PL174673B1

PL174673B1 - Method of obtaining hyaluronidaze

Info

Publication number: PL174673B1
Application number: PL94305076A
Authority: PL
Inventors: Jan Czarnecki; Dariusz Pietrzykowski; Jolanta Gogo-Kosiorek; Barbara Trafała; Małgorzata Wolińska
Original assignee: Przed Farmaceutyczne Jelfa Sa
Priority date: 1994-09-15
Filing date: 1994-09-15
Publication date: 1998-08-31
Also published as: PL305076A1

Abstract

1. Sposób otrzymywania hyaluronidazy polegający na ekstrakcji jąder ssaków 0,1 N kwasem octowym z dodatkiem kwasu solnego przy pH od 3,2 do 3,6, znamienny tym, że roztwór po odwirowaniu doprowadza się do pH 4 do 6 za pomocą wodorotlenku i oddziela powstałe balasty przez odwirowanie, a pozostały po odwirowaniu roztwór oczyszcza się znanym sposobem i poddaje suszeniu rozpyłowemu.1. A method of obtaining hyaluronidase by extracting mammalian nuclei 0.1 N acetic acid with the addition of hydrochloric acid at a pH of 3.2 to 3.6, characterized in that the centrifugation solution is adjusted to pH 4 to 6 with hydroxide and separates the resulting ballasts by centrifugation, and the solution remaining after centrifugation is cleaned in a known manner and spray-dried.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania hyaluronidazy, która znajduje zastosowanie w leczeniu jaskry, we wlewach kroplowych podskórnych w celu zwiększenia zasięgu działania środków miejscowo znieczulających, ponadto podawanie tego leku ułatwia wchłanianie 0,9% chlorku sodu lub 5% roztworu glukozy, przyspiesza wchłanianie płynu wysiękowego z jamy opłucnej, brzusznej i stawowej. Hyaluronidaza jest miejscowo stosowana w zapaleniu naczyń krwionośnych, żylakach, zmianach pourazowych, a łącznie z hydrokortyzonem jest stosowana w leczeniu reumatologicznego zapalenia stawów.The subject of the invention is a method of obtaining hyaluronidase, which is used in the treatment of glaucoma, in subcutaneous drip infusions in order to increase the range of action of local anesthetics, moreover, administration of this drug facilitates the absorption of 0.9% sodium chloride or 5% glucose solution, accelerates the absorption of exudate fluid from pleural, abdominal and articular cavities. Hyaluronidase is topically used in vasculitis, varicose veins, and traumatic lesions, and together with hydrocortisone it is used to treat rheumatological arthritis.

Znany jest sposób otrzymywania hyaluronidazy polegający na ekstrakcji jąder ssaków roztworem chlorku sodu przy pH od 5,8 do 6,3, kilkakrotnym wysoleniu siarczanem amonu, odsoleniu i liofilizacji.There is a known method of obtaining hyaluronidase, which consists in extracting mammalian nuclei with sodium chloride solution at pH from 5.8 to 6.3, salting out with ammonium sulphate several times, desalting and freeze-drying.

Inny znany sposób otrzymywania hyaluronidazy polega na ekstrakcji jąder ssaków 0,1 N kwasem octowym, selektywnym wytrąceniu acetonem, dializie i liofilizacji.Another known method of obtaining hyaluronidase is the extraction of mammalian nuclei with 0.1 N acetic acid, selective precipitation with acetone, dialysis and lyophilization.

Znany jest również sposób otrzymywania hyaluronidazy polegający na ekstrakcji jąder ssaków 0,1 N kwasem octowym z dodatkiem kwasu solnego, przy pH od 3,2 do 3,6 selektywnym wysoleniu siarczanem amonu, odsoleniu i liofilizacji.There is also a known method of obtaining hyaluronidase, which consists in extracting mammalian nuclei with 0.1 N acetic acid with the addition of hydrochloric acid, at a pH from 3.2 to 3.6, selectively salting out with ammonium sulphate, desalting and freeze-drying.

Wadą znanych sposobów otrzymywania hyaluronidazy jest stosowanie dużych ilości soli (np. siarczanu amonu) i rozpuszczalników organicznych szkodliwych i niebezpiecznych dla środowiska. Wadą jest również duża pracochłonność i czasochłonność procesu. Ponadto otrzymany znanymi sposobami liofilizat jest niejednorodny co jest przyczyną wielu problemów technologicznych przy produkcji maści.The disadvantage of the known methods of obtaining hyaluronidase is the use of large amounts of salts (e.g. ammonium sulfate) and organic solvents which are harmful and dangerous to the environment. Another disadvantage is that the process is laborious and time-consuming. In addition, the lyophilisate obtained by known methods is heterogeneous, which causes many technological problems in the production of ointments.

Sposób otrzymywania hyaluronidazy według wynalazku polega na ekstrakcji jąder ssaków 0,1 N kwasem octowym z dodatkiem kwasu solnego przy pH od 3,2 do 3,6, po czym roztwór po odwirowaniu doprowadza się do pH od 4,8 do 5,2 za pomocą wodorotlenku i oddziela powstałe balasty przez odwirowanie, zaś pozostały po odwirowaniu roztwór oczyszcza się znanym sposobem i poddaje suszeniu rozpyłowemu. Korzystnie jest, gdy jako wodorotlenek stosuje się wodorotlenek sodu.The method of obtaining hyaluronidase according to the invention consists in extracting the nuclei of mammals with 0.1 N acetic acid with the addition of hydrochloric acid at a pH of 3.2 to 3.6, and then, after centrifugation, the solution is adjusted to a pH of 4.8 to 5.2 with of hydroxide and the resulting ballasts are separated by centrifugation, and the solution remaining after centrifugation is purified in a known manner and subjected to spray drying. Preferably sodium hydroxide is used as the hydroxide.

Roztwór pozostały po oddzieleniu balastów korzystnie jest oczyszczać za pomocą chromatografii kolumnowej na sitach molekularnych.The solution remaining after the separation of the ballasts is preferably purified by column chromatography on a molecular sieve.

Korzystnie jest również gdy suszenie rozpyłowe prowadzi się w temperaturze wlotu 200 - 220¾ i temperaturze wylotu 85 - 95°C.It is also preferred that the spray drying is carried out at an inlet temperature of 200-220 ° C and an outlet temperature of 85-95 ° C.

1746Ί31746Ί3

Zaletą sposobu według wynalazku jest prostota wykonania, używanie bardzo małej ilości odczynników chemicznych, niestosowanie rozpuszczalników organicznych i duża wydajność procesu. Produkt otrzymany sposobem według wynalazku jest jednorodny co ułatwia produkcję form gotowych w oparciu o ten preparat, np. maści, kremów.The advantage of the process according to the invention is the simplicity of implementation, the use of a very small amount of chemical reagents, the use of no organic solvents and the high efficiency of the process. The product obtained by the method according to the invention is homogeneous, which facilitates the production of ready-made forms based on this preparation, e.g. ointments, creams.

Sposób według wynalazku jest bliżej wyjaśniony w przykładach wykonania.The method according to the invention is explained in more detail in the working examples.

Przykład I. 40,0 kg zmielonych jąder ssaków miesza się z 40,0 dm³ 0,1 N kwasu octowego i dodaje się 2,0 dm3 2 N kwasu solnego otrzymując pH mieszaniny 3,2. Ekstrakcję prowadzi się przez 2 godziny w temperaturze +5 °C do l0°C. Po tym czasie ekstrakt oddziela się od wytłoków poprzez wirowanie i otrzymuje się 49,0 dm3 roztworu. Roztwór nastawia się na pH = 5,0 40% wodorotlenkiem sodu zużywając do tego celu 0,305 dm3 wodorotlenku. Roztwór o pH = 5,0 zostawia się przez 8 godzin w chłodnym pomieszczeniu w temperaturze ±5°C, w celu uformowania osadu balastów. Po wirowaniu osad odrzuca się, a pozostały z nad osadu płyn o objętości 40,0 dm3 zatęża się na wyparce próżniowej do objętości 6,0 dm3 w temperaturze mniejszej niż 35°C. Zatężony roztwór zostawia się na 8 godzin w temperaturze 5°C i po tym czasie wiruje. Klarowny, zatężony roztwór poddaje się chromatografii kolumnowej na Sephadex G-25 równoważony wodą destylowaną. Aktywne frakcje zbiera się razem otrzymując 18,0 dm3 roztworu i zatęża się go na wyparce próżniowej do objętości 1,5 dm3 Tak otrzymany roztwór poddaje się ponownie chromatografii kolumnowej, tym razem na G-50 równoważony wodą destylowaną. Frakcje zawierające aktywny enzym zlewa się razem otrzymując 6,5 dm3 roztworu. Zatęża się go do objętości 2,0 dm3 na wyparce próżniowej. Zatężony roztwór po odwirowaniu i sączeniu jałowym poddaje się suszeniu rozpyłowemu o temperaturze wlotu 200 - 220°C i temperaturze wylotu 85 - 95°C. Otrzymuje się 18 g substancji o aktywności właściwej 695 jedn./mg.EXAMPLE 1 40.0 kg of ground mammalian testes are mixed with 40.0 dm ^{3 of} 0.1 N acetic acid and 2.0 dm 3 of 2N hydrochloric acid are added to obtain a mixture of pH 3.2. The extraction is carried out for 2 hours at a temperature of +5 ° C to 10 ° C. After this time, the extract was separated from the pomace by centrifugation, and 49.0 dm3 of solution was obtained. The solution is adjusted to pH 5.0 with 40% sodium hydroxide, consuming 0.305 liters of hydroxide for this purpose. The solution with pH = 5.0 is left for 8 hours in a cool room at a temperature of ± 5 ° C to form a ballast deposit. After centrifugation, the pellet is discarded, and the 40.0 dm3 supernatant fluid is concentrated on a vacuum evaporator to a volume of 6.0 dm3 at a temperature less than 35 ° C. The concentrated solution is left for 8 hours at 5 ° C, after which it is centrifuged. The clear, concentrated solution is subjected to Sephadex G-25 column chromatography equilibrated with distilled water. The active fractions are combined to give 18.0 liters of solution and concentrated on a vacuum evaporator to a volume of 1.5 liters. The solution thus obtained is again subjected to column chromatography, this time on a G-50 equilibrated with distilled water. The active enzyme containing fractions are pooled together to obtain 6.5 liters of solution. It is concentrated to a volume of 2.0 dm3 on a vacuum evaporator. The concentrated solution, after centrifugation and sterile filtration, is subjected to spray drying with an inlet temperature of 200-220 ° C and an outlet temperature of 85-95 ° C. 18 g of a substance with a specific activity of 695 U / mg are obtained.

Przykład II. 40,0 kg zmielonych jąder ssaków miesza się z 40,0 dm3 0,1 N kwasu octowego i dodaje 2,0 dm3 2 N kwasu solnego otrzymując pH = 3,4 mieszaniny ekstrakcyjnej. Ekstrakcję prowadzi się 2 godziny w temperaturze 5°C do 10°C. Po tym czasie ekstrakt oddziela się od wytłoków poprzez wirowanie. Otrzymuje się 47,0 dm3 roztworu. Roztwór ten nastawia się na pH = 5, 40% wodorotlenkiem potasu. Do tego celu zużywa się około 0,295 dm3 wodorotlenku. Roztwór o pH = 5,0 pozostawia się w temperaturze 5°C przez 8 godzin w celu uformowania osadu. Osad jako balast usuwa się przez wirowanie. Otrzymuje się 37,5 dm3 płynu z nad osadu. Płyn ten zatęża się na wyparce do objętości 5,3 dm3 w temperaturze nie większej niż 35°C. Zatężony roztwór pozostawia się na 1 godzinę w temperaturze 5°C i po tym czasie wiruje się. Klarowny, zatężony roztwór poddaje się chromatografii kolumnowej na Sephadex G-25 równoważony wodą destylowaną. Aktywne frakcje zlewa się razem otrzymując roztwór o objętości 16,8 dm3 Zatęża się go na wyparce próżniowej w temperaturze poniżej 35°C do objętości 1,5 dm3 Tak zatężony roztwór poddaje się chromatografii kolumnowej na Sephadex G-50 równoważony wodą destylowaną. Frakcje zawierające aktywny enzym zlewa się razem. Otrzymuje się 6,0 dm3 roztworu. Roztwór zatęża się do objętości 2,0 dm3 na wyparce próżniowej. Zatężony roztwór po odwirowaniu i sączeniu jałowym poddaje się suszeniu rozpyłowemu o temperaturze wlotu 200 - 220°C i temperaturze wylotu 85 - 95°C. Otrzymuje się 23,0 g substancji o aktywności właściwej 526 jedn./mg.Example II. 40.0 kg of ground mammalian testes are mixed with 40.0 dm3 of 0.1N acetic acid and 2.0 dm3 of 2N hydrochloric acid are added to obtain pH = 3.4 of the extraction mixture. Extraction is carried out for 2 hours at 5 ° C to 10 ° C. After this time, the extract is separated from the pomace by centrifugation. 47.0 liters of solution are obtained. This solution is adjusted to pH = 5 with 40% potassium hydroxide. About 0.295 dm3 of hydroxide is used for this purpose. The solution with pH = 5.0 is allowed to stand at 5 ° C for 8 hours to form a precipitate. The sediment as ballast is removed by centrifugation. 37.5 dm3 of fluid is obtained from the above sediment. The fluid is concentrated on an evaporator to a volume of 5.3 dm3 at a temperature not exceeding 35 ° C. The concentrated solution is left for 1 hour at 5 ° C, after which it is centrifuged. The clear, concentrated solution is subjected to Sephadex G-25 column chromatography equilibrated with distilled water. The active fractions are pooled together to give a solution of 16.8 liters. It is concentrated on a vacuum evaporator at a temperature below 35 ° C to a volume of 1.5 liters. The concentrated solution is then subjected to column chromatography on Sephadex G-50 equilibrated with distilled water. The active enzyme containing fractions are pooled together. 6.0 dm3 of solution are obtained. The solution is concentrated to a volume of 2.0 dm3 on a vacuum evaporator. The concentrated solution, after centrifugation and sterile filtration, is subjected to spray drying with an inlet temperature of 200-220 ° C and an outlet temperature of 85-95 ° C. 23.0 g of a substance with a specific activity of 526 U / mg are obtained.

174 673174 673

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 2,00 złPublishing Department of the UP RP. Circulation of 90 copies. Price PLN 2.00

Claims

Patent claims

1. The method of obtaining hyaluronidase consisting in the extraction of mammalian nuclei with 0.1 N acetic acid with the addition of hydrochloric acid at a pH from 3.2 to 3.6, characterized in that the solution after centrifugation is adjusted to pH 4 to 6 with hydroxide and separated the resulting ballasts by centrifugation, and the solution remaining after centrifugation is purified in a known manner and subjected to spray drying.

2. The method according to p. The process of claim 1, wherein the hydroxide is sodium hydroxide.

3. The method according to p. The process of claim 1 or 2, characterized in that the solution remaining after the separation of the ballasts is purified by means of column chromatography on molecular sieves.

4. The method according to p. The process of claim 1, wherein the spray-drying is carried out at an inlet temperature of 200 ° C to 220 ° C and an outlet temperature of 85 ° C to 95 ° C.

* * *