PL171150B1 - Method of separating a racemic mixture of nucleoside enantiomers - Google Patents

Method of separating a racemic mixture of nucleoside enantiomers

Info

Publication number
PL171150B1
PL171150B1 PL92310211A PL31021192A PL171150B1 PL 171150 B1 PL171150 B1 PL 171150B1 PL 92310211 A PL92310211 A PL 92310211A PL 31021192 A PL31021192 A PL 31021192A PL 171150 B1 PL171150 B1 PL 171150B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
ftc
acid
enantiomers
cells
enzyme
Prior art date
Application number
PL92310211A
Other languages
Polish (pl)
Inventor
Dennis C Liotta
Raymond F Schinazi
Woo-Baeg Choi
Original Assignee
Univ Emory
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Emory filed Critical Univ Emory
Priority claimed from PCT/US1992/001339 external-priority patent/WO1992014743A2/en
Publication of PL171150B1 publication Critical patent/PL171150B1/en

Links

Landscapes

  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

1. The separation method of a recemic mixture of enantiomers consists in subjecting the recemic mixture to the operation of an enzyme. Characterized in that: The enzyme, which selectively catalyzes the reaction with one enantiomer, is selected from the group covering the following enzymes: esterase, lipase, substylysine, α-chymotrypsin and cytidine desoxycytidine deaminase.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób rozdzielania mieszaniny enancjomerów nukleozydu, a zwłaszcza biologicznie czynnego nukleozydu 2-hydroksymetylo-5-(5-fuorocytozynvlo-1)1,3-oksatiolanu. Nukleozyd ten znajduje zastosowanie w leczeniu zespołu nabytego braku odporności (AIDS).The present invention relates to a process for the separation of a mixture of nucleoside enantiomers, in particular the biologically active nucleoside 2-hydroxymethyl-5- (5-fuorocytosin-1) 1,3-oxathiolane. This nucleoside finds use in the treatment of acquired immune deficiency syndrome (AIDS).

W 1981 r zidentyfikowano zespół nabytego braku odporności (AIDS) jako chorobę, która upośledza ludzki układ odpornościowy i która prawie bez wyjątku prowadzi do śmierci. W 1983 r. ustalono etiologię AIDS, wykazując, że przyczyną tej choroby jest wirus niedoboru odpornościowego u ludzi (HTV). W grudniu 1990 r Światowa Organizacja Zdrowia oceniła, ze 8 do 10 milionów ludzi na święcie jest zakażonych wirusem HIV, z tej liczby 10000001400000 w Stanach Zjednoczonych Ameryki. W 1985 r. doniesiono, ze syntetyczny nukleozyd, 3'-azydo-3'-dezoksytymidyna (AZT) hamuje rozmnażanie wirusa niedoboru odpornościowego u ludzi. Od tego czasu stwierdzono, że szereg innych syntetycznych nukleozydów, w tym 2',3'-dwudezoksyinozyna (DDI), 2',3'-dwudezoksycytydyna (DDC), 3'-fluoro-3'-dezoksytymidyna (FLT) i 2',3'-dwudezoksy-2',3'-dwudehydrotymidyna (D4T), wykazuje aktywność przeciw HIV. Stwierdzono, że wiele innych 2',3'-dwudezoksynukleotydów hamuje wzrost różnych wirusów in vitro. Wydaje się, ze powyższe syntetyczne nukleozydy po fosforylacji w komórce do 5-trójfosforanu przez komórkowe kinazy są wbudowywane w rosnący łańcuch DNA wirusa i powodują zakończenie wzrostu łańcucha ze względu na brak grupy 3'-hydrokyslowej.In 1981, acquired immune deficiency syndrome (AIDS) was identified as a disease that impairs the human immune system and is nearly fatal. In 1983, the etiology of AIDS was established, showing that the cause of the disease is human immunodeficiency virus (HTV). In December 1990, the World Health Organization estimated that 8 to 10 million people worldwide were infected with HIV, of which 1,000,000,100,000 in the United States of America. In 1985, it was reported that the synthetic nucleoside 3'-azido-3'-deoxytimidine (AZT) inhibits the reproduction of the immunodeficiency virus in humans. A number of other synthetic nucleosides have since been found, including 2 ', 3'-dimesoxyinosine (DDI), 2', 3'-dimesoxycytidine (DDC), 3'-fluoro-3'-deoxytimidine (FLT) and 2 ' , 3'-Ddeoxy-2 ', 3'-Dehydrimidine (D4T), has anti-HIV activity. Many other 2 ', 3'-dipoxynucleotides have been found to inhibit the growth of various viruses in vitro. The above synthetic nucleosides appear to be incorporated into the growing viral DNA chain after being phosphorylated in the cell to 5-triphosphate by cellular kinases and result in chain termination due to the absence of a 3'-hydrocyal group.

Skuteczne hamowanie przez różne 2',3'-dwudezoksynukleozydy replikacji HIV in vivo lub in vitro skłoniło wielu badaczy do syntetyzowania i testowania nukleozydów, w których atom węgla w pozycji 3' nukleozydu zamiemono na heteroatom. Norbeck i wsp. podają, ze (±)-1-[(2β, 4p)-2-(hydroksymetylo)-4-dioksolanyloj-tymina (określana jako (±)-dioksolano-T) wykazuje umiarkowaną aktywność wobec HIV (EC50 = 20 gm w komórkach ATHS) i nie jest toksyczna dla niezakażonych kontrolnych komórek w stężeniu 200 mM. Tetrahedron Letters, 30 (46), 6246 (1989) W opublikowanym europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0 337 713 i opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 041 449 (iAF BioChem International, Inc ) ujawniono 2- i 4-podstawione 1,3-dioksolany wykazujące aktywność przeciwwirusowąThe effective inhibition of HIV replication in vivo or in vitro by various 2 ', 3'-dinesoxynucleosides has prompted many researchers to synthesize and test nucleosides in which the 3' carbon of the nucleoside has been replaced with a heteroatom. Norbeck et al. Report that (±) -1 - [(2β, 4p) -2- (hydroxymethyl) -4-dioxolanyl] thymine (referred to as (±) -dioxolane-T) exhibits moderate activity against HIV (EC50 = 20 gm in ATHS cells) and is non-toxic to uninfected control cells at a concentration of 200 mM. Tetrahedron Letters, 30 (46), 6246 (1989) Published European Patent Application No. 0 337 713 and U.S. Patent No. 5,041,449 (iAF BioChem International, Inc) disclose 2- and 4-substituted 1,3-dioxolanes showing antiviral activity

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 047 407 i w europejskiej publikacji zgłoszenia patentowego nr 0 382 526 (także IAF BioChem International, Inc.) ujawniono szereg nukleozydów 2- i 5-podstawionych 1,3-oksatiolanow oraz podano, że mieszanina racemiczna (w pozycji C4') izomeru CT-β 2-hydroksymetylo-5-(cytozynylo-1)1,3-oksatiolanu (nazywanego dalej (±)-BCH-189) wykazuje w przybliżeniu taką samą aktywność wobec HIV jak AZT i nie wykazuje toksyczności komórkowej przy testowanych poziomach Stwierdzono także, że (±)-BCH-189 hamuje in vitro replikowanie opornych na AZT izolatów HIV od pacjentów, którym podawano AZT dłużej niż 36 tygodni.U.S. Patent No. 5,047,407 and European Patent Application Publication No. 0 382 526 (also IAF BioChem International, Inc.) disclose a number of 2- and 5-substituted 1,3-oxathiolane nucleosides and state that the racemic mixture (in position of C4 ') of the CT-β isomer of 2-hydroxymethyl-5- (cytosinyl-1) 1,3-oxathiolane (hereinafter (±) -BCH-189) shows approximately the same activity against HIV as AZT and does not exhibit cell toxicity at the levels tested, (±) -BCH-189 was also found to inhibit in vitro replication of AZT-resistant HIV isolates from patients treated with AZT for more than 36 weeks.

Innym wirusem, który stwarza poważne problemy zdrowotne jest wirus zapalenia wątroby B (określany dalej jako HBV). HBV jest drugą po tytoniu przyczyną raka u ludzi. Mechanizm wywoływania raka przez HBV nie jest znany, ale postuluje się, ze może on bezpośrednio wywoływać rozwój nowotworu albo działać pośrednio poprzez przewlekłe zapalenie, marskość wątroby oraz regenerację komórek związaną z infekcją.Another virus that causes serious health problems is the hepatitis B virus (hereinafter referred to as HBV). HBV is the second most common cause of human cancer after tobacco. The mechanism by which HBV induces cancer is unknown, but it is postulated that it may induce tumor growth directly or act indirectly through chronic inflammation, cirrhosis and cell regeneration associated with infection.

Po upływie 2 do 6 miesięcznego okresu wylęgania, w którym gospodarz jest nieświadomy infekcji, zakażenie HBV może prowadzić do ostrego zapalenia wątroby i jej uszkodzenia, wynikiem czego jest ból brzuszny, żółtaczka i podwyższone poziomy we krwi pewnych enzymów. HBV może wywoływać zapalenie wątroby o gwałtownym przebiegu, szybko postępującą i często śmiertelną postać choroby, w której duże fragmenty wątroby ulegają zniszczeniu.After a 2 to 6 month incubation period, in which the host is unaware of the infection, HBV infection can lead to acute hepatitis and hepatitis damage, resulting in abdominal pain, jaundice, and elevated blood levels of certain enzymes. HBV can cause acute hepatitis, a rapidly progressive and often fatal form of the disease in which large parts of the liver are destroyed.

Pacjenci na ogół odzyskują zdrowie po ostrym zapaleniu wątroby, u niektórych jednak utrzymują się we krwi wysokie poziomy antygenu wirusa w ciągu przedłużonego lub nieokreślonego okresu czasu, wywołując przewlekłą infekcję. Chroniczne zakażenia mogą prowadzić do chronicznego zapalenia wątroby. Pacjenci zakażeni chronicznie utrzymującym się HBV występują najczęściej w rozwijających się krajach. W połowie roku 1991 było w przybliżeniu 225 milionów chronicznych nosicieli HBV tylko w Azji, a w całym świecie prawie 300 milionów nosicieli. Chroniczne zapalenie wątroby może wywoływać zmęczenie, marskość wątroby oraz raka wątrobowo-komórkowego, głównego raka wątroby.Patients generally recover from acute hepatitis, but some maintain high levels of viral antigen in their blood for prolonged or indefinite periods of time, causing chronic infection. Chronic infections can lead to chronic hepatitis. Patients infected with chronic HBV are most common in developing countries. In the middle of 1991 was approximately 225 m ilionów chronic carriers of HBV in Asia alone, and worldwide almost 300 million, and if n Osica. Chronic hepatitis can cause fatigue, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma, the main cancer of the liver.

W zachodnich uprzemysłowionych krajach do grupy wysokiego ryzyka zakażenia HBV należą stykający się z nosicielami HBV lub próbkami ich krwi. Epidemiologia HBV jest bardzo podobna do epidemiologii zespołu nabytego niedoboru odpornościowego, co tłumaczy dla4In the western industrialized countries, people who are in contact with HBV carriers or their blood samples are among the high risk of HBV infection. The epidemiology of HBV is very n and the like epidemiology of acquired immunodeficiency syndrome, which explains dla4

171 150 czego zakażenie HBV jest pospolite wśród pacjentów z AIDS lub pokrewnym kompleksem. Jednak, HBV jest bardziej zaraźliwy niż HIV.171,150 of which HBV infection is common among patients with AIDS or a related complex. However, HBV is more contagious than HIV.

Dla uodporniania pacjentów wobec HBV wynaleziono szczepionkę pochodzącą z surowicy krwi ludzkiej. Chociaż stwierdzono, że jest ona skuteczna, to wytwarzanie jest kłopotliwe, gdyż ilość surowicy krwi ludzkiej od chronicznych nosicieli jest ograniczona, a oczyszczanie jest długie i kosztowne.For the immunization of patients against HBV, a vaccine derived from human blood serum has been developed. While it has been found to be effective, the production is cumbersome as the amount of human blood serum from chronic vectors is limited and purification is long and costly.

Ponadto, każda szarża szczepionki przyrządzona z różnych surowic musi być testowana na szympansach dla zapewnienia bezpieczeństwa. Szczepionki są także wytwarzane drogą inżynierii genetycznej. Codzienne podawanie a-interfemonu, genetycznie skonstruowanego białka, wygląda także obiecująco. Jednakże, do dzisiaj nie jest znany środek farmaceutyczny, który skutecznie hamuje rozmnażanie wirusa.In addition, each batch of vaccine made from different sera must be tested on chimpanzees to ensure safety. Vaccines are also produced by genetic engineering. Daily administration of a-interphemon, a genetically engineered protein, also looks promising. However, no pharmaceutical agent that effectively inhibits the reproduction of the virus is known to date.

Aby nukleozyd mógł być wprowadzony na rynek do celów farmaceutycznych musi być on nie tylko skuteczny i mało toksyczny, ale także opłacalny w wytwarzaniu. Prowadzone są intensywne badania zmierzające do opracowania nowych, opłacalnych sposobów wytwarzania nukleozydu 2',3'-dwudezoksynukleozydy są obecnie wytwarzane jednym z dwóch sposobów: pierwszy to otrzymywanie pochodnych kompletnych nukleozydów, drugi - kondensacja pochodnej reszty podstawionej pochodnej cukrowej z zasadą heterocykliczną.In order for a nucleoside to be placed on the market for pharmaceutical purposes, it must not only be effective and low-toxic, but also cost-effective to produce. Intensive research is underway to develop new, cost-effective methods for the production of 2 ', 3'-ddeoxynucleosides, and are currently produced in one of two ways: the first is to derive complete nucleoside derivatives, the second is to condense a derivative of a substituted sugar derivative residue with a heterocyclic base.

Chociaż z otrzymywaniem nowych nukleozydów drogą modyfikacji kompletnych nukleozydów są związane liczne niedogodności, to główną zaletą tego podejścia jest to, że utrzymuje się odpowiednią absolutną stereochemię naturalnego produktu. Jednak takie podejście nie może być stosowane w przypadku wytwarzania nukleozydów, które zawierają me występujące w naturze zasady lub reszty węglowodanowe i które tym samym nie mogą być otrzymywane z kompletnych nukleozydów, takich jak nukleozydy 1,3-oksatiolanowe i 1,3-dioksolanowe.While numerous disadvantages are associated with obtaining new nucleosides by modification of complete nucleosides, the main advantage of this approach is that the absolute stereochemistry of the natural product is maintained properly. However, this approach cannot be used for the preparation of nucleosides that contain non-naturally occurring bases or carbohydrate moieties and which therefore cannot be obtained from complete nucleosides such as 1,3-oxathiolane and 1,3-dioxolane nucleosides.

Gdy kondensuje się resztę węglowodanową lub węgfowodanopodobną z zasadą heterocykliczną w celu otrzymania syntetycznego nukleozydu, wytworzony nukleozyd posiada dwa chiralne centra (przy Cl' i C4') i występuje w postaci pary diastereomerów. Każdy diastereomer istnieje w postaci pary enangomerów. Produkt jest więc mieszaniną czterech enanqomerów.When a carbohydrate or carbohydrate-like moiety is condensed with a heterocyclic base to obtain a synthetic nucleoside, the resulting nucleoside has two chiral centers (at Cl 'and C4') and exists as a pair of diastereomers. Each diastereomer exists as a pair of enangomers. The product is therefore a mixture of the four enantiomers.

Często stwierdza się, że nukleozydy o stereochemii innej niż w produktach naturalnych, w pozycji Cl' lub C4', są mniej aktywne niz takie same naturalne nukleozydy. Np. Carter i wsp. donieśli, że stężenie (-)-enancjomeru preparatu carbovir (2',3'-dwudehydro-2',3'-dwudezoksyguanozyna) w hodowli komórek wymagane dla zmniejszenia o 50% (EC50) aktywność odwróconej transkryptazy wynosi 0,8 μΜ natomiast EC50 dla (+)-enancjomeru carboviru jest większe niż 60 μΜ. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 34 (6), 1297-1300 (czerwiec 1990).It is often found that nucleosides with non-natural stereochemistry at the Cl 'or C4' position are less active than the same natural nucleosides. For example, Carter et al. Reported that the concentration of the (-) - enantiomer of carbovir (2 ', 3'-dwudehydro-2', 3'-dipoxyguanosine) in cell culture required for a 50% (EC 50 ) reduction in reverse transcriptase activity is 0.8 μΜ while the EC50 for the (+) - carbovir enantiomer is greater than 60 μΜ. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 34 (6), 1297-1300 (June 1990).

W międzynarodowej publikacji PCT nr WO 91/11186 ujawniono, że nukleozydy 1,3-oksatiolanowe o wysokiej diastereoselektywności (o dużej zawartości procentowej nukleozydu o konfiguracji β wiązania węgla C1' z zasadą heterocykliczną) można wytwarzać dobierając starannie kwas Lewisa stosowany w procesie kondensacji. Odkryto, że kondensacja nukleozydu 1,3-oksatiolanowego z zasadą zachodzi z prawie całkowitą β-stereospecyficznością, gdy jako katalizator kondensacji stosuje się chlorek cynowy. Inne kwasy Lewisa dają niską (lub żadną) CT-e-selektywność albo wcale nie katalizują reakcji.PCT International Publication No. WO 91/11186 discloses that 1,3-oxathiolane nucleosides with high diastereoselectivity (high percentage of nucleoside having the β configuration of C1 'carbon bond to a heterocyclic base) can be prepared by carefully selecting the Lewis acid used in the condensation process. It has been found that condensation of 1,3-oxathiolane nucleoside with a base occurs with almost complete β-stereospecificity when tin chloride is used as the condensation catalyst. Other Lewis acids give little (or no) CT-e-selectivity or do not catalyze the reaction at all.

W świetle faktu, że zespół nabytego niedoboru odpornościowego, kompleks pokrewny AIDS i wirus zapalenia wątroby B osiągnęły na całym świecie poziomy epidemiczne i spowodowały tragiczne skutki dla zakażonych pacjentów, występuje silna potrzeba uzyskiwania nowych skutecznych środków farmaceutycznych do leczenia powyższych chorób, charakteryzujących się niską toksycznością dla biorcy.In view of the fact that acquired immune deficiency syndrome, a complex of related AIDS and hepatitis B virus have reached worldwide levels epidemic and resulted in tragic effects on the infected patient, there is a strong need to provide new c h rms that part n s of pharmaceutical compositions for the treatment of the above diseases , characterized by low toxicity to the recipient.

Istnieje również potrzeba opracowania ekonomicznej i nadającej się do przemysłowego stosowania metody wytwarzania ważnych farmaceutycznie nukleozydów oraz uzyskania specyficzności m pozycji C4' syntetycznego nukleozydu wytwafzanego drogą kondzysacji reszty węglowodano-podobnej z zasadą.There is also a need for an economical and suitable for industrial that it st present Osowa m ethods for preparing pharmaceutically important nucleosides, and received and spe c yfi parts of n m COMPONENTS C4 'wytwafzanego synthetic nucleoside residues by kondzysacji-like carbohydrates with a base.

Metoda zwclczcnlc infekcji HIV i HBV u ludzi i zwierząt polega na podawaniu skute^ nej ilości 2zCcdrokszceetylO-5-(5-fluorocctozynylo-1)il,c-oasa1tiolanu lnb jego ZopuszcdalyzjM e t of d and l ZWC part of c n lc of HIV and HBV in humans and animals comprising administering chained ^ football quantity and 2 Ccdroksz c eetyl O -5- (5-fluorocctozynylo-1) yl, C -oasa1tiolanu LNB his Zopuszcdalyzj

171 150 w farmacji pochodnej, w tym 5' lub N4 alkilowanej lub acylowanej pochodnej albo dopuszczalnej w farmacji soli w dopuszczalnym w farmacji nośniku.A pharmaceutically acceptable derivative, including a 5 'or N 4 alkylated or acylated derivative, or a pharmaceutically acceptable salt in a pharmaceutically acceptable carrier.

Stwierdzono, ze 2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolan (FTC) wykazuje zaskakująco wysoką aktywność wobec wirusa ludzkiego niedoboru odpornościowego, połączoną z bardzo niską toksycznością komórkową u biorcy. Stwierdzono również, że FTC wykazuje bardzo znaczną aktywność wobec HBV, może więc być stosowany do leczenia pacjentów cierpiących na różne choroby związane z zakażeniem HBV.It has been found that 2-hydroxymethyl-5- (5-fluorocytosinyl-1) -1,3-oxathiolane (FTC) has surprisingly high activity against human immunodeficiency virus, combined with very low cellular toxicity in the recipient. FTC has also been found to be very active against HBV and can therefore be used to treat patients suffering from various diseases associated with HBV infection.

Badania toksykologiczne i farmakokinetyczne potwierdzają użyteczność FTC jako środka przeciwwirusowego do podawania jako farmaceutyku. FTC i jego enancjomery są nietoksyczne dla ludzkich obwodowych komórek szpiku kostnego w stężeniu do 50 μM i dla innych linii komórkowych w stężeniu do 200 uM. FTC-TP jest głównym metabolitem wewnątrzkomórkowym w komórkach PBMC i HepG2. FTC-TP kompetytywnie inhibituje odwrotną transkryptazę (RT) HIV-1 przy K = 0,2 pM, stosując poli(I)oligo(dC) marker-primer. Stosując analizę sekwencyjną można wykazać, że FTC-TP jest silnym terminatorem łańcucha DNA, gdy jest HTV-RT (w końcu C).Toxicological and pharmacokinetic studies support the utility of FTC as an antiviral agent for administration as a pharmaceutical. FTC and its enantiomers are non-toxic to human peripheral bone marrow cells up to 50 µM and to other cell lines up to 200 µM. FTC-TP is the major intracellular metabolite in PBMC and HepG2 cells. FTC-TP competitively inhibits HIV-1 reverse transcriptase (RT) at K = 0.2 pM using poly (I) oligo (dC) marker primer. Using sequence analysis it can be shown that FTC-TP is a strong DNA chain terminator when it is HTV-RT (C-terminus).

Przewlekłe podawanie FTC nie jest toksyczne dla gryzoni, nawet w dawkach doustnych 85 mg/kg/dzień, w ciągu co najmniej dwóch miesięcy. Farmakokinetyka FTC u małp rezusów wskazuje wysoką biodostępność (około 73 ± 6%) i okres półtrwania w plazmie wynoszący około 1,34 ± 0,18 (średnia z podawania doustnego i dożylnego).Chronic administration of FTCs is not toxic to rodents, even at oral doses of 85 mg / kg / day for at least two months. The pharmacokinetics of FTC in rhesus monkeys indicate high bioavailability (approximately 73 ± 6%) and a plasma half-life of approximately 1.34 ± 0.18 (mean of oral and intravenous administration).

Sposób enzymatycznego rozdzielania racemicznej mieszaniny enancjomerów nukleozydu polegający na podawaniu mieszaniny racemicznej działaniu enzymu według wynalazku polega na tym, ze jako enzym, który wybiórczo katalizuje reakcję z jednym enancjomerem, stosuje się enzym wybrany z grupy obejmującej esterazę, lipazę, substylizynę, a-chymotryp>synę oraz dezaminazę cytydynowo-dezoksycytydynową.The method for enzymatic resolution of a racemic mixture of nucleoside enantiomers by administering the racemic mixture to an enzyme according to the invention consists in using an enzyme selected from the group consisting of esterase, lipase, substilisin, a-chymotrip> syn as an enzyme that selectively catalyzes a reaction with one enantiomer. and cytidine deoxycytidine deaminase.

W sposobie według wynalazku jako esterazę stosuje się esterazę z wątroby świni, a jako lipazę stosuje się świńską lipazę trzustkową lub lipazę Amano PS-800.In the method of the invention, porcine liver esterase is used as the esterase and porcine pancreatic lipase or Amano PS-800 lipase is used as the lipase.

W sposobie według wynalazku stosuje się mieszaninę enancjomerów nukleozydu ze zacytowaną grupą hydroksylową w pozycji C5'. Przed rozdzieleniem enancjomery poddaje się acylowaniu za pomocą związku z grupy, do której należą kwasy alkiiokarboksylowe i podstawione kwasy karboksylowe, takie jak kwas octowy, kwas propionowy, kwas masłowy, kwas walerianowy, kwas 2-chloropropionowy, kwas 2-chloromasłowy lub kwas 2-chlorowalerianowy. Enancjomery nukleozydu przepuszcza się przez kolumnę zawierającą enzym immobilizowany na nośniku. Enancjomery te miesza się z enzymem w roztworem, a reakcję enzymatyczną prowadzi się w obecności niejonowego środka powierzchniowo czynnego, korzystnie eteru glikolu polietylenowego z p-izooktylofenolem (Triton X-100). Produkt rozdzielania poddaje się działaniu drugiego enzymu, co zwiększa stopień rozdziału. Następnie produkt ten poddaje się rekrystalizacji. Produkt rozdzielania poddaje się działaniu chiralnego kwasu, takiego jak kwas jabłkowy, kwas migdałowy, kwas dwubenzoilowinowy, kwas 3-bromokamforowy, kwas kamforosulfonowy i kwas dwu-p-toluilowinowy. Rozdzielaniu poddaje się (±)-2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolan lub (±)-2-hydroksymetylo-5-(cytozynylo-1) 1,3-oksatiolan.The method of the invention uses a mixture of nucleoside enantiomers with the quoted hydroxyl group at the C5 'position. Before separation, the enantiomers are acylated with a compound from the group consisting of alkylcarboxylic acids and substituted carboxylic acids such as acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, 2-chloropropionic acid, 2-chlorobutyric acid or 2-chlorovaleric acid . The nucleoside enantiomers are passed through the column containing the enzyme immobilized on a support. These enantiomers are mixed with the enzyme in solution, and the enzymatic reaction is carried out in the presence of a non-ionic surfactant, preferably polyethylene glycol p-isooctylphenol ether (Triton X-100). The separation product is treated with a second enzyme which increases the degree of separation. The product is then recrystallized. The separation product is treated with a chiral acid such as malic acid, mandelic acid, dibenzoyltartaric acid, 3-bromocamphoric acid, camphorsulfonic acid and di-p-toluyltartaric acid. Separation is performed on (±) -2-hydroxymethyl-5- (5-fluorocytosinyl-1) -1,3-oxathiolane or (±) -2-hydroxymethyl-5- (cytosinyl-1) 1,3-oxathiolane.

Sposób ten może być stosowany do rozdzielania wielu różnych nukleozydów, w tym pirymidynowych i purynowych, ewentualnie podstawionych w reszcie węglowodanowej lub reszcie zasady.This method can be used to separate a wide variety of nucleosides, including pyrimidine and purine, optionally substituted at a carbohydrate or base residue.

Sposób powyższy może być także stosowany do rozdziału pochodnych nukleozydów zawierających dodatkowe heteroatomy w reszcie węglowodanowej, np. (±)-FTC i (±)-BCH-189. Rozdział nukleozydów może być wykonywany w dużej skali przy umiarkowanych kosztach.The above method may also be used for the separation of nucleoside derivatives containing additional heteroatoms at the carbohydrate moiety, e.g. (±) -FTC and (±) -BCH-189. The separation of nucleosides can be performed on a large scale at moderate cost.

Stosując opisane tu metody, FTC rozdzielano na enancjomery (+)-p-D i (-)-P-L. Enancjomer θ-β-L okazał się być bardziej aktywnym niż enancjomer (+)-βΟ wobec HIV, HBV i SIV Enancjomer (+) FTC jćst aównież aktywnywobec HTV; HBV i SIV.Using the methods described herein, FTC was separated into the (+) - p-D and (-) - P-L enantiomers. The θ-β-L enantiomer was found to be more active than the (+) - β enantiomer against HIV, HBV and SIV. The (+) FTC enantiomer is also active against HTV; HBV and SIV.

Krótki opis rysunkówBrief description of the drawings

Na figurze 1 przedstawiono budowę chemiczną 2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-_)1_1 'k-atlonati nlann fFTCJFigure 1 shows the chemical structure of 2-hydroxymethyl-5- (5-fluorocytosinyl) 1_1 'k-atlonati nlann fFTCJ

Figura 2 ilustruje metodę otrzymywania 2-hydroksymctylo-5-(5-fiuorocytozynylG-1)1,3-oksatiolanu.Figure 2 illustrates a method for the preparation of 2-hydroxymethyl-5- (5-fluorocytosinylG-1) 1,3-oxathiolane.

Figura 3 przedstawia specyficzność fosfatazy alkalicznej i fosfodwuesterazy z jadu węża dla (+) i (-) enancjomerów FTC.Figure 3 shows the specificity of alkaline phosphatase and snake venom phosphodiesterase for the (+) and (-) enantiomers of FTC.

Na figurze 4 przedstawiono wykres pokazujący postęp w czasie katalizowanej lipazą hydrolizy estru 5’-butyrylowego FTC przy stosowaniu enzymów Amano PS-800 (puste kwadraciki) i PLE (kółka z kropką).Figure 4 is a graph showing the progress over time of lipase catalyzed hydrolysis of FTC 5'-butyryl ester using the enzymes Amano PS-800 (open boxes) and PLE (dotted circles).

Na figurze 5 przedstawiono wykres obrazujący wpływ stężenia (M) racemicznego i wzbogaconego enancjomerycznie FTC (otrzymanego metodą z przykładu IV) na procent hamowania ludzkich komórek PBM zakażonych HiV-1; (zaciemnione kółka, (±)-FTC), (puste kółka, (-)-FTC), (zaciemnione kwadraciki, (+)-FTC).Figure 5 is a graph showing the effect of the concentration (M) of racemic and enantiomerically enriched FTC (obtained by the method of Example 4) on the percent inhibition of HiV-1 infected human PBM cells; (darkened circles, (±) -FTC), (open circles, (-) - FTC), (darkened squares, (+) - FTC).

Na figurze 6 przedstawiono wykres obrazujący wpływ stężenia (M) racemicznego i wzbogaconego enancjomerycznie FTC (otrzymanego metodą z przykładu IH) na procent hamowania ludzkich komórek PBM zakażonym HIV-1; (zaciemnione kółka - (±)-FTC, puste kółka - (-)-FTC, zaciemnione kwadraciki - (+)-FTC).Figure 6 is a graph showing the effect of the concentration (M) of racemic and enantiomerically enriched FTC (obtained by the method of Example 1H) on the percent inhibition of HIV-1 infected human PBM cells; (darkened circles - (±) -FTC, empty circles - (-) - FTC, darkened squares - (+) - FTC).

Na figurze 7 przedstawiono wykres obrazujący wchłanianie trytylowanego (±)-FTC w ludzkich komórkach PBM (średnia z dwóch oznaczeń), jako stosunek czasu (w godzinach) do pmol/106 komórekFigure 7 is a graph showing the uptake of tritylated (±) -FTC in human PBM cells (average of two determinations) as the ratio of time (hours) to pmol / 10 6 cells.

Na figurze 8 przedstawiono wykres wydalania znakowanego (±)-FTC z ludzkich komórek PBM, jako stosunek czasu (w godzinach) do pmol/106 komórek.Figure 8 is a graph of the excretion of (6) -FTC labeled from human PBM cells as the ratio of time (in hours) to pmol / 10 6 cells.

Figura 9 ilustruje obecność [3H]-(±)-(±)-FTC i jego fosforylowanych pochodnych w ludzkich komórkach HepG-2 (średnia z dwóch oznaczeń) inkubowanych w podłożu zawierającym 10 (M [3H]-(±)-FTC. Wykres obrazuje zależność pmol/106 komórek od czasu.Figure 9 illustrates the presence of [3 H] - (±) - (±) -FTC and its phosphorylated derivatives in human HepG -2 cells (average of two determinations) incubated in media containing 10 (M [3 H] - (±) - FTC Plot shows pmol / 106 cells versus time.

Na figurze 10 przedstawiono wydalanie [3H]-(±)-(±)-FTC i jego fosforylowanych pochodnych z ludzkich komórek HepG2 po przetrzymywaniu komórek w ciągu 24 godzin z 10 (M [3H]-(±)-FTC (700 DPM/pmol) i badania stężenia związku po 24 godzinach po usunięciu związku, jako zależność pmol/106 komórek od czasu.Figure 10 shows the excretion of [3 H] - (±) - (±) -FTC and its phosphorylated derivatives from human HepG2 cells after storage for 24 hours with 10 (M [3 H] - (±) -FTC (700 DPM / pmol) and compound concentration studies 24 hours after compound removal as a function of pmol / 10 6 cells against time.

Figura 11 ilustruje spadek połączonego stężenia 3H-(±)-FTC i jego fosforylowanych pochodnych w ludzkich komórkach HepG2 po inkubowaniu w ciągu 24 godzin z 10 (M [3H]-(±)-FTC (700 dPM/pmol) jako zależność pmol/106 komórek od czasu.Figure 11 illustrates the decrease in the combined concentration of 3H- (±) -FTC and its phosphorylated derivatives in human HepG2 cells after incubating for 24 hours with 10 (M [3H] - (±) -FTC (700 dPM / pmol) as the pmol / relationship. 106 cells from time.

Figura 12 obrazuje na wykresie wpływ enancjomerów FTC na tworzenie kolonii komórek prekursora granulocyto-mikrofagowego, wyrażony w procentach przeżycia w zależności od stężenia w (M (-)-FTC (puste kółko), (+)-FTC (zaciemnione kółko) i AZ-T (zaciemniony kwadracik).Figure 12 plots the effect of FTC enantiomers on colony formation of granulocytic-microfage precursor cells, expressed as percentage survival versus concentration in (M (-) - FTC (open circle), (+) - FTC (dark circle) and AZ-. T (shaded square).

Szczegółowy opis wynalazkuDetailed description of the invention

Stosowane określenie wzbogacony enancjomerycznie nukleozyd oznacza nukleozyd, który zawiera co najmniej 95% pojedynczego enancjomeru tego nukleozydu.The term enantiomerically enriched nucleoside as used herein means a nucleoside that contains at least 95% of a single enantiomer of that nucleoside.

Określenie FCT oznacza 2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolan (mieszaninę racemiczną lub enancjomery), którą także nazywa się 2'-dezoksy-5-fluoro-3'-tiacytydynąThe term FCT stands for 2-hydroxymethyl-5- (5-fluorocytosinyl-1) -1,3-oxathiolane (racemic mixture or enantiomers), which is also called 2'-deoxy-5-fluoro-3'-thiacytidine

Określenie (±)-FCT oznacza (±)-P-D,L-2-hydroksymetylo-5-(5-fiuorocytozynylo-1)-1,3oksatiolan.The term (±) -FCT means (±) -P-D, L-2-hydroxymethyl-5- (5-fluorocytosinyl-1) -1,3-oxathiolane.

Określenie (-)-FCT oznacza (-)-|3-L-2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3oksatiolan.The term (-) - FCT means (-) - | 3-L-2-hydroxymethyl-5- (5-fluorocytosinyl-1) -1,3-oxathiolane.

Określenie (+)-FCT oznacza (+)-P-D-2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,1oksatiolan.The term (+) - FCT means (+) - P-D-2-hydroxymethyl-5- (5-fluorocytosinyl-1) -1,1-oxathiolane.

Określenia FTC-MP, FTC-DP i FTC-TP oznaczają odpowiednio jednofosforan, dwufosforan i trójfosforan FTC.The terms FTC-MP, FTC-DP and FTC-TP mean FTC monophosphate, diphosphate, and triphosphate, respectively.

Określenie BCH-189 oznacza 2-hydroksymetylo-5-(cytozynylo-1)-1,3-oksatiolan.The term BCH-189 means 2-hydroxymethyl-5- (cytosinyl-1) -1,3-oxathiolane.

171 150171 150

Określenie wybiórcza kataliza enzymatyczna oznacza katalizę enzymem, który faworyzuje jeden substrat w stosunku do drugiego.The term selective enzymatic catalysis means catalysis with an enzyme that favors one substrate over another.

Określenie grupa odszczepialna oznacza grupę funkcyjną, która zapoczątkowuje przyłączanie atomu węgla oddzielając się od cząsteczki, do której jest przyłączona.The term leaving group denotes a functional group that initiates attachment of a carbon atom by separating it from the molecule to which it is attached.

Metoda zwalczania infekcji HIV i HBV oraz innymi wirusami rozmnażającymi się w podobny sposób u ludzi i zwierząt polega na podawaniu skutecznej ilości (±)-β-Ό,Ε, (-)-β-Σ lub (+)-β-ϋ enancjomeru 2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolanu, jego dopuszczalnej farmaceutycznie (fizjologicznie) pochodnej, w tym 5' lub N4 alkilowej lub acylowej pochodnej lub dopuszczalnej farmaceutycznie (fizjologicznie) soli w dopuszczalnym w farmacji nośniku. Jak wykazano poniżej, związki wytworzone sposobem według wynalazku albo same wykazują aktywność wobec retrowirusów, taką jak aktywność anty-HIV-1, anty-HIV-2 lub wobec wirusa niedoboru odpornościowego u małp (anty-SIV) albo są metabolizowane do związków, które wykazują powyższą aktywność.A method of combating HIV and HBV infection, and other viruses that reproduce in a similar manner in humans and animals, is to administer an effective amount of the (±) -β-Ό, Ε, (-) - β-Σ or (+) - β-ϋ enantiomer 2 -hydroxymethyl-5- (5-fluorocytosinyl-1) -1,3-oxathiolane, a pharmaceutically (physiologically) acceptable derivative thereof, including a 5 'or N 4 alkyl or acyl derivative or a pharmaceutically (physiologically) acceptable salt in a pharmaceutically acceptable carrier . As shown below, the compounds of the invention either exhibit retroviral activity themselves, such as anti-HIV-1, anti-HIV-2 or monkey immunodeficiency virus (anti-SIV) activity, or are metabolized to compounds that exhibit the above activity.

FTC i jego dopuszczalne w farmacji pochodne albo dopuszczalne w farmacji preparaty zawierające te związki są użyteczne do zapobiegania i zwalczania zakażeń HIV i innych pokrewnych stanów, takich jak związany z AIDS kompleks (ARC), trwałe uogólnione powiększenie węzłów chłonnych (PGL), związane z AIDS stany neurologiczne, stany związane z dodatnim odczynem przeciwciała anty-HTV i HIV, mięsak Kaposi’ego, plamica małopłytkowa i zakażenia zarazkiem oportunistycznym. Ponadto, powyższe związki stosuje się do zapobiegania lub opóźniania postępu choroby u osobników o dodatnim odczynie na przeciwciała anty-HIV lub antygen HIV lub tym, którzy zetknęli się z HIV.The FTC and its pharmaceutically acceptable derivatives or pharmaceutically acceptable formulations thereof are useful for preventing and combating HIV infection and other related conditions such as AIDS-related complex (ARC), persistent generalized lymphadenopathy (PGL), related to AIDS. neurological conditions, conditions associated with positive anti-HTV antibody and HIV, Kaposi's sarcoma, thrombocytopenic purpura and opportunistic infections. In addition, the above compounds are used to prevent or delay disease progression in individuals who are positive for anti-HIV antibodies or HIV antigen or who have been exposed to HIV.

FTC i jego dopuszczalne w farmacji pochodne lub sole albo dopuszczalne w farmacji preparaty zawierające te związki są także użyteczne w zapobieganiu i zwalczaniu infekcji HBV i innych pokrewnych stanów, takich jak stany związane z dodatnim odczynem na przeciwciała anty-HBV i HBV, przewlekłe zapalenie wątroby wywołane przez HBV, marskość wątroby, ostre zapalenie wątroby, piorunujące zapalenia wątroby, przewlekłe zapalenie wątroby i zmęczenie. Powyższe związki lub preparaty mogą być również stosowane profilaktycznie dla zapobiegania lub opóźniania postępu choroby u osobników, którzy wykazują dodatni odczyn na przeciwciała anty-HBV i antygen HBV lub którzy zetknęli się z HBV.The FTC and its pharmaceutically acceptable derivatives or salts or pharmaceutically acceptable preparations containing these compounds are also useful in the prevention and control of HBV infection and other related conditions such as conditions associated with anti-HBV and HBV antibody positivity, chronic hepatitis caused by by HBV, cirrhosis, acute hepatitis, fulminant hepatitis, chronic hepatitis and fatigue. The above compounds or formulations can also be used prophylactically to prevent or delay disease progression in subjects who are positive for anti-HBV antibodies and HBV antigen, or who have been exposed to HBV.

Sposobem według wynalazku rozdziela się:The method according to the invention separates:

a) (±)^D,L-2-hydroksymetylo-5-(5-fiuorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolan i jego dopuszczalne w farmacji pochodne i sole; i otrzymuje się:a) (±) 1 D, L-2-hydroxymethyl-5- (5-fiuorocytosinyl-1) -1,3-oxathiolane and pharmaceutically acceptable derivatives and salts thereof; and one gets:

b) (-^^L^-hydroksymetyla-S-iS-fluoroigyojgyylcollH^-oksatiolan i jego dopuszczalne w farmacji pochodne lub sole;b) (- ^ ^ L ^ -hydroxymethyl-S-^ -fluoroigyljgyylcoll ^ -oxathiolane and pharmaceutically acceptable derivatives or salts thereof;

c) (+)^D-2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolan i jego dopuszczalne w farmacji pochodne i sole.c) (+) < 1 > D-2-hydroxymethyl-5- (5-fluorocytosinyl-1) -1,3-oxathiolane and pharmaceutically acceptable derivatives and salts thereof.

Niżej przedstawiono kilka sposobów wytwarzania nukleozydu:Several methods for producing a nucleoside are outlined below:

a) Sposób wytwarzania 2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolanu polega na tym, że (i) ewentualnie ochronioną 5-fluorocytozynę poddaje się reakcji z 1,3-oksatiolanem o wzorze A w którym R]a oznacza atom wodoru lub grupę chroniącą grupę hydroksylową, w tym acylową, a L oznacza grupę odszczepialną, po czym ewentualnie usuwa się grupę chromącą grupę hydroksylowya) A method for the preparation of 2-hydroxymethyl-5- (5-fluorocytosinyl-1) -1,3-oxathiolane consists in: (i) reacting an optionally protected 5-fluorocytosine with 1,3-oxathiolane of formula A wherein R ] a is a hydrogen atom or a hydroxyl protecting group, including an acyl group, and L is a leaving group, and optionally the chromium group is removed from the hydroxyl group

171 150 (ii) związek o wzorze B >iHRib(Ii) a compound of formula B> and HR ib

w którym Ru ma wyżej podane znaczenie, a Rib oznacza grupę chroniącą grupę aminową, poddaje się reakcji z czynnikiem fluorującym w celu wprowadzenia atomu fluoru w pozycję 5 pierścienia cytozyny; lub (iii) związek o wzorze Cwherein Ru is as defined above and Rib is an amino protecting group, is reacted with a fluorinating agent to introduce a fluorine atom at the 5-position of the cytosine ring; or (iii) a compound of formula C

w którym Ru ma wyżej podane znaczenie poddaje się reakcji ze środkiem służącym do przekształcania grupy keto w pozycji 4 pierścienia uracylu w grupę aminową; po czym wszystkie grupy ochronne usuwa się i otrzymuje pożądany produkt.wherein R u is as defined above is reacted with an agent to convert the keto group at the 4-position of the uracil ring to an amino group; after which all protecting groups are removed to give the desired product.

W odniesieniu do procesu (i), grupami chroniącymi grupę hydroksylową mogą być grupy opisane szczegółowo poniżej, w tym.gpupa acylowa (np. acetylowa, aryloacylowa (np. benzoilowa lub podstawiona benzoilowa), trytylowa lub jednotrytylowa, benzylowa lub podstawiona benzylowa, trójpodstawiona grupa sililowa, w tym trójalkilosililowa (np. dwumetylo-III-rzęd.-butylosihlowa) lub dwufenylometylosllilcwa. Pochodna 5-fluorocytozynowa może być ewentualnie ochroniona grupami trójpodstawionymi siblowymi. Grupy ochronne można usuwać znanymi sposobami. Grupa odszczepialna L jest typową grupą znaną z chemii nukleozydów, np. atom chlorowca, taki jak chloru lub bromu, grupa alkoksylowa, taka jak metoksylowa lub etoksylowa, albo acylowa, taka jak acetylowa lub benzoilowaWith respect to process (i), the hydroxyl protecting groups may be those described in detail below, including acyl group (e.g., acetyl, arylacyl (e.g., benzoyl or substituted benzoyl), trityl or monotrityl, benzyl or substituted benzyl, trisubstituted group. silyl, including trialkylsilyl (e.g., dimethyl tertiary butylsilyl) or diphenylmethylsilylcwa. The 5-fluorocytosine derivative may be optionally protected with trisubstituted groups. Protective groups may be removed by known methods. The L leaving group is a typical group known from nucleoside chemistry. e.g. a halogen atom such as chlorine or bromine, an alkoxy group such as methoxy or ethoxy, or an acyl group such as acetyl or benzoyl

Reakcje w sposobie a (i) można prowadzić w rozpuszczalniku organicznym (np w 1,2-dwuchloroetanie lub acetonitrylu) w obecności kwasu Lewisa, korzystnie chlorku cynowego lub trójfluorometylosulfonianu trójmetylosililu.The reactions of process a (i) may be carried out in an organic solvent (e.g. 1,2-dichloroethane or acetonitrile) in the presence of a Lewis acid, preferably stannic chloride or trimethylsilyl trifluoromethylsulfonate.

Związki o wzorze A, w którym L oznacza grupę acylową (np. acetylową), można otrzymywać w reakcji związku o wzorze DCompounds of formula A where L is acyl (e.g., acetyl) can be prepared by reacting a compound of formula D

(w którym Ru ma znaczenie podane uprzednio) z czynnikiem redukującym, np. wodorkiem litowoglinowym, a następnie reakcji z reagentem potrzebnym dla uzyskania pożądanego pół171150 produktu, np reakcji z bezwodnikiem kwasu karboksylowego, np bezwodnikiem octowym, w przypadku acylowama reakcji z czynnikiem chlorującym lub bromującym w przypadku chlorowcowania, lub z reagentami alkilującymi.(where Ru is as defined previously) with a reducing agent, e.g. lithium aluminum hydride, followed by reaction with a reagent needed to obtain the desired semi-171150 product, e.g. with a carboxylic acid anhydride, e.g. acetic anhydride, in the case of acylation with a chlorinating or brominating agent in the case of halogenation, or with alkylating reagents.

Związek o wzorze D można wytwarzać w reakcji związku o wzorze EA compound of formula D can be prepared by reacting a compound of formula E

H.H.

RR

ze związkiem o wzorze HSCH2COOH, prowadzonej w podwyższonej temperaturze.with a compound of formula HSCH 2 COOH carried out at elevated temperature.

Związek o wzorze E można wytwarzać drogą ozonolizy alliiowego eteru lub estru o wzorze CH2=CH-CH2-OR lub dwueteru albo dwuestru 2-buteno-1,3-diolu o wzorze ROCH^CH=CH-CH2OR, gdzie R oznacza grupę ochronną, takąjak alkilowa, siliiowa lub acylowaA compound of formula E may be prepared by ozonolysis alliiowego ether or ester of the formula CH 2 = CH-CH2-OR or dwueteru or diester of 2-butene-1,3-diol having the formula ROCH ^ CH = CH-CH 2 OR, where R is a protecting group such as alkyl, silyl or acyl

W odniesieniu do procesu a (ii) atom fluoru w pozycję 5 można wprowadzać znanymi metodami opisanymi przez M J. Robinsa i wsp. w Nucleic Acid Chemistry, część 2, wyd. L. B. Towsend i R. S. Tipson, J. Wiley and Sons, New York, 895-900 (1978) i w cytowanych tam odnośnikach; orazR. Duschinsky Nucleic Acid Chemistry, część 1, wyd. L. B. Towsend 1R. S Tipson, J Wiley and Sons, New York, 43-46 (1978) i w cytowanych tam czasopismach Środkiem fluorującym może być np. podfluoryn trójmetylu w fluorotrójchlorometanie.Regarding process a (ii), a fluorine atom in the 5-position can be introduced by known methods described by M. J. Robins et al. In Nucleic Acid Chemistry, Part 2, Ed. L. B. Towsend and R. S. Tipson, J. Wiley and Sons, New York, 895-900 (1978) and references cited therein; and R. Duschinsky Nucleic Acid Chemistry, Part 1, Ed. L. B. Towsend 1R. S Tipson, J Wiley and Sons, New York, 43-46 (1978) and in the journals cited therein. The fluorinating agent may be, for example, trimethyl hypfluorite in fluorotrichloromethane.

W odniesieniu do procesu a (iii), związek o wzorze C można poddawać reakcji z 1,2,4-triazolem i dwuchlorofosforanem 4-chlorofenylu. Otrzymuje się odpowiedni związek 4-(1,2,4-triazoililowy), który przekształca się w pożądaną 4-aminocytydynę w reakcji, np. z metanolem.Regarding process a (iii), a compound of formula C can be reacted with 1,2,4-triazole and 4-chlorophenyl dichlorophosphate. The corresponding 4- (1,2,4-triazoilyl) compound is obtained, which is converted into the desired 4-aminocytidine by reaction, for example, with methanol.

Wyjściowe związki o wzorach B i C można otrzymywać np. w reakcji odpowiedniej (ewentualnie ochronionej) zasady ze związkiem o wzorze A, w sposób analogiczny do opisanego dla procesu a (i). 5-Fluuorouracyl i 5-fluorocytozyna są związkami handlowymi, sprzedawanymi przez firmę Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI 53233, Stany Zjednoczone Ameryki.Starting compounds of the formulas B and C can be obtained, for example, by reacting a suitable (optionally protected) base with a compound of the formula A in a manner analogous to that described for process a (i). 5-Fluuorouracil and 5-fluorocytosine are commercial compounds sold by Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI 53233, USA.

Rozdzielanie enancjomerów (±) można przeprowadzić tak, jak to szczegółowo przedstawiono w ponizszych przykładach wykonania..Resolution of the (6) enantiomers can be performed as detailed in the following working examples.

FTC można przekształcać w dopuszczalny w farmacji ester w reakcji z odpowiednim środkiem estryfikującym, np. halogenkiem lub bezwodnikiem kwasowym. FTC lub jego dopuszczalną w farmacji pochodną można przekształcać w dopuszczalną w farmacji sól, stosując znany sposób, np. w reakcji z odpowiednią zasadą Ester lub sól FTC można przekształcać w FTC, np. drogą hydrolizy.FTC can be converted to a pharmaceutically acceptable ester by reaction with a suitable esterifying agent, e.g., an acid halide or anhydride. FTC or a pharmaceutically acceptable derivative thereof can be converted into a pharmaceutically acceptable salt using a known method, e.g. by reaction with an appropriate base. The ester or salt of FTC can be converted to FTC, e.g. by hydrolysis.

I. Aktywny związek i jego dopuszczalne fizjologicznie pochodne i soleI. The active compound and its physiologically acceptable derivatives and salts

Przedstawiony w opisie aktywny przeciwwirusowo związek jest 2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolanein (patrz figura 1) w postaci mieszaniny racemicznej lub wydzielonego enancjomeru.The antiviral active compound described herein is 2-hydroxymethyl-5- (5-fluorocytosinyl-1) -1,3-oxathiolanein (see figure 1) as a racemic mixture or as an isolated enantiomer.

Aktywny związek może być podawany w postaci pochodnej, która po podaniu biorcy jest zdolna jest bezpośrednio lub pośrednio przekształcać się w macierzysty FTC lub która sama wykazuje aktywność. Nieograniczającymi przykładami są dopuszczalne w farmacji sole (alternatywnie określane jako dopuszczalne fizjologicznie sole) oraz 5' i N4 acylowane lub alkilowane pochodne (alternatywnie określane jako aktywne fizjologicznie lub farmaceutycznie pochodne) W jednej odmianie, grupą acylową jest ester kwasu karboksylowego, w którym reszta niekarbonylowa grupy estrowej jest prostą, rozgałęzioną lub cykliczną grupą alkilową; grupą alkoksyalkilową, np. metoksymetylową grupą arylooksyalkilową, np. fenoksymetylową; arylową, np. fenylową ewentualnie podstawioną atomem chlorowca, grupą Ć1-4-alkilową lub Cj_4-alkoksylową; ester sulfonianowy, taki jak alkilo- lub aryloalkilosulfonylowy, np. metanosulfonylowy; ester jedno-, dwu- lub trójfosforanowy; trytylowy lub jednometoksytrytylowy·, podstawiony benzylowy, trójalkilosililowy (np. dwumetylo-III-rz -butylosililowy) lub dwufeny10 lometylosililowy Grupą arylową w estrach jest optymalnie grupa fenylowa. Grupa alkilowa może być grupą prostą, rozgałęzioną lub cykliczną, optymalnie o CuThe active compound can be administered in the form of a derivative which, when administered to the recipient, is capable of converting directly or indirectly to the parent FTC, or which is itself active. Non-limiting examples are pharmaceutically acceptable salts (alternatively referred to as physiologically acceptable salts) and 5 'and N 4 acylated or alkylated derivatives (alternatively referred to as physiologically active or pharmaceutically active derivatives). In one embodiment, the acyl group is a carboxylic acid ester in which the non-carbonyl moiety is the ester group is a straight, branched, or cyclic alkyl group; an alkoxyalkyl group, e.g. a methoxymethyl group, an aryloxyalkyl group, e.g. a phenoxymethyl group; aryl, e.g., phenyl optionally substituted with halogen, C1-4alkyl or C1-4alkoxy; a sulfonate ester such as an alkyl or aralkylsulfonyl ester, e.g. methanesulfonyl; mono-, di- or triphosphate ester; trityl or monomethoxytrityl, substituted benzyl, trialkylsilyl (e.g. dimethyl-tert-butylsilyl) or diphenylmethylsilyl The aryl group in the esters is optimally a phenyl group. The alkyl group may be straight, branched or cyclic, preferably Cu

Specyficznymi przykładami dopuszczalnych w farmacji pochodnych FTC są, ale nie wy-Specific examples of pharmaceutically acceptable FTC derivatives include, but are not

w którym Ri i R2 oznaczają niezależnie od siebie grupę alkilową lub acylową, przykładowo, ale nie wyłącznie, taką jak metylowa, etylowa, propylowa, butylowa, pentylowa, heksylowa, izopropylowa, izobutylowa, Il-rz.-butylowa, III-rz.-butylowa, izopentylowa, amylowa, III-rz.-pentylowa, 3-metylobutyrylowa, wodorobursztynianowa, 3-chlorobenzoesanowa, cyklopentylowa, cykloheksylowa, benzoilowa, acetylowa, piwaloiolowa, mezylanowa, propionylowa, butyrylowa, walerylowa, kapronowa, kaprylowa, kaprynowa, laurylowa, mirystynowa, palmitynowa, stearynowa, olemowa lub reszta aminokwasu, taka jak, ale nie wyłącznie, alkanylowa, walinylowa, leucynylowa, izoleucynylowa, prolinylowa, fenyloalanylowa, tryptofanylowa, metioninylowa, glicynylowa, serynylowa, treoninylowa, cysteinylowa, tyrozynylowa, asparaginylowa, glutaminylowa, aspratoilowa, glutaoilowa, lizynylowa, arginylowa i histydynylowa, a jeden z podstawników Ri i R2 może być atomem wodoru.wherein R 1 and R 2 are independently an alkyl or acyl group, for example but not limited to methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, isopropyl, isobutyl, tert-butyl, tertiary- butyl, isopentyl, amyl, tertiary pentyl, 3-methylbutyryl, hydrogen succinate, 3-chlorobenzoate, cyclopentyl, cyclohexyl, benzoyl, acetyl, pivaloyl, mesylate, propionyl, butyryl, valeryl, caprilic, caprylate, caprylate , palmitic, stearic, olemic, or an amino acid residue such as, but not limited to, alkanyl, valinyl, leucinyl, isoleucinyl, prolinyl, phenylalanyl, tryptophanyl, methioninyl, glycinyl, serinyl, threoninyl, asprilaginyl, asparilylglycinyl, asylaginyl , lysinyl, arginyl and histidinyl, and one of Ri and R2 may be hydrogen.

FTC lub jego pochodne mogą występować w postaci dopuszczalnych w farmacji soli. Stosowane w opisie określenie dopuszczalne w farmacji sole lub kompleksy dotyczy soli lub kompleksów FTC zachowujących pożądaną aktywność biologiczną macierzystego związku i wykazujących minimalne, jeśli w ogóle, niepożądane działanie toksyczne. Nie ograniczającymi przykładami takich soli są (a) addycyjne sole kwasowe utworzone z kwasami nieorganicznymi (np. z chlorowodorem, bromowodorem, kwasem siarkowym, kwasem fosforowym, kwasem azotowym, itp.) oraz sole z kwasami organicznymi, takimi jak kwas octowy, kwas szczawiowy, kwas winowy, kwas bursztynowy, kwas jabłkowy, kwas askorbinowy, kwas benzoesowy, kwas garbnikowy, kwas embonowy, kwas alginowy, kwas poliglutaminowy, kwasy naftalenosulfonylowe, kwasy naftalenodwusolfonowe i kwas poligalakturonowy; (b) zasadowe sole addycyjne utworzone z wielowartościowymi kationami metali, takich jak cynk, wapń, bizmut, bar, magnez, glin, miedź, kobalt, nikiel, kadm, sód, potas, itp., albo z organicznymi kationami utworzonymi z N,N-dwubenzyloetylenodwuaminy, soli amoniowej lub etylenodwuaminy; lub (c) kombinacje soli (a) i (b), np. sól cynkowo-taninowa lub podobna.FTC or its derivatives can be in the form of pharmaceutically acceptable salts. The term pharmaceutically acceptable salts or complexes as used herein refers to FTC salts or complexes that retain the desired biological activity of the parent compound and exhibit minimal, if any, undesirable toxic effects. Non-limiting examples of such salts are (a) acid addition salts formed with inorganic acids (e.g., hydrogen chloride, hydrogen bromide, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, etc.) and salts with organic acids such as acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, succinic acid, malic acid, ascorbic acid, benzoic acid, tannic acid, pamoic acid, alginic acid, polyglutamic acid, naphthalenesulfonyl acids, naphthalene dipolfonic acids and polygalacturonic acid; (b) basic addition salts formed with multivalent metal cations such as zinc, calcium, bismuth, barium, magnesium, aluminum, copper, cobalt, nickel, cadmium, sodium, potassium, etc., or with organic cations formed from N, N - dubenzylethylenediamine, ammonium salt or ethylenediamine; or (c) combinations of salts (a) and (b), e.g. a zinc tannin salt or the like.

Modyfikacje aktywnego związku w pozycjach N4 i 5-0 mogą wpływać na biodostępność i metabolizm i tym samym pozwalają na kontrolę podawania leku. Ponadto, modyfikacje mogą wpływać na aktywność przeciwwirusową, zwiększając ją w niektórych przypadkach ponad aktywność macierzystego związku. Łatwo to można- ocenić testując otrzymaną pochodną na aktywność przeciwwirusową metodami przedstawionymi w tym opisie lub innymi, znanymi specjalistom.Modifications of the active compound at the N 4 and 5-0 positions may affect bioavailability and metabolism and thus allow control of drug administration. Moreover, the modifications may affect the antiviral activity, increasing it in some cases over that of the parent compound. This can be easily assessed by testing the obtained derivative for antiviral activity by methods set forth in this specification or others known to those skilled in the art.

U. Wytwarzanie aktywnych związkówU. Preparation of active compounds

Racemiczną mieszaninę FTC można otrzymywać metodą opisaną szczegółowo w międzynarodowej publikacji PCT nr WO 91/11186 z dnia 8 sierpnia 1991 r., zgłoszonej przez Emory University lub metodą ujawnioną w przykładzie I. Generalnie, metoda polega na tym, że poddaje się ozonowaniu eter lub ester allilowy o wzorze CH2=CH-CH2-OR lub dwueterThe racemic FTC mixture can be obtained by the method detailed in PCT International Publication No. WO 91/11186, dated August 8, 1991, filed by Emory University, or by the method disclosed in Example I. Generally, the method comprises ozonizing an ether or an ester. allyl of formula CH2 = CH-CH2-OR or a diether

171 150 albo dwuester 2-buteno-1,3-didu o wzorze ROCH2-CH=CH-CH2OR, w których to wzorach R oznacza grupę ochronną, taką jak alkilowa, siliiowa lub acylowa. Otrzymuje się aldehyd glikolowy o wzorze OHC-CH2-OR, do którego dodaje się kwas tioglikolowy i otrzymuje lakton o wzorze 2-(R-oksy) meV^4l^-5^k:^’to-1,3-oksatiolan Lakton ten redukuje się do różnych związków zawierających grupę odchodzącą w pozycji 5 pierścienia oksatiolanu i następnie sprzęga je z siliiowaną 5-fluorocytozyną w obecności SnCl4. Otrzymuje się FTC i ewentualnie usuwa się grupy ochronne.171 150 or diester of 2-butene-1,3-Didu the formula ROCH2-CH = CH-CH 2 OR, in which formulas R is a protecting group such as alkyl, acyl or siliiowa. A glycol aldehyde of formula OHC-CH2-OR is obtained, to which thioglycolic acid is added to obtain a lactone of formula 2- (R-oxy) meV ^ 4l ^ -5 ^ k: ^ 'to-1,3-oxathiolate Ten lactone is reduced to the various compounds containing a group leaving the 5-position of the oxathiolane ring and then coupled to silylated 5-fluorocytosine in the presence of SnCl 4 . FTC is obtained and optionally the protecting groups are removed.

Przykład I. Wytwarzanie (±)-P-D,L-2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)1.3- oksatiolanu.Example 1 Preparation of (±) -P-D, L-2-hydroxymethyl-5- (5-fluorocytosinyl-1) 1,3-oxathiolane.

Poniżej opisano szczegółowo sposób wytwarzania mieszaniny racemicznej FTC, zilustrowany na figurze 2The method for producing the racemic mixture of FTC as illustrated in figure 2 is described in detail below

Ochrona 2-buteno-1,4-dioluProtection of 2-butene-1,4-diol

W suchej 2-litrowej, trójszyjnej kolbie rozpuszczono w obojętnej atmosferze 100 g (93,5 ml, 1,135 mola, 1,00 równoważnik) 2-buteno-l,4-diolu i 15 g (około 0,1 równoważnika) DMAP (4-dwumetyloaminopirydyny) w 800 ml bezwodnej pirydyny i całość mieszano i ochłodzono do temperatury 0°C. Następnie dodano powoli dla uniknięcia przegrzania 260 ml (2,2 równoważnika) chlorku butyrylu i znów mieszano w ciągu 1 godziny. Reakcję zatrzymano dodając małą ilość lodowatej wody. Ciecz zdekantowano z nad soli i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałą sól rozpuszczono w wodzie i wodny roztwór ekstrahowano dwukrotnie eterem etylowym. Połączone ekstrakty eterowe przemyto jeden raz nasyconym roztworem CuSO4 i dwukrotnie nasyconym roztworem NaHCO3 zawierającym Non® i przesączono pod zmniejszonym ciśnieniem przez warstwę ziemi okrzemkowej Celittt®®.100 g (93.5 mL, 1.135 mol, 1.00 eq.) 2-butene-1,4-diol and 15 g (about 0.1 eq.) DMAP (4 eq.) Were dissolved in a dry 2-liter 3-neck flask under an inert atmosphere. -dimethylaminopyridine) in 800 ml of anhydrous pyridine and the mixture was stirred and cooled to 0 ° C. 260 ml (2.2 eq.) Of butyryl chloride were slowly added to avoid overheating and stirred again for 1 hour. The reaction was stopped by adding a small amount of ice water. The liquid was decanted from the salt and evaporated under reduced pressure. The remaining salt was dissolved in water and the aqueous solution was extracted twice with diethyl ether. The combined ether extracts were washed once with a saturated CuSO 4 solution and twice with a saturated NaHCO 3 solution containing Non® and filtered under vacuum through a pad of Celittt® diatomaceous earth.

Zatężoną mieszaninę reakcyjną rozpuszczono w eterze etylowym i przemyto, stosując takie same jak powyżej postępowanie. Połączone warstwy organiczne zatężono w wyparce obrotowej i umieszczono pod zmniejszonym ciśnieniem. Wydajność reakcji zwykle jest bardzo bliska ilościowej. Skalę wytwarzania można łatwo w razie potrzeby zwiększyć. Produkt,The concentrated reaction mixture was dissolved in diethyl ether and washed using the same procedure as above. The combined organic layers were concentrated on a rotary evaporator and placed under reduced pressure. The yield of the reaction is usually very close to quantitative. Manufacturing scale can be easily increased if necessary. Product,

1.4- dwubutyrylo-2-buteno-1,4-diol jest bezbarwną do jasnożółtej, klarowną cieczą.1.4-Dibutyryl-2-butene-1,4-diol is a colorless to pale yellow, clear liquid.

Ozonoliza ochronionego dioluOzonolysis of a protected diol

1,365 mola 1,4-dwubutyrylo-2-buteno-1,4-diolu rozpuszczono w 4 litrach bezwodnego CH2C12 w suchej 5-litrowej kolbie trójszyjnej, wyposażonej w dużą rurkę suszącą i otwartą rurę do wprowazdania gazu. Rura jest korzystnie rurą do przepuszczania gazu nie zawierającą spieku, który może się zatykać w przypadku stężonego roztworu. Roztwór miesza się i oziębia do temperatury -78°C, przepuszczając obojętny gaz. Wlot gazu zamyka się, gdy roztwór został dostatecznie oziębiony, po czym kolbę i mieszadło przenosi się do generatora ozonu. Przez mieszany roztwór przepuszcza się w ciągu co najmniej 20 minut tlen, oziębiając przez ten czas. Urządzenie Cryoccol jest idealne do utrzymywania niskiej temperatury podczas tej długotrwałej reakcji. Ozon wprowadza się pod ciśnieniem 2,29-2,44 MPa. Po zakończeniu reakcji zatrzymuje się dopływ ozonu i przez roztwór przepuszcza się tlen w ciągu pół godziny, a następnie dodaje się 3 równoważniki Me2S. Kolbę usuwa się z łaźni oziębiającej, przenosi pod wyciąg i miesza w ciągu około dwóch dni, do uzyskania całkowitej redukcji. Roztwór odparowuje się i pozostawia pod zmniejszonym ciśnieniem w ciągu kilku godzin.1.365 mole of 1,4-dwubutyrylo-2-butene-1,4-diol were dissolved in 4 liters of anhydrous CH 2 C1 2 in a dry 5-liter three-necked flask equipped with a large drying tube and an open tube for wprowazdania gas. The pipe is preferably a gas passage pipe containing no sinter which may clog in the case of a concentrated solution. The solution was stirred and cooled to -78 ° C while passing an inert gas. The gas inlet is closed when the solution has cooled down sufficiently, then the flask and stirrer are transferred to the ozone generator. Oxygen is bubbled through the stirred solution for at least 20 minutes, while cooling. The Cryoccol device is ideal for keeping the temperature low during this prolonged reaction. Ozone is introduced at a pressure of 2.29-2.44 MPa. After the reaction is complete, the ozone flow is stopped and oxygen is bubbled through the solution for half an hour, then 3 equivalents of Me 2 S are added. The flask is removed from the cooling bath, placed in a fume hood and stirred for about two days until complete reduction is obtained. . The solution was evaporated and left under reduced pressure for several hours.

W tej reakcji otrzymuje się typowo około 95% ochronionego aldehydu (aldehydu 2-butyrylooksycctowego) w postaci bezbarwnego do żółtego,’ przezroczystego roztworuThis reaction typically produces about 95% of the protected aldehyde (2-butyryloxaldehyde) as a colorless to yellow, clear solution.

Cyklizacja aldehydu z kwasem merkaptooctowym równoważnik aldehydu rozpuszczono w toluenie i otrzymano 0,80-0,85 M roztwór w kolbie zaopatrzonej w nasadkę Deana-Starka. Następnie dodano 1,1 równoważnika kwasu tlogbkclowego i mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia. Wodę usuwano azeotropowo w nasadce Reakcja została zakończona po 3 godzinach. Mieszaninę pozostawiono do ochłodzenia do pokojowej temperatury, po czym przemyto dwukrotnie równymi objętościami nasyconego roztworu wodnego NaHC03 i jednokrotnie wodą, suszono nad MgSO., i Noritem, przesączono pod zmniejszonym ciśnieniem przez celit i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pierwszy roztwór NaHCO3 z przemycia ekstrahowano eterem etylowym, ekstrakt przemyto wodą, suszono nad MgSO4 i Noritem®, przesączono próżniowo przez ziemię krzemionkową celite® i odparowano razem z innym organicznym materiałem z roztworu toluenowego. Połączony materiał pozostawiono pod zmniejszonym ciśnieniem w ciągu . nocy.Cyclization of the aldehyde with mercaptoacetic acid an equivalent of the aldehyde was dissolved in toluene to give a 0.80-0.85 M solution in a flask equipped with a Dean-Stark trap. Then 1.1 eq of tlogbkClic acid was added and the mixture was heated to reflux. Water was azeotroped in the cap. The reaction was complete after 3 hours. The mixture was allowed to cool to room temperature, and then washed twice with equal volumes of saturated aqueous NaHC0 3, once with water, dried over MgSO., And Norit, filtered under reduced pressure through Celite and evaporated under reduced pressure e Ger. First a solution of NaHCO 3 the washes were extracted with diethyl ether, the extract was washed with water, dried over MgSO 4 and Norit®, vacuum filtered through celite® silica earth and co-evaporated with other organic material from the toluene solution. The combined material was allowed to sit under reduced pressure for a long time. night.

W reakcji otrzymuje się typowo z 90% wydajnością 2-(butyrylooksy)-metylo-5-keto1,3-oksatiolan.The reaction typically produces 2- (butyryloxy) methyl-5-keto-1,3-oxathiolane in 90% yield.

Redukcja laktonu i przekształcenie w octanLactone reduction and conversion to acetate

W trójszyjnej kolbie wyposażonej w mieszadło mechaniczne 1,00 równoważnik 2-butyrylooksymetylo-5-keto-1,3-oksatiolanu rozpuszcza się w obojętnej atmosferze w bezwodnym THF, otrzymując 0,21 M roztwór. Roztwór mieszano i ochłodzono do temperatury 0°C, po czym dodano przez rurkę 1,1 równoważnika 1,0 M roztworu Li(t-BuO)iAlH w THF. Redukcja zaszła całkowicie po upływie około trzech godzin, zgodnie z TLC, w której stosowano do rozwijania mieszaninę 2:1 eteru etylowego i heksanu, a do wywoływania aldehyd anyżowy.In a three-necked flask equipped with a mechanical stirrer, 1.00 equivalents of 2-butyryloxymethyl-5-keto-1,3-oxathiolane are dissolved under an inert atmosphere in anhydrous THF, yielding a 0.21 M solution. The solution was stirred and cooled to 0 ° C then 1.1 equivalents of a 1.0 M solution of Li (t-BuO) iAlH in THF was added via cannula. The reduction was complete after about three hours according to TLC where a 2: 1 mixture of ethyl ether and hexane was used for development and anisaldehyde was developed for development.

Do mieszaniny dodano około 10 równoważników świeżo destylowanego AC2O i całość mieszano w ciągu 2 dni, otrzymując acetylowany produkt, Reakcję zatrzymano dodając nasycony roztwór NaHCOi i mieszano w ciągu nocy. Roztwór odparowano i mieszano w ciągu nocy z nową porcją roztworu NaHCOi, po czym ekstrahowano eterem etylowym. Ekstrakt przemyto starannie nasyconym roztworem NaHCOi (dwukrotnie) i jeden raz wodą, suszono nad MgSOd i preparatem Non®, przesączono próżniowo przez ziemię okrzemkową celite® i odparowano. Otrzymano produkt w postaci ciemnożółtego, przezroczystego płynu. Chromatografia gzowa (temperatura początkowa - 80°C, wstępny czas - 5 minut, przyrost temperatury - 10°C/min., końcowa temperatura - 240°C) wykazała czystość około 70%.About 10 equivalents of freshly distilled AC2O was added to the mixture and stirred for 2 days to give the acetylated product. Quenched with saturated NaHCOi solution and stirred overnight. The solution was evaporated and stirred overnight with new portion of NaHCOi solution, then extracted with diethyl ether. The extract was washed thoroughly with saturated NaHCOi solution (twice) and once with water, dried over MgSOd and Non®, vacuum filtered through celite® diatomaceous earth and evaporated. The product was obtained in the form of a dark yellow transparent liquid. Gas chromatography (starting temperature - 80 ° C, initial time - 5 minutes, temperature rise - 10 ° C / min, final temperature - 240 ° C) showed a purity of about 70%.

Sililowanie 5-fluorocytozynySilylation of 5-fluorocytosine

5-fluorocytozynę (1,05 równoważnika jak obliczono na podstawie acetylowanego laktolu otrzymanego w poprzednim etapie o czystości według chromatografii gazowej) siliiowano w temperaturze wrzenia z co najmniej 10 równoważnikami heksametylodisilazanu zawierającego katalityczną ilość czystego siarczanu amonowego (0,05 do 0,1 równoważnika). Reakcję prowadzono w ciągu dwóch godzin od momentu, gdy roztwór osiągnął klarowność. Kolbę dobrze zamknięto i rozpuszczalnik odparowano, stosując pompę próżniową i pomocniczy łapacz. Produkt, mający postać białego osadu, pozostawiono w ciągu nocy pod zmniejszonym ciśnieniem i stosowano następnie w reakcji sprzęgania.5-Fluorocytosine (1.05 equivalents as calculated from the gas chromatographic purity of the acetylated lactol obtained in the previous step) was silicated at reflux with at least 10 equivalents of hexamethyldisilazane containing a catalytic amount of pure ammonium sulfate (0.05 to 0.1 equivalents) . The reaction was carried out within two hours from the time the solution became clear. The flask was closed well and the solvent was evaporated using a vacuum pump and an auxiliary trap. The product, in the form of a white solid, was left under reduced pressure overnight and then used in the coupling reaction.

Sprzęganie siliiowanej 5-fluorocytozyny z acetylowanym laktonemCoupling of silylated 5-fluorocytosine with an acetylated lactone

Do roztworu 33,86 g (0,124 mola) siłiłowanej 5-fluorocytozyny w 350 ml bezwodnego chlorku metylenu dodano 135,6 ml 1 m roztworu SnCL w chlorku metylenu, w atmosferze azotu. Całość mieszano w ciągu 15 minut w pokojowej temperaturze, po czym w ciągu 30 minut podano rurką do roztworu 38 g (0,113 mola) octanu laktolu w 400 ml chlorku metylenu, utrzymywanego pod azotem.To a solution of 33.86 g (0.124 mol) of the strength 5-fluorocytosine in 350 ml of anhydrous methylene chloride was added 135.6 ml of a 1M solution of SnCl in methylene chloride under nitrogen atmosphere. After stirring for 15 minutes at room temperature, a solution of 38 g (0.113 mol) of lactol acetate in 400 ml of methylene chloride under nitrogen was cannulated over 30 minutes.

Całość mieszano w ciągu 2 godzin i za pomocą HPLC stwierdzono zakończenie reakcji. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono chlorkiem metylenu (500 ml) i zatrzymano reakcję dodając roztwór wodorotlenku amonowego. Do roztworu dodano powoli 100 ml wodorotlenku amonowego, utrzymując temperaturę poniżej 30°C. Obserwowano wypadanie białego osadu.The mixture was stirred for 2 hours and the reaction was judged to be complete by HPLC. The reaction mixture was diluted with methylene chloride (500 ml) and quenched by adding ammonium hydroxide solution. 100 ml of ammonium hydroxide was added slowly to the solution keeping the temperature below 30 ° C. A white precipitate was observed.

Całość mieszano w ciągu dalszych 30 minut, po czym podano na kolumnę z żelem krzemionkowym (o średnicy 17,8 cm i długości 12,6 cm), eluując kolejno 2 litrami chlorku metylenu, 2 litrami octanu etylu i 4 litrami mieszaniny 9:1 octanu etylu i etanolu. Zawierające pożądany produkt eluaty octanowe oraz octanowo-etanolowe połączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostały lepki, stały produkt przemyto 200 ml bezwodnego eteru etylowego i otrzymano 25,35 g (71%) 5'-maślanu FTC w postaci białego, stałego produktuThe mixture was stirred for a further 30 minutes, then applied to a silica gel column (17.8 cm diameter, 12.6 cm long), eluting sequentially with 2 liters of methylene chloride, 2 liters of ethyl acetate and 4 liters of 9: 1 acetate. ethyl and ethanol. The acetate and acetate-ethanol eluates containing the desired product were combined and evaporated under reduced pressure. The remaining sticky solid product was washed with 200 ml of anhydrous diethyl ether to give 25.35 g (71%) of FTC 5'-butyrate as a white solid product

Porcję 8,74 g (0,026 mola) 5'-maślanu FTC rozpuszczono w 250 ml metanolu i dodano w pokojowej temperaturze 2,85 g (0,052 mola) metoksylanu sodowego. Całość mieszano w ciągu 1 godziny, stwierdzając za pomocą TLC zakończenie reakcji. W celu zatrzymania reakcji dodano 10 ml roztworu NFLC1, po czym odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość zaabsorbowano na 5 g żelu krzemionkowego i przepuszczono przez małą kolumnę, eluując mieszaniną 9:1 octanu etylu i etanolu. Połączone frakcje zawierająceA 8.74 g (0.026 mol) portion of FTC 5'-butyrate was dissolved in 250 ml of methanol and 2.85 g (0.052 mol) of sodium methoxide was added at room temperature. The mixture was stirred for 1 hour and the reaction was complete by TLC. 10 ml of NFLC1 solution was added to stop the reaction, and then the solvent was evaporated under reduced pressure. The residue was absorbed onto 5 g of silica gel and passed through a small column, eluting with a 9: 1 mixture of ethyl acetate and ethanol. Combined fractions containing

171 150 produkt odparowano i otrzymano lepki osad, który przemyto bezwodnym eterem etylowym i uzyskano 6,00 g (88%) FTC w postaci białego osadu.The product was evaporated to give a sticky solid which was washed with anhydrous diethyl ether to afford 6.00 g (88%) of FTC as a white solid.

Widmo 'HNMR (DMSO-d6): 8,18 (1H, d, He, J = 8,4 Hz), 7,81 i 7,57 (2H, szeroki sygnał, NH2), 6,12 (1H, dd, H;, J = 5,7 i 4,2 Hz), 5,40 (1H, t, OH, T - 5,7 Hz), 5,17 (1H, L 1H, J = 3,6 Hz), 3,74 (2H, m, 2H5), 3,41 (1H, dd, H2, J = 5,7 i 11,7 Hz), 3,11 (1H, dd, H2, J = 4,2 i 11,7 Hz).1HNMR spectrum (DMSO-d 6 ): 8.18 (1H, d, He, J = 8.4Hz), 7.81 and 7.57 (2H, broad signal, NH 2 ), 6.12 (1H , dd, H, J = 5.7 and 4.2 Hz), 5.40 (1H, t, OH, T - 5.7 Hz), 5.17 (1H, t 1H, J = 3.6 Hz), 3.74 (2H, m, 2H 5 ), 3.41 (1H, dd, H 2 , J = 5.7 and 11.7 Hz), 3.11 (1H, dd, H 2 , J = 4.2 and 11.7 Hz).

Widmo ”C NMR (DMSO-d6): 157, 85 (d, J = 13,4 Hz), 153,28, 136,12 (d, J = 24,1 Hz), 126,01 (d, J = 32,6 Hz), 86,90, 86,84, 62,48, 37,07.C NMR Spectrum (DMSO-d6): 157.85 (d, J = 13.4Hz), 153.28, 136.12 (d, J = 24.1Hz), 126.01 (d, J = 32.6 Hz), 86.90, 86.84, 62.48, 37.07.

Temperatura topnienia 195-196°CMelting point 195-196 ° C

Przykład II. Rozdział encncjomerów nualeozcdów.Example II. Chapter nualeozcd encncjomers.

Przedstawiony sposób rozdziału mieszanin racdmiczncch enancjomerów nualeozydów Zotyyzc, ale me wyłącznie, (+) i (-) enancjomerów FTC. Metoda ta może być także stosowana do rozdziału mieszanin racemiczncyh reszt węglowodanowych i węglowodanowo-podobnych, takich jak pochodne 1,3-oksatiolanu i 1,3-Zioksolanu W metodzie tej wykorzystuje się enzym, który wybiórczo katalizuje reakcję jednego z enancjomerów mieszaniny reckccjnej. Poddany reakcji encncjomer jest oddzielany od mezrzerdcgowanego enancjomeru z wykorzystaniem nowych różnic w strukturze fizycznej. Na podstawie powyższych danych specjalista będzie w stanie wybrać enzym selektywny w stosunku do potrzebnego enancjomeru (lub selektywny w stosunku do niepożądanego enancjomeru w celu wyeliminowania go) z omówioncyh w dalszej części opisu enzymów lub drogą baZcnic innych znanych enzymów. Specjalista będzie również wiedział, jak modyfikować substrat w celu uzyskania pożądanego rozdziału. Stosując chiralne odczynniki do NMR, polarymetrię lub chudną HPLC, można oznaczać optyczne wzbogacanie wydzielonego estru.The method of separation is shown for the racism mixtures of the enantiomers of the Zotyyzc nualeosides, but not exclusively for the (+) and (-) FTC enantiomers. This method can also be used to separate racemic mixtures of carbohydrate and carbohydrate-like residues, such as 1,3-oxathiolane and 1,3-zioxolane derivatives. This method uses an enzyme that selectively catalyzes the reaction of one of the enantiomers of the recruitment mixture. The reacted encantiomer is separated from the meshed enantiomer using new differences in physical structure. On the basis of the above data, the skilled person will be able to select an enzyme selective for the desired enantiomer (or selective for the undesirable enantiomer to eliminate it) from the enzymes discussed hereinafter, or from other known enzymes. One skilled in the art will also know how to modify the substrate to achieve the desired separation. By using chiral NMR reagents, polarimetry or lean HPLC, optical enrichment of the isolated ester can be determined.

Poniższe przykłady ilustrują stosowanie enzymów do rozdziału mieszanin rccemiczncch encnyjomerów. Mogą tez być stosowane inne znane metody rozdziału mieszanin rccdmiyznych w kombinacji z podanymi w opisie. Wszystkie takie modyfikacje mieszczą się w zakresie wcnrlczku.The following examples illustrate the use of enzymes for the separation of microchemical mixtures of encnyiomers. Other known methods for separating rccdmix mixtures can also be used in combination with those given in the description. All such modifications are within the scope of this.

Rozdział oparty na hydrolizie C5'-estrów nukleozyduSeparation is based on the hydrolysis of nucleoside C5'-esters

W jednej odmianie metoda polega na poddawaniu grupy C5'-hydroksclowej w mieszaninie rayemicznej nukleozydu reakcji ze związkiem acclującym. Otrzymuje się C5'-estry, w których nukleozyd znajduje się w karbinolowym końcu estru. Mieszaninę racemiczną C5'-dstrów nukleozydu poddaje się działaniu enzymu, który wybiórczo rozszczepia lub hedrolizuje jeden z enancjomerów, pozostawiając nietknięty drugi, w określonym okresie czasu.In one embodiment, the method comprises reacting a C5'-hydroxy group in a rayemic mixture of a nucleoside with an acclating compound. There are obtained C5'-esters in which the nucleoside is located at the carbinol terminus of the ester. The racemic mixture of the C5'-dstrers of the nucleoside is treated with an enzyme that selectively cleaves or hedrolyses one of the enantiomers, leaving the other intact, for a specified period of time.

Zaletą powyższej metody jest możliwość jej stosowania do rozdziału wielu różnych nuk^zydów, w tym nukldozydów zircmiZcnowych i zurcnowcch, ewentualnie podstawionych w reszcie cukru lub zasady. Metoda ta może być również stosowana do rozdziału zoyhodnych nukleozcdów, które zawierają dodatkowe heteroatomy w reszcie cukrowej, np. FTC i BCH-189. Szeroka stosowalność powyższej metody wynika częściowo z faktu, że chociaż karbinolowa część estru ma znaczenie dla zdolności różnicowania przez enzym enancjomerów, to główne rozpoznawalne przez te enzymy miejsce znajduje się w reszcie kwasu karboksylowego w estrzeAn advantage of the above method is that it can be used to separate a wide variety of nucleic acid, including nucleic acid and nucleic acid, optionally substituted with a sugar or base moiety. The method can also be used to separate nucleated nucleosides that contain additional heteroatoms in a sugar residue, e.g., FTC and BCH-189. The wide applicability of the above method is due in part to the fact that although the carbinol portion of the ester is important in the enzyme's ability to differentiate enantiomers, the principal recognizable site for these enzymes is at the carboxylic acid residue in the ester.

Ponadto, można z powodzeniem ekstrapolować wyniki z jednych badań enzcm/substrct do innych różnych układów, jeśli reszta kwasu karboksylowego w obu substratayC jest taka sama lub znacznie podobna.Moreover, it is possible to successfully extrapolate the results from one enzcm / substrct study to other different systems if the carboxylic acid residue in both substrates is the same or significantly similar.

Inną zaletą powyższej metody jest fakt, że jest ona regloseίektc4na. Enzymy, które hyZrolizują estry, nie katalizują zwykle innych reakcji w innych fragmentach cząsteczki Np., enzym lipaza katalizuje hydrolizę estru 2-hcZrokscmetclo-5-keto- 1,3-oksatiolanu, nie hydrolizując przy tym wewnętrznego laktonu. Odróżnia to się wyraźnie od podejść chemlyzncch do hydrolizy estrów.Another advantage of the above method is that it is regloseίektc4na. The enzymes that hydrolyze esters do not usually catalyze other reactions in other parts of the molecule. For example, the enzyme lipase catalyzes the hydrolysis of 2-hcZroxymethyl-5-keto-1,3-oxathiolane ester without hydrolyzing the internal lactone. This is clearly different from the chemistry approaches to ester hydrolysis.

Inną zaletą opisywanej metody jest fakt, ze wyodrębnianie niezhydrolizowanego dnancjomeru i zhyZrolizewanego enancjomeru jest bardzo proste NlezCcdrolizowany dncncjomer jest bardziej l^oSln. i może być wydajnie wyodrębniany drogą prostej ekstrakcji wieloma niepolamymi rozpuszczalnikami organicznymi lub mieszaninami rozpuszczalników, w tym heksanem i mieszaniną heksanu i eteru etylowego. Mniej lipofilny, bardziej polarne zhcZrolizowcncAnother advantage of the described method is that the isolation of the non-hydrolyzed dnantiomer and the hydrolyzed enantiomer is very simple. The non-hydrolyzed dnantiomer is more simple. and can be efficiently isolated by simple extraction with many non-pungent organic solvents or mixtures of solvents, including hexane and a mixture of hexane and diethyl ether. Less lipophilic, more polar

171 150 enancjomer można otrzymywać drogą ekstrakcji bardziej polarnym rozpuszczalnikiem organicznym, np. octanu etylu lub drogą liofilizacji i następnie ekstrakcji etanolem lub metanolem Podczas hydrolizy należy unikać stosowania alkoholu, gdyż może on. w pewnych warunkachThe enantiomer may be obtained by extraction with a more polar organic solvent, e.g. ethyl acetate, or by lyophilization followed by extraction with ethanol or methanol. Alcohol should be avoided during the hydrolysis as it may. under certain conditions

Enzymy i substratyEnzymes and substrates

Dobierając właściwy enzym i substrat można ustalić warunki dla wyodrębniania każdego enancjomeru nukleozydu Pożądany enancjomer można izolować traktując mieszaninę racemiczną enzymem hydrolizującym pożądany enancjomer (po czym ekstrahując polarny hydrolizat polarnym rozpuszczalnikiem) lub traktując enzymem hydrolizującym niepożądany enancjomer i następnie usuwając niepożądany enancjomer niepolamym rozpuszczalnikiem.By selecting the appropriate enzyme and substrate, conditions can be set for the isolation of each enantiomer of the nucleoside. The desired enantiomer can be isolated by treating the racemic mixture with an enzyme hydrolyzing the desired enantiomer (followed by extracting the polar hydrolyzate with a polar solvent) or treating the unwanted enantiomer with the enzyme hydrolyzing the undesired enantiomer and then removing the undesirable enantiomer with the unwanted enantiomer.

Do enzymów, które katalizują hydrolizę estrów należą esterazy, np. esteraza z wątroby świni; lipazy, np. świńska lipaza trzustkowa i lipaza Amano PS-800; substylizyna i a-chymotrypsyna.Enzymes which catalyze the hydrolysis of esters include esterases, e.g. porcine liver esterase; lipases, e.g. porcine pancreatic lipase and Amano PS-800 lipase; substilisin and? -chymotrypsin.

Na rysunku 3 przedstawiono wykres specyficzności alkalicznej fosfatazy i fosfodwuesterazy z jadu węża w stosunku do (+) i (-) enancjomerów FTC. Jak widać, fosfataza alkaliczna hydrolizuje trójfosforan obu enancjomerów FTC i nie nadaje się tym samym jako czynnik rozdzielający. Fosfodwuesteraza I wybiórczo hydrolizuje (+)-izomer FTC do jego jednoestru, który można następnie poddawać działaniu 5'-nukleotydazy i otrzymywać (+)-FTC.Figure 3 shows a graph of the specificity of alkaline phosphatase and phosphodiesterase from snake venom in relation to the (+) and (-) enantiomers of FTC. As can be seen, alkaline phosphatase hydrolyzes the triphosphate of both FTC enantiomers and is therefore not suitable as a resolving agent. Phosphodiodieesterase I selectively hydrolyzes the (+) - isomer of FTC to its monester, which can then be treated with 5'-nucleotidase to produce (+) - FTC.

Najbardziej efektywną grupę acylową do stosowania do estryfikacji w pozycji C5' nukleozydu można wybierać bez zbędnego eksperymentowania, drogą badania szeregu homologów z zastosowaniem wybranego układu enzymatycznego. Np., jeśli nukleozydy 1,3-oksatiolanowe są zestryfikowane kwasem masłowym, wówczas rozdział za pomocą zarówno esterazy z wątroby świni, jak i Amono PS-800 zachodzą z wysoką enancjoselektywnością (94-100% nadmiaru enancjomerycznego) i przeciwstawną selektywnością. Esteraza z wątroby świni wybiórczo hydrolizuje (+)-enancjomer FTC, a Amano PS-800® hydrolizuje selektywnie (-)-enancjomer FTC. Procentowy nadmiar enancjomeryczny podany w tabeli 1 jest to ilość oczyszczonego estru kwasu masłowego (-)-FTC w przypadku PLE oraz estru kwasu masłowego (+)-PLC w przypadku Amano PS-800®.The most effective acyl group to be used for the esterification at the C5 'position of a nucleoside can be selected without undue experimentation by testing a series of homologues using the selected enzyme system. For example, if 1,3-oxathiolane nucleosides are esterified with butyric acid, then separation with both porcine liver esterase and Amono PS-800 occurs with high enantioselectivity (94-100% enantiomeric excess) and contradictory selectivity. Porcine liver esterase selectively hydrolyzes the (+) - FTC enantiomer and Amano PS-800® selectively hydrolyzes the (-) - FTC enantiomer. The percent enantiomeric excess given in Table 1 is the amount of purified butyric acid ester (-) - FTC for PLE and butyric acid ester (+) - PLC for Amano PS-800®.

Nie ograniczającymi przykładami grup acylowych, które można badać do stosowania z poszczególną mieszaniną enancjomerów nukleozydu i poszczególnymi enzymami, są takie jak reszty kwasów alkilokarboksylowych i podstawionych kwasów alkilokarboksylowych, takich jak kwas octowy, kwas propionowy, kwas masłowy i kwas walerianowy. W przypadku niektórych enzymów może być korzystne stosowanie związku acylowego, który znacznie odciąga elektrony, dla ułatwienia hydrolizy przez osłabienie wiązania estrowego. Do odciągających elektrony grup acylowych należą α-chlorowcoestry, takie jak z kwasem 2-chloropropionowym, kwasem 2-chloromasłowym i kwasem 2-chlorowalerianowym, przy czym a-chlorowcoestry są doskonałymi substratami dla lipaz.Non-limiting examples of acyl groups that can be tested for use with a particular mixture of nucleoside enantiomers and individual enzymes include alkyl carboxylic acid and substituted alkyl carboxylic acid residues such as acetic acid, propionic acid, butyric acid, and valeric acid. For some enzymes it may be advantageous to use an acyl compound that significantly withdraws electrons to facilitate hydrolysis by weakening the ester bond. Electron withdrawing acyl groups include α-haloesters such as with 2-chloropropionic acid, 2-chlorobutyric acid and 2-chlorovaleric acid, and α-haloesters are excellent substrates for lipases.

Warunki rozdziałuSeparation conditions

Hydroliza enzymatyczna jest zwykle prowadzona z katalityczną ilością enzymu w wodnym buforze o pH bliskim optymalnej wartości pH dla danego enzymu. W miarę jak zachodzi reakcja, spada wartość pH jako rezultat uwalniania kwasu karboksylowego. Dla utrzymania wartości pH blisko optymalnego poziomu należy dodawać wodny roztwór zasady. Postęp reakcji można łatwo śledzić obserwując zmiany pH i zużycie zasady potrzebnej do utrzymania właściwego pH Hydrofobowy ester (niezhydrolizowany enancjomer) i bardziej polarny alkohol (zhydrolizowany enancjomer) można kolejno i selektywnie ekstrahować z roztworu właściwie wybranymi rozpuszczalnikami organicznymi. Alternatywnie, rozdzielany materiał można przepuszczać przez kolumnę zawierającą enzym immobilizowany na stałym nośnikuEnzymatic hydrolysis is usually performed with a catalytic amount of the enzyme in an aqueous buffer at a pH close to the optimum pH for the enzyme in question. As the reaction proceeds, the pH value drops as a result of the release of the carboxylic acid. To keep the pH value close to the optimum level, an aqueous alkaline solution should be added. The progress of the reaction can be easily monitored by observing changes in pH and the consumption of the base needed to maintain the proper pH. The hydrophobic ester (unhydrolysed enantiomer) and more polar alcohol (hydrolyzed enantiomer) can be sequentially and selectively extracted from the solution with appropriately selected organic solvents. Alternatively, the material to be separated can be passed through a column containing the enzyme immobilized on a solid support

Enzymatyczna hydroliza prowadzona w warunkach heterogenicznych może dawać słabo powtarzalne wyniki. Stąd korzystne jest prowadzania hydrolizy w warunkach homogenicznych. Rozpuszczalniki alkoholowe me są korzystne, gdyż mogą one denaturować enzymy Homogeniczność można osiągnąć stosując niejonowy środek powierzchniowo czynny, taki jak Triton Χ-100. Dodatek takich środków powierzchniowo czynnych nie tylko jednak pomagaEnzymatic hydrolysis performed under heterogeneous conditions may give poor reproducible results. Hence, it is preferred to carry out the hydrolysis under homogeneous conditions. Alcohol solvents are not preferred as they can denature the enzymes. Homogeneity can be achieved using a non-ionic surfactant such as Triton®-100. The addition of such surfactants not only helps, however

171 150 w rozpuszczeniu wyjściowego związku, ale także zwiększa rozpuszczalność w wodzie produktu. Chociaż więc reakcja enzymatyczna może przebiegać efektywniej, gdy dodaje się niejonowy środek powierzchniowo czynny niż w warunkach heterogenicznych, to izolacja zarówno wyjściowego materiału, jak i produktu może się stać trudniejsza. Produkt można, wyodrębniać za pomocą odpowiednich technik chromatograficznych i chemicznych (np. drogą selektywnego tworzenia soli). Można stosować dwuacylowane nukleozydy, ale są one często bardzo lipofilowe i trudne do rozpuszczenia w stosowanym środowisku.In dissolution of the starting compound, but also increases the water solubility of the product. Thus, while the enzymatic reaction may be more efficient when a nonionic surfactant is added than under heterogeneous conditions, isolation of both the starting material and the product may become more difficult. The product can be isolated using appropriate chromatographic and chemical techniques (e.g., by selective salt formation). Diacylated nucleosides can be used, but are often very lipophilic and difficult to dissolve in the medium used.

Przykład IH. Enancjoselektywna, katalizowana lipazą hydroliza estrów FTC. Otrzymano szereg pochodnych 5'-O-acylowych FTC drogą selektywnego acylowaniaExample IH. Enantioselective, lipase-catalyzed hydrolysis of FTC esters. A number of FTC 5'-O-acyl derivatives were prepared by selective acylation

N-chlorowodorku (±)-FTC (patrz tabela 1 i figura 4). Badano stopień hydrolizy pochodnych przez lipazy. Jak pokazano w tabeli 1, esteraza z wątroby świńskiej (PLE) wykazuje wysoki poziom selektywnej hydrolizy estru (+)-enancjomeru FTC, pozostawiając głównie maślan (-)-FTC w analizowanej za pomocą HPLC mieszaninie. Stwierdzono także, że stopień hydrolizy jest zależny od rodzaju grupy acylowej - pochodna acetylowa jest hydrolizowana znacznie wolniej niż pochodna butyrylowa. Stwierdzono obecnie, że szybkość hydrolizy propionianu FTC jest nawet wyzsza niż dla pochodnej kwasu masłowego. Procent odzysku i procent nadmiaru enancjomerycznego oznaczono za pomocą HPLC. Chociaż enancjoselektywność jest doskonała, gdy stosuje się PLE (zwykle 97% lub więcej), to można uzyskiwać dodatkowe wzbogacenie przez kolejne enzymatyczne reakcje hydrolizy, w których wzbogacony enancjomerycznie maślan z hydrolizy katalizowanej PLE poddaje się enzymatycznej hydrolizie za pomocą PS-800.N-Hydrochloride (±) -FTC (see Table 1 and Figure 4). The degree of hydrolysis of derivatives by lipases was investigated. As shown in Table 1, porcine liver esterase (PLE) shows a high level of selective ester hydrolysis of the (+) - FTC enantiomer, leaving mainly (-) - FTC butyrate in the HPLC-analyzed mixture. It was also found that the degree of hydrolysis depends on the type of the acyl group - the acetyl derivative is hydrolyzed much slower than the butyryl derivative. It has now been found that the hydrolysis rate of FTC propionate is even faster than that of the butyric acid derivative. The percent recovery and percent enantiomeric excess were determined by HPLC. Although the enantioselectivity is excellent when PLE is used (usually 97% or more), additional enrichment can be obtained by successive enzymatic hydrolysis reactions in which enantiomerically enriched butyrate from PLE catalyzed hydrolysis is enzymatically hydrolyzed with PS-800.

Tabela 1Table 1

Porównywane wpływu rodzaju estru na hydrolizę enzymatycznąThe effects of ester type on enzymatic hydrolysis were compared

Substrat Substrate % odzysku % recovery % wzbogacenia enancjomerycznego % enantiomeric enrichment Estry FTC/PLE octan FTC / PLE esters acetate 32,68 32.68 (-)-FTC (maślan) nie oznaczono (-) - FTC (butyrate) not marked propionian propionate 39,87 39.87 nie oznaczono not marked maślan butyrate 48,00 48.00 98 98 maślan butyrate 45,71 45.71 98,6 98.6 Estry FTC/PS800 octan FTC / PS800 esters acetate 73,17 73.17 (+)-FTC (maślan) nie oznaczono (+) - FTC (butyrate) not marked propionian propionate 52,67 52.67 nie oznaczono not marked maślan butyrate 58,34 58.34 nie oznaczono not marked walerian valerian 41.50 41.50 94 94

Przykład IV. Sposób otrzymywania (+)- i (-)-FTC drogą enancjoselektywnej, katalizowanej lipazą hydrolizy maślanu FTC.Example IV. The method of obtaining (+) - and (-) - FTC by enantioselective, lipase-catalyzed hydrolysis of FTC butyrate.

149 mg (0,47 mmola) 5'-0-maślanu (±)-FTC rozpuszczono w 16 ml mieszaniny 41 buforu pH 8 i CH3CN. Klarowny roztwór mieszano i dodano 26 mg esterazy z wątroby świńskiej (PLE-A). Postęp reakcji monitorowano za pomocą HPLC (figura 4). Po upływie 20 godzin (52% konwersji) mieszaninę reakcyjną ekstrahowano 2 x 80 ml CHC1 i 80 ml octanu etylu. Połączone ekstrakty organiczne suszono nad bezwodnym M'gSO4, przesączono i zatężono w wyparce obrotowej. Pozostałość eluowano na 2 x 1000 m płytkach pTLC, stosując do elucji octan etylu (dwukrotna elucja) i otrzymano po wyizolowaniu 53 mg (36% w stosunku do wyjściowego materiału) maślanu FTC o 98% nadmiarze enancjomerycznym (e.e.) zgodnie z analizą HPLC. Wzbogacony enancjomerycznie maślan traktowano 1,6 ml metanolu i następnie 0,38 mola (20 mg) metoksylanu sodowego Otrzymaną mieszaninę mieszano w pokojowej temperaturze i postęp reakcji monitorowano za pomocą HPLC. Reakcja została zakończona po upływie 30 minut. Rozpuszczalnik odparowano w wyparce obrotowej i otrzymano 76 mg surowego białego osadu, który następnie eluowano na 1000 m płytkach pTLC, eluując mieszaninę 5:1 octanu i etylu. Izomer (-)-FTC izolowano jako biały osad (33 mg, 82%). Analiza HPLC 5'-O-octanu FTC wykazała 97% nadmiaru enancjomerycznego; [a)d = -120,5° (c = 0,88, bezwodny etanol).149 mg (0.47 mmol) of (±) -FTC 5'-O-butyrate was dissolved in 16 ml of a mixture of pH 8 buffer and CH 3 CN. The clear solution was mixed and 26 mg of porcine liver esterase (PLE-A) was added. The progress of the reaction was monitored by HPLC (figure 4). After 20 hours (52% conversion), the reaction mixture was extracted with 2 x 80 ml of CHCl and 80 ml of ethyl acetate. The combined organic extracts were dried over anhydrous MgSO4, filtered, and concentrated on the rotary evaporator. The residue was eluted on 2 x 1000m pTLC plates, eluting with ethyl acetate (2-fold elution), yielding 53 mg (36% based on starting material) of FTC butyrate with 98% enantiomeric excess (ee) as determined by HPLC analysis. The enantiomerically enriched butyrate was treated with 1.6 mL of methanol and then 0.38 mol (20 mg) of sodium methoxide. The resulting mixture was stirred at room temperature and the progress of the reaction was monitored by HPLC. The reaction was complete after 30 minutes. The solvent was evaporated on a rotary evaporator to give 76 mg of a crude white solid which was then eluted on 1000 m pTLC plates, eluting with a 5: 1 mixture of acetate and ethyl. The (-) - FTC isomer was isolated as a white solid (33 mg, 82%). HPLC analysis of FTC 5'-O-acetate showed 97% enantiomeric excess; [a) d = -120.5 ° (c = 0.88, anhydrous ethanol).

Emulsji w etapie przerobu można uniknąć dodając do mieszaniny reakcyjnej HCCk po zakończeniu reakcji (służy to także denaturacji enzymu). Następnie, odparowuje się rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem i ekstrahuje chloroformemThe workup step can be avoided by adding HCCk to the reaction mixture after completion of the reaction (this also serves to denature the enzyme). Then, the solvents are evaporated off under reduced pressure and extracted with chloroform

Podobnie 1,2 mmola (375 mg) 5-O-maślanu (±)-FTC rozpuszczono w 40 ml mieszaniny 41 buforu o pH 8 i CH3CN. Do klarownego roztworu dodano podczas mieszania 58 mg esterazy z wątroby świni (PLE-A). Postęp reakcji monitorowano za pomocą HPLC Po upływie 90 minut (38% konwersji) mieszaninę reakcyjną dodano do 150 ml CHC13, warstwy rozdzielono i wodą liofilizowano w celu usunięcia rozpuszczalnika. Biały liofilizat ekstrahowano 3 x 10 ml bezwodnego etanolu, ekstrakty przesączono, połączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano 179 mg surowego oleistego produktu, który oczyszczano na kolumnie 45 x 30 mm z żelem krzemionkowym, stosując do elucji 3 x 75 ml octanu etylu i następnie mieszaninę 5:1 octanu etylu i etanolu. Otrzymano 109 mg (37% w stosunku do wyjściowego maślanu) (+)-FTC w postaci białego, stałego produktu. Analiza HPLC (+)-FTC w postaci 5'-0-maslanu wykazała 97,4% nadmiaru enancjomerycznego (e.e); [aj^ = +113,4° (c = 2,53, bezwodny etanol).Similarly, 1.2 mmol (375 mg) of (±) -FTC 5-O-butyrate were dissolved in 40 ml of a mixture of 41 buffer pH 8 and CH 3 CN. 58 mg of porcine liver esterase (PLE-A) was added to the clear solution with stirring. The progress of the reaction was monitored by HPLC. After 90 minutes (38% conversion) the reaction mixture was added to 150 ml of CHCl 3 , the layers were separated and the water was lyophilized to remove the solvent. The white lyophilisate was extracted with 3 x 10 ml of anhydrous ethanol, the extracts were filtered, combined and concentrated under reduced pressure. 179 mg of crude oily product was obtained, which was purified on a 45 x 30 mm silica gel column, eluting with 3 x 75 ml of ethyl acetate and then with a 5: 1 mixture of ethyl acetate and ethanol. 109 mg (37% with respect to the starting butyrate) of (+) - FTC were obtained as a white solid product. HPLC analysis (+) - FTC as 5'-O-butanate showed 97.4% enantiomeric excess (ee); [j R 2 = + 113.4 ° (c = 2.53, anhydrous ethanol).

Podobną reakcję przeprowadzono stosując 0,12 mmola (37 mg) 5-O-maŚlanu FTC i 7 mg PS-800 w 4,0 ml mieszaniny 4:1 buforu o pH 8 i CH3CN. Reakcja zachodziła znacznie wolniej niż dla PLE-A i wymagała 74 godzin dla osiągnięcia 59% konwersji.A similar reaction was performed using 0.12 mmol (37 mg) of FTC 5-O-butyrate and 7 mg of PS-800 in 4.0 ml of a 4: 1 mixture of pH 8 buffer and CH 3 CN. The reaction was much slower than for PLE-A and required 74 hours to achieve 59% conversion.

Wyodrębniono 11,4 mg maślanu (31% pierwotnej ilości) wykazującego 94% e.e. (HPLC).11.4 mg of butyrate (31% of original amount) was isolated showing 94% e.e. (HPLC).

Przykład V. Rozdział enancjomerów nukleozydu za pomocą deaminazy cytydynowo-dezoksycytydynowej.Example 5 Separation of nucleoside enantiomers with cytidine-deoxycytidine deaminase.

W alternatywnym sposobie, stosowano deaminazę cytydynowo-dezoksycytydynową do rozdziału mieszanin racemicznych 2-hydroksymetylo-5-(cytozynylo-1)-1,3-oksatiolanu i jego pochodnych, w tym 2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolanu. Enzym katalizuje dezaminację reszty cytozyny do uracylu. Stwierdzono, że jeden z enancjomerów nukleozydów 1,3-oksatiolanowych jest korzystnym substratem dla deaminazy cytydynowo-dezoksycytydynowej. Enancjomer, który nie jest przekształcany w pochodną uracylową (i tym samym pozostaje zasadowy) jest ekstrahowany z roztworu kwaśnym roztworem. Należy unikać stosowania roztworów silnych kwasów (o pH poniżej 3,0), które mogą rozszczepiać pierścień oksatiolanu.In an alternative method, cytidine deoxycytidine deaminase has been used to separate racemic mixtures of 2-hydroxymethyl-5- (cytosinyl-1) -1,3-oxathiolane and its derivatives, including 2-hydroxymethyl-5- (5-fluorocytosinyl-1) - 1,3-oxathiolane. The enzyme catalyses the deamination of the cytosine residue to uracil. One of the enantiomers of 1,3-oxathiolane nucleosides has been found to be the preferred substrate for cytidine deoxycytidine deaminase. The enantiomer which is not converted to the uracil derivative (and thus remains basic) is extracted from the solution with an acidic solution. Strong acid solutions (less than pH 3.0) that can cleave the oxathiolane ring should be avoided.

Deaminazę cytydynowo-dezoksycytydynową można izolować z wątroby szczura lub wątroby ludzkiej, lub otrzymywać drogą ekspresji z sekwencji rekombinanta w prokariotycznym układzie, takim jak w E. coli.Cytidine-deoxycytidine deaminase can be isolated from rat liver or human liver, or can be expressed from a recombinant sequence in a prokaryotic system, such as in E. coli.

Rozdział enancjomerów nukleozydu cytydynowego za pomocą deaminazy cytydynowo-dezoksycytydynowej może być stosowany jako samodzielna metoda rozdziału lub może być stosowany w kombinacji z innymi metodami rozdziału, w tym enzymatyczną hydrolizą estrów 5'-0-nukleozydu, opisaną uprzednio.Separation of cytidine nucleoside enantiomers by cytidine deoxycytidine deaminase can be used as a standalone separation method or can be used in combination with other separation methods including the enzymatic hydrolysis of 5'-O-nucleoside esters described previously.

Przykład VI. Kombinacja rozdziału enzymatycznego z klasycznymi metodami rozdziału.P r zykład VI. Combination of enzymatic separation with classical separation methods.

Opisany powyżej proces rozdziału mieszanin racemicznych enancjomerów nukleozydów może być łączony z innymi klasycznymi metodami rozdziału enancjomerów dla zwiększenia czystości optycznej produktu końcowego.The above-described process for separation of racemic mixtures of nucleoside enantiomers can en be combined with other classical methods of enantiomeric separation to increase the optical purity of the final product.

Do klasycznych metod rozdziału należą różne techniki fizyczne i chemiczne. Często najbardziej prostą i najskuteczmejszą techniką jest rekrystalizacja wykorzystująca zasadę, że racematy są często lepiej rozpuszczalne niż ich indywidualne enancjomery. Rekrystalizację można prowadzić w dowolnym etapie, w tym na etapie acylowanych związków lub końcowych enancjomerycznych produktów. Jeśli jest skuteczna, to proste podejście może być metodą z wyboru. D and SYNC frames with different separation methods include a variety of physical and chemical techniques. Often najb ar d straight branches j and aj n s k of teczmejszą technique is recrystallization, based on the principle that rac ema you are drawing part of the glue t e j of soluble than their individual enantiomers. Recrystallization Moz p ditch you generously at any stage including the stage of the acylated compounds or the final enantiomeric product. If it works, this simple approach may be the method of choice.

Jeśli drogą rekrystalizacji nie udaje się otrzymywanie materiału o dopuszczalnej czystości optycznej, wówczas trzeba sprawdzać inne metody. Jeśli nukleozyd ma charakter zasadowy (np. cytydyna) można stosować chiralne kwasy tworzące mieszaniny diastereomeryczne, które mogą wykazywać znacznie różne rozpuszczalności. Nie ograniczającymi przykładami chiralnych kwasów są kwas jabłkowy, kwas migdałowy, kwas dwubenzoilowinowy, kwas 3-bromokamforo-8-sulfonowy, kwas 10-kamforosulfonowy i kwas dwu-p-toluilowinowy. Podobnie, acylowanie wolnej grupy hydroksylowej także prowadzi w przypadku stosowania pochodnej chiralnego kwasu do tworzenia mieszanin diastereomerycznych, których właściwości fizyczne mogą się różnić dostatecznie, by umożliwić rozdział.If the material cannot be obtained with acceptable optical purity by recrystallization, other methods must be tested. If the nucleoside is basic (e.g., cytidine), chiral acids can be used to form diastereomeric mixtures which may have significantly different solubilities. Non-limiting examples of chiral acids are malic acid, mandelic acid, dibenzoyltartaric acid, 3-bromocamphoro-8-sulfonic acid, 10-camphorsulfonic acid, and di-p-toluoyltartaric acid. Likewise, acylation of the free hydroxyl group also leads, when a chiral acid derivative is used, to form diastereomeric mixtures whose physical properties may vary sufficiently to permit separation.

Małe ilości wzbogaconych enancjomerycznie nukleozydów można otrzymywać lub oczyszczać drogą przepuszczania mieszaniny racemicznej przez kolumnę HPLC przeznaczoną do rozdziałów chiralnych, taką np. jak kolumna zawierająca cyklodekstrynę, sprzedawana przez Rainin CorporationSmall amounts of enantiomerically enriched nucleosides can be obtained or purified by passing the racemic mixture over an HPLC column designed for chiral separations, such as, for example, a cyclodextrin column sold by Rainin Corporation.

Przykład VII. Rozdział mieszanin racemicznych nukleozydów za pomocą HPLC.Example VII. Resolution of racemic nucleoside mixtures by HPLC.

Rozdział C4'-enancjomerów (±)-FTC prowadzono stosując zawierającą chiralną cyklodekstrynę (cyclobond AC-I) kolumnę firmy Rainin Corporation (Woburn, MA). Stosowano następujące warunki: izokratyczny 0,5% roztwór metanolu w wodzie; szybkość przepływu 1 ml/min.; detekcja UV przy 262 nm. Metanol do HPLC otrzymano z firmy J. T. Baker (Phillisburg, NJ). Wstrzykiwano racemiczne mieszaniny i zbierano frakcje. Frakcje zawierające każdy z enancjomerów zbierano, zamrożono i następnie zliofilizowano. Związki charakteryzowano za pomocą spektroskopii w UV i ich czasów retencji w HPLC. Zwykle (-)-enancjomery miały niższe czasy retencji niż (+)-enancjomery (patrz J. Liquid Chromatography, 7, 353-376, 1984). Stężenie związków oznaczano za pomocą spektroskopii UV, stosując standardowy roztwór o znanym stężeniu (15 |iM), sporządzony w wodzie do badania biologicznego. Czasy retencji dla rozdzielonych enancjomerów podano w tabeli 2.Separation of the C4'-enantiomers (±) -FTC was carried out using a chiral cyclodextrin (cyclobond AC-I) column from Rainin Corporation (Woburn, MA). The conditions used were: isocratic 0.5% methanol in water; flow rate 1 ml / min .; UV detection at 262 nm. HPLC methanol was obtained from J. T. Baker (Phillisburg, NJ). Racemic mixtures were injected and fractions collected. Fractions containing each enantiomer were collected, frozen and then lyophilized. The compounds were characterized by UV spectroscopy and their HPLC retention times. Typically the (-) - enantiomers had lower retention times than the (+) - enantiomers (see J. Liquid Chromatography, 7, 353-376, 1984). The concentration of the compounds was determined by UV spectroscopy using a standard solution of known concentration (15 µM) prepared in water for bioassay. The retention times for the resolved enantiomers are given in Table 2.

Tabela 2Table 2

Czasy retencji enancjomerów FTCRetention times of the FTC enantiomers

Związek Relationship RXmin.) RXmin.) (-)-FTC (-) - FTC 8,3 8.3 (+)-FTC (+) - FTC 8,7 8.7

Przykład VIII. Alternatywne metody rozdziału enancjomerów FTC przy zastosowaniu chiralnej kolumny.Example VIII. Alternative methods for the separation of FTC enantiomers using a chiral column.

Przy zastosowaniu kolumny Cyclobond I-Ac (5 mm,2 5cm x 4,6 mn-pRainin Corporation, Wobum, MA, nr katalogowy AST-41049), szybkości przepływu 0,6 ml/minutę izokratycznego metanolu (Fisher Scientific, Inc., czystość do HPLC, nr katalogowy A-452-4, w wodzie) i detekcji w UV przy 262 nm, enancjomery FTC wykazywały czasy retencji odpowiednio 12,68 minut ((-)-FTC) i 13,20 minut ((+)-FTC).Using a Cyclobond I-Ac column (5mm, 2.5cm x 4.6mn-pRainin Corporation, Wobum, MA, catalog no. AST-41049), a flow rate of 0.6 ml / min isocratic methanol (Fisher Scientific, Inc., HPLC grade, catalog # A-452-4, in water) and UV detection at 262 nm, the FTC enantiomers exhibited retention times of 12.68 minutes ((-) - FTC) and 13.20 minutes ((+) - FTC).

Przy zastosowaniu kolumny Chiralpak AS (10 pm, 25 cm x 4,6 mm, J. T. Baker Inc., Phillisburg, NJ, nr katalogowy 7406-00, nr seryjny 09-29-10320), szybkości przepływu 0,8 ml/minutę alkoholu izopropylowego (czystość do HPLC, Fisher Scientific, Inc., nr katalogowy A-451-4) i detekcji w UV przy 262 nm, enancjomery FTC wykazywały czasy retencji odpowiednio 5,9 minut ((-)-FTC) i 9,8 minut ((+)-FTC).Using a Chiralpak AS column (10 µm, 25 cm x 4.6 mm, JT Baker Inc., Phillisburg, NJ, catalog number 7406-00, serial number 09-29-10320), flow rates of 0.8 ml / min alcohol isopropyl (HPLC grade, Fisher Scientific, Inc., Cat # A-451-4) and UV detection at 262 nm, the FTC enantiomers showed retention times of 5.9 minutes ((-) - FTC) and 9.8 minutes respectively ((+) - FTC).

Aktywność biologiczną nowego nukleozydu i jego poszczególnych enancjomerów przedstawiono w poniższych testach.The biological activity of the new nucleoside and its individual enantiomers is demonstrated in the following tests.

Tt 1. Zdolność 2-hydroksymetylo-2-(2-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatlolanu (FTC) do hamowania replikacji HIV.Tt 1. Ability of 2-hydroxymethyl-2- (2-fluorocytosinyl-1) -1,3-oxatlate (FTC) to inhibit HIV replication.

171 150171 150

Często jest pożądane przeprowadzenie skriningu wielu racemicznych mieszanin nukleozydów, jako wstępnego etapu oceny, na podstawie której można dokonywać dalszego rozdziału na wzbogacone enancjomerycznie składniki i prowadzić dalsze badania aktywności przeciwwirusowej. Zdolność nukłeozydów do hamowania HIV można oceniać różnymi technikami doświadczalnymi. W stosowanej tutaj i opisanej szczegółowo poniżej technice mierzy się hamowanie replikacji wirusa z pobudzonych fitohemoglutyniną (PHA) jednojądrzastych komórkach (PBM) z obwodowej krwi ludzkiej zakażonej HIV-1 (szczep LAV). Dość wytwarzanego wirusa oznacza się drogą pomiaru kodowanego wirusem enzymu, odwrotnej transkryptazy. Ilość wytwarzanego enzymu jest proporcjonalna do ilości wytwarzanego wirusa W tabeli 3 podano wartości EC50 (stężenie nukleozydu hamujące o 50% replikację wirusa w komórkach PBM z uwzględnieniem błędu ocenianego na 10 %) oraz wartości IC50 (stężenie nukleozydu hamujące o 50% wzrost pobudzanych nitrogenem niezakazonych ludzkich komórek PBM), dla szeregu nukleozydów (±)-oksatiolanowych.It is often desirable to screen multiple racemic mixtures of nucleosides as a preliminary evaluation step from which to perform further separation into enantiomerically enriched components and further investigate antiviral activity. The ability of nucleosides to inhibit HIV can be assessed by various experimental techniques. The technique used herein and detailed below measures the inhibition of viral replication from phytohaemoglutinin (PHA) stimulated mononuclear cells (PBM) from peripheral blood of HIV-1 infected human (LAV strain). The amount of virus produced is determined by measuring the virus-encoded enzyme, reverse transcriptase. The amount of enzyme produced is proportional to the amount of virus produced. Table 3 shows the EC50 values (nucleoside concentration inhibiting 50% of viral replication in PBM cells including 10% error) and IC50 values (nucleoside concentration inhibiting 50% of the increase in nitrogen-stimulated non-infected human PBM cells), for a range of (±) -oxathiolane nucleosides.

Test 2. Aktywność anty-HIV nukleozydów (±)-1,3-oksatiolanowych.Test 2. Anti-HIV activity of (±) -1,3-oxathiolane nucleosides.

A. Trzydniowe, pobudzane fitohemoglutyniną komórki PBM (106 komórek/ml) od surowiczo-ujemnych w stosunku do HBV i HIV-1 zdrowych dawców zakażono wirusem HIV-1 (szczep LAV) w stężeniu na ml wynoszącym około 100 razy więcej niż 50% dawka zakażająca hodowlę komórkową (TICD 50) i następnie hodowano bez dodatku lub z dodatkiem różnych stężeń związków przeciwwirusowych.A. Three-day-old phytohemoglutinin stimulated PBM cells (10 6 cells / ml) from HBV and HIV-1 negative healthy donors were infected with HIV-1 (LAV strain) at a concentration per ml of approximately 100 times greater than 50% cell culture infecting dose (TICD 50) and then cultured without or with varying concentrations of antiviral compounds.

B. Po upływie około 1 godziny od zakażenia, podłoże z testowanym związkiem (dwukrotne stężenie końcowe w podłożu) lub bez tego związku, przeniesiono do kolb (5 ml, końcowa objętość 10 ml). Jako pozytywną kontrolę stosowano AZT.B. About 1 hour after infection, the medium with or without test compound (2-fold final concentration in medium) was transferred to flasks (5 ml, final volume 10 ml). AZT was used as a positive control.

C. Komórki poddano działaniu wirusa (około 2 x 105 dpm/ml, zgodnie z oznaczeniem za pomocą transkryptazy) i następnie umieszczono w inkubatorze w C02. HIV-1 (szczep LAV) otrzymano z Disease Control, Atlanta, Georgia. Do hodowania komórek PBM, zbierania wirusa i oznaczania aktywności odwrotnej transkryptazy stosowano metody opisane przez McDougal'a i wsp. w J. Immun. Meth., 76, 171-183 (1985) oraz Spira i wsp. w Clin. Meth., 25, 97-99 (1987), z tym tylko, że do podłoża nie dodawano fungizonu (patrz: Schinazi i wsp., Antimicrob. Agents Chemother., 32, 1784-1787 (1988); oraz ibidem, 34, 1061-1067 (1990)).C. Cells were treated with virus (approximately 2 x 105 dpm / ml, as determined by transcriptase) and then placed in a CO 2 incubator. HIV-1 (LAV strain) was obtained from Disease Control, Atlanta, Georgia. The methods described by McDougal et al., J. Immun, were used to cultivate the PBM cells, harvest the virus, and determine reverse transcriptase activity. Meth., 76, 171-183 (1985) and Spira et al. In Clin. Meth., 25, 97-99 (1987), except that no fungizone was added to the medium (see Schinazi et al., Antimicrob. Agents Chemother., 32, 1784-1787 (1988); and ibid., 34, 1061-1067 (1990)).

D. W szóstym dniu komórki i supernatant przeniesiono do 15 ml probówki i wirowano przy około 900 g w ciągu 10 minut. Usunięto 5 ml supematantu i wirus zatężono drogą wirowania przy 40000 obrotach/minutę w ciągu 30 minut (Beckman 70.1 Ti roztor). Rozpuszczalne pastylki wirusa przygotowano do oznaczenia poziomów odwrotnej transkryptazy. Wyniki wyrażono w dpm/ml pobranego supematantu. Wirus z mniejszej objętości supematantu (1 ml) można także zatężać drogą wirowania przed rozpuszczeniem i oznaczeniem poziomów odwrotnej transkryptazy.D. On the sixth day, cells and supernatant were transferred to a 15 ml tube and centrifuged at approximately 900 g for 10 minutes. 5 ml of supernatant was removed and the virus was concentrated by centrifugation at 40,000 rpm for 30 minutes (Beckman 70.1 Ti solution). Soluble viral pellets were prepared for the determination of reverse transcriptase levels. The results are expressed in dpm / ml of supernatant removed. The virus from a smaller volume of the supernatant (1 ml) can also be concentrated by centrifugation prior to dissolution and determination of reverse transcriptase levels.

Średnie skuteczne stężenie (EC50) oznaczono metodą średniego' działania (Antimicrob Agents Chemother., 30, 491-498 (1986)). Sporządza się wykres zależności procentowego hamowania wirusa, oznaczanego z pomiarów odwrotnej transkryptazy, od mikromolamego stężenia związku. EC5o jest to stężenie związku, przy którym zachodzi 50% hamowania wzrostu wirusaThe mean effective concentration (EC 50) was determined by the mean action method (Antimicrob Agents Chemother., 30, 491-498 (1986)). Percentage viral inhibition, as determined by reverse transcriptase measurements, versus micromolar compound concentration is plotted. EC 5 o is the concentration of compound at which 50% inhibition of viral growth occurs

E. Pobudzane mitogenem niezakażone ludzkie komórki PBM (3,8 x 105 komórek/ml) hodowano bez i w obecności leku, w warunkaęh podobnych do opisanych uprzednio badaniach przeciwwirusowych Komórki zliczano po 6 dniach za pomocą hemocytometru i metodą eliminacji błękitu trypanowego, opisaną przez SchinazTego i wsp. w Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 22(3), 499 (1982). IC 50 jest to stężenie z^viązku ha^nujące o 50/Ό nor^malny wzrost komórek.E. Mitogen stimulated uninfected human PBM cells (3.8 x 105 cells / ml) were cultured without and in the presence of drug under conditions similar to the antiviral studies previously described. Cells were counted after 6 days using a hemocytometer and the trypan blue elimination method described by Schinaz in Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 22 (3), 499 (1982). IC 50 is the concentration of compound that inhibits 50% of normal cell growth.

Tabela 3Table 3

EC^ i IC50 dla różnych analogów nukleozydów 1,3-oksatięlanowych w ludzkich komórkach PBMEC1 and IC50 for various 1,3-oxathylate nucleoside analogs in human PBM cells

Kod Code X lub Y X or Y R R Aktywność przeciwwirusowa EC50, pM Activity antiviral EC50, pM Cytotoksyczność IC50 μΜ IC50 cytotoxicity μΜ DLS-009 DLS-009 x = o x = o H H. > 100 > 100 > 100 > 100 DLS-010 DLS-010 x = o x = o Me Me 64,4 64.4 > 100 > 100 DLS-027 DLS-027 x = o x = o F F. > 100 > 100 > 100 > 100 DLS-028 DLS-028 X = 0 X = 0 Cl Cl 60,8 60.8 > 100 > 100 DLS-044 DLS-044 x = o x = o Br Br > 100 > 100 > 100 > 100 DLS-029 DLS-029 x = 0 x = 0 J J. > 100 > 100 > 100 > 100 DLS-020 DLS-020 Y = nh2 Y = nh 2 H H. 0,02 0.02 > 100 > 100 DLS-011 DLS-011 y = nh2 y = nh 2 Me Me > 10 > 10 > 100 > 100 DLS-022 DLS-022 y = nh2 y = nh 2 F F. 0,01 0.01 >100 > 100 DLS-023 DLS-023 Y = NH2 Y = NH2 Cl Cl 38,7 38.7 > 100 > 100 DLS-021 DLS-021 Y = NH2 Y = NH2 Br Br 77,4 77.4 > 100 > 100 DLS-026 DLS-026 Y = NH2 Y = NH2 J J. 0,72 0.72 > 100 > 100 DLS-058 (-) DLS-058 (-) Y = NH2 Y = NH2 F F. 0,008 0.008 > 100 > 100 DLS-059 (+) DLS-059 (+) Y = nh2 Y = nh 2 F F. 0,84 0.84 > 100 > 100 DLS-053 DLS-053 y = nh2 y = nh 2 cf3 cf 3 60,7 60.7 > 100 > 100

Jak podano w tabeli 3, generalnie, podstawione nukleozydy cytozyno-1,3-oksatiolanowe są bardziej aktywne niż odpowiednie nukleozydy uracylowe. Błąd w pomiarach EC50 i IC5o oceniany jest na ± 10%.As shown in Table 3, in general, substituted cytosine-1,3-oxathiolane nucleosides are more active than the corresponding uracil nucleosides. The error in the measurements of EC 5 0 and IC 5 o is estimated at ± 10%.

Jeden ze związków, (±)-FTC (określony jako DLS-022, związek 8) nie tylko wykazuje wyjątkową aktywność (około 10 nM w komórkach PBM), ale także zupełnie niską toksyczność (> 100 w komórkach PBM, Vero i CEM).One of the compounds, (±) -FTC (referred to as DLS-022, compound 8) not only exhibits exceptional activity (about 10 nM in PBM cells), but also quite low toxicity (> 100 in PBM, Vero and CEM cells).

IC50 dla (±)-FTC wynosi powyżej 100 pM, co wskazuje, że związek nie jest toksyczny dla niezakażonych komórek PBM w badaniach do 100 pM.The IC50 for (±) -FTC is above 100 µM, indicating that the compound is not toxic to uninfected PBM cells when tested up to 100 µM.

Test 3. Aktywność przeciwwirusowa enancjomerów FTC rozdzielanych za pomocą HPLC.Test 3. Antiviral activity of FTC enantiomers separated by HPLC.

Enancjomery FTC wyodrębniano metodą opisaną w przykładzie VII i aktywność przeciwwirusową oznaczano metodą podaną w teście 2. Wyniki przedstawiono w tabeli 4 i zilustrowano na figurze 5.FTC enantiomers were isolated by the method described in Example 7 and antiviral activity was determined by the method described in test 2. The results are presented in Table 4 and illustrated in Figure 5.

Tabela 4Table 4

Aktywność przedwwirusowa (+)- i (-)-enancjomerów FTCPre-viral activity of the (+) - and (-) - enantiomers of FTC

Podawane stężenie (gM) Administered concentration (gM) DPM/ml DPM / ml % hamowania (niekorygowany) % inhibition (uncorrected) EC50 (gM) EC50 (gM) FTC (±) FTC (±) 0,0001 0.0001 73,755 73.755 26,6 26.6 0,018 0.018 0,005 0.005 83,005 83.005 16,3 16.3 0,01 0.01 60,465 60,465 41,3 41.3 0,05 0.05 34,120 34,120 70,4 70.4 0,1 0.1 14,160 14,160 92,4 92.4 0,5 0.5 18,095 18.095 88,1 88.1 1 1 7,555 7.555 99,7 99.7 5 5 7,940 7.940 99,3 99.3 10 10 5,810 5.810 101,7 101.7 FTC (-) FTC (-) 0,001 0.001 76,275 76.275 23,8 23.8 0,02 0.02 0,005 0.005 58,590 58.590 43,3 43.3 0,01 0.01 75,350 75.350 24,8 24.8 0,05 0.05 28,890 28.890 76,2 76.2 0,1 0.1 13,175 13.175 93,5 93.5 0,5 0.5 9,485 9.485 97,6 97.6 FTC (+) FTC (+) 0,001 0.001 94,340 94.340 3,8 3.8 0,28 0.28 0,005 0.005 107,430 107,430 -10,6 -10.6 0,01 0.01 99,465 99.465 -1,8 -1.8 0,05 0.05 87,120 87,120 11,8 11.8 0,1 0.1 86,340 86.340 12,7 12.7 0,5 0.5 33,225 33.225 71,4 71.4

Jak wynika z danych z tabeli 4, w tym doświadczeniu enancjomer (-)-FTC jest o około jeden rząd wielkości bardziej aktywny niż enanqomer (+)-FTC i wykazuje w przybliżeniu taką samą aktywność anty-HIV jak mieszanina racemiczna. Ani enancjomery ani mieszanina racemiczna nie jest toksyczna do 100 gM, co oznaczono metodą eliminacji błękitu trypanowego w ludzkich komórkach PBM.As shown in Table 4, in this experiment the (-) - FTC enantiomer is approximately one order of magnitude more active than the (+) - FTC enantiomer and exhibits approximately the same anti-HIV activity as the racemic mixture. Neither the enantiomers nor the racemic mixture are toxic up to 100 gM as determined by the elimination of trypan blue in human PBM cells.

Test 4. Aktywność przeciwwirusowa enancjomerów FTC rozdzielanych metodą z przykładu IV.Test 4. Antiviral activity of FTC enantiomers separated by the method of Example IV.

Enancjomery (±)-FTC były także rozdzielane metodą z przykładu IV, a aktywność przeciwwirusową badano metodą z testu 2. Wyniki zilustrowano na figurze 6. Jak pokazano na figurze 6, EC50 racemicznej mieszaniny FTC wynosiło 0,017 gM, EC50 dla (-)-FTC 0,0077 gM oraz EC50 dla (+)-FTC 0,84 gM.The enantiomers of (±) -FTC were also separated by the method of Example IV, and the antiviral activity was examined by Test 2. The results are shown in Figure 6. As shown in Figure 6, the EC50 of the racemic mixture of FTC was 0.017 gM EC 5 0 of (-) -FTC 0.0077 gM and EC50 for (+) - FTC 0.84 gM.

Test 5. Wchłanianie (±)-FTC przez ludzkie komórki PBM.Test 5. Absorption of (±) -FTC by human PBM cells.

Przeprowadzono badania, stosując znakowany FTC, mające na celu ustalenie poziomów wewnątrzkomórkowych macierzystego leku i jego metabolitów. Wszystkie badania powtarzano dwukrotnie. Ludzkie jednojądrzaste komórki (PBM) z obwodowej krwi zawieszono w podłożu RPMI 1640 zawierającym 10% surowicy płodu cielęcia i antybiotyki (2 x 106 komórek/ml, dla każdego przedziału czasu) i inkubowano z dodatkiem 10 gM FTC (o aktywności właściwej około 700 dpm/pmol) Komórki poddawano działaniu leku w ciągu 2, 6, 12 i 24 godzin. Po upływie kolejnych przedziałów czasu komórki przemywano dwukrotnie zimnym roztworem zrównoważonej soli Hanka. Ekstrakcję prowadzono z dodatkiem 0,2 ml 60% zimnego roztworu metanolu w wodzie, przechowywano w ciągu nocy w temperaturze -70°C. Następnego dnia zawiesiny wirowano i ekstrakcję powtórzono dwukrotnie w ciągu 0,5 godziny, w temperaturze -70°C. Wszystkie supematanty (0,6 ml) zliofillzowano. Pozostałości zawieszono w 250 gl wody i próbki po 50 do 100 gl analizowano za pomocą HPLC. Ocenę ilościową zawartości wewnątrzkomórkowej macierzystego leku i jego metabolitów prowadzono za pomocą HPLC. Ze względu na potencjalną nietrwałość niektórych związków w kwasie, w procesie rozdziału metabolitów stosowano układ buforujący bliski fizjologicznego pH.Studies have been carried out using labeled FTC to determine the intracellular levels of the parent drug and its metabolites. All tests were repeated twice. Human mononuclear cells (PBM) from peripheral blood were suspended in RPMI 1640 medium containing 10% fetal calf serum and antibiotics (2 x 106 cells / ml, for each time interval) and incubated with 10 gM FTC (specific activity about 700 dpm). / pmol) Cells were treated with drug for 2, 6, 12 and 24 hours. After successive time intervals, cells were washed twice with cold Hank's balanced salt solution. The extraction was carried out with the addition of 0.2 ml of a 60% cold solution of methanol in water, stored overnight at -70 ° C. The next day, the suspensions were centrifuged and the extraction was repeated twice for 0.5 hours at -70 ° C. All supernatants (0.6 ml) were freeze-dried. The residues were suspended in 250 g of water and aliquots of 50 to 100 g were analyzed by HPLC. The quantification of the intracellular content of the parent drug and its metabolites was performed by HPLC. Due to the potential instability of some compounds in acid, a buffer system close to the physiological pH was used in the process of separating the metabolites.

Na figurze 7 przedstawiono wykres zależności obecności (wchłonięcia) trytylowanego (±)-FTC w ludzkich komórkach PBM (średnia z dwóch oznaczeń) w czasie (godziny) od pmol/106 komórek. Badania wchłaniania wykazują, że znakowany FTC jest łatwo wychwytywany przez ludzkie limfocyty, w których powstają bardzo duże ilości pochodnej 5,-trójfosforanowej FTC.Figure 7 is a plot of the presence (uptake) of trilylated (6) -FTC in human PBM cells (mean of two determinations) over time (hours) versus pmol / 10 6 cells. Absorption studies show that labeled FTC is readily taken up by human lymphocytes, which produce very large amounts of the 5 , -triphosphate FTC derivative.

Test 6. Aktywność przeciwretrowirusowa FTC w różnych liniach komórkowych.Test 6. Antiretroviral activity of FTCs on various cell lines.

Aktywność przeciwretrowirusową FTC oznaczano w wielu liniach komórkowych stosując postępowanie podobne, ale nie identyczne, do przedstawionego w teście 2. Linie komórkowe otrzymano od dawców ludzkich z AIDS Research and Reference Reagent Program, NIH, Rockville, Maryland, ATCC lub z Czerwonego Krzyża. Komórki CEM z niedoborem kinazy tymidynowej preparowano drogą kolejnych pasaży komórek CEM w obecności 5-bromo-2'-dezoksyurydyny. Wyniki przedstawiono w tabeli 5.FTC antiretroviral activity was assayed in a number of cell lines using procedures similar, but not identical, to those described in Test 2. Cell lines were obtained from human donors from the AIDS Research and Reference Reagent Program, NIH, Rockville, Maryland, ATCC, or the Red Cross. Thymidine kinase deficient CEM cells were prepared by serial passages of CEM cells in the presence of 5-bromo-2'-deoxyuridine. The results are presented in Table 5.

Tabela 5Table 5

Aktywność przeciwretrowirusowa FTC w różnych układach komórkowychAntiretroviral activity of FTCs in various cell systems

Układ komórkowy (szczep wirusa) Cell system (virus strain) EC5t) (pM) (±)-FTCEC 5t) (pM) (±) -FTC HIV-1 HIV-1 PMBC (LAV-1) PMBC (LAV-1) 0,027 0.027 MT2 (HTLVniBMT2 (HTLV n and B 0,89 0.89 CEM (LAV-1) CEM (LAV-1) 0,08 0.08 CEM-TK (LAV-1) CEM-TK (LAV-1) 0,026 0.026 CEM (HTLV„ib)NIH CEM (HTLV "ib) NIH 0,09 0.09 HlV-2 HlV-2 PBMC (ROD2) PBMC (ROD2) 0,0038 (±>FTC 0,0007 (-)-FTC 0,0260 (+) FTC 0.0038 (±> FTC 0.0007 (-) - FTC 0.0260 (+) FTC SIV SIV AA-2 (SIV251) AA-2 (SIV251) 4,6 4.6 C-8166 (SIV251) C-8166 (SIV251) <8,0 <8.0 FTV FTV CrFK (61E) CrFK (61E)

Test 7. Wydalanie (±)-FTC z ludzkich komórek PBMTest 7. Excretion of (±) -FTC from human PBM cells

Przeprowadzono badania z zastosowaniem znakowanego FTC w celu ustalenia poziomów macierzystego leku i jego metabolitów wewnątrz komórek po inkubowaniu w pożywkach z lekiem w ciągu 24 godzin i następnie usunięciu leku. W tym badaniu dokonywano pomiaru czasu niezbędnego do obniżenia poziomów wewnątrzkomórkowych trójfosforanów. Każde doświadczenie prowadzono dwukrotnie. Niezakażone komórki (2 x 106 ml) zawieszano w odpowiednim podłożu uzupełnionym o surowicę (10 ml dla każdego przedziału czasu) i inkubowano w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2. Stężenie znakowanego FTC wynosiło 10 pM. Po przetrzymaniu komórek ze znakowanym związkiem w ciągu 24 godzin przemyto je starannie i dodano świeżego podłoża bez związku przeciwwirusowego (godzina 0). Po upływie 0, 2, 4, 6, 12 i 48 godzin (drugi okres inkubacji) komórki usuwano i natychmiast eks22FTC-labeled studies were performed to determine intracellular levels of the parent drug and its metabolites after incubating in drug media for 24 hours and then removing the drug. In this study, the time required to lower intracellular triphosphate levels was measured. Each experiment was conducted twice. Uninfected cells (2 x 106 m L) was suspended in an appropriate medium supplemented with serum (10 ml for each time interval) and incubated at 37 ° C in a 5% CO 2. The concentration of labeled FTC was 10 pM. After the cells with labeled compound were held for 24 hours, they were washed thoroughly and fresh medium without antiviral compound was added (0 hour). After 0, 2, 4, 6, 12 and 48 hours (second incubation period) the cells were removed and immediately ex22

171 150 trahowano zimnym 60% roztworem metanolu w wodzie. Ekstrakty, otrzymane drogą wirowania i usunięcia pastylek zawierających komórki, zliofilizowano i przechowywano w temperaturze -70°C. Przed poddaniem analizie powyższy materiał zawieszono w 250 mikrolitrach buforu do HPLC i natychmiast analizowano. Oznaczenia ilościowe obecnego wewnątrz komórki macierzystego leku i metabolitów wykonywano za pomocą HPLC, stosując do tego celu albo aparat Micromeritios albo aparat Hewlett-Packard model 1090 HLPC, z anionowymienną kolumną Partisil 10 SAX (Whatman, Inc.), szybkość przepływu 1 ml/minutę, ciśnienie 287 MPa i detekcję w UV przy 262 nm. Faza ruchoma składała się z dejonizowanej wody (A), 2 mM NaH2PC>4/16mM NaOAC, pH6,6 (B) 15 mM NaH2P120,2 mM NaOAC, pH6,6 (C) i 100 mM NaH2P04/800 mM NaOAC, pH 6,6 (D).The 171 150 were treated with cold 60% methanol in water. Extracts, obtained by centrifugation and removal of pellets containing cells, were lyophilized and stored at -70 ° C. Prior to analysis, the above material was suspended in 250 microliters of HPLC buffer and analyzed immediately. Quantification of the drug inside the parental cell and metabolites was performed by HPLC using either the Micromeritios apparatus or the Hewlett-Packard model 1090 HLPC apparatus, with Partisil 10 SAX anion exchange column (Whatman, Inc.), flow rate 1 ml / min, pressure 287 MPa and UV detection at 262 nm. The mobile phase consisted of deionized water (A), 2 mM NaH 2 PC> 4/16 mM NaOAC, pH 6.6 (B) 15 mM NaH 2 P 120.2 mM NaOAC, pH 6.6 (C) and 100 mM NaH 2 PO 4 / 800 mM NaOAC, pH 6.6 (D).

Sposób rozdziału: w ciągu 5 minut zokratycznie A, następnie 15 minut w liniowym gradiencie do 100% B, następnie 20 minut w liniowym gradiencie do 100% C, następnie 10 minut w liniowym gradiencie do 100% D i w końcu 30 minut izokratycznie 100% D.Separation method: in 5 minutes zocratic A, then 15 minutes in a linear gradient to 100% B, then 20 minutes in a linear gradient to 100% C, then 10 minutes in a linear gradient to 100% D and finally 30 minutes isocratic 100% D .

Czasy retencji (w minutach) w komórkach ludzkichRetention times (minutes) in human cells

Związek Relationship Niezmieniony Unchanged Jednofosforan Monophosphate Dwufosforan Diphosphate Trójfosforan Triphosphate (±)-FTC (±) -FTC 5,0 5.0 39,0 39.0 55,0 55.0 68,0 68.0

Na figurze 8 przedstawiono wykres wydalania znakowanego (±)-FTC z ludzkich komórek PBM, podany jako zależność stężenia leku (pmoli/106 komórek) od czasu po usunięciu leku. Jak wynika z figury 8, czas wewnątrzkomórkowego półtrwania dla trójfosforanu FTC wynosi około 12 godzin i związek ten można z łatwością wykryć wewnątrz komórki w stężeniach 1-5 μΜ po 48 godzinach od usunięcia z zewnątrz komórek leku. Jest to znacznie powyżej wartości EC50 dla tego związku. Ponadto, powinowactwo (K1) trójfosforanu (±)-FTC przy stosowaniu HIV RT wynosi 0,2 pM, czyli poniżej poziomu stężenia po 48 godzinach.Figure 8 is a graph of the excretion of labeled (±) -FTC from human PBM cells, given as drug concentration (pmol / 10 6 cells) versus time after drug removal. As can be seen from figure 8, the intracellular half-life for FTC triphosphate is about 12 hours and this compound can be readily detected inside the cell at concentrations of 1-5 µM 48 hours after removal of the drug externally. This is well above the EC50 value for this compound. In addition, the affinity (K 1 ) of (±) -FTC triphosphate when using HIV RT is 0.2 pM, which is below the concentration level after 48 hours.

Test 8. Aktywność anty-HIV dopuszczalnych w farmacji pochodnych (±)-FTC.Test 8. Anti-HIV Activity of Pharmaceutically Acceptable (±) -FTC Derivatives.

a Badano szereg dopuszczalnych w farmacji pochodnych (±)-FTC, otrzymanych przez podstawienie w pozycjach 5' i N4, na aktywność anty-HIV, w komórkach PBM. Stosowano postępowame podobne do opisanego w teście 2. Uzyskano następujące wyniki. 5'-0-maślan (±)-FTC wykazywał ECo = 0,0017; pochodna N4-acetylowa miała EC50 = 0,0028, a 5'-0-maślan N4-estru (±)-FTC wykazywał EC50 = 0,0058a A number of pharmaceutically acceptable (±) -FTC derivatives, obtained by substitutions at the 5 'and N 4 positions, were tested for anti-HIV activity in PBM cells. A progression similar to that described in test 2 was used. The following results were obtained. (6) -FTC 5′-O-butyrate showed an ECo = 0.0017; the N4-acetyl derivative had an EC50 = 0.0028, and the (±) -FTC 5'-O-butyrate of the N4-ester showed an EC50 = 0.0058

b. Aktywność anty-HIV 5'-O-maślanu (±)-FTC w układzie MT4 (EC50) wynosiła 0,04 pM. W tym samym badaniu, nieacylowany (±)-FTC miał IC50 = 0,52 pM. IC50 dla AZT w tym układzie wynosił 0,09 pM.b. Anti-HIV activity of 5'-O-butyrate (±) -FTC in the MT4 system (EC50) was 0.04 pM. In the same study, non-acylated (±) -FTC had an IC50 = 0.52 pM. The IC50 for AZT in this system was 0.09 pM.

Zdolność FTC do hamowania replikacji HBV Test 9. Badanie aktywności enancjomerów (+) i (-) FTC w hodowlach komórek 2.2.15.Ability of FTC to inhibit HBV replication Test 9. Testing the activity of (+) and (-) enantiomers of FTC in cell cultures 2.2.15.

Zdolność enancjomerów FTC do hamowania wzrostu wirusa w hodowlach komórek 2.2.15 (komórki HepG2 transformowane virionem zapalenia wątroby) opisano poniżej.The ability of the FTC enantiomers to inhibit virus growth in 2.2.15 cell cultures (HepG2 cells transformed with hepatitis virion) is described below.

Opis badania działania przeciwwirusowego w tej hodowli i analizę HBV DNA opisali Korba i Milman, 1991, Antiviral Res., 15, 217. Badania aktywności przeciwwirusowej wykonywano na dwóch oddzielnych pasażach komórek. Wszystkie studzienki na wszystkich płytkach zaszczepiano materiałem o takiej samej gęstości, w tym samym czasie.The description of the antiviral activity test in this culture and the HBV DNA analysis is described by Korba and Milman, 1991, Antiviral Res., 15, 217. The antiviral activity tests were performed on two separate cell passages. All wells of all plates were inoculated with material of the same density at the same time.

Parametry badańResearch parameters

Ze względu na naturalne różnice w poziomach zarówno wewnątrzkomórkowego, jak i zewnątrzkomórkowego DNA wirusa HBV, tylko obniżenie więcej niż 3,5-krotne (dla DNA wiriona HBV) lub 3,0-krotne (dla produktów przejściowych replikacji DNA wirusa HBV) w stosunku do średnich poziomów dla tych form wirusa HBV w nietraktowanych komórkach przyjmuje się statystycznie znaczące (P < 0,05). Poziomy zintegrowanego DNA wirusa HBV w każdym komórkowym preparacie DNA (które pozostają stałe dla jednej komórki w tych do171150 świadczeniach), wykorzystano do obliczania poziomów wewnątrzkomórkowych form DNA wirusa HBV, zapewniając w ten sposób porównywanie równych ilości komórkowego DNA między oddzielnymi próbkami.Due to natural differences in levels of both intracellular and extracellular HBV DNA, only a reduction of more than 3.5-fold (for HBV virions DNA) or 3.0-fold (for HBV DNA replication transients) compared to the mean levels for these forms of HBV in untreated cells are considered statistically significant (P <0.05). The levels of integrated HBV DNA in each cellular DNA preparation (which remain constant for one cell in these up to 171,150 treatments) were used to calculate the levels of intracellular forms of HBV DNA, thus ensuring that equal amounts of cellular DNA were compared between separate samples.

Typowe wartości dla pozakomórkowego DNA wiriona HBV w metraktowcnych ko mórkach wynosiły 50 do 150 pg/ml pożywki hodowlanej (średnio około 76 pg/ml). Wewnątrzkomórkowe przejściowe produkty replikacji DNA wirusa HBV w nietraktewatych komórkach znajdowały się w ilości 50 do 100 pg/gg komórkowego DNA (średnio około 74 pg/gg komórkowego DNA). Generalnie, obniżenie poziomów wewnątrzkomórkowego DNA wirusa HBV wywołane traktowaniem związkiem przeciwwlrusewym jest słabiej wyrażone i zcyhoZzi wolniej niz obniżanie poziomów DNA wirionu HBV (Korba i Milman, 1991, Antivird Res., 15, 217).Typical values for extracellular DNA of HBV virion in methanogenic co cells were 50 to 150 pg / ml of culture medium (average about 76 pg / ml). Intracellular transient products of HBV DNA replication in untreated cells were found to be 50 to 100 µg / g of cellular DNA (approximately 74 µg / g of cellular DNA). In general, the reduction in intracellular HBV DNA levels induced by treatment with an anti-virion compound is less pronounced and is slower than the reduction in HBV DNA levels (Korba and Milman, 1991, Antivird Res., 15, 217).

Sposób, w jaki przeprowadzono analizę hybrydyzacją w tych ZoświaZyzeniayh dawał w rezultacie równoważnik około 1,0 pg wewnątrzkomórkowego DNA HBV na 2-3 kopie genomu/komórkę oraz 1,0 pg/ml pozakomórkowdgo DNA HBV na 3 r 105 cząstek wirusa/ml.The manner in which the hybridization analysis was performed in these ZoświaZyzeniay resulted in the equivalent of approximately 1.0 µg of intracellular HBV DNA per 2-3 genome copies / cell and 1.0 µg / ml of extracellular HBV DNA per 3 of 10 5 viral particles / ml.

Badanie toksycznościToxicity study

Przeprowadzono badania toksccznośyi w celu stwierdzenia czy obserwowane działanie przeciwwirusowe jest wynikiem ogólnego oddziaływania na żywotność komórek. Stosowana metoda polega na pomiarach wchłaniania czerwieni obojętnej i jest standardową i szeroko stosowaną metodą badania żywotności komórek w różnych układach wirus-gospodarz, w tym HSV i HIV. Badania toksykologiczne prowadzono na płytkach do hodowli tkankowej, zawierającycC 96 studzienek o płaskich dnach. Komórki przeznaczone do baZcnia toksyczności hodowano i traktowano testowanymi związkami stosując taki sam schemat postępowania, jaki opisano uprzednio dla badania działania przeciw-wirusowego. Każdy związek testowano w 4 stężenicyC. Dla każdego stężenia test powtarzano trzy razy (studzienki A, B i C). Wchłanianie czerwieni obojętnej stosowano do oznaczania względnego poziomu toksyczności. Absorbancję wchłoniętego barwnika przy 510 nm (Asm) wykorzystywano do analizę lłościewej. Uzyskane wyniki przedstawiono jako procent przeciętnych wartości Am z 9 oddzielnych hodowii nietraktowanęch komórek, prowaZzonyyC na tej samej płytce o 96 studzienkach, na której badano testowane związki. Wchłanianie barwnika w 9 kontrolnych hodowla-C na płytce 5 wynosiło od 91,6% do 110,4%, a na płytce 6 od 96,6% do 109%. Wyniki badania przedstawiono w tabeli 6.Toxicity studies were performed to determine whether the observed antiviral activity is due to an overall effect on cell viability. The method used is a neutral red absorption measurement, and is a standard and widely used method for testing cell viability in a variety of virus-host systems, including HSV and HIV. The toxicology studies were performed in tissue culture plates containing 96 flat bottomed wells. Cells destined for the toxicity test were cultured and treated with test compounds using the same protocol as described previously for the antiviral activity study. Each compound was tested at 4 concentrations of C. For each concentration, the test was replicated three times (wells A, B and C). Neutral red absorption was used to determine the relative level of toxicity. The absorbance of the dye absorbed at 510 nm (Asm) was used for the malleolus analysis. The results obtained are presented as a percentage of the average Am values from 9 separate cultures of untreated cells, carried out in the same 96-well plate on which the test compounds were tested. The dye uptake in the 9 culture controls in plate 5 ranged from 91.6% to 110.4% and in plate 6 from 96.6% to 109%. The results of the study are presented in Table 6.

Tabela 6Table 6

Badanie toksyczności testowanych związków w komórkach 2.2.15Study of the toxicity of test compounds in cells 2.2.15

Płytka Plate Związek Relationship Stężenie gM GM concentration Wchłanianie barwnika (% kontroli) Studzienka Dye Absorption (% of control) Well A AND B B C C. 5 5 DMSO DMSO 10* 10 * 0,7 0.7 1,6 1.6 0,9 0.9 3,3 3.3 55,9 55.9 68,7 68.7 61,7 61.7 1,0 1.0 91,2 91.2 96,4 96.4 106,8 106.8 0,3 0.3 98,7 98.7 102,9 102.9 93,5 93.5 6 6 (-)-FTC (-) - FTC 300 300 53,0 53.0 51,1 51.1 51,5 51.5 100 100 64,1 64.1 66,6 66.6 77,6 77.6 30 thirty 98,7 98.7 94,3 94.3 96,4 96.4 10 10 94,3 94.3 94,9 94.9 92,2 92.2 6 6 (+)-FTC (+) - FTC 300 300 43,4 43.4 56,7 56.7 58,5 58.5 100 100 77,7 77.7 66,3 66.3 72,1 72.1 30 thirty 81,1 81.1 88,3 88.3 88,1 88.1 10 10 90,9 90.9 99,4 99.4 90,5 90.5

‘ Dla DMSO stężenia są podane w proydntcyC w stosunku do wy|śyle4dgo roztworu'For DMSO, the concentrations are given in terms of prod- uct in relation to the total solution

171 150171 150

Ocena toksycznościToxicity assessment

Jak wynika z tabeli 6, nie obserwowano znaczącej toksyczności (większej niż zmniejszenie o 50% poziomów wchłaniania barwnika obserwowanych dla komórek kontrolnych) testoObaAs can be seen in Table 6, no significant toxicity was observed (greater than a 50% reduction in the dye absorption levels observed with control cells) of testoOba

Λ/Ίΐι mnn ιργϊιχζωι • W W11 UOV VT wanych związków w stężeniach stosowanych w badaniach aktywności przeci testowane związki, (-)-FTC i (+)-FTC, okazały się toksyczne w najwyższych stężeniach stosowanych w testach na toksyczność (330 pM).Λ / Ίΐι mnn ιργϊιχζωι • In W11 UOV VT of valid compounds at the concentrations used in the activity tests against the tested compounds, (-) - FTC and (+) - FTC, proved to be toxic at the highest concentrations used in the toxicity tests (330 pM).

Ocena aktywności przeciwwirusowejAssessment of antiviral activity

KontrolaControl

Poza naturalnymi wahaniami, poziomy DNA wirusa HBV i wewnątrzkomórkowych przejściowych produktów replikacji wirusa HBV (HBV RI) pozostawały stałe w nietraktowanej komórce w okresie zakażenia. DMSO w stężeniu 1%o nie wpływał na poziomy replikacji HBV w hodowlach komórek 2.2.15.In addition to natural fluctuations, levels of HBV DNA and intracellular transient HBV replication products (HBV RI) remained constant in the untreated cell throughout the infection period. DMSO at a concentration of 1% did not affect the levels of HBV replication in 2.2.15 cell cultures.

Jak pokazano w tabeli 7, zarówno (-)-FTC jak i (+)-FTC znacząco hamują replikację HBV w testowanych poziomach. Jak pokazano w tabeli 8, (-)-FTC hamuje jeszcze znaczącą syntezę DNA wirionu HBV i wewnątrzkomórkowego DNA wirusa HBV w stężeniach 4, 1 i 0,25 pM).As shown in Table 7, both (-) - FTC and (+) - FTC significantly inhibited HBV replication at the levels tested. As shown in Table 8, (-) - FTC further inhibits the significant synthesis of HBV virion DNA and HBV intracellular DNA at concentrations of 4, 1 and 0.25 µM).

Tabela 7Table 7

Oddziaływanie testowanych związków na rozwój HBV w hodowlach komórek 2.2.15Effect of test compounds on HBV development in cell cultures 2.2.15

Studzienka Sump Traktowanie Treatment DNA wiriona HBV (pg/ml podłoża hodowlanego) HBV virion DNA (pg / ml culture medium) Wewnątrzkomórkowy DNA HBV (pg/pg DNA w komórkach) Intracellular HBV DNA (pg / pg DNA in cells) Dzień 0 Day 0 Dzień 4 Day 4 Dzień 9 Day 9 MONO MONO RI RI 7A 7A nietraktowane komórki untreated cells 59 59 75 75 94 94 2,7 2.7 93 93 7B 7B nietraktowane komórki untreated cells 47 47 64 64 88 88 2,5 2.5 93 93 8A 8A nietraktowane komórki untreated cells 65 65 100 100 71 71 2,2 2.2 97 97 8B 8B nietraktowane komórki untreated cells 77 77 65 65 110 110 2,4 2.4 62 62 7K 7K DMSO 1,00% DMSO 1.00% 100 100 50 50 48 48 1,9 1.9 95 95 7L 7L DMSO 1,00% DMSO 1.00% 48 48 96 96 54 54 2,8 2.8 98 98 8K 8K DMSO 1,00% DMSO 1.00% 93 93 63 63 68 68 2,2 2.2 86 86 8L 8L DMSO 1,00% DMSO 1.00% 66 66 57 57 59 59 1,6 1.6 97 97 9U 9U (-)-FTC” 10 pM (-) - FTC ”10 pM 120 120 36 36 1 1 1,1 1.1 14 14 9V 9V (-)-FTC 10 pM (-) - FTC 10 pM 89 89 48 48 1 1 1,5 1.5 19 19 10U 10U (-)-FTC 10 pM (-) - FTC 10 pM 58 58 41 41 0,1 0.1 1,9 1.9 13 13 10V 10V (-)-FTC 10 pM (-) - FTC 10 pM 110 110 32 32 0,1 0.1 1,2 1.2 16 16 9W 9W (+)-FTC** 10 pM (+) - FTC ** 10 pM 88 88 42 42 0,1 0.1 0,8 0.8 14 14 9X 9X (+)-FTC 10 pM (+) - FTC 10 pM 58 58 57 57 0,2 0.2 0,4 0.4 19 19 10W 10W (+)-FTC 10 pM (+) - FTC 10 pM 69 69 55 55 0,1 0.1 0,7 0.7 17 17 10X 10X (+)-FTC 10 pM (+) - FTC 10 pM 45 45 39 39 0,1 0.1 0,4 0.4 15 15

‘ Granica czułości dla DNA winona HBV wynosiła 0,1 pg/ml ** Wewnątrzkomórkowy DNA wirusa HBV analizowano po upływie 24 godzin po 9 dniu traktowania. Poziomy zintegrowanego DNA HBV w każdym preparacie komórkowego DNA wykorzystywano do obliczania poziomów epizomalnyeh genomów 3,2 Kb HBV (MONO) i przejściowych produktów replikacji (RI) DNA wirusa HBV'The limit of sensitivity for HBV vinona DNA was 0.1 pg / ml ** Intracellular DNA of HBV was analyzed 24 hours after day 9 of treatment. The levels of integrated HBV DNA in each cellular DNA preparation were used to calculate the epizomal levels of the 3.2 Kb HBV genomes (MONO) and the transient replication products (RI) of HBV DNA.

Tabela 8Table 8

Oddziaływanie testowanych związków na rozwój HBV w hodowlach komórek 2 2.15Effect of test compounds on HBV development in cell cultures 2 2.15

Studzienka Sump Traktowanie Treatment DNA wiriona HBV (pg/ml podłoża hodowlanego) HBV virion DNA (pg / ml culture medium) Wewnątrzkomórkowy DNA HBV (pg/(g DNA w komórkach) Intracellular HBV DNA (pg / (g DNA in cells) Dzień 0 Day 0 Dzień 4 Day 4 Dzień 9 Day 9 MONO MONO RI RI 31A 31A nietraktowane komórki untreated cells 64 64 54 54 65 65 2,8 2.8 65 65 3 1B 3 1B tt mp 51 51 54 54 77 77 2,0 2.0 53 53 32A 32A « « 100 100 76 76 56 56 3,5 3.5 81 81 32B 32B '' '' 53 53 97 97 83 83 3,1 3.1 68 68 35A 35A ,(-)-FTC** 4 (M , (-) - FTC ** 4 (M 74 74 27 27 >0,1 > 0.1 1,4 1.4 1 1 35B 35B 87 87 28 28 >0,1 > 0.1 0,5 0.5 1 1 36A 36A 11 11 120 120 20 twenty 1 1 0,9 0.9 1 1 36B 36B tt mp 59 59 16 16 0,2 0.2 0,2 0.2 2 2 35C 35C (-)-FTC** 1 (M (-) - FTC ** 1 (M 70 70 13 13 >0,1 > 0.1 1,7 1.7 2 2 35D 35D '' '' 62 62 15 15 >0,1 > 0.1 1,2 1.2 3 3 36C 36C « « 60 60 22 22 1 1 1,4 1.4 2 2 36D 36D H H. 89 89 28 28 0,3 0.3 1,5 1.5 4 4 35E 35E (-)-FTC 0,25 (M (-) - FTC 0.25 (M 84 84 15 15 >0,1 > 0.1 1,5 1.5 4 4 35F - 35F - '' '' 89 89 16 16 4 4 2,2 2.2 4 4 36E 36E tt mp 66 66 13 13 1 1 1,8 1.8 8 8 36F 36F II II 49 49 19 19 0,1 0.1 0,3 0.3 9 9

* Granica czułości dla DNA wiriona HBV wynosiła 0, i pg/ml.* The limit of sensitivity for HBV virion DNA was 0, and pg / ml.

Wewnątrzkomórkowy DNA wirusa HBV analizowano po upływie 24 godzin po 9 dniu traktowania. Poziomy zintegrowanego DNA HBV w każdym preparacie komórkowego DNA wykorzystywano do obliczania poziomów epizomalnych genomów 3,2 Kb HBV (MONO) i przejściowych produktów replikacji (RI) DNA wirusa HBVHBV intracellular DNA was analyzed 24 hours after the 9th day of treatment. The levels of integrated HBV DNA in each cellular DNA preparation were used to calculate the levels of the epizomal 3.2 Kb HBV genomes (MONO) and the transient replication products (RI) of HBV DNA

Test 10. Wchłanianie (±)-FTC w komórkach ludzkiej wątroby; aktywność FTC wobec HBV. Powtórzono postępowanie z testu 5 stosując komórki ludzkiej wątroby (komórki HepG2, dostępne w ATCC) do oznaczenia wchłaniania i metabolizmu FTC w tych komórkach. Jak pokazano na figurze 9, (±)-FTC jest wchłaniany przez komórki HepG2 w dużych ilościach. Powyższe komórki ludzkiej wątroby metabolizują duzy procent (±)-FTC do trójfosforanu (±)-FTC.Test 10. Absorption of (±) -FTC in human liver cells; FTC activity against HBV. The procedure of assay was repeated using human liver cells (HepG2 cells, available from ATCC) to determine the uptake and metabolism of FTC in these cells. As shown in Figure 9, (±) -FTC is absorbed by HepG2 cells in large amounts. The above human liver cells metabolize a high percentage of (±) -FTC to triphosphate (±) -FTC.

Powyższe dane, w połączeniu z innymi danymi podanymi w opisie wskazują, że (±)-FTC, jak też jego (-) i (+) enancjomery, są fosforylowane w komórkach wątroby. Powyższe komórki mogą być transformowane wirusem zapalenia wątroby B.The above data, together with other data reported herein, indicate that (±) -FTC, as well as its (-) and (+) enantiomers, are phosphorylated in liver cells. The above cells can be transformed with hepatitis B virus.

Test 11. Wydalanie FTC z ludzkich komórek HepG2.Test 11. FTC excretion from human HepG2 cells.

Figura 10 ilustruje wydalanie /3H/-(±)-FTC i jego fosforylowanych pochodnych z ludzkich komórek HepG2 wyrażane jako pmol/106 komórek w czasie, po 24 godzinach przetrzymywania komórek z 10 (M /3H/-(±)-FTC (700 DPM/pmol) i oznaczaniu stężenia związku po 24 godzinach od usunięcia leku.Figure 10 illustrates the shedding of / 3 H / - (±) -FTC and its phosphorylated derivatives from human HepG2 cells expressed as pmol / 10 6 cells over time, after 24 hours of cell retention with 10 (M / 3 H / - (±) -FTC (700 DPM / pmol) and determination of compound concentration 24 hours after drug removal.

Figura 11 ilustruje obniżenie połączonego stężenia /3H/-(±)-FTC i jego fosforylowanych pochodnych w ludzkich komórkach HepG2 po inkubowaniu z 10 (M /3H/-(±)-FTC (700 DPM/pmol) w ciągu 24 godzin, wyrażone jako ilość pmoli/106 komórek w czasie.Figure 11 illustrates the reduction in the combined concentration of / 3 H / - (±) -FTC and its phosphorylated derivatives in human HepG2 cells after incubation with 10 (M / 3 H / - (±) -FTC (700 DPM / pmol) for 24 hours. , expressed as number of pmoles / 106 cells over time.

171 150171 150

Jak z tego wynika, nawet po 48 godzinach, ciągle jeszcze ponad 1 gM aktywnego związku jest obecne w komórkach, co jest znacznie większe niż EC% związku.As a result, even after 48 hours, still more than 1 gM of active compound is still present in the cells, which is significantly greater than the EC% of the compound.

Toksyczność w granuiocyto-makrofagowych prekursorowych komórkach Test 12. Wpływ FTC na tworzenie kolonii granuiocyto-makrofagowych prekursorowych komórek.Toxicity in granuiocyte-macrophage precursor cells. Test 12. Effect of FTC on colony formation of granuiocyte-macrophage precursor cells.

Figura 12 obrazuje na wykresie wpływ (-) i (+) enancjomerów FTC na tworzenie kolonii granuiocyto-makrofagowych prekursorowych komórek, wyrażony w procentach przezycia w zależności od stężenia w gM [(-)-FTC (puste kółko), (+)-FTC (zaciemnione kółko) i AZT (zaciemniony kwadracik)]. Jak widać, enancjomer (-)-FTC jest mniej toksyczny, to znaczy wykazuje wyższą wartość IC50 niż enancjomer (+) lub AZT, dla tej linii komórek.Figure 12 plots the effect of (-) and (+) enantiomers of FTC on colony formation of granuiocytes-macrophage precursor cells, expressed as percentage of survival versus concentration in gM [(-) - FTC (open circle), (+) - FTC (darkened circle) and AZT (darkened square)]. As can be seen, the (-) - FTC enantiomer is less toxic, i.e. has a higher IC 50 value than the (+) enantiomer or AZT, for this cell line.

Farmakokinetyka FTCFTC pharmacokinetics

Test 13. Metabolizm FTC po podaniu szczurom.Test 13. FTC metabolism after administration to rats.

(±)-FTC podawano dożylnie szczurom w dawkach 10, 50 i 100 mg/kg i określano pole powierzchni pod krzywą stężenia leku w czasie (AUC), całkowity klirens (CL), objętość dystrybucji w ustalonym stanie (Vss), średni czas przebywania (MRT) i okres półtrwania (Εο). Wyniki doświadczeń przedstawiono w tabeli 9.(±) -FTC was administered intravenously to rats at doses of 10, 50 and 100 mg / kg and the area under the concentration-time curve (AUC), total clearance (CL), volume of distribution at steady state (Vss), mean residence time was determined (MRT) and half-life (Εο). The results of the experiments are presented in Table 9.

Tabela 9Table 9

Parametry farmakokinetyczne FTC po podaniu dożylnym szczurom w dawkach 10, 50 i 100 mg/kg*Pharmacokinetic parameters of FTC after intravenous administration to rats at 10, 50 and 100 mg / kg *

Dawka mg/kg Dose mg / kg AUC mg h/L AUC mg h / L CL L/h/kg CL L / h / kg Vss L/kg Vss L / kg MRT godz. MRT hours tie godz.t and e hours 10 10 9,65 9.65 0,988 0.988 0,758 0.758 0,768 0.768 0,757 0.757 50 50 57,11 57.11 0,874 0.874 0,699 0.699 0,800 0.800 0,815 0.815 100 100 120,72 120.72 0,830 0.830 0,663 0.663 0,798 0.798 0,969 0.969

' AUC - pols powierzchni pod krzywą stężenia leku w osoczu w czasie, CL - całkowity klirens; VS5 - objętość dystrybucji w ustalonym stanie, MRT - Średni czas przebywania, tu - okres półtrwania.'AUC - area under the plasma drug concentration time curve, CL - total clearance; V S5 - volume of distribution at steady state, MRT - Mean residence time, tu - half-life.

Test 14. Parametry farmakokinetyczne FTC po podaniu dożylnym i doustnymTest 14. Pharmacokinetic parameters of FTC after intravenous and oral administration

Niezależnie od modelu parametry farmakokinetyczne wyznaczano podając małpom rezusom dożylnie (IV) i doustnie (P.O.) 33,3 mg/kg (±)-FTC. Wyniki przedstawiono w tabeli 10. Co jest ważne, średnia biodostępność związku u małp wynosiła 73% (± 6%).Regardless of the model, pharmacokinetic parameters were determined by administering intravenous (IV) and orally (P.O.) 33.3 mg / kg (±) -FTC to rhesus monkeys. The results are shown in Table 10. Importantly, the mean bioavailability of the compound in monkeys was 73% (6%).

Tabela 10Table 10

Niezależne parametry farmakokinetyczne dla FTC pod dożylnym (I.V.) lub doustnym podaniu 33,3 mg/kg rezusom*Independent pharmacokinetic parameters for FTCs administered intravenously (I.V.) or orally 33.3 mg / kg to rhesus monkeys *

Małpa Monkey AUC mg h/L AUC mg h / L CL L/h/kg CL L / h / kg Vss L/kg Vss L / kg MRT h MRT h tl/2 h tl / 2 h Kit Putty F % F% 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 LV. LV. RUh RUh 19,14 19.14 1,74 1.74 2,71 2.71 1,56 1.56 1,28 1.28 RMi RMi 26,31 26.31 1,26 1.26 1,97 1.97 1,56 1.56 1,22 1.22 RJd RJd 22,51 22.51 1,48 1.48 2,00 2.00 1,36 1.36 1,47 1.47 Średnia Average 22,65 22.65 1,49 1.49 2,23 2.23 1,49 1.49 1,32 1.32 Standardowe odchylenie Standard deviation 3,59 3.59 0,24 0.24 0,42 0.42 0,12 0.12 0,13 0.13

1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 P.O. AFTER. RUh RUh 13,21 13.21 2,07 2.07 1 co 1,UO 1 every 1, UO Λ A O 0,40 Λ A O 0.40 71 71 RMi RMi 21,11 21.11 2,32 2.32 1,08 1.08 0,43 0.43 80 80 RJd RJd 15,29 15.29 3,23 3.23 1,47 1.47 0,31 0.31 68 68 Średnia Average 16,54 16.54 2,54 2.54 1,38 1.38 0,41 0.41 73( ±6) 73 (± 6) Standardowe odchylenie Standard deviation 4,09 4.09 0,61 0.61 0,26 0.26 0,09 0.09 6,24 6.24

‘ AUC - pole powierzchni pod krzywą stężenia Icku w osoczu w czasie, CL - całkowity klirens; Vss - objętość dystrybugi w ustalonym stanie, MRT - średni czas przebywania, t,„ - okres półtrwania.'AUC - area under the plasma concentration time curve of Icku, CL - total clearance; Vss - volume of distribution in the steady state, MRT - mean residence time, t, "- half-life.

Tabela 11Table 11

Stosunek zawartości w CSF i surowicy krwi FTC i jego dezaminowego metabolitu po 1 godzinie po podaniuThe ratio of CSF and serum levels of FTC and its deaminate metabolite 1 hour after administration

Małpa Monkey Droga podawania Route of administration FTC FTC Metabolit (FTU) Metabolite (FTU) RUh RUh dożylnie intravenously 0,076 0.076 0,024 0.024 RMi RMi dożylnie intravenously 0,062 0.062 0,032 0.032 RJd RJd dożylnie intravenously 0,162 0.162 0,052 0.052 Średnia Average 0,100 0.100 0,036 0.036 ± standardowe odchylenie ± standard deviation 0,054 0.054 0,014 0.014 RUh RUh doustnie orally 0,048 0.048 0,026 0.026 RMi RMi doustnie orally 0,039 0.039 0,037 0.037 RJd RJd doustnie orally 0,117 0.117 0,055 0.055 Średnia Average 0,068 0.068 0,039 0.039 ± standardowe odchylenie ± standard deviation 0,043 0.043 0,015 0.015

Test 15. Stosunek zawartości w CSF i surowicy krwi FTC i jego metabolitów u małp rezusów.Test 15. Ratio of CSF and serum levels of FTC and its metabolites in rhesus monkeys.

Zdolność (±)-FTC do przekraczania bariery krew-mózg badano podając 33,3 mg/kg aktywnego związku małpom rezusom i oznaczając ilość (±)-FTC w płynie mózgowo-rdzeniowym i w surowicy krwi po upływie 1 godziny po podaniu. Wyniki zestawiono w tabeli 11. Dane wykazują, że znaczna ilość aktywnego związku przekracza barierę krew-mózg u tych ssaków.The ability of (±) -FTC to cross the blood-brain barrier was tested by administering 33.3 mg / kg of active compound to rhesus monkeys and determining the amount of (±) -FTC in the cerebrospinal fluid and serum 1 hour after dosing. The results are summarized in Table 11. The data show that a significant amount of the active compound crosses the blood-brain barrier in these mammals.

Wytwarzanie kompozycji farmaceutycznychPreparation of pharmaceutical compositions

Ludzie cierpiący na choroby wywoływane przez HIV lub HBV mogą być leczeni drogą podawania skutecznej ilości (±)-FTC lub jego (-) albo (+) enancjomeru lub dopuszczalnej w farmacji pochodnej albo soli powyższego związku; razem z dopuszczalnym w farmacji nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. Aktywne związki można podawać w dowolny odpowiedni sposób, np. doustnie, pozajelitowo, dożylnie, śródskórnie, podskórnie lub miejscowo, w postaci preparatów ciekłych lub stałych.People suffering from HIV or HBV disease can be treated by administering an effective amount of (±) -FTC or its (-) or (+) enantiomer or a pharmaceutically acceptable derivative or salt of the above compound; together with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. The active compounds can be administered by any suitable means, for example, orally, parenterally, intravenously, intradermally, subcutaneously, or topically, in liquid or solid form.

Aktywny związek jest zawarty w dopuszczalnym w farmacji nośniku lub rozpuszczalniku w ilości dostatecznej do dostarczenia pacjentowi do skutecznego hamowania in vivo replikacji wirusa, w szczególności HIV i HBV, bez powodowania poważnych działań toksycznych u leczonych pacjentów. Określenie ilość hamująca oznacza ilość aktywnej substancji wystarczającej do wywoływania działania hamującego, oznaczonego np. jedną z opisanych tutaj metod.The active compound is included in a pharmaceutically acceptable carrier or solvent in an amount sufficient to provide the patient with effective inhibition of in vivo replication of the virus, in particular HIV and HBV, without causing serious toxic effects in treated patients. The term inhibitory amount means the amount of active substance sufficient to produce an inhibitory effect, determined, e.g., by one of the methods described herein.

171 150171 150

Korzystna dawka (-), (+) lub (±)-FTC dla wszystkich wspomnianych powyżej chorób wynosi od około 1 do 50 mg/kg, korzystnie 1-20 mg/kg ciężaru ciała na dzień, bardziej ogólnie od 0,1 do około 100 mg kg ciężaru ciała biorcy dziennie. Skuteczną dawkę dopuszczalnych w farmacji pochodnych można obliczyć na podstawie ilości wagowej macierzystego nukleozydu, jaką należy podawać. Jeśli sama pochodna wykazuje aktywność, wówczas właściwe dawkowanie można ustalić jak powyżej, na podstawie ciężaru pochodnej albo innymi sposobami znanymi specjalistom.A preferred dose of (-), (+) or (±) -FTC for all of the above-mentioned diseases is from about 1 to 50 mg / kg, preferably 1-20 mg / kg of body weight per day, more generally from 0.1 to about 100 mg kg of the recipient's body weight per day. The effective dose of the pharmaceutically acceptable derivative can be calculated based on the amount by weight of the parent nucleoside to be administered. If the derivative itself is active, then the appropriate dosage can be determined as above based on the weight of the derivative or by other methods known to those skilled in the art.

Związek dogodnie podaje się w dawkach jednostkowych w odpowiedniej postaci, w tym, ale nie wyłącznie, w ilości 7-3000 mg, korzystnie 70-1400 mg aktywnej substancji w dawce jednostkowej. Dawki ustne wynoszące 50-1000 mg są zwykle odpowiednie.The compound is conveniently administered in unit doses in a suitable form including, but not limited to, 7-3000 mg, preferably 70-1400 mg of active ingredient per unit dose. Oral doses of 50-1000 mg are usually appropriate.

W idealnym- przypadku, substancja aktywna powinna być podawana tak, by osiągnąć szczytowe stężenie w surowicy aktywnego związku wynoszące od około 0,2 do 70 pM, korzystnie około 1,0 do 10 pM. Można to uzyskać, np. przez podawanie drogą iniekcji dożylnej 0,1 do 5% roztworu substancji aktywnej w roztworze soli fizjologicznej lub jednej dużej dawki aktywnej substancji.Ideally, the active ingredient should be administered so as to achieve a peak serum concentration of active compound of from about 0.2 to 70 pM, preferably about 1.0 to 10 pM. This can be achieved, for example, by administering by intravenous injection 0.1 to 5% solution of the active substance in physiological saline or one bolus dose of the active substance.

Stężenie aktywnego związku w kompozycji zależy od absorpcji, inaktywacji i szybkości wydzielania leku oraz od innych czynników znanych specjalistom. Należy także zauważyć, że wartości dawkowania mogą być różne w zależności od przebiegu leczonej choroby. Jest również zrozumiałe, że dla każdego indywidualnego pacjenta należy ustalić specyficzny reżim dawkowania w czasie, zgodny z indywidualną potrzebą i oceną osoby leczącej lub nadzorującej podawanie leku. Dlatego, podane stężenia są tylko przykładowymi i nie mają na celu ograniczenia zakresu podawania zastrzeżonych kompozycji. Aktywny składnik może być podawany jednorazowo lub może być dzielony na wiele mniejszych dawek podawanych w różnych odstępach czasu.The concentration of active compound in the composition depends on the absorption, inactivation and release rate of the drug, and other factors known to those skilled in the art. It should also be noted that the dosage values may vary depending on the course of the disease being treated. It is also understood that a specific dosing regimen over time should be established for each individual patient according to the individual need and judgment of the person treating or supervising drug administration. Therefore, the given concentrations are exemplary only and are not intended to limit the scope of administration of the claimed compositions. The active ingredient may be administered at once, or it may be divided into multiple smaller doses administered at varying intervals.

Korzystnym sposobem podawania aktywnego związku jest podawanie doustne. Preparaty doustne zawierają generalnie obojętny rozcieńczalnik lub jadalny nośnik. Mogą one mieć postać żelatynowych kapsułek lub tabletek. Do terapeutycznego podawania doustnego, aktywny związek może być mieszany z wypełniaczami i stosowany w postaci tabletek, kołaczyków lub kapsułek. W skład preparatu mogą wchodzić odpowiednie środki wiążące i/lub adjuwanty.Oral administration is the preferred mode of administration of the active compound. Oral preparations generally contain an inert diluent or an edible carrier. They may take the form of gelatin capsules or tablets. For oral therapeutic administration, the active compound can be mixed with fillers and used in the form of tablets, troches, or capsules. The formulation may contain suitable binders and / or adjuvants.

Tabletki, pigułki, kapsułki, kołaczyki i podobne mogą zawierać któreś z następujących substancji lub związków o podobnym charakterze: środek wiążący, taki jak celuloza mikrokrystaliczna, guma tragakant lub żelatyna; wypełniacz, taki jak skrobia lub laktoza, środek rozpraszający, taki jak kwas alginowy, Primogel lub skrobia kukurydziana środek poślizgowy, taki jak stearynian magnezu lub Sterostes; albo koloidalny dwutlenek krzemu; środek słodzący, taki jak sacharoza lub sacharyna; albo środek aromatyzujący, taki jak olejek miętowy, salicylan metylu lub olejek pomarańczowy. W przypadku kapsułek, to poza wymienionymi wyżej materiałami mogą one zawierać ciekły nośnik, taki jak olej tłuszczowy. Ponadto, preparaty mogą zawierać różne inne materiały modyfikujące ich fizyczną postać, np. powłoczki cukrowe, szelakowe lub inne środki do podawania do jelit.The tablets, pills, capsules, troches and the like may contain any of the following substances, or compounds of a similar nature: a binder such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth or gelatin; a filler such as starch or lactose, a dispersing agent such as alginic acid, Primogel, or corn starch, a lubricant such as magnesium stearate or Sterostes; or colloidal silicon dioxide; a sweetening agent such as sucrose or saccharin; or a flavoring such as peppermint oil, methyl salicylate or orange oil. In the case of capsules, in addition to the materials mentioned above, they may contain a liquid carrier such as a fatty oil. In addition, the preparations may contain various other materials to modify their physical form, for example, sugar coatings, shellacs or other enteric agents.

(±)-FTC lub jego (-) albo (+) enancjomery lub dopuszczalne w farmacji pochodne albo sole powyższych związków mogą być podawane jako składniki eliksiru, zawiesiny, syropu, opłatka, gumy do żucia, itp. Syrop, poza związkiem aktywnym, może zawierać środek słodzący oraz środki konserwujące, barwiące i aromatyzujące.The (±) -FTC or its (-) or (+) enantiomers or pharmaceutically acceptable derivatives or salts thereof can be administered as ingredients of an elixir, suspension, syrup, wafer, chewing gum, etc. Syrup, in addition to the active compound, may contain a sweetening agent and preservatives, colors and flavors.

(±)-FTC lub jego (-) albo (+) enancjomery lub dopuszczalne w farmacji pochodne albo sole powyższych związków mogą również być mieszane z innymi aktywnymi substancjami nie przeszkadzającymi w pożądanym działaniu, albo z substancjami, które wspomagają pożądane działanie, takimi jak antybiotyki, środki przeciwgrzybicze, przeciwzapalne lub inne środki przeciwwwirusowe, w tym także inne nukleozydy anty-HIV.The (±) -FTC or its (-) or (+) enantiomers or pharmaceutically acceptable derivatives or salts of the above compounds can also be mixed with other active substances which do not interfere with the desired action, or with substances which promote the desired action, such as antibiotics , anti-fungal, anti-inflammatory or other anti-viral agents, including other anti-HIV nucleosides.

Roztwory lub zawiesiny do stosowania pozajelitowego, śródskórnego lub miejscowego mogą zawierać następujące składniki' jałowy rozcieńczalnik, taki jak woda do iniekcji, roztwór soli fizjologicznej, oleje, glikole pobetylenowe,,gbceryna, glikol propylenowy lub inne syntetyczne rozpuszczalniki, czynniki przeciwbakteryjne, takie jak alkohol benzylowy lub metyloparaben, przeciwutleniacze, takie jak kwas askorbinowy lub wodorosiarczyn sodowy czynnikiSolutions or suspensions for parenteral, intradermal, or topical use may contain the following ingredients: - sterile diluent such as water for injection, saline solution, oils, acetylene glycols, gbcerine, propylene glycol or other synthetic solvents, antibacterial agents such as benzyl alcohol or methylparaben, antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite agents

171 150 chelatujące, takie jak kwas etylenodwuaminoczterooctowy; środki buforujące, takie jak octany, cytryniany lub fosforany; oraz środki tonizujące, takie jak chlorek sodowy lub dekstroza Preparaty do podawania pozajelitowego mogą być zamknięte w ampułkach, jednorazowych strzykawkach lub fiolkach do wielokrotnego stosowania, wykonanych ze szkła lub tworzywa sztucznego.Chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid; buffering agents such as acetates, citrates, or phosphates; and tonics such as sodium chloride or dextrose. Preparations for parenteral administration can be enclosed in ampoules, disposable syringes or multiple use vials made of glass or plastic.

Korzystnymi do podawania dożylnego nośnikami są fizjologiczny roztwór soli lub buforowany fosforanem fizjologiczny roztwór soli (PBS).Preferred carriers for intravenous administration are physiological saline or phosphate buffered saline (PBS).

W korzystnym wykonaniu, związki aktywne są sporządzane w postaci preparatów zawierających nośniki chroniące je przed szybkim wydalaniem z organizmu, takich jak preparaty o kontrolowanym uwalnianiu, np. wszczepy lub mikrokapsułki. Można stosować rozkładane biologicznie, odpowiednie biologicznie polimery, takie jak octan etylenowinylu, polibezwodniki, kwas poliglikolowy, kollagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Metody wytwarzania takich preparatów są dobrze znane specjalistom. Materiały takie są również dostarczane przez firmy Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc.In a preferred embodiment, the active compounds are formulated into preparations containing carriers to protect them against rapid excretion from the body, such as in controlled release preparations, e.g. implants or microcapsules. Biodegradable, biologically compatible polymers can be used, such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid. Methods of making such preparations are well known to those skilled in the art. Such materials are also supplied by Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc.

Zawiesiny lipozomalne (w tym lipozomy działające na zakażone komórki z monoklonalnymi przeciwciałami wirusowych antygenów) są także korzystne jako dopuszczalne w farmacji nośniki. Można je otrzymywać znanymi specjalistom metodami, np. opisanymi w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 522 811 (włączonym tutaj w całości jako odnośnik). Np., preparat lipozomowy można otrzymywać rozpuszczając odpowiedni lipid (lipidy) (np. stearoilo-fosfatydyloetanolaminę stearoilo-fosfatydylocholinę arachodoilo-fosfatydylocholinę lub cholesterol) w nieorganicznym rozpuszczalniku, który następnie odparowuje się. Pozostaje cienka filmowa warstwa suchego lipidu na powierzchni pojemnika. Do pojemnika wprowadza się następnie wodny roztwór aktywnego związku lub jego jednofosforanu, dwufosforanu albo trójfosforanu. Pojemnik wstrząsa się w ręku w celu uwolnienia materiału lipidowego ze ścianek i zawieszenia agregatów lipidu. Otrzymuje się lipozomalną zawiesinę.Liposomal suspensions (including liposomes that act on infected cells with monoclonal antibodies to viral antigens) are also preferred as pharmaceutically acceptable carriers. They can be prepared by methods known to those skilled in the art, e.g., as described in U.S. Patent No. 4,522,811 (incorporated in its entirety by reference). For example, a liposome preparation can be prepared by dissolving the appropriate lipid (s) (e.g. stearoyl phosphatidyl ethanolamine, stearoyl phosphatidylcholine, arachodoyl phosphatidylcholine or cholesterol) in an inorganic solvent which is then evaporated. A thin film of dry lipid remains on the surface of the container. An aqueous solution of the active compound or its monophosphate, diphosphate or triphosphate thereof is then introduced into the container. The container is shaken by hand to release the lipid material from the walls and suspend the lipid aggregates. A liposomal suspension is obtained.

Wytwarzanie fosforanów FTCProduction of FTC phosphates

Jedno-, dwu- i trójfosforanowe pochodne FTC można otrzymywać w sposób opisany poniżej.FTC mono-, di- and triphosphate derivatives can be prepared as described below.

Jednofosforan można wytwarzać metodą opisaną przez Imai i wsp. w J. Org. Chem., 34 (6), 1547-1550 (czerwiec 1989). Np., około 100 mg FTC poddaje się reakcji z około 280 pl chlorku fosforylu, mieszając w około 8 ml bezwodnego octanu etylu, w temperaturze około 0°C, w ciągu około czterech godzin. Reakcję zatrzymuje się oziębiając lodem. Fazę wodną oczyszcza się węglem aktywnym na kolumnie, eluując 5% roztworem wodorotlenku amonowego w mieszaninie 1: 1 etanolu i wody. Po odparowaniu eluatu otrzymuje się sól amonową 5'-jednofosforanu FTC.The monophosphate can be prepared by the method described by Imai et al. In J. Org. Chem., 34 (6), 1547-1550 (June 1989). For example, about 100 mg of FTC is reacted with about 280 µL of phosphoryl chloride while stirring in about 8 mL of anhydrous ethyl acetate at about 0 ° C for about four hours. The reaction was stopped by cooling with ice. The aqueous phase is purified with activated carbon on a column, eluting with 5% ammonium hydroxide in a 1: 1 mixture of ethanol and water. After evaporation of the eluate, the ammonium salt of FTC 5'-monophosphate is obtained.

Dwufosforan można otrzymywać metodą opisaną przez Davissona i wsp. w J. Org. Chem., 52 (9), 1794-1801 (1987). Dwufosforan FTC można otrzymywać z odpowiedniego tozylanu, który wytwarza się np. poddając nukleozyd reakcji z chlorkiem tozylu w pirydynie, w pokojowej temperaturze, w ciągu około 24 godzin. Mieszaninę reakcyjną przerabia się w zwykły sposób, np. przemywa, suszy i krystalizuje produkt.The diphosphate can be prepared by the method described by Davisson et al., J. Org. Chem., 52 (9), 1794-1801 (1987). FTC diphosphate can be prepared from the corresponding tosylate, which is prepared, for example, by reacting a nucleoside with tosyl chloride in pyridine at room temperature for about 24 hours. The reaction mixture is worked up in the usual way, e.g. washed, dried and the product crystallizes.

Trójfosforan można otrzymywać metodą opisaną przez Hoarda i wsp w J. Am. Chem. Soc., 87 (8), 1785-1788 (1965). FTC poddaje się aktywowaniu (np. przekształcając w imidazolid znanymi specjalistom metodami) i następnie reakcji z pirofosforanem trójbutyloamoniowym w DMF. W reakcji otrzymuje się głównie trójfosforan nukleozydu, zawierający nieco nieprzereagowanego jednofosforanu i dwufosforanu Mieszaninę oczyszcza się drogą chromatografii anionowymiennej na kolumnie z DEAE i izoluje trójfosforan, np. w postaci soli czterosodowej.The triphosphate can be prepared by the method described by Hoard et al in J. Am. Chem. Soc., 87 (8), 1785-1788 (1965). The FTC is activated (e.g., converted to imidazolide by methods known to those skilled in the art) and then reacted with tributylammonium pyrophosphate in DMF. The reaction mainly produces a nucleoside triphosphate containing some unreacted monophosphate and diphosphate. The mixture is purified by anion exchange chromatography on a DEAE column and the triphosphate is isolated, e.g. in the form of the tetrasodium salt.

Wynalazek został opisany w odniesieniu do korzystnych jego odmian. Wariacje i modyfikacje sposobu według wynalazku powinny być oczywiste dla specjalistów z przedstawionego szczegółowego opisu. Wszystkie powyższe wariacje i modyfikacje wchodzą w zakres wynalazku i załączonych zastrzeżeń.The invention has been described with reference to its preferred variations. Variations and modifications to the process of the invention should be apparent to those skilled in the art from the detailed description provided. All the above variations and modifications are within the scope of the invention and the appended claims.

FtGURK 3FtGURK 3

(+)-FTC =25% =75%(+) - FTC = 25% = 75%

NN

-► W-PTC-► W-PTC

APAP

AP apAP ap

PDPD

Fosfotaza alkalicznaAlkaline phosphotase

Fosfodwudwuesteraza IPhosphoddiesterase I.

5'-Nukleotydaza (-)-PTC-TP IPTC (+) - FTC5'-Nucleotidase (-) - PTC-TP IPTC (+) - FTC

Wzbogacanie enancjomeru (-)Enantiomer enrichment (-)

Proporcja 4:1 na korzyść enancjomeru (44: 1 ratio in favor of the enantiomer (4

17^115017 ^ 1150

Hamowania Ϊ HamowaniaBraking Ϊ Braking

FIGURK 5FIGURES 5

FIGURK 6FIGURES 6

□ FTC □ FTC-MP □ FTC-DP □ FTC-TP□ FTC □ FTC-MP □ FTC-DP □ FTC-TP

FIGURK 7FIGURES 7

Czas (godzina) po wydaleniu lekuTime (hour) after drug excretion

FIGURK 8FIGURES 8

Moment czasu, godzinyA moment of time, an hour

FIGURK 9FIGURES 9

Czas, godzinyTime, hours

FIGURK 10FIGURES 10

FIGURK 11FIGURES 11

FIGURK 12FIGURES 12

171 150171 150

FIGURK 2FIGURES 2

RO —' +-ORRO - '+ -OR

R = n-butyryl or hs©hR = n-butyryl or hs © h

RORO

1. Środek redukujący1. Reducing agent

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz. Cena 6,00 złPublishing Department of the Polish Patent Office of the Republic of Poland Circulation of 90 copies Price PLN 6.00

Claims (16)

Zastrzeżenia patentowePatent claims 1. Sposób rozdzielania racemicznej mieszaniny enancjomerów nukleozydu polegający na poddawaniu mieszaniny racemicznej działaniu enzymu, znamienny tym, ze jako enzym, który wybiórczo katalizuje reakcję z jednym enancjomerem, stosuje się enzym wybrany z grupy obejmującej esterazę, lipazę, substylizynę, a-chymotrypsynę oraz dezaminazę cytydynowo-dezoksycytydynową.A method of resolving a racemic mixture of nucleoside enantiomers by treating the racemic mixture with an enzyme, characterized in that the enzyme that selectively catalyzes the reaction with one enantiomer is an enzyme selected from the group consisting of esterase, lipase, substilisin, a-chymotrypsin and cytidine deaminase - deoxycytidine. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze jako esterazę stosuje się esterazę z wątroby świni.2. The method according to p. The process of claim 1, wherein the esterase is porcine liver esterase. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako lipazę stosuje się świńską lipazę trzustkową lub lipazę Amano PS-800.3. The method according to p. The method of claim 1, wherein the lipase is porcine pancreatic lipase or Amano PS-800 lipase. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się mieszaninę enancjomerów nukleozydu ze zacylowaną grupą hydroksylową w pozycji C5'.4. The method according to p. The process of claim 1, wherein the mixture of nucleoside enantiomers is acylated at the C5 'hydroxyl group. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się mieszaninę enancjomerów poddaną acylowaniu za pomocą związku wybranego z grupy obejmującej kwasy alkilokarboksylowe i podstawione kwasy karboksylowe.5. The method according to p. The process of claim 1, wherein the mixture of enantiomers acylated with a compound selected from the group consisting of alkylcarboxylic acids and substituted carboxylic acids. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako kwas alkilokarboksylowy stosuje się kwas octowy, kwas propionowy, kwas masłowy, kwas walerianowy, kwas 2-chloropropionowy, kwas 2-chloromasłowy lub 2-chlorowalerianowy.6. The method according to p. The process of claim 5, wherein the alkyl carboxylic acid is acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, 2-chloropropionic acid, 2-chlorobutyric acid or 2-chlorovaleric acid. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że enancjomery nukleozydu przepuszcza się przez kolumnę zawierającą enzym immobUizowany na nośniku.7. The method according to p. The process of claim 1, wherein the nucleoside enantiomers are passed through a column containing the enzyme immobilized on a support. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że enancjomery miesza się z enzymem w roztworze.8. The method according to p. The process of claim 1, wherein the enantiomers are mixed with the enzyme in solution. 9 Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję enzymatyczną prowadzi się w obecności niejonowego środka powierzchniowo czynnego.The method according to p. The process of claim 1, wherein the enzymatic reaction is carried out in the presence of a nonionic surfactant. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako środek powierzchniowo czynny stosuje się eter glikolu polietylenowego z p-izooktylofenolem.10. The method according to p. The process of claim 9, wherein the surfactant is polyethylene glycol ether with p-isooctylphenol. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że produkt rozdzielania poddaje się działaniu drugiego enzymu.11. The method according to p. The process of claim 1, wherein the separation product is treated with a second enzyme. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że produkt rozdzielania poddaje się rekrystalizacji.12. The method according to p. The process of claim 1, wherein the separation product is recrystallized. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że produkt rozdzielania poddaje się działaniu chiralnego kwasu.13. The method according to p. The process of claim 1, wherein the separation product is treated with a chiral acid. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że jako chiralny kwas stosuje się kwas wybrany z grupy obejmującej kwas jabłkowy, kwas migdałowy, kwas dwubenzoilowinowy, kwas 3-bromokamforc-8-sulfonowy, kwas 10-kamforosulfonowy i kwas dwu-p-toluilowinowy.14. The method according to p. The process of claim 13, wherein the chiral acid is an acid selected from the group consisting of malic acid, mandelic acid, dibenzoyltartaric acid, 3-bromocamphorc-8-sulfonic acid, 10-camphorsulfonic acid and di-p-toluyl tartaric acid. 15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze rozdzielaniu poddaje się mieszaninę racemiczną(±)-2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1.)-1,3-oksatiolanu.15. The method according to p. A method as claimed in claim 1, characterized in that a racemic mixture of (±) -2-hydroxymethyl-5- (5-fluorocytosinyl-1.) -1.3-oxathiolane is subjected to separation. 16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze rozdzielaniu poddaje się mieszaninę racerniczną(±)-2-hydroksymetylo-5-(cytozynylo-1)-1,3-oksatiolanu.16. The method according to p. A method according to claim 1, characterized in that a raceric mixture of (±) -2-hydroxymethyl-5- (cytosinyl-1) -1,3-oxathiolane is subjected to the separation.
PL92310211A 1991-07-26 1992-02-20 Method of separating a racemic mixture of nucleoside enantiomers PL171150B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US73608991A 1991-07-26 1991-07-26
PCT/US1992/001339 WO1992014743A2 (en) 1991-02-22 1992-02-20 Antiviral activity and resolution of 2-hydroxymethyl-5-(5-fluorocytosin-1-yl)-1,3-oxathiolane

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL171150B1 true PL171150B1 (en) 1997-03-28

Family

ID=24958466

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL92310211A PL171150B1 (en) 1991-07-26 1992-02-20 Method of separating a racemic mixture of nucleoside enantiomers

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL171150B1 (en)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6114343A (en) Antiviral activity and resolution of 2-hydroxymethyl-5-(5-flurocytosin-1-yl)-1,3-oxathiolane
US6642245B1 (en) Antiviral activity and resolution of 2-hydroxymethyl-5-(5-fluorocytosin-1-yl)-1,3-oxathiolane
EP1439177B1 (en) Antiviral activity and resolution of 2-hydroxymethyl-5-(5-fluorocytosin-1-yl)-1,3-oxathiolane
US6346627B1 (en) Intermediates in the synthesis of 1,3-oxathiolane nucleoside enantiomers
AU2004200957B2 (en) Antiviral activity and resolution of 2-hydroxymethyl-5-(5-flurocytosin-1-yl)-1,3-oxathiolane
PL171150B1 (en) Method of separating a racemic mixture of nucleoside enantiomers
AU665187C (en) Antiviral activity and resolution of 2-hydroxymethyl-5-(5-fluorocytosin-1-YL)-1,3-oxathiolane
AU2008201984B2 (en) Antiviral activity and resolution of 2-hydroxymethyl-5-(5-flurocytosin-1-yl)-1,3-oxathiolane
RU2235724C2 (en) Methods for separating mixture of enantiomers
IE20060148A1 (en) Antiviral activity and resolution of 2-hydroxymethyl-5-(5-fluorocytosin-1-yl)-1,3-oxathiolane