PL167763B1 - Sposób oznaczania glikozydów, zwłaszcza lanatozydu C w mieszankach recepturowych i preparatach roślinnych - Google Patents

Abstract

1 · Sposób oznaczania glikozydów, zwłaszcza lanatozydu C w mieszankach recepturowychi preparatach roślinnychmetodą chromatografu cienkowarstwowej przez naniesienie na powierzchnię adsorbentu umieszczonego na płytce chromatograficznej w komorze płaskiej z dystrybutorem, substancji wzorcowej oraz substancji badanej i rozwijanie chromatogramu, znamienny tym, że chromatogramrozwija się na dystansie 8-10 cm metodą elucji gradientowej stosując 8-10 porcji eluentu będącego mieszaniną co najmniej 2 rozpuszczalników o zróżnicowanej polarności, zawierających wzrastające ilości, uprzednio dobrane eksperymentalnie, odpowiednio od 1 do 100% rozpuszczalnika bardziej polarnego, a po zakończeniu procesu płytkę suszy się w strumieniu suchego powietrza i w znany sposób identyfikuje się substancje na chromatogramie·

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania glikozydów, zawartych zwłaszcza w mieszankach recepturowych i preparatach roślinnych, szczególnie przydatny do oznaczania lanatozydu C występującego w niewielkich ilościach, na przykład w lekach recepturowych. Występowanie lanatozydu C obok innych składników często o podobnych właściwościach fizyko-chemicznych nastręcza duże trudności analityczne w jego oznaczaniu (Stahl E., Kaltenbach U.-J. Chromatogr. 5, 458 (1961); Sobiczewska M. Mucharska A. - Acta. Polon. Pharm. 41/2, 229 (1984)).

Opracowano wiele metod chromatograficznego badania lanatozydu C. Oznaczenia lanatozydu C łącznie z innymi glikozydami można dokonać kalorymetrycznie.

Związek ten oznacza się również metodą kalorymetryczną, po rozdzieleniu chromatograficznym na bibule lub za pomocą chromatografii cienkowarstwowej.

Sam lanatozyd C można oznaczać bezpośrednio na chromatogramach densytometrycznie w zakresie ultrafioletu lub przy wykorzystaniu wysokosprawnej chromatogramach densytometrycznie w zakresie ultrafioletu lub przy wykorzystaniu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (Karting T. H., Kolbosil P. - J. Chromatogr. 138,238 (1977); Frei R. W. - Planta Med. 38,1 (1980)).

Metody podane z Farmakopei Polskiej IV (14) opierają się na bezpośrednim kolorymetryczynym oznaczeniu lanatozydu C wraz z innymi glikozydami, natomiast sam lanatozyd C jest oznaczony po oddzieleniu go na chromatogramach bibułowych. Norma Polska dla preparatu „lanatozyd C“ w kroplach przewiduje tylko kolorymetryczne oznaczanie sumy glikozydów, natomiast oznaczanie innych glikozydów opiera się na wizualnym określeniu wielkości intensywności plam na chromatogramach.

Dotychczasowe metody oznaczania lanatozydu C są bardzo praco i czasochłonne. Na przykład, oznaczanie metodą kolorymetryczną według Farmakopei Polskiej trwa około 24 godzin. Ponadto kolorymetryczne oznaczenia lanatozydu C zwykle zawodzą ze względu na małą ich wybiórczość, jak również z powodu jego małych stężeń w lekach recepturowych.

Wynalazek rozwiązuje zagadnienie oznaczania glikozydów, zwłaszcza lanatozydu C w sposób prosty z dużą dokładnością i w krótkim czasie oraz nawet dla niskich stężeń w roztworze badanym.

Podany efekt osiągnięto według wynalazku przez zastosowanie wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej z elucją gradientową.

167 763

Istota sposobu według wynalazku polega na tym, że na powierzchnię adsorbentu umieszczonego na płytce w komorze chromatograficznej poziomej z dystrybutorem eluentu, nanosi się w znany sposób próbkę substancji wzorcowej oraz na tym samym poziomie próbkę substancji badanej, po czym rozwija się chromatogram na dystansie 8-10 cm metodą elucji gradientowej stosując 8-10 porcji eluentu będącego mieszaniną co najmniej 2 rozpuszczalników o zróżnicowanej polarności, zawierających wzrastające ilości, uprzednio dobrane eksperymentalnie, odpowiednio od 1 do 100% rozpuszczalnika bardziej polarnego. Po zakończeniu procesu płytkę suszy się w strumieniu suchego powietrza i w znany sposób identyfikuje się substancję na chromatogramie.

Jako eluentu stosuje się, korzystnie mieszaninę octanu etylu w metanolu, mieszaninę octanu etylu, metanolu i wody, przy czym wody w ilości maksymalnie do 10%, mieszaninę ketonu metylowo-etylowego z metanolem.

Wynalazek jest dodatkowo objaśniony na przykładach oznaczania lanatozydu C obok siedmiu innych glikozydów w ekstraktach roślinnych z Digitalis lanata i Digitalis orientalis.

Przykład . Do doświadczeń zastosowano komorę sandwicz według polskiego opisu patentowego nr 165 698. Badania chromatograficzne wykonano na płytkach szklanych typu HPTLC pokrytych żelazem krzemionkowym (Kieselgel 60) firmy Merck-Darmstadt RFN, o wymiarach 10X 10 cm.

Wzorcowe roztwory glikozydów: lanatozydu C, digitoksyny, digitaliny, desacetylolanatozydu C, strofantyny G, acetylodigitoksyny, konwalatoksyny, digoksyny przygotowano przez rozcieńczenie odważki metanolem do otrzymania roztworów o stężeniu 0,01%. Przygotowano jednocześnie wyciągi z Digitalis lanata i Digitalis orientalis. W tym celu odważono dokładnie 10 g sproszkowanego surowca do kolby stożkowej o pojemności 250 cm³, dodano 1000 cm³ roztworu metanolu w wodzie w stosunku 1:1 i wytrząsano 2 godziny. Dodano 25 cm³ 30% roztworu octanu ołowiawego, zmieszano i nie przesączając wytrącono Pb²⁺ 15% roztworem fosforanu sodowego (NaHzPO4). Obecność jonów Pb²⁺ kontrolowano 2% roztworem KJ. Po przesączeniu osad przemywano trzykrotnie 50% roztworem wodno-metanolowym. Połączone przesącze wytrząsano 5krotnie chloroformem po 50 cm³. Zebrane wyciągi chloroformowe suszono bezwodnym Ńa2SO4, po przesączeniu wyciągi odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 30-35°C. Suchą pozostałość rozpuszczono w 1 cm³ roztworu metanolu + chloroform w stosunku 1:1.

Roztwór wzorcowy glikozydów i ekstrakty roślinne nanoszono na linię startową płytki w postaci cienkich pasm o długości 1,5μ! każdego roztworu wzorcowego glikozydów i badanych ekstraktów i chromatografowano w układzie octanu etylu i metanol według gradientu podanego w tabeli. Płytki rozwijano na dystansie 8 cm. Rozwinięte chromatogramy suszono w temperaturze pokojowej, po czym spryskiwano dokładnie 10 ml 3% roztworem chloraminy w kwasie trójchlorooctowym. Chromatogramy ogrzewano w temperaturze 100-110°C przez 10 minut i obserwowano w świetle nadfioletowym UV 366 nm. Densytogramy wykonywano densytometrem firmy Shimadzu CS-930 przy długości fali 360 nm.

Uzyskane wyniki obrazują załączone rysunki, gdzie fig. 1 przedstawia densytogram mieszaniny glikozydów chromatografowanych według gradientu podanego w tabeli. Na fig. 1 pik 1 oznacza acetylodigitoksynę, pik 2 oznacza strofantynę, pik 3 oznacza digitalinę, pik 4 desacetyloanatozyd C, pik 5 lanatozyd C, pik 6 konwalatoksynę, pik 7 digoksym, pik 8 digitoksynę.

Figura 2 przedstawia densytogram ekstraktu z Digitalis Orientalis w układzie podanym w tabeli, przy czym pik 5 oznacza lanatozyd C. Pik 5 na fig. 3 oznacza lanatozyd C analizowany z ekstraktu Digitalis Lanata.

Tabela

Rozpuszczalnik

I II III IV V VI VII VIII IX

100 100 80 70 98 90 65 — — — — 20 30 2 10 35 100 100

Objętość jednego skoku 0,11 ml

Octan etylu % N

Metanol % N

167 763

f^2

-O. 200. 6.4

a,, ooo

1.600

1.200

Ο-βΟβ

O. 400

0.000

0.200

2.000

1.600

t.200

O. 400

- 0.200

S. 7

o. βοο

o.ooo

90. 2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób oznaczania glikozydów, zwłaszcza lanatozydu C w mieszankach recepturowych i preparatach roślinnych metodą chromatografii cienkowarstwowej przez naniesienie na powierzchnię adsorbentu umieszczonego na płytce chromatograficznej w komorze płaskiej z dystrybutorem, substancji wzorcowej oraz substancji badanej i rozwijanie chromatogramu, znamienny tym, że chromatogram rozwija się na dystansie 8-10 cm metodą elucji gradientowej stosując 8-10 porcji eluentu będącego mieszaniną co najmniej 2 rozpuszczalników o zróżnicowanej polarności, zawierających wzrastające ilości, uprzednio dobrane eksperymentalnie, odpowiednio od 1 do 100% rozpuszczalnika bardziej polarnego, a po zakończeniu procesu płytkę suszy się w strumieniu suchego powietrza i w znany sposób identyfikuje się substancje na chromatogramie.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako rozpuszczalniki o zróżnicowanej polarności, stosuje się, korzystnie mieszaninę octanu etylu w metanolu, mieszaninę octanu etylu, metanolu i wody, przy czym wody w ilości maksymalnie do 10% objętościowych w odniesieniu do mieszaniny, mieszaninę ketonu metylowo-etylowego w metanolu.