNA prowadzi do zahamowania replikacji wirusa w komórkach, które biorą szczególny udział w komórkowej reakcji immunologicznej. To niszczenie komórek układu odpornościowego w końcowej fazie choroby AIDS pozostaje w związku przyczynowym ze zwiększoną częstością zakażeń oportunistycznych, które wtedy mają często przebieg śmiertelny. Dlatego celem prac z komórkami krwiotwórczymi a najpierw ciągłymi liniami komórkowymi, jak na przykład HUT 78, MOLT 4, U 937, Jurkat, CEM-CM3 (wszystkie według American Type Culture Collection ATCC, Bethesda, Maryland, USA) po transfekcji wektorem, klonowaniu i genetycznym scharakteryzowaniu, w doświadczeniach nad zakażeniem odpowiednimi izolatami HTV-1 i HIV-2 było zbadanie oporności na wirus tych transfekowanych linii komórkowych.In order to demonstrate the antiviral activity of the antisense RNA, for example against HIV-1, human cell lines which could be infected with HIV-1 were transfected with the above-mentioned expression vector constructs. The aim was to demonstrate on a wide variety of human hematopoietic cells that endogenous expression of antisense RNA leads to inhibition of viral replication in cells that are specifically involved in the cellular immune response. This destruction of immune cells in the end stage of AIDS is causally linked to the increased incidence of opportunistic infections, which are then often fatal. Therefore, the aim of work with hematopoietic cells and first continuous cell lines, such as HUT 78, MOLT 4, U 937, Jurkat, CEM-CM3 (all according to the American Type Culture Collection ATCC, Bethesda, Maryland, USA) after vector transfection, cloning and In genetic characterization, in infection experiments with the appropriate HTV-1 and HIV-2 isolates, the virus resistance of these transfected cell lines was tested.
Wykazana ekspresja działającego przecwiwirusowo antysensownego RNA w tych komórkach wskazuje na użyteczność konstruktów ekspresyjnych w komórkach krwiotwórczych i w końcu także na ich zastosowanie do transformacji komórek tkanki krwiotwórczej szpiku kostnego dla celów terapeutycznych. Włączenie genów do limfocytów krwi obwodowej i komórek szpiku w celach leczniczych zostało opisane w innym miejscu (K.W. Culver i in., Transplant Proc. 23,170-177 (1991) i w zasadzie powinno być możliwe do zastosowania w odniesieniu do wymienionych tu konstruktów do ekspresji antysensownego RNA.The demonstrated expression of antiviral-active antisense RNA in these cells indicates the utility of the expression constructs in hematopoietic cells and ultimately also their use in transforming bone marrow hematopoietic tissue cells for therapeutic purposes. The integration of genes into peripheral blood lymphocytes and bone marrow cells for therapeutic purposes has been described elsewhere (KW Culver et al., Transplant Proc. 23, 170-177 (1991), and should in principle be applicable to the antisense RNA expression constructs mentioned herein. .
Przykład I. Konstrukt wektora ekspresyjnego KTX 11. (Jeśli nie podano inaczej, cała numeracja nukleotydów odnosi się poniżej do sekwencji wirusa ludzkiego niedoboru odporności typu 1 (HXB2), WUGCG, GENENBLData Bank, file: HTVHXB2CG VIRAL, od 25 września 1987).Example I. KTX 11 expression vector construct. (All nucleotide numbering below refers to the human immunodeficiency virus type 1 (HXB2) sequence, WUGCG, GENENBLData Bank, file: HTVHXB2CG VIRAL, from September 25, 1987, unless otherwise indicated).
W celu endogennej ekspresji działającego przeciwwirusowo antysensownego RNA po transfekcji komórek, które mogą ulec zakażeniu HTV-1, skonstruowano następujący wektor ekspresji.The following expression vector was constructed for the endogenous expression of an antiviral-functional antisense RNA after transfecting cells that could be infected with HTV-1.
Mysi promotor metalotioneiny I (1600 par zasad EcoRI Bgl II fragment (N. Glanville i in., Nature 292,267-269 (1982)) zligowano w miejscu cięcia Sal I (nukleotydów 5786) regionem 3' prowirusowej sekwencji DNA HIV-1 po ligacji z adaptorowym RNF Bgl Ii-Xho I, uzyskując w efekcie modyfikację miejsc cięcia Bgl Π, Xho I i Sal I.The mouse metallothionein I promoter (1600 bp EcoRI Bgl II fragment (N. Glanville et al., Nature 292, 267-269 (1982)) was ligated at the Sal I cleavage site (nucleotide 5786) with the 3 'region of the HIV-1 proviral DNA sequence when ligated to adapter RNF Bgl Ii-Xho I, resulting in modification of the Bgl Π, Xho I and Sal I cleavage sites.
Region 5' prowirusowego DNA HIV-1 w miejscu cięcia Bgl II (nukleotyd 474) poddano ligacji z miejscem cięcia Bam HI, do którego przyłączona jest sekwencja sygnału poliadenylacji SV 40 (nukleotydy 2564 do 4713 z delecją sekwencji z UWGCG GenEMBL file Sv 40xX). Tę samą sekwencję poliadenylacji z SV 40 zastosowano w kierunku 3' — 5' dla terminacji TRN5NEO (marker selekcyjny neomycyna (fosfotransacetylaza), nukleotydy 1-1286 TRN5NEO BACTERIA, UW GCG GenEMBL). Ekspresja genu oporności na neomycynę jest inicjowana przez wczesny promotor SV 40 (nukleotydy 5171-371), UWGCG GenEMBL SV 40XX). W innym przypadku wektor zawiera także pBR 322 DNA (nukleotydy 2067-4363, WUGCG, GenEMBL File PBR 322) pochodzenia bakteryjnego oraz gen oporności na ampi175 143 cylinę, aby można było go użyć jako wektor wahadłowy (Shuttle) dla E. coli i komórek zwierzęcych. Mapa genowa tego wektora KTX 11 jest przedstawiona na fig. 1.The 5 'region of HIV-1 proviral DNA at the Bgl II cleavage site (nucleotide 474) was ligated to a Bam HI cleavage site to which an SV 40 polyadenylation signal sequence (nucleotides 2564 to 4713 with a sequence deletion from UWGCG GenEMBL file Sv 40xX) was attached. The same polyadenylation sequence from SV 40 was used in the 3 '- 5' direction for TRN5NEO termination (neomycin selection marker (phosphotransacetylase), nucleotides 1-1286 TRN5NEO BACTERIA, UW GCG GenEMBL). Expression of the neomycin resistance gene is initiated by the SV 40 early promoter (nucleotides 5171-371), UWGCG GenEMBL SV 40XX). In another case, the vector also contains pBR 322 DNA (nucleotides 2067-4363, WUGCG, GenEMBL File PBR 322) of bacterial origin and an ampi175 143cillin resistance gene to be used as a shuttle vector for E. coli and animal cells. . The gene map of this KTX 11 vector is shown in Figure 1.
Przykład II. Konstrukt wektora ekspresyjnego KTX 12.Example II. KTX 12 expression vector construct.
Wektor ekspresyjny KTX 12 antysensownego RNA HIV-1 jest skonstruowany tak samo jak wektor KTX 11 (przykład I). Zawiera on jednak podlegający indukcji promotor hybrydowy, a nić matrycy DNA HIV-1 rozciąga się w orientacji 3' — 5' poza ten promotor hybrydowy, od nukleotydów 7514 — 474.The KTX 12 expression vector of HIV-1 antisense RNA is constructed in the same way as the KTX 11 vector (Example I). However, it contains an inducible hybrid promoter and the strand of the HIV-1 template DNA extends in a 3 '- 5' orientation beyond this hybrid promoter, from nucleotides 7514 - 474.
Dla otrzymania promotora hybrydowego, fragment promotora LTR HIV-1, nukleotydy 289 do 532, poddano fuzji z nukleotydem 368 promotora metalotioneiny (UW GCG File MYSMETI.RO). Mapa restrykcyjna tego wektora KTX 12 jest przedstawiona na fig. 2.To obtain a hybrid promoter, the HIV-1 LTR promoter fragment, nucleotides 289 to 532, was fused to nucleotide 368 of the metallothionein promoter (UW GCG File MYSMETI.RO). The restriction map of this KTX 12 vector is shown in Figure 2.
Przykład III. Konstrukt wektora ekspresyjnego KTX 15.Example III. KTX 15 expression vector construct.
Wektor ekspresyjny KTX 15 antysensownego RNA HIV-1 jest skonstruowany podobnie jak wektor KTX 12 (przykład II). Jednakże fragment DNA nici matrycy HIV-1 (w orientacji 3' - 5') jest istotnie skrócony i rozciąga się od nukleotydu 2096 do nukleotydu 474, obejmując tym samym sekwencję GAG, sekwencję lidera, sekwencję U5 oraz część sekwencji R. Dalszą ważną cechą wektora KTX jest delecja sekwencji TAR, z delecją nukleotydów 474-532 promotora hybrydowego HTV-jLTR. W ten sposób powinna nadal być możliwa aktywacja promotora hybrydowego w przypadku zakażenia HIV, ale bez obecności białka TAT HIV-1 nie powinna zachodzić terminacja transkrypcji, kodowanej przez TAR (S.Y. Kao i in., Nature 330, 489 (1987)). Ten promotor hybrydowy odznacza się zatem szczególnie wysoką konstytutywną transkrypcją pod kontrolą sekwencji promotora LTR HIV-1. Mapa restrykcyjna wektora KTX 15 jest przedstawiona na fig. 3.The KTX 15 expression vector of HIV-1 antisense RNA is constructed similar to the KTX 12 vector (Example II). However, the DNA fragment of the HIV-1 template strand (in the 3 '- 5' orientation) is significantly shortened and extends from nucleotide 2096 to nucleotide 474, thus including the GAG sequence, leader sequence, U5 sequence and part of the R sequence. A further important feature of the vector KTX is a deletion of the TAR sequence, with the deletion of nucleotides 474-532 of the HTV-jLTR hybrid promoter. In this way, it should still be possible to activate the hybrid promoter in case of HIV infection, but in the absence of the HIV-1 TAT protein, transcription termination, encoded by the TAR, should not occur (S.Y. Kao et al., Nature 330, 489 (1987)). This hybrid promoter is thus characterized by particularly high constitutive transcription under the control of the HIV-1 LTR promoter sequence. The restriction map of the KTX 15 vector is shown in Figure 3.
PrzykładIV. Wektor ekspresyjny PSXK 1 antysensownego RNA HIV -1 przygotowano celem wykazania ekspresji antysensownego RNA pod kontrolą innego silnego promotora warunkującego wydajną i konstytutywną ekspresją, w tym przykładzie promotora wirusa cytomegalii. Fragment genu HIV-1, nukleotydy 681-3825, wprowadzono w orientacji 3' — 5', do miejsca restrykcji Hind III przy nukleotydzie 891 (wektor pRc/CMV, numer katalogu V 750-20, Invitrogen, San Diego CA 92121, USA). Sygnał poliadenylacji pochodzi z genu bydlęcego hormonu wzrostu (BGH).Example IV. The PSXK 1 expression vector of HIV-1 antisense RNA was prepared to demonstrate the expression of the antisense RNA under the control of another strong promoter for efficient and constitutive expression, in this example the cytomegalovirus promoter. The HIV-1 gene fragment, nucleotides 681-3825, was inserted in the 3 '- 5' orientation into the Hind III restriction site at nucleotide 891 (pRc / CMV vector, catalog number V 750-20, Invitrogen, San Diego CA 92121, USA) . The polyadenylation signal comes from the bovine growth hormone (BGH) gene.
W innym przypadku wektor jest skonstruowany jako wektor wahadłowy, w ten sposób jak wektor KTX 11 (przykład I) z neomycynowym markerem selekcji i fragmentem DNA pBR322 dla replikacji i selekcji w E.coli. Mapa restrykcyjna wektora pSXK 1 jest przedstawiona na fig. 4.In another instance, the vector is constructed as a shuttle vector, such as the KTX 11 vector (Example I) with a neomycin selectable marker and a pBR322 DNA fragment for replication and selection in E.coli. The restriction map of the pSXK 1 vector is shown in Figure 4.
Przykład V. Konstrukt wektora ekspresyjnego pSXK 2.Example 5. Construct of the expression vector pSXK 2.
Wektor ekspresyjny pSXK 2 antysensownego RNA HIV-1 różni się od wektora pSXK 1 (przykład IV) tym, że posiada sekwencje promotora zawierające nukleotydy 209-865 promotora CMV (patrz przykład IV) sfuzowane z nukleotydami 150-369 promotora metalotiotioneiny (UWgCg GenEMBL file MUSMETI.RO), a więc jest promotorem hybrydowym. Ponadto, prowirusową sekwencję DNA nukleotydów 4158-5786 wstawiono w orientacji 3' — 5' jako matrycę dlaekspresji antysensownego RNA, pod kontrolą promotora hybrydowego CMV/metalotioneina. Mapa restrykcyjna wektora pSXK 2 jest przedstawiona na fig. 5.The pSXK 2 expression vector of the HIV-1 antisense RNA differs from the pSXK 1 vector (Example IV) in that it has promoter sequences containing nucleotides 209-865 of the CMV promoter (see Example IV) fused to nucleotides 150-369 of the metallothiotionein promoter (UWgCg GenEMBL file MUSMETI .RO) and is therefore a hybrid promoter. In addition, the proviral DNA sequence of nucleotides 4158-5786 was inserted in the 3 '- 5' orientation as template for antisense RNA expression, under the control of the CMV / metallothionein hybrid promoter. The restriction map of the pSXK 2 vector is shown in Figure 5.
Przykład VI. Konstrukty wektorów ekspresyjnych pHTT 1, 4, 6, 10, 12 i 15.Example VI. Expression vector constructs pHTT 1, 4, 6, 10, 12 and 15.
Wektory ekspresyjne pHTT 1,4, 6,9,10,12 i 15 antysensownego RNA HIV-1 przygotowano w sposób podobny jak wektor pSXK 1 (przykład IV, fig. 4). Wszystkie fragmenty genowe HIV-1 wstawione do wektorów pHTT klonowano w orientacji 3' — 5' do wektora pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA 92121, nr katalogu V 750-20, 1991), pod kontrolą promotora cytomegalowirusa warunkującego konstytutywną ekspresję. Wektory pHTT są podane niżej:The expression vectors pHTT 1,4,6,9,10,12 and the HIV-1 antisense RNA were prepared in a similar manner to the vector pSXK 1 (Example IV, Fig. 4). All HIV-1 gene fragments inserted into pHTT vectors were cloned in the 3 '- 5' orientation into the pRc / CMV vector (Invitrogen, San Diego, CA 92121, catalog number V 750-20, 1991), under the control of the cytomegalovirus promoter necessary for constitutive expression. The pHTT vectors are given below:
(a) pHTT 1: fragment genu HIV-1 (nukleotydy 4648-5746) wbudowano do miejsca cięcia Not I (nukleotyd 966) wektora pRc/CMV.(a) pHTT 1: the HIV-1 gene fragment (nucleotides 4648-5746) was inserted into the Not I cleavage site (nucleotide 966) of the pRc / CMV vector.
(b) pHTT 4: fragment genu HIV-1 (nukleotydy 1635-2639) wbudowano do miejsca cięcia Xba I (nukleotyd 985) wektora pRc/CMV.(b) pHTT 4: the HIV-1 gene fragment (nucleotides 1635-2639) was inserted into the Xba I cleavage site (nucleotide 985) of the pRc / CMV vector.
(c) pHTT 6: fragment genu HIV-1 (nukleotydy 3003-3227) wbudowano do miejsca cięcia(c) pHTT 6: the HIV-1 gene fragment (nucleotides 3003-3227) was inserted into the cleavage site
Xba I jak opisano pod (b). , (d) pHTT 9: fragment genu HIV-1 (nukleotydy 678-2099) wbudowano do miejsca cięcia Xba I jak opisano pod (b).Xba I as described in (b). , (d) pHTT 9: the HIV-1 gene fragment (nucleotides 678-2099) was inserted into an Xba I cleavage site as described under (b).
175 143 (e) pHTT 10: fragment genu HIV-1 (nukleotydy 2099-3829) wbudowano do miejsca cięcia Xba I jak opisano pod (b).(E) pHTT 10: the HIV-1 gene fragment (nucleotides 2099-3829) was inserted into an Xba I cleavage site as described under (b).
(f) pHTT 12: fragment genu HIV-1 (nukleotydy 4157-4647) wbudowano do miejsca cięcia Xba I jak opisano pod (b).(f) pHTT 12: the HIV-1 gene fragment (nucleotides 4157-4647) was inserted into an Xba I cleavage site as described under (b).
(g) pHTT 15: fragment genu HTV-1 (nukleotydy 3830-4157) wbudowano do miejsca cięcia Xba I jak opisano pod (b).(g) pHTT 15: the HTV-1 gene fragment (nucleotides 3830-4157) was inserted into an Xba I cleavage site as described under (b).
Ogólny wykres fragmentów genowych HIV-1, które są wprowadzone w orientacji antysensownej 3' — 5' w wektorach z przykładów I do VI jest przedstawiony na fig. 6.A general diagram of the HIV-1 gene fragments that are inserted in the 3 '- 5' antisense orientation in the vectors of Examples I to VI is provided in Figure 6.
Przykład VII. Transfekcja i klonowanie limfocytów ludzkich wektorami dla ekspresji antysensownego RNA.Example VII. Transfection and cloning of human lymphocytes with vectors for antisense RNA expression.
Jako przykłady transfekowanych linii ludzkich komórek krwiotwórczych, które wykazują oporność na wirus w wyniku endogennej ekspresji antysensownego RNA przeciw HIV-1, wybrano rosnącą w zawiesinie monocytopodobną linię komórkową U 937 oraz tak samo rosnącą linię T limfocytów HUT 78. Obie linie komórkowe otrzymano z American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852-1776, USA.As examples of transfected human hematopoietic cell lines that show resistance to the virus by endogenous expression of anti-HIV-1 antisense RNA, the suspension growing monocytic cell line U 937 and the same growing T lymphocyte line HUT 78 were selected. Both cell lines were obtained from American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852-1776, USA.
Linie komórkowe hodowano w pożywce zalecanej przez ATCC. Transfekcję wektorem przeprowadzono różnymi sposobami, przy czym najlepsze wyniki dała elektroporacja:Cell lines were grown in the medium recommended by the ATCC. Vector transfection was carried out in various ways, with the best results being obtained by electroporation:
1. Metoda z fosforanem wapnia:1. Calcium phosphate method:
Modyfikacja metody Wiglera i in., 1977, Cell 11, 223.Modification of the method of Wigler et al., 1977, Cell 11, 223.
Transfekcję przeprowadza się precypitatami wapniowymi DNA. Różne ilości DNA od 0,05 do 20 gg rozpuszczono w 0,25 ml w 250 mM CaCl2i wolno wkroplono do 0,25 ml buforu HEPES X 2. Transfekcję otrzymano dodając całą mieszaninę precypitatu do 10 ml hodowli komórkowej. 15 godzin później usunięto podłoże przed odessanie. Komórki poddano szokowi DMSO. Na 10 ml hodowli dodano 3 ml 25% roztworu DMSO w jałowym PBS. Po 4 minutach odessano płyn a komórki przemyto 5 ml PBS. Następnie komórki zawieszono w 10 ml pożywki DMEM.Transfection is performed with DNA calcium precipitates. Various amounts of DNA from 0.05 to 20 gg were dissolved in 0.25 ml in 250 mM CaCl 2 and slowly added dropwise to 0.25 ml of HEPES X2 buffer. Transfection was obtained by adding the entire precipitate mixture to 10 ml of cell culture. 15 hours later, the substrate was removed prior to aspiration. Cells were shocked with DMSO. 3 ml of 25% DMSO solution in sterile PBS were added per 10 ml of culture. After 4 minutes, the fluid was aspirated and the cells were washed with 5 ml PBS. The cells were then resuspended in 10 ml of DMEM medium.
2. DEAE dekstran2. DEAE dextran
Dzień przed transfekcją sporządzono zawiesinę komórek o gęstości 3-4 x 105 na ml pożywki wzrostowej. 2-4 godziny przed transfekcją komórki odwirowano i zawieszono w świeżej porcji pożywki. 0,5 do 20 gg DNA zmieszano z 1070 gl PBD i dodano 120 gg roztworu DEAE (roztwór transfekcyjny). Przed transfekcją odwirowano 40 ml zawiesiny komórek, zawieszono je w 10 ml PBS i ponownie wirowano.The day before transfection, cells were suspended at a density of 3-4 x 10 5 per ml of growth medium. 2-4 hours before transfection, cells were centrifuged and resuspended in a fresh aliquot of medium. 0.5 to 20 g of DNA was mixed with 1070 g of PBD and 120 g of DEAE solution (transfection solution) was added. Before transfection, 40 ml of cell suspension was centrifuged, resuspended in 10 ml PBS and centrifuged again.
Osad komórek zawieszono w roztworze pBS-DEAE dekstran i inkubowano 30 minut. Następnie komórki poddano szokowi przez dodanie 0,8 ml zimnego roztworu DMSO (25% TBS). Po 3 minutach dodano 10 ml TBS i wirowano. Komórki przemyto pożywką wzrostową RPMI i zawieszono w 40 ml tej pożywkiThe cell pellet was suspended in pBS-DEAE dextran solution and incubated for 30 minutes. The cells were then shocked by adding 0.8 ml of cold DMSO solution (25% TBS). After 3 minutes, 10 ml TBS was added and centrifuged. The cells were washed with RPMI growth medium and resuspended in 40 ml of this medium
3. Fuzja (metoda Sanari-Goldin)3. Fusion (Sanari-Goldin method)
Rosnące wykładniczo komórki (1 x 107/ml) odwirowano i raz przemyto pożywką RPMI. Do osadu komórek dodano 2 ml zawiesiny protoplastów E.coli (2 x 103/ml) w 10% sacharozie w 10 mM MgCl2. Protoplasty z transfekującym plazmidem wytworzono według Sanari-Goldin i in., Po 8 minutach inkubacji wirowano i ostrożnie w ciągu 2 minut dodano roztwór PEG (glikol polietylenowy 4000, 45% roztwór w RPMI). Po 1 minucie inkubacji w ciągu 7 minut dodano 10 ml pożywki RPMI bez FCS. Komórki odwirowano, przemyto pożywką RPMI i zawieszono w 10 ml.Exponentially growing cells (1 x 10 7 / ml) were centrifuged and washed once with RPMI medium. 2 ml of a suspension of E. coli protoplasts (2 x 10 3 / ml) in 10% sucrose in 10 mM MgCl 2 was added to the cell pellet. Protoplasts with transfecting plasmid were prepared according to Sanari-Goldin et al. After 8 minutes of incubation, centrifugation was carried out and a PEG solution (polyethylene glycol 4000, 45% solution in RPMI) was carefully added for 2 minutes. After 1 minute incubation for 7 minutes, 10 ml RPMI medium without FCS was added. The cells were centrifuged, washed with RPMI medium and resuspended in 10 ml.
4. Elektroporacja4. Electroporation
Elektroporację (EP) przeprowadzono w aparacie Gene Pulser and Capacitance Extender, firmy Bio Rad. Komórki w wykładniczej fazie wzrostu doprowadzono do gęstości 1 x 107/ml, raz przemyto w PBS i zawieszono w pożywce RPMI bez FCS z 10 mM dekstrozą i 0,1 mM ditiotreitolem. 0,4 ml zawiesiny komórek umieszczono w kuwecie do EP i dodano 10-20 Lig DNA. DNA rozpuszczono do stężenia 1 gg na 1 gl TE. Warunki elektroporacji wahały się, jak następuje:Electroporation (EP) was performed on a Gene Pulser and Capacitance Extender, Bio Rad. Exponential growth cells were adjusted to a density of 1 x 107 / ml, washed once in PBS and resuspended in RPMI medium without FCS with 10 mM dextrose and 0.1 mM dithiothreitol. 0.4 ml of the cell suspension was placed in an EP cuvette and 10-20 Lg of DNA was added. DNA was dissolved to a concentration of 1 gg per 1 g of TE. The electroporation conditions ranged as follows:
Pojemność: 260-960 gF; napięcie : 150-300 V; odległość elektrod 0,2/0,4 cm; oporność: 100 - °°omów.Capacity: 260-960 gF; voltage: 150-300 V; electrode distance 0.2 / 0.4 cm; resistance: 100 - °° ohms.
175 143175 143
Przed i po elektroporacji komórki inkubowano 10 minut w temperaturze pokojowej, po czym zawieszono w 10 ml pożywki wzrostowej + PCS.Before and after electroporation, cells were incubated for 10 minutes at room temperature, then resuspended in 10 ml of growth medium + PCS.
Selekcja transfektantów:Selection of transfectants:
Selekcję transfektantów przeprowadzono w każdym przypadku na podstawie oporności przeciw G 418.The selection of transfectants was performed in each case on the basis of the resistance to G 418.
1. Selekcja na podłożu półpłynnym1. Selection on a semi-liquid medium
Transfekowane komórki najpierw inkubowano w pożywce wzrostowej zawierającej G 418 tak długo, aż nie stwierdzono dalszego wzrostu. Następnie wysiewano na podłoże półpłynne. Do zestalenia środowiska służył agar (Gibco) albo metyloceluloza. Wstępnie wyselekcjonowane komórki wysiewano na płytkę do hodowli tkanek (10 cm) i dodano 10 ml pożywki selekcyjnej (RPMI plus 1 mg/ml G 418) i 2 ml 2% upłynnionego roztworu agaru. Po ochłodzeniu agaru, inkubowano w cieplarce w 37°C. W wariancie tego doświadczenia agar zastąpiono metylocelulozą.The transfected cells were first incubated in growth medium containing G 418 until no further growth was detected. Then they were sown on a semi-liquid substrate. Agar (Gibco) or methylcellulose was used to solidify the medium. The pre-selected cells were plated on a tissue culture plate (10 cm) and 10 ml of selection medium (RPMI plus 1 mg / ml G 418) and 2 ml of a 2% liquefied agar solution were added. After the agar had cooled down, it was incubated in an incubator at 37 ° C. In a variant of this experiment, the agar was replaced with methyl cellulose.
2. Selekcja i klonowanie w komorze do hodowli komórek Transwell TM, firmy Costar godzin po transfekcji komórki wysiewano na 96-studzienkową płytkę mikrotitracyjną, przy gęstości 1 x 105 komórek na studzienkę 0,2 ml. Dodano G 418 do stężenia 0,7 mg/ml dla komórek U 937 i 1,0 mg/ml dla HUT 78. Gdy tylko pożywka została zużyta dodawano 1/2 objętości studzienki i pożywki; w przypadku U 937 dodawano tylko 0,5 mg/ml G 418.2. Selection and cloning in a Costar Transwell TM cell culture chamber. Hours after transfection, cells were plated in a 96-well microtiter plate at a density of 1 x 10 5 cells per well of 0.2 ml. G 418 was added to a concentration of 0.7 mg / ml for U 937 cells and 1.0 mg / ml for HUT 78. As soon as the medium was consumed, 1/2 volume of well and medium were added; in the case of U 937 only 0.5 mg / ml of G 418 was added.
Inkubację prowadzono tak długo, aż w poszczególnych studzienkach narosły komórki oporne. Te klony mieszane uzupełniano do większej objętości i następnie klonowano. Stosowano do tego celu specjalne komory hodowlane firmy Costar (Transwell TM, nr katalogu 3425, 205, Broadway, Cambridge, MA 02139, USA).Incubation was continued until resistant cells had grown up in individual wells. These mixed clones were made up to a larger volume and then cloned. For this purpose, special rearing chambers from Costar (Transwell TM, Catalog No. 3425, 205, Broadway, Cambridge, MA 02139, USA) were used.
Komórki w zawiesinie o niewielkiej gęstości (50 do 200 komórek na 6 ml) wysiewano do miękkiego agaru zawierającego G 418 (patrz selekcja w środowisku półpłynnym), a 6 ml umieszczano w komorze centralnej (przedział górny). Komora jest oddzielona błoną od bardzo gęsto rosnącej płynnej hodowli zaopatrującej U 937 względnie HUT 78 (20 000 komórek/ml) w dolnym przedziale. Płynną pożywkę w miarę zużycia częściowo wymieniano, aby umożliwić dalszy wzrost komórek. Gdy w miękkim agarze pojawiły się kolonie oporne na G 418, izolowano je pipetą Pasteurowską i namnażano.The cells in the low-density suspension (50 to 200 cells per 6 ml) were plated on soft agar containing G 418 (see slurry selection) and 6 ml was placed in the central chamber (upper compartment). The chamber is separated by a membrane from the very densely growing liquid feed culture of U 937 or HUT 78 (20,000 cells / ml) in the lower compartment. The liquid medium was partially replaced as used up to allow further cell growth. When G 418 resistant colonies appeared in the soft agar, they were isolated with a Pasteur pipette and propagated.
W ten sposób z użyciem wektorów KTX 11, KTX 12, KTX 15, pSXK 1 i pSXK 2 sklonowano po około 10 niezależnych, transfekowanych linii komórek U 937 i HUT 78, które zbadano dalej dla wykazania ekspresji antysensownego RNA i oporności na HIV-1. Ponadto, z użyciem wektorów pHTT1, pHTT4, pHTT9 i pHTT10 generowano linie komórek HUT 78 i sprawdzono je w próbie zakażenia HIV.Approximately 10 independent, transfected U 937 and HUT 78 cell lines were cloned each with the vectors KTX 11, KTX 12, KTX 15, pSXK 1 and pSXK 2 and tested further to demonstrate antisense RNA expression and HIV-1 resistance. In addition, HUT 78 cell lines were generated using the vectors pHTT1, pHTT4, pHTT9 and pHTT10 and tested for HIV infection.
Przykład VIII. Transformacja komórek szpiku wektorem ekspresji KTX 15.Example VIII. Transformation of marrow cells with the expression vector KTX 15.
Jako przykład, podstawowe postępowanie do badania transformacji pierwotnych komórek szpiku na modelu myszy przebiegało następująco:As an example, the basic procedure for studying transformation of primary bone marrow cells in a mouse model was as follows:
Pierwotne komórki szpiku otrzymano z kości udowych myszy C57 w wieku od sześciu do dziesięciu tygodni. Komórki pobrano w pożywce McCoy (firmy Flow) i wysiano na szalki Petriego, po zmieszaniu z interleukiną 3 i GM-CSF (czynnik stymulujący kolonie granulocytów-monocytów - Granulocyte-monocyte colony stimulating factor, firmy Genzyme) w stężeniu 2,5 gg/ml, oraz z agarem (Bacto Agar firmy Difco, końcowe stężenie 0,3%), w stężeniu 1 x 105 komórek na ml, w obecności lub bez obecności toksycznego antybiotyku G 418 (neomycyna). Transfekcję przeprowadzono bezpośrednio po pobraniu komórek szpiku, przed wysianiem w agarze. Następnie komórki hodowano przez szereg dni w cieplarni z przepływem CO2 (7,5%) w 37°C. W różnych odstępach czasu liczbę transformowanych kolonii (co najmniej 50 komórek) lub skupisk komórek (clusters, 10 do 50 komórek) liczono w każdym przypadku pod mikroskopem. W podanych warunkach doświadczenia, większość kolonii były to kolonie mieszane granulocytów/monocytów albo kolonie granulocytów, rzadko obserwowane wybuchy komórek erytroidalnych, w jednym przypadku stwierdzono megakariocyty. Typy komórek w koloniach identyfikowano przez barwienie May-Griinewald.Primary bone marrow cells were obtained from the femurs of C57 mice six to ten weeks of age. Cells were harvested in McCoy's broth (from Flow) and plated in petri dishes after mixing with interleukin 3 and GM-CSF (Granulocyte-monocyte colony stimulating factor, Genzyme) at a concentration of 2.5 gg / ml , and with agar (Difco Bacto Agar, 0.3% final concentration) at a concentration of 1 x 10 5 cells per ml, in the presence or absence of the toxic antibiotic G 418 (neomycin). Transfection was performed immediately after harvesting the marrow cells, prior to plating on agar. The cells were then cultured for several days in a greenhouse with CO2 (7.5%) flow at 37 ° C. At various time intervals, the number of transformed colonies (at least 50 cells) or cell clusters (10 to 50 cells) was counted under the microscope in each case. Under the given experimental conditions, most of the colonies were mixed granulocyte / monocyte or granulocyte colonies, outbreaks of erythroid cells were rarely observed, in one case megakaryocytes were found. The cell types in the colonies were identified by May-Griinewald staining.
Warunki transfekcji zostały zoptymalizowane. Pomyślne transfekcje komórek pierwotnych szpiku otrzymano w następującym układzie: 800 gl zawiesiny komórek szpiku (5 x 106 komórek w płynie do elektroporacji, jak opisano w przykładzie VII), 5 gg KTX15, elektroporacja przy 300 V, 100 Ω, 250 gFD, 6 ms.The transfection conditions have been optimized. Successful transfection of primary cells marrow was obtained in the following manner: 800 gl suspension of bone marrow cells (5 x 10 6 cells in the fluid to electroporation as described in Example VII) 5 gg KTX15, electroporation at 300 V, 100 Ω, 250 GFD 6 ms .
175 143175 143
Po elektroporacji (aparat Gene Pulser and Capacitance Extender firmy Bio Rad) komórki poddano selekcji w opisanej pożywce hodowlanej w obecności 500 μg/ml G 418 (neomycyna). Oporność na G-418 wskazywała na udaną transfekcję zdolnych do propagacji komórek pierwotnych szpiku.After electroporation (Gene Pulser and Capacitance Extender by Bio Rad), cells were selected in the described culture medium in the presence of 500 µg / ml G 418 (neomycin). G-418 resistance indicated successful transfection of propagating primary bone marrow cells.
Przykład IX. Wykazanie integracji nienaruszonych konstruktów wektorów ekspresyjnych oraz wykazanie ekspresji antysensownego RNA.Example IX. Demonstration of integration of intact expression vector constructs and demonstration of antisense RNA expression.
Transfekowane linie komórkowe U 937 i HUT 78 poddano dezintegracji i DNA i RNA z tych linii komórkowych izolowano standardowymi metodami stosując wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu (L.G. Davis i in., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, Nowy Jork 1986). Dowód na integrację nienaruszonych konstruktów wektora ekspresyjnego antysensownego RNA przeprowadzono przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR Technology Principles and Application of DNA Amplification, wyd. Henry A. Erlich, M. Stockton Press, Nowy Jork 1989), stosując primery oligonukleotydowe, które amplifikowały zachodzące na siebie fragmenty DNA sekwencji promotora, sekwencji insertu i sekwencji terminacji. Następnie, amplifikowany DNA identyfikowano metodą analizy Southern Blot (Davis i in., patrz wyżej) używając sond genowych dla wstawek DNA. Przykłady wyników analizy są przedstawione na fig. 7, 8 i 9. Dla wektorów KTX 11, KTX 12 i KTX 15, na przykład, zastosowano flankujące primery 5'-CAA ACC CTT TGC GCC CG-3' albo 5'-ACT CGT CCA ACG ACT AT-3' z sekwencji promotora i 5'-TTT TTT CAC TGC ATT CTA CTT-3' z sekwencji poliadenylacji. W przypadku wektorów ekspresyjnych z wektorem pRc-CMV na przykład, zastosowano flankujący primer 5'CTT TCC AAA ATG TCG TAA CAA CTCC-3' dla sekwencji promotora i 5'-ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT-3' dla sekwencji terminacji. We wstawce (sekwencja HIV) wybrano sekwencje primera, które zależnie od wybranej pary primerów dawały produkty PCR o około 500 do 2100 par zasad.The transfected U 937 and HUT 78 cell lines were disintegrated and DNA and RNA from these cell lines were isolated by standard methods using cesium chloride density gradient centrifugation (L.G. Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, New York 1986). Evidence for the integration of intact antisense RNA expression vector constructs was performed by the polymerase chain reaction (PCR Technology Principles and Application of DNA Amplification, Henry A. Erlich Ed., M. Stockton Press, New York 1989) using oligonucleotide primers that amplified overlapping DNA fragments of the promoter sequence, insert sequence and termination sequence. Then, the amplified DNA was identified by Southern Blot analysis (Davis et al., Supra) using gene probes for the DNA inserts. Examples of the results of the analysis are shown in Figures 7, 8 and 9. For the vectors KTX 11, KTX 12 and KTX 15, for example, the flanking primers 5'-CAA ACC CTT TGC GCC CG-3 'or 5'-ACT CGT CCA were used. ACG ACT AT-3 'from the promoter sequence and 5'-TTT TTT CAC TGC ATT CTA CTT-3' from the polyadenylation sequence. In the case of expression vectors with the pRc-CMV vector for example, the flanking primer 5'CTT TCC AAA ATG TCG TAA CAA CTCC-3 'for the promoter sequence and 5'-ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT-3' for the termination sequence were used. Primer sequences were selected in the insert (HIV sequence) which, depending on the primer pair selected, resulted in PCR products of approximately 500 to 2100 bp.
Ekspresję antysensownego RNA wykazano przeprowadzając analizę Northern Blot (Davis i in., patrz wyżej) RNA z klonowanych, transfekowanych linii komórek. Przykład wyniku analizy wykazujący antysensowny RNA HIV-1 w transfekowanej linii komórek U 937 przedstawia fig. 10.Expression of antisense RNA was demonstrated by Northern Blot analysis (Davis et al., Supra) of RNA from cloned, transfected cell lines. An example of the result of the analysis showing HIV-1 antisense RNA in the transfected U 937 cell line is shown in Figure 10.
Przykład X. Wykazanie oporności na wirus transfekowanych klonowanych linii komórkowych krwiotwórczych.Example X. Demonstration of virus resistance of transfected cloned hematopoietic cell lines.
Klonowane linie komórkowe, w których zachodzi ekspresja antysensownego RNA, otrzymane i scharakteryzowane według przykładów VII i IX, badano w porównawczych próbach zakażenia HIV-1 (L. Ratner i in., Nature 313, 277, 1985) albo HIV-2 194 (H. Kuhnei i in., NucleicAcids Research 1990,18,6142) razem z wyjściowymi liniami komórek HUT 78 i U 937 jako kontrolnymi, na ekspresję oporności przeciwwirusowej.Cloned cell lines expressing antisense RNA obtained and characterized according to Examples 7 and 9 were tested in comparative HIV-1 (L. Ratner et al., Nature 313, 277, 1985) or HIV-2 194 (H Kuhnei et al., NucleicAcids Research 1990, 18, 6142) together with the original HUT 78 and U 937 cell lines as controls, for expression of antiviral resistance.
1. Zakażenie HUT 78 i U 937 wirusem HIV-1 (kontrola)1. Infection of HUT 78 and U 937 with HIV-1 (control)
WykonanieExecution
Porcje po 10 ml zawiesiny komórek traktowano przez 60 minut różnymi rozcieńczeniami płynu z hodowli HUT 78 (HUT-1)około 104 PFU/ml w hodowlach PBL, aktywność RT zamrożonego roztworu macierzystego 650 000 cmp/ml). Następnie komórki odwirowano i trzykrotnie przemyto, w celu usunięcia niezwiązanych cząstek wirusa u białek wirusowych. Na koniec w każdym przypadku komórki zawieszano w 10 ml pożywki i hodowano w cieplarce.Aliquots of 10 ml of cell suspension is treated for 60 minutes with various dilutions of liquid cultures HUT 78 (HUT-1) of about 10 4 PFU / ml in PBL cultures, RT activity of the frozen stock solution 650 000 cpm / ml). The cells were then centrifuged and washed three times to remove unbound virus particles in viral proteins. Finally, in each case, the cells were resuspended in 10 ml of medium and grown in an oven.
Co 30-40 dni badano 200 gl wolnego od komórek płynu z hodowli na obecność antygenów HIV. Stosowano test wychwytywania antygenu firmy Organon Technika.Every 30-40 days, 200 µl of cell-free culture fluid was tested for HIV antigens. The antigen capture test by Organon Technika was used.
Dla podtrzymania komórek za każdym razem usuwano 5 ml zawiesiny komórek i zastępowano 5 ml pożywki.In order to maintain the cells, 5 ml of the cell suspension were removed each time and replaced with 5 ml of medium.
2. Zakażenie HIV-1 komórek HUT 78 i U 937 wykazujących ekspresję antysensownego RNA.. Wykonanie2. HIV-1 infection of HUT 78 and U 937 cells expressing antisense RNA.
W każdym przypadku 10 ml zawiesiny komórek (około 4 x 105 komórek na mli traktowano przez 60 minut rozcieńczonym płynem z hodowli HUT 78/HIV-1 (około 104 PFU/ml w hodowlach PBL, aktywność RT zamrożonego roztworu macierzystego 650 000 cpm/ml); końcowe rozcieńczenie roztworu macierzystego wirusa wynosiło 1:1000 dla komórek HUT 78 i 1:50 dla komórek U 937. Następnie komórki odwirowano i czterokrotnie ostrożnie przemyto w celu usunięcia niezwiązanych cząstek wirusa i białek wirusowych. Na koniec, komórki wIn each case, 10 ml of cell suspension (approximately 4 × 10 5 cells per ml were treated for 60 minutes with diluted HUT 78 / HIV-1 culture fluid (approximately 10 4 PFU / ml in PBL cultures, RT activity of the frozen stock 650,000 cpm / ml); the final dilution of the virus stock solution was 1: 1000 for HUT 78 cells and 1:50 for U 937 cells. The cells were then centrifuged and washed four times carefully to remove unbound virus particles and viral proteins.
175 143 każdym przypadku zawieszano w 10 ml pożywki (RPMI 1640 + 16% FCS) i hodowano przez 60 dni w cieplarce. Co 3-4 dni 160 gl wolnego od komórek płynu hodowlanego badano na obecność antygenów HIV, stosując test wychwytywania antygenu, firmy Organon Technika z odpowiednim czytnikiem płytek mikrotitracyjnych.Each case was suspended in 10 ml of medium (RPMI 1640 + 16% FCS) and cultured for 60 days in an incubator. Every 3-4 days, 160 µl of cell-free culture fluid was tested for the presence of HIV antigens using the Organon Technika antigen capture assay with an appropriate microtiter plate reader.
Dla podtrzymania komórek w każdym przypadku co 3-4 dni usuwano 5 ml zawiesiny komórek i zastępowano 5 ml świeżej pożywki.To maintain the cells, 5 ml of the cell suspension were removed every 3-4 days in each case and replaced with 5 ml of fresh medium.
Jako wynik reprezentatywny dla innych linii komórkowych wykazujących ekspresję antysensownego RNA można wymienić dwie serie doświadczeń z trzema transfektantami HUT 78 (HUT K14-KTX11, SSHUTTK16/2-SXK1, SSHUTK1/1-SXK2, patrz fig. 11) i z trzema transfektantami U 937 (ssUK 20/4-KTX1 la, ssUK 3/1-SXK2 i ssUK 20/15-KTX1 1b, patrz fig. 12). Po zakażeniu w ciągu inkubacji do 60 dni, zarówno w pomiarach aktywności odwrotnej transkryptazy (RT), jak również w oznaczeniach antygenu VIF te hodowle komórek wykazujące ekspresję antysensownego RNA i zawierające wektory ekspresji pSCK1 i pSXK2, nie wykazały żadnych oznak namnażania się HI V. Natomiast w kontrolnej linii komórek namnażanie się HIV można było wyraźnie oznaczyć. Ponadto stwierdzono opóźniony wzrost replikacji wirusa w transfektantach o słabszej ekspresji wektora KTX11. Wynik jest przedstawiony na fig. 11 i 12.Two series of experiments with three HUT 78 transfectants (HUT K14-KTX11, SSHUTTK16 / 2-SXK1, SSHUTK1 / 1-SXK2, see Fig. 11) and three U 937 transfectants ( suction unit 20/4-KTX1 la, suction unit 3/1-SXK2 and suction unit 20/15-KTX1 1b, see Fig. 12). Following infection for an incubation period of up to 60 days, both in the measurements of reverse transcriptase (RT) activity as well as in the VIF antigen assays, these cell cultures expressing the antisense RNA and containing the expression vectors pSCK1 and pSXK2 showed no signs of HI V. in a control cell line, HIV proliferation could be clearly determined. Moreover, a delayed increase in viral replication was found in transfectants with weaker expression of the KTX11 vector. The result is shown in Figures 11 and 12.
Dla sprawdzenia, że zakażenie HIV-1 nastąpiło w liniach komórek sSu K3/1-SXK2, SSHUT K16/2-SXK1 i SSHUT K1/1-SXK2, które po inkubacji przez 60 dni nie wykazywały antygenu HIV-1 ani aktywności RT, dodatnie zakażenie wykazało na przykład przez reakcję PCR sekwencji genu HIV-1 TAT i sekwencji genów otoczki w inkubowanych przez 60 dni liniach komórek SSHUT K16/2-SXK1 i SSHUT K1/1-SXK2 (fig. 13). Zastosowano w tym celu primer PCR 5'-ATG GAG CCA GTA GAT CCT-3' i 5'-TCT ACC ATG TCAT-3' do generowania fragmentu PCR o długości 690 par zasad. Wektory ekspresyjne pSXK1 i pSXK2 nie zawierają tych sekwencji i dlatego nie mogą dać fałszywie dodatniego produktu PCR.To verify that HIV-1 infection has occurred in sSu K3 / 1-SXK2, SSHUT K16 / 2-SXK1 and SSHUT K1 / 1-SXK2 cell lines, which showed no HIV-1 antigen or RT activity after 60 days of incubation, positive for example, infection was demonstrated by PCR of the HIV-1 TAT gene sequence and the envelope gene sequence in the 60 days incubated SSHUT K16 / 2-SXK1 and SSHUT K1 / 1-SXK2 cell lines (Figure 13). For this purpose, the PCR primer 5'-ATG GAG CCA GTA GAT CCT-3 'and 5'-TCT ACC ATG TCAT-3' were used to generate a PCR fragment with a length of 690 bp. The expression vectors pSXK1 and pSXK2 do not contain these sequences and therefore cannot give a false positive PCR product.
Przykład XI. Doświadczenia kontrolne.Example XI. Control experiences.
Transfekcja wektorów z przykładów I do VI, bez wstawek prowirusowego DNA HIV-1 w orientacji antysensownej, nie prowadziła w liniach do powstania komórek U 937 i HUT 78 do linii komórkowych, w których replikacja wirusa była zahamowana. Jednak doświadczenia kontrolne z wektorami z przykładów I do VI, w których są wstawki prowirusowego fragmentu DNA HTV-1 w orientacji sensownej, nie zostały przeprowadzone, ponieważ odpowiednie sensowne transkrypty mogą wiązać białka regulatorowe replikacji HIV, jak np. TAT i REV i dlatego mogą konkurencyjnie hamować replikację wirusa (G.J. Graham i in. PNAS 87, 5817, 1990) i dlatego okazują się nieprzydatne w doświadczeniach kontrolnych.The transfection of the vectors of Examples I to VI, without the HIV-1 proviral DNA inserts in the antisense orientation, did not produce U 937 and HUT 78 cells in lines in which viral replication was inhibited. However, control experiments with the vectors of Examples I to VI in which there are insertions of the proviral HTV-1 DNA fragment in the sense orientation have not been performed because the corresponding sense transcripts may bind HIV replication regulatory proteins such as TAT and REV and therefore may competitively inhibit virus replication (GJ Graham et al. PNAS 87, 5817, 1990) and therefore prove to be unsuitable for control experiments.
Przykład XII. Zakażenie HIV-2 linii komórek HUT 78 i U 937 wykazujących ekspresję antysensownego RNA.Example XII. HIV-2 infection of HUT 78 and U 937 cell lines expressing antisense RNA.
Próby zakażenia przeprowadzono z izolatem HIV-2 D194 /H. Kuhnle i in., Nucleic Acids Res. 18, 6142,1990/. Zawiesinę wirusa o aktywności RT 2,14 x 105 cpm/ml i stężeniu antygenu (w rozcieńczeniu 1:1000) 0,249 OD450 nm (próbka 160 gl) przechowywano w -80°C. Z tej zawiesiny wirusa do zakażenia 2 x 106 komórek HUT 78 pobrano 50 gl, dodano do 4 ml podłoża i inkubowano przez 3 godziny. Komórki U 937 zakażono (2 χ 106) 100 gl zawiesiny wirusa w 4 ml podłoża i inkubowano przez 24 godziny. Następnie niezwiązane cząstki wirusa usunięto w hodowli przez przemywanie.Infection trials were performed with the HIV-2 D194 / H isolate. Kuhnle et al., Nucleic Acids Res. 18, 6142,1990 /. A suspension of virus RT activity of 2.14 x 10 5 cpm / ml and the antigen concentration (dilution 1: 1000) of 0.249 OD450 nm (Sample D 160) were stored at -80 ° C. In the suspension of the virus to infect 2 x 10 6 HUT 78 cells was collected 50 gl added to 4 ml of medium and incubated for 3 hours. U 937 cells were infected (2 × 10 6 ) with 100 µl of a virus suspension in 4 ml of medium and incubated for 24 hours. Then, unbound virus particles were removed in the culture by washing.
W odstępach 3-4 dni hodowlę komórek podtrzymywano i pobierano supernatant do ilościowego oznaczania antygenu HIV, używając testu wychwytywania antygenu HIV firmy Organon Technika w połączeniu w odpowiednim fotometrem płytek mikrotitracyjnych. Przebieg replikacji HIV-2 D194 w kontrolnych liniach komórek HUT 78 i U 937, które nie zawierają wektorów ekspresji antysensownego RNA jest porównany na fig. 14 i 15 z transfekowanymi liniami komórek, które przez ekspresję antysensownego RNA wykazują opóźnione namnażanie się HIV-2.At intervals of 3-4 days, the cell culture was maintained and the supernatant was removed for quantification of HIV antigen using Organon Technika's HIV Antigen Capture Assay in conjunction with an appropriate microtiter plate photometer. The replication course of HIV-2 D194 in control HUT 78 and U 937 cell lines that do not contain antisense RNA expression vectors is compared in Figures 14 and 15 with transfected cell lines that exhibit delayed proliferation of HIV-2 by expression of the antisense RNA.
WynikiResults
Stosując wektory ekspresji KTX 11, KTX 12, KTX 15, pSXK 1, pSXK 2, pHTT 1, pHTT 4, pHTT 6, pHTT 9, pHTT 10, pHTT 12 i pHTT 15 (przykłady I do VI), w ludzkich liniach komórek krwi po transfekcji genu i klonowaniu transfekowanych linii komórek (przykład VII) stwierdzo12Using the expression vectors KTX 11, KTX 12, KTX 15, pSXK 1, pSXK 2, pHTT 1, pHTT 4, pHTT 6, pHTT 9, pHTT 10, pHTT 12 and pHTT 15 (Examples I to VI) in human blood cell lines after gene transfection and cloning of the transfected cell lines (Example VII) it was found 12
175 143 no endogenne wytwarzanie antysensownego RNA przeciw HIV-1 (przykład IX) i wykazano jego działanie przeciwwirusowe (przykłady X, XII).The endogenous production of anti-HIV-1 antisense RNA (Example IX) has been demonstrated and its antiviral activity has been demonstrated (Examples X, XII).
Nieoczekiwanie stwierdzono wyraźne hamowanie replikacji retrowirusa HIV-1 w transfekowanych liniach komórek. Podobnie przy użyciu HIV-1 specjalnie adaptowanego do transfekowanych komórek, można było wykazać oporność na wirus komórek z ekspresją antysensownego RNA (fig. 11, 12). Obserwowano również wyraźne cechy przeciwwirusowe antysensownego RNA przeciw HIV-2 (fig. 14,15).Surprisingly, there was a clear inhibition of HIV-1 retrovirus replication in the transfected cell lines. Similarly, by using HIV-1 specially adapted to the transfected cells, it was possible to demonstrate viral resistance of cells expressing antisense RNA (Figs. 11, 12). Clear antiviral features of the anti-HIV-2 antisense RNA were also observed (Figures 14, 15).
Wyniki te sąprzykładem, że odpowiednie promotory ekspresji cząsteczek antysensownego RNA i oczywiście rodzaj sekwencji antysensownego RNA, prowadzą w genetycznie zmienionych komórkach do wytworzenia oporności na zakażenie retrowirusem. W przykładzie IX wykazano, że w związku z dotychczas nieznanym procesem cięcia i składania RNA HTV-1, transkryptów nici /+/ prowirusowego DNA w orientacji 3' — 5', powstało kilka cząsteczek mRNA, które prowadzą do efektu przeciwwirusowego.These results exemplify that the respective promoters of the expression of antisense RNA molecules, and of course the type of antisense RNA sequence, lead to the development of resistance to retrovirus infection in genetically altered cells. Example 9 shows that due to the hitherto unknown cleavage and splicing of HTV-1 RNA, transcripts of the +/- strand of proviral DNA in the 3 '- 5' orientation, several mRNA molecules were produced which lead to an antiviral effect.
Prace doświadczalne, które opisano w przykładach I do XII, wykazały, że stosując odpowiednie konstrukty wektorów ekspresyjnych z fragmentami DNA retrowirusa, kodującymi antysensowny RNA, można otrzymać w komórkach właściwości przeciwretrowirusowe, które chronią przed zakażeniem retrowirusowym. Z fig. 11 do 13 widać, że linie komórek SSHUT K16/2-SXK1 i SSHUT K1/1-SXK2 po 60 dniach od zakażenia HIV są dodatnie w analizie PCR prowirusowego DNA HTV, chociaż oznaczanie antygenu HTV jest ujemne. Wynik ten pozwala wnosić, że po zakażeniu komórek HIV-1, wprawdzie w pierwszym etapie cyklu replikacyjnego HIV powstaje jeszcze prowirusowy DNA w transfekowanych liniach komórek HUT 78, ale antysensowny RNA zapobiega transkrypcji/translacji prowirusowego DNA i nie wytwarza się białko HIV do replikacji wirusa w dających się oznaczyć ilościach.The experimental work described in Examples I to XII has shown that by using appropriate expression vector constructs with retroviral DNA fragments encoding antisense RNA, antiretroviral properties can be obtained in cells that protect against retroviral infection. It can be seen from Figures 11 to 13 that the SSHUT K16 / 2-SXK1 and SSHUT K1 / 1-SXK2 cell lines 60 days after HIV infection are positive by PCR analysis of HTV proviral DNA, although the determination of HTV antigen is negative. This result allows the conclusion that after infection of HIV-1 cells, although in the first stage of the HIV replication cycle, proviral DNA is still formed in the transfected HUT 78 cell lines, but antisense RNA prevents transcription / translation of proviral DNA and HIV protein is not produced for viral replication in quantifiable amounts.
W DNA linii komórkowej SSU K3/1-SXK2 w 60 dni po zakażeniu HIV-1, we wszystkich próbach testowych nie można było wykryć wytwarzania białek HIV względnie prowirusowego DNA HIV ani testem na antygeny ani analizą PCR. Ten wynik może oznaczać, że w linii komórek SSU K3/1-SXK2 wytworzony antysensowny RNA nie tylko zapobiega drugiemu etapowi cyklu replikacyjnego HIV (transkrypcja i translacja prowirusowego DNA) ale także hamuje już pierwszy etap cyklu replikacyjnego.In the DNA of the SSU K3 / 1-SXK2 cell line, 60 days after HIV-1 infection, the production of HIV proteins or HIV proviral DNA could not be detected in all test samples by antigen test or PCR analysis. This result may mean that in the SSU K3 / 1-SXK2 cell line the produced antisense RNA not only prevents the second stage of the HIV replication cycle (transcription and translation of proviral DNA) but also inhibits the first stage of the replication cycle.
Antysensowny RNA może najwyraźniej zapobiegać tworzeniu się prowirusowego DNA z genomowej nici /+/ RNA przez proces odwrotnej translacji. To działanie antysensownego RNA przyjęto spekulatywnie, jednak dotychczas nie zostało ono wykazane (R. Y.L. To i P.E. Neiman, Gene Regulation, Biology of antisense RNA and DNA, wyd. R.P. Erickson i J.G. Izant, Raven Press Ltd., Nowy Jork 1992), ponieważ dotychczas nie znaleziono odpowiednio wydajnych konstruktów wektorów ekspresyjnych.Antisense RNA can apparently prevent proviral DNA from being formed from the genomic / + / RNA strand by a reverse translation process. This effect of antisense RNA has been speculatively assumed, but has not yet been demonstrated (RYL To and PE Neiman, Gene Regulation, Biology of antisense RNA and DNA, RP Erickson and JG Izant, Raven Press Ltd., New York 1992) since No sufficiently efficient expression vector constructs were found.
Opisy figurDescriptions of figures
Figura 1Figure 1
Wektor ekspresyjny KTX 11, do ekspresji antysensownego RNA HIV-1. Promotor metalotioneiny (MTI) uruchamia transkrypcję antysensownego RNA z prowirusowego fragmentu DNA HIV-1, obejmującego nukleotydy 5786 — 474 (numeracja: UWGCG GENEMBL DATA BANK File; HIV HXB2CG.VIRAL). Terminacja transkryptów antysensownego RNA następuje przez sekwencję poliadenylacji SV 40. Transkrypcja genu oporności na neomycynę TRN5neo jest zainicjowana przez wczesny promotor SV 40. Wektor wahadłowy zawiera także początek pBR322 oraz gen ampicyliny (pBr 322-amp). Dalsze szczegóły opisano w przykładzie I.KTX 11 expression vector, for expression of HIV-1 antisense RNA. The metallothionein promoter (MTI) triggers the transcription of antisense RNA from the HIV-1 proviral DNA fragment spanning nucleotides 5786 - 474 (numbering UWGCG GENEMBL DATA BANK File; HIV HXB2CG.VIRAL). Termination of antisense RNA transcripts occurs by the SV 40 polyadenylation sequence. Transcription of the TRN5neo neomycin resistance gene is initiated by the SV 40 early promoter. The shuttle vector also contains the pBR322 start and the ampicillin gene (pBr 322-amp). Further details are described in Example I.
Figura 2Figure 2
Wektor ekspresyjny KTX 12, do ekspresji antysensownego RNA HIV-1 pod kontrolą promotora hybrydowego metalotioneiny LTR HTV-1. Szczegóły budowy wektora są opisane w przykładzie II.KTX 12 expression vector, for expression of HIV-1 antisense RNA under the control of the HTV-1 LTR hybrid metallothionein promoter. Details of the vector structure are described in example 2.
Figura 3Figure 3
Wektor ekspresyjny KTX 15, do ekspresji antysensownego RNA HIV-1 pod kontrolą promotora hybrydowego metalotioneiny LTR HIV-1, w którym jest delecja sekwencji TARKTX 15 expression vector, for expression of HIV-1 antisense RNA under the control of the HIV-1 LTR hybrid metallothionein promoter, in which there is a deletion of the TAR sequence
175 143175 143
HIV-1 dla osiągnięcia maksymalnej ekspresji bez obecności białka transaktywatora TAT. Szczegóły budowy wektora opisano w przykładzie III.HIV-1 for maximal expression in the absence of TAT transactivator protein. Details of vector construction are described in Example 3.
Figura 4Figure 4
Wektor ekspresyjny pSXK 1, do ekspresji antysensownego RNA HIV-1 pod kontrolą promotora wirusa cytomegalii (CMV). Szczegóły budowy wektora są opisane w przykładzie IV.PSXK 1 expression vector, for expression of HIV-1 antisense RNA under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter. The details of the vector structure are described in Example 4.
Figura 5Figure 5
Wektor ekspresyjny pSXK 2, do ekspresji antysensownego RNA HIV-1 pod kontrolą promotora cytomegalowirusa (CMV). Prowirusowy fragment DNA HIV-1 ze środkowego regionu genomu HIV obejmuje w tym przykładzie nie sekwencje z regionu 5' jak w przykładach I do IV, ale sekwencję z regionu POL/VIF. Szczegóły budowy wektora opisano w przykładzie V.PSXK 2 expression vector, for expression of HIV-1 antisense RNA under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter. The HIV-1 proviral DNA fragment from the middle region of the HIV genome comprises in this example not sequences from the 5 'region as in Examples I to IV, but from the POL / VIF region. Details of vector construction are described in Example 5.
Figura 6Figure 6
Orientacyjny digram dla przygotowania fragmentów genowych HIV-1, które w antysensownej orientacji 3' — 5' (kierunek strzałki) są zawarte w wektorach ekspresyjnych antysensownego RNA, z oznaczeniami podanymi w kolumnie 1. Promotor odpowiedniego wektora ekspresyjnego jest podany w kolumnie 2, w kolumnie 3 numeracja nukleotydów sekwencji HTV według UWGCG GENEMBL DATA BANK file: HIVHXB2CG.VIRAL.Indicative digram for the preparation of HIV-1 gene fragments which, in the 3 '- 5' antisense orientation (arrow direction), are included in the antisense RNA expression vectors, with the markings given in column 1. The promoter of the corresponding expression vector is given in column 2, column 3 nucleotide numbering of HTV sequence according to UWGCG GENEMBL DATA BANK file: HIVHXB2CG.VIRAL.
Figura 7Figure 7
Analiza Southern Blot, po amplifikacji PCR, chromosomowego DNA z klonowanego transfektanta U 937, który zawiera wektor ekspresyjny pSXK1 zintegrowany w chromosomowym DNA. Wielkość fragmentu produktów PCR, oraz hybrydyzacja z sondą genową HIV, która nie zawiera sekwencji primera produktów PCR, wskazują na nienaruszony charakter sekwencji promotor/insert.Southern Blot analysis, after PCR amplification, of chromosomal DNA from the cloned U 937 transfectant which contains the pSXK1 expression vector integrated into the chromosomal DNA. The fragment size of the PCR products, and hybridization with the HIV gene probe that does not contain the primer sequence of the PCR products, indicate the intact nature of the promoter / insert sequence.
1. Wektor próby kontrolnej, połączenie 5', fragment z 887 par zasad1. Vector control, 5 'combination, 887 bp fragment
2. Wektor próby kontrolnej, połączenie 3', fragment z 775 par zasad2. Vector control, 3 'combination, 775 bp fragment
3. Chromosomowy DNA, połączenie 5', fragment z 887 par zasad3. Chromosomal DNA, 5 'junction, 887 bp fragment
4. Chromosomowy DNA, połączenie 3', fragment z 775 par zasad.4. Chromosomal DNA, 3 'junction, 775 bp fragment.
Dalsze szczegóły podano w przykładzie IX.Further details are given in Example IX.
Figura 8Figure 8
Wykrywanie fragmentu genu HIV-1 w chromosomowym DNA z klonowanych transfektantów HUT 78, przy pomocy amplifikacji PCR. Reakcję PCR rozdzielono na żelu agarozaTAE i po barwieniu bromkiem etydyny fotografowano w świetle UV. Produkt PCR obejmuje 561 par zasad i odpowiada fragmentowi genu HIV-1(nukleotydy 699-1305), który jest również składnikiem wektora pSXK1, Produkt PCR o długości 561 bp pokazuje strzałka.Detection of HIV-1 gene fragment in chromosomal DNA from cloned HUT 78 transfectants by PCR amplification. The PCR reaction was separated on a TAE agarose gel and, after staining with ethidium bromide, photographed under UV light. The PCR product covers 561 bp and corresponds to the HIV-1 gene fragment (nucleotides 699-1305) which is also a component of the pSXK1 vector. The 561 bp PCR product is shown by the arrow.
M = standard długości DNA, pokazane są 516 bp i 1018 = kontrola ujemna, DNA nie dodano do reakcji PCR = chromosomowy DNA z komórek U 937 (typ dziki) = chromosomowy DNA z komórek HUT 78 (typ dziki) = kontrola ujemna, DNA nie dodano do reakcji PCR = kontrola dodatnia = chromosomowy DNA z transformantów HUT 78 (SSHUT 6/1 107-9/1) = chromosomowy DNA z transformantów HUT 78 (SSHUT 6/1 107-9/1) = chromosomowy DNA z transformantów HUT 78 (SSHUT 6/1 107-9/1) = chromosomowy DNA z transformantów HUT 78 (SSHUT 6/1 107-9/1)M = DNA length standard, 516 bp and 1018 are shown = negative control, DNA not added to PCR = chromosomal DNA from U 937 cells (wild type) = chromosomal DNA from HUT 78 cells (wild type) = negative control, DNA not added to PCR reaction = positive control = chromosomal DNA from HUT 78 transformants (SSHUT 6/1 107-9 / 1) = chromosomal DNA from HUT 78 transformants (SSHUT 6/1 107-9 / 1) = chromosomal DNA from HUT 78 transformants (SSHUT 6/1 107-9 / 1) = chromosomal DNA from HUT 78 transformants (SSHUT 6/1 107-9 / 1)
Figura 9Figure 9
Wykrywanie fragmentu genu HIV-1 (nukleotydy 4158-5792) w chromosomowym DNA w monocytów U 937 i limfocytów T HUT 78, przy pomocy amplifikacji PCR. Komórki uprzednio transfekowano wektorem pSXK2. Reakcję PCR rozdzielono na żelu agaroza TAE i po barwieniu bromkiem etydyny fotografowano w świetle UV. Produkt PCR obejmuje cały fragment genu HIV-1 w pSXK2 (nukleotydy 4158-5792) i ma długość 1811 bp. Strzałka pokazuje produkt PCR o długości 1811 bp.Detection of HIV-1 gene fragment (nucleotides 4158-5792) in chromosomal DNA in U 937 monocytes and HUT 78 T lymphocytes by PCR amplification. Cells were previously transfected with the pSXK2 vector. The PCR reaction was separated on a TAE agarose gel and, after staining with ethidium bromide, photographed under UV light. The PCR product covers the entire fragment of the HIV-1 gene in pSXK2 (nucleotides 4158-5792) and is 1811 bp in length. The arrow shows the 1811 bp PCR product.
M = standard długości DNA, 1635 bp i 2036 bp są pokazane = kontrola ujemna, DNA nie dodano reakcji PCRM = DNA length standard, 1635 bp and 2036 bp are shown = negative control, DNA not added PCR
175 143 = chromosomowy DNA z komórek U 937 (typ dziki) = chromosomowy DNA z komórek HUT 78 (typ dziki) = chromosomowy DNA z transformantów HUT 78 (SSUK 3/1 ) = chromosomowy DNA z transformantów U 937 (SSUK 3/1 107-12/1)175 143 = chromosomal DNA from U 937 cells (wild type) = chromosomal DNA from HUT cells 78 (wild type) = chromosomal DNA from HUT transformants 78 (SSUK 3/1) = chromosomal DNA from transformants U 937 (SSUK 3/1 107 -12/1)
Figura 10Figure 10
Analiza Northern Blot dla oznaczenia szeregu transkryptów antysensownego RNA w transfekowanej, klonowanej linii komórek U 937, która zawiera wektor ekspresji KTX 11 w linii komórek SSUK 20/15-KTX1 1b. Przy pomocy sondy genowej, która odpowiada wstawce DNA wektora KTX 11, w RNA linii komórek opornych na wirus (pasmo 1) można stwierdzić co najmiej trzy transkrypty antysensownego RNA, o długości 800,1200 i 3200 bp. Pasmo 2 zawiera RNA z nie transfekowanej linii komórek U 937 (kontrola ujemna). Pasmo 3 zawiera standardy ciężaru cząsteczkowego.Northern Blot analysis to determine a series of antisense RNA transcripts in the transfected cloned U 937 cell line, which contains the KTX 11 expression vector in the SSUK 20/15-KTX1 1b cell line. With the help of the gene probe corresponding to the insert DNA of the KTX 11 vector, at least three antisense RNA transcripts of 800, 1200 and 3200 bp can be found in the RNA of the virus resistant cell line (lane 1). Lane 2 contains RNA from the non-transfected U 937 cell line (negative control). Band 3 contains the molecular weight standards.
Figura 11Figure 11
Przebieg wytwarzania antygenu HIV-1 w ciągu 60 dni po zakażeniu (w dniu zero) linii komórek HUT 78 izolatem HIV-1 LAV/BRU. Na osi rzędnych podano gęstości optyczne przy 450 nm (OD450nm) wyników testu ELISA HIV z płynem z hodowli komórek. Przy gęstości optycznej >2,0 płyn z hodowli rozcieńczano i podaną wartość wyliczano z rozcieńczenia. Wartość odciętej przedstawia granicę wykrywalności oznaczenia antygenu HIV. W liniach komórek SSHUT K16/2-SXK1 i SSHUT K1/1-SXK2, wykazujących ekspresję antysensownego RNA, replikacja HIV jest całkowicie zahamowana w okresie 60 dni. W linii komórek HUT K14-KTX11 początek replikacji HIV jest opóźniony w porównaniu z nietransfekowaną linią komórek typu dzikiego HUT 78.The course of HIV-1 antigen production within 60 days after infection (on day zero) of the HUT 78 cell line with the HIV-1 LAV / BRU isolate. The ordinate shows the optical densities at 450 nm (OD 450 nm) of HIV ELISA results with cell culture fluid. At an optical density> 2.0, the culture fluid was diluted and the reported value was calculated from the dilution. The value of the abscissa represents the detection limit of the HIV antigen assay. In the SSHUT K16 / 2-SXK1 and SSHUT K1 / 1-SXK2 cell lines expressing antisense RNA, HIV replication is completely inhibited over a 60 day period. In the HUT K14-KTX11 cell line, the origin of HIV replication is delayed compared to the untransfected wild-type cell line HUT 78.
Figura 12Figure 12
Przebieg wytwarzania antygenu HIV-1 w okresie 60 dni po zakażeniu (w dniu zero) linii komórek U 937 izolatem HIV-1 LAV/BRU. Na osi rzędnych podano gęstość optyczną przy 450 nm (OD450nm) wyników testu ELISA HIV z płynem z hodowli komórek. Przy gęstości optycznej > 2,0 płyn z hodowli rozcieńczano i podaną wartość wyliczano z rozcieńczenia. Wartość odciętej przedstawia granicę wykrywalności oznaczenia antygenu HIV. W linii komórek SSUK 3/1-SXK2, wykazującej ekspresję antysensownego RNA, replikacja HIV jest w zakresie 60 dni całkowicie zahamowana, pozostałe transfekowane linie komórek wykazują opóźnienie replikacji HIV w porównaniu z linią komórek typu dzikiego (U 937).The course of HIV-1 antigen production within 60 days after infection (on day zero) of the U 937 cell line with HIV-1 LAV / BRU isolate. The ordinate shows the optical density at 450 nm (OD 450nm) of HIV ELISA results with cell culture fluid. At an optical density> 2.0, the culture fluid was diluted and the reported value was calculated from the dilution. The value of the abscissa represents the detection limit of the HIV antigen assay. In the SSUK 3/1-SXK2 cell line expressing the antisense RNA, HIV replication is completely inhibited within 60 days, the remaining transfected cell lines show a delay in HIV replication compared to the wild-type cell line (U 937).
Figura 13 ,,Figure 13 ,,
Analiza PCR celem oznaczenia DNA HIV-1 w liniach komórek, które zawierają wektory ekspresyjne antysensownego RNA i były badane 60 dni po zakażeniu HIV. Barwiona bromkiem etydyny elektroforeza w żelu agarozowym pokazuje produkty PCR chromosomowego DNA z podanych niżej linii komórek. Przy pomocy pary primerów 5'-ATG GAG CCA GTA GAT CCT-3' i 5'-TCT GT TCT ACC ATG TCAT, w komórkach zakażonych HIV poddano amplifikacji fragment PCR długości 702 par zasad z regionu genu TAT-ENV. Dla porównania z wynikiem PCR, w nawiasie podano wynik testu na antygen HIV odpowiednich próbek hodowli komórek.PCR analysis to determine HIV-1 DNA in cell lines that contain antisense RNA expression vectors and were tested 60 days after HIV infection. The ethidium bromide stained agarose gel electrophoresis shows the PCR products of chromosomal DNA from the following cell lines. Using the primer pair 5'-ATG GAG CCA GTA GAT CCT-3 'and 5'-TCT GT TCT ACC ATG TCAT, a 702 bp PCR fragment from the TAT-ENV gene region was amplified in HIV infected cells. For comparison with the PCR result, the result of the HIV antigen test of the respective cell culture samples is given in parentheses.
Pasmo M : standard ciężaru cząsteczkowego, zaznaczono 600 bpM band: molecular weight standard, 600 bp is marked
Pasmo 1 : HUT K14-KTX11, 702 bp dodatni (test antygenowy dodatni)Lane 1: HUT K14-KTX11, 702 bp positive (antigen test positive)
Pasmo 2 : SSHUT K16/2-SXK1,702 dodatni (test antygenowy ujemny)Lane 2: SSHUT K16 / 2-SXK1,702 positive (antigen test negative)
Pasmo 3 : Produkt PCR z równoległego doświadczenia z zakażeniem jak w piOśime 2Lane 3: PCR product from a parallel infection experiment as in PiSime 2
Pasmo 4 : Produkt PCR z równoległego doświadczenia z zakażeniem jak w paśmie 2Lane 4: PCR product from a parallel infection experiment as in lane 2
Pasmo 5 : SSHUT K1/1-SXK2, 702 dodatai (test antygenowy ujemny)Lane 5: SSHUT K1 / 1-SXK2, 702 dodatai (negative antigen test)
Pasmo 6 : Produkt PCR zrównoległego doświadczenia z zakażeniem jak w paśmie 5Lane 6: PCR product of the parallel infection experiment as in lane 5
Pasmo 7 : Równoległe doświadczenie z zakażeniem jak w paśmie 5 Pasmo 8 : HUT 78, kontrola dodatniaLane 7: Parallel experiment with infection as in lane 5 Lane 8: HUT 78, positive control
Pasma 9-11: Hodowle SSUK3/1-SXK2 - produkt PCR 702 bp niewykrywalny (test antygenowy ujemny)Lanes 9-11: SSUK3 / 1-SXK2 cultures - PCR product 702 bp undetectable (antigen test negative)
175 143175 143
Figura 14Figure 14
Przebieg wytwarzania antygenu HIV w ciągu 30 dni po zakażeniu (w dniu zero) linii komórek HUT 78 izolatem D194 HIV-2. Na osi rzędnych podano gęstość optyczną przy 450 nm (OD450nm) wyników testu ELIS A HIV z płynem z hodowli komórek. Przy gęstości optycznej > 2,0 płyn z hodowli rozcieńczano i podaną wartość OD wyliczano z rozcieńczenia. Wartość odciętej przedstawia granicę wykrywalności oznaczenia antygenu HIV. W linii komórek SSHUT K1/1-SXK2, wykazującej ekspresję antysensownego RNA replikacja HIV jest w okresie 14 dni całkowicie zahamowana, pozostałe transfekowane linie komórek wykazują opóźnienie replikacji HIV w porównaniu z linią komórek typu dzikiego (HUT 78).The course of HIV antigen production within 30 days after infection (on day zero) of the HUT 78 cell line with the HIV-2 isolate D194. The ordinate shows the optical density at 450 nm (OD 450nm) of the results of the HIV ELIS A assay with cell culture fluid. At an optical density> 2.0, the culture fluid was diluted and the reported OD value was calculated from the dilution. The value of the abscissa represents the detection limit of the HIV antigen assay. In the SSHUT K1 / 1-SXK2 cell line, which expresses the antisense RNA, HIV replication is completely inhibited within 14 days, the remaining transfected cell lines show a delay in HIV replication compared to the wild-type cell line (HUT 78).
Figura 15Figure 15
Przebieg wytwarzania antygenu HIV w ciągu 30 dni po zakażeniu (w dniu zero) linii komórek U 937 izolatem D194 HIV-2. Na osi rzędnych podano gęstość optyczną przy 450 nm (OD450nm) wyników testu ELIS A HIV z płynem z hodowli komórek. Przy gęstości optycznej > 2,0 płyn z hodowli rozcieńczano i podaną wartość OD wyliczano z rozcieńczenia. Wartość odciętej przedstawia granicę wykrywalności oznaczenia antygenu HIV. W linii komórek SSHUT K3/1-SXK2, wykazującej ekspresję antysensownego RNA, replikacja HIV jest w okresie 30 dni całkowicie zahamowana, pozostała transfekowana linia komórek wykazuj ą opóźnienie replikacj i HIV w porównaniu z linią komórek typu dzikiego (U 937).The course of HIV antigen production within 30 days after infection (on day zero) of the U 937 cell line with HIV-2 isolate D194. The ordinate shows the optical density at 450 nm (OD 450nm) of the results of the HIV ELIS A assay with cell culture fluid. At an optical density> 2.0, the culture fluid was diluted and the reported OD value was calculated from the dilution. The value of the abscissa represents the detection limit of the HIV antigen assay. In the SSHUT K3 / 1-SXK2 cell line, which expresses the antisense RNA, HIV replication is completely inhibited within 30 days, the remaining transfected cell line shows a delay in HIV replication compared to the wild-type cell line (U 937).
175 143175 143
VV
H-1 czH-1 part
Ol.Ol.
LJL.LJL.
175 143 |3175 143 | 3
CD σιCD σι
COWHAT
175 143175 143
AA TA AA [ Hind jH891 / MTi SacJ]AA TA AA [Hind jH891 / MTi SacJ]
/ I AATAAA/ AND AATAAA
4000 30004000 3000
175 143175 143
5095 !6341789 . ’Ι 22915095! 6341789. ’Ι 2291
LTR gag poiLTR gag poi
6794! Irev vif Itot6794! Irev vif Itot
BCSBCS
HIV vpr'HIV vpr '
-bertom-bertom
6224 env '8378 i lrev J 1 1 1 I6224 env '8378 and lrev J 1 1 1 I
Tot LTRi nefTot LTRi nef
97189718
Oznaczenie Promotor Nukleotyły HIVHIV Nucleotide Promoter Assay
- DNA koduje antysensowny RNA- DNA encodes antisense RNA
FIG. 6FIG. 6
175 143175 143
FIG.7FIG. 7
175 143 en en175 143 en en
M 1 2 3M 1 2 3
FIG.9ąFIG. 9a
FIG.10FIG.10
M 4 5M 4 5
175 143175 143
Od 450nmFrom 450nm
Dzień po zakażeniu HiV-1The day after HiV-1 infection
-e- HUTK14 ΚΤΧ11 -θ-ssHUTK 16-SXK 1 *· ssHUTKI/1 SXK2-e- HUTK14 ΚΤΧ11 -θ-ssHUTK 16-SXK 1 * ssHUTKI / 1 SXK2
Typ dziki “θ- Wartości odcinająceWild type “θ - Cut-off values
FIG.11FIG.11
175 143175 143
Od 450 nmFrom 450 nm
Dzień po infekcji HIVThe day after HIV infection
-❖-sUK20/4-KTX 11a-❖-sUK20 / 4-KTX 11a
-^ssUK 20/15-ΚΤΧ 11b- ^ ssUK 20/15-ΚΤΧ 11b
-«-ssUK 3/1-5ΧΚ 2 Typ dziki- «- SSUK 3 / 1-5ΧΚ 2 Wild type
-0- Wartości odcinające- 0- Cut-off values
FIG. 12FIG. 12
175 143175 143
Μ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11Μ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
600 ρζ.->600 ρζ .->
FIG.13FIG. 13
175 143175 143
-e-ssHUTK16-SXK 1 -®-ss HUTK1/1SXK 2 —Typ dziki —Wartości odcinające-e-ssHUTK16-SXK 1 -®-ss HUTK1 / 1SXK 2 — Wild type — Cut-off values
FIG 14FIG 14
175 143175 143
Od 450 nmFrom 450 nm
”$-ssUK20/4-KTX 11q -^ssUK 3/1-SXK 2 -0—Typ dziki" $ - ssUK20 / 4-KTX 11q - ^ ssUK 3/1-SXK 2 - 0 — Wild type
Wartości odcinająceCut-off values
FIG. 15FIG. 15
175 143175 143
Sph_L < HindJliSph_L <HindJli
PstPst
PvuPvu
Hind_flj_< Sac_L Bglf< SacT _ClaTHind_flj_ <Sac_L Bglf <SacT _ClaT
Hind liiHind lii
12000 / (Bgl / Bani)12000 / (Bgl / Bani)
Pst'Pst '
SmaSma
PvuPvu
BglJlBglJl
BcFBcF
10000.10,000.
SV40·SV40
TthlTfiTthlTfi
BclTBclT
Kpn.Cpn.
^i-promo^^ i-promo ^
---—-a-----and
40004000
Bgl JL PstTBgl JL PstT
PvuT ScaTPvuT ScaT
EcoRT (XhoT/SalT BgN < SstT ^e^Q/ofione\i0yEcoRT (XhoT / SalT BgN <SstT ^ e ^ Q / offer \ i 0 y
(EcoR i(EcoR i
FIG. 1FIG. 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 złPublishing Department of the UP RP. Circulation of 90 copies. Price PLN 4.00
Claims (7)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PL93297945A PL175143B1 (en) | 1993-03-04 | 1993-03-04 | Expression vectors and their application for generation of human cells resistant against hiv for therapeutic purposes |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PL93297945A PL175143B1 (en) | 1993-03-04 | 1993-03-04 | Expression vectors and their application for generation of human cells resistant against hiv for therapeutic purposes |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL297945A1 PL297945A1 (en) | 1994-09-05 |
PL175143B1 true PL175143B1 (en) | 1998-11-30 |
Family
ID=20059684
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL93297945A PL175143B1 (en) | 1993-03-04 | 1993-03-04 | Expression vectors and their application for generation of human cells resistant against hiv for therapeutic purposes |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
PL (1) | PL175143B1 (en) |
-
1993
- 1993-03-04 PL PL93297945A patent/PL175143B1/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PL297945A1 (en) | 1994-09-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8735145B2 (en) | Property effecting and/or property exhibiting compositions for therapeutic and diagnostic uses | |
Parker et al. | Expression of v-src and chicken c-src in rat cells demonstrates qualitative differences between pp60v-src and pp60c-src | |
JP4336371B2 (en) | Method for removing mRNA inhibition / unstable region | |
US5306631A (en) | Compositions and method for inhibition of HIV production | |
Roberts et al. | Individual adenovirus type 5 early region 1A gene products elicit distinct alterations of cellular morphology and gene expression | |
AU3364089A (en) | Recombinant retroviruses | |
PL191300B1 (en) | Synthetic gene encoding green fluorescent protein, method for preparing gene, expressing vector, method for preparing cell culture | |
AU653656B2 (en) | Expression vectors and their use in the preparation of HIV-resistant human cells for therapeutic applications | |
US5985661A (en) | Anti-HIV ribozymes | |
Paludan et al. | Different relative expression from two murine leukemia virus long terminal repeats in unintegrated transfected DNA and in integrated retroviral vector proviruses | |
US5583035A (en) | HIV antisense expression vectors | |
Rhim et al. | Exon2 of HIV-2 Tat contributes to transactivation of the HIV-2 LTR by increasing binding affinity to HIV-2 TAR RNA | |
Das et al. | HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro | |
PL175143B1 (en) | Expression vectors and their application for generation of human cells resistant against hiv for therapeutic purposes | |
Hunter et al. | Isolation and characterization of irradiation fusion hybrids from mouse chromosome 1 for mapping Rmc-1, a gene encoding a cellular receptor for MCF class murine retroviruses | |
US20050260717A1 (en) | Double transdominant fusion gene and protein | |
WO1998035032A2 (en) | Methods of inducing cell cycle stasis | |
HU214684B (en) | Method for the preparation of expression vectors and pharmaceutical compositions containing them | |
US20030036056A1 (en) | Inhibitors and target molecule co-localization | |
US20030177509A1 (en) | Mouse model for HIV infection utilizing a chimeric HIV/MLV Gag protein that permits efficient assembly from murine cells | |
Schiller | Characterization Of A Human 70,000 Dalton Heat Shock Protein Gene Segment And Its Regulation |