PL165302B1 - Sposób Izolowania I oczyszczania białka antygenowego otoczki wirusa HIV-1 z komórek zrekombinowanych bakterii Escherichia coli - Google Patents

Abstract

Sposób izolowania i oczyszczania białka antygenowego otoczki wirusa HIV-1z komórek zrekombinowanych bakterii Escherichia coli, znamienny tym, że komórki bakteryjne zawierające zrekombinowany plazmid pRA27 pozbawia się elementów ściany komórkowej, uzyskane sferoplasty poddaje się lizie za pomocą detergentu niejonowego, po czym uwolnione ciałka inkluzyjne oczyszcza się poprzez wirowania w roztworze o zwiększonej gęstości, rozpuszcza się w 6 M roztworze mocznika a po odwirowaniu zanieczyszczeń i usunięciu mocznika poprzez dializę, wytrącone białko hybrydowe poddaje się hydrolizie kwaśnej a następnie zobojętnia do pH 5,2, po czym oddzielony fragment gp120 wirusa HIV-1 oczyszcza się za pomocą chromatografii jonowymiennej na kai^tłc^lc^^n^^tyllc^c^^u^^c^^ie.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób izolowania i oczyszczania białka antygenowego otoczki wirusa HIV-1 z komórek rekombinowanych bakterii Escherichia coli, jako niezbędnego składnika testów diagnostycznch do wykrywania zakażenia wirusem HIV-1, a także mającego zastosowanie do prac badawczych i klinicznych nad wirusem HIV-1.

Rozprzestrzeniający się zespół nabytego niedoboru immunologicznego (AIDS) stwarza potrzebę wytwarzania testów diagnostycznych do wykrywania zakażenia ludzkim wirusem upośledzenia odporności (HIV). Diagnostyka zakażenia wirusem HIV polega na wykazaniu obecności w surowicy swoistych przeciwciał przeciwko wirusowi HIV, bądź wolno krążących antygenów. W rutynowej diagnostyce powszechnie stosowane są testy immunoenzymatyczne typu ELISA wykrywające w badanej surowicy swoiste przeciwciała przeciwko antygenom białkowym wirusa HIV. Początkowo do tego typu testów używano jako antygenów nie uczynnionych cząstek wirusa uzyskanych po lizie hodowli tkankowej. Tak otrzymane preparaty były zanieczyszczone antygenami HLA, co znacznie obniżało swoistość testu. Obecnie w testach ELISA do wykrywania zakażeń wirusem HIV stosuje się zestawy z użyciem antygenów wirusowych otrzymanych w wyniku syntezy chemicznej lub drogą rekombinacji genetycznej z genomem komórek bakterii Escherichia coli lub drożdży.

Bakterie Escherichia coli są często wykorzystywane do produkcji użytecznych białek metodami inżynierii genetycznej. Białka te mogą syntetyzować się w komórkach bakterii w znacznych ilościach, dochodzących nawet do 50% całkowitej zawartości białka w komórce. Mogą być one produkowane w postaci wolnej lub związane z nośnikiem w postaci białka enzymatycznego np. β-galaktozydazy. Syntetyzowane białko, produkt ekspresji wprowadzonego do komórki zrekombinowanego genu, najczęściej odkładane jest wewnątrz komórki bakteryjnej w postaci nierozpuszczalnych ziarnistości zwanych ciałkami inkluzyjnymi [Sharama S. K., (1986), Separation Sci. Technol. 21, str. 701-726].

Znane metody izolowania i oczyszczania białka rekombinowanego z komórek Escherichia coli polegają na lizie całych komórek bakteryjnych, solubilizacji odwirowanych ciałek inkluzyjnych i oczyszczeniu pożądanego białka metodami chromatograficznymi. Rozbicie komórek bakteryjnych przeprowadza się zazwyczaj poprzez sonikację, wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie lub za pomocą prasy French'a. W celu rozpuszczenia ciałek inkluzyjnych stosuje się najczęściej

165 302 czynniki denaturujące takie jak mocznik, chlorowodorek quanidyny, dezoksycholan sodu i inne [SharamaS. K., (1986), Separation Sci. Technol. 21,str. 701-726; Samuel K. P. i wsp.,(1988), Gene 64, str. 121-134].

Niedogodnością stosowanych metod jest to, że białko izoluje się z homogenatu całych bakterii co prowadzi do wstępnego zanieczyszczenia ciałek inkluzyjnych trudnymi do usunięcia elementami ściany komórkowej. Ponadto homogenat bakteryjny posiada wysoką aktywność proteolityczną na skutek uwolnienia bakteryjnych enzymów periplazmatycznych, co powoduje degradację izolowanego białka. Otrzymane w ten sposób białko musi być poddane wielokrotnemu oczyszczaniu metodami chromatograficznymi, co pociąga spadek wydajności i wzrost kosztów metody. Powyższych wad nie posiada sposób według wynalazku.

W sposobie według wynalazku za pomocą prostych metod preparatywnych otrzymuje się z dużą wydajnością wysoce oczyszczony polipeptyd stanowiący końcowy fragment glikoproteiny gp120 otoczki wirusa HIV-1. Polipeptyd ten jest syntetyzowany w komórkach bakterii Escherichia coli w postaci białka hybrydowego z fragmentem bakteryjnego enzymu β-galaktozydazy. Białko hybrydowe jest poduktem ekspresji wprowadzonego do komórek bakteryjnych zrekombinowanego plazmidu pRA27, otrzymanego sposobem opisanym w polskim opisie patentowym nr 15(9234. W miejscu połączenia fragmentu wirusowego z fragmentem β-galaktozydazy występuje kwasolabilne wiązanie pomiędzy kwasem asparaginowym a proliną, co umożliwia oddzielenie fragmentu wirusowego od nośnika za pomocą hydrolizy kwaśnej. Drugie takie wiązanie występuje we fragmencie β-galaktozydazy.

Sposób według wynalazku polega na tym, że bakterie Escherichia coli K12, zawierające plazmid pRA27, hoduje się znanymi metodami i inkubuje kolejno w roztworach zawierających chlorek wapniowy, wersenian dwusodowy i lizozym jaja kurzego, przez co komórki bakteryjne przyjmują postać sferoplastów, które następnie lizuje się roztworem detergentu niejonowego, korzystnie Tritonem X-100 (deka(etylenoglikol)monooktylofenyloeter). Uwolnione w ten sposób ciałka inkluzyjne oczyszcza się poprzez wirowanie w roztworze o zwiększonej gęstości, na przykład w 20% wodnym roztworze sacharozy. Ciałka inkluzyjne rozpuszcza się w 6 M roztworze mocznika a następnie, po odwirowaniu, wytrąca się białko hybrydowe poprzez usunięcie mocznika na drodze dializy.

Oczyszczone sposobem według wynalazku białko hybrydowe jest prawie jednorodne w elektroforezie na żelu poliakryloamidowym.

Białko hybrydowe poddaje się następnie hydrolizie kwaśnej, co prowadzi do rozerwania dwóch wiązań pomiędzy kwasem asparaginowym a proliną, które występują w cząsteczce białka hybrydowego. Hydrolizat zobojętnia się do pH 5,2 przez co następuje wytrącenie większości białek balastowych. Fragment glikoproteiny gp120 oczyszcza się ostatecznie za pomocą chromatografii na karboksymetolocelulozie. Uzyskany sposobem według wynalazku fragment glikoproteiny gp120 wirusa HIV-1 zawiera 66 końcowych aminokwasów natywnej cząsteczki w pozycjach Ser418-Arg483.

Otrzymane sposobem według wynalazku białko jest homogenne w elektroforezie na żelu poliakryloamidowym. Charakteryzuje się bardzo dobrą rozpuszczalnością w wodzie i roztworach soli w szerokim zakresie pH oraz nie ulega degradacji w czasie długiego przechowywania w stanie zamrożonym w -20°C.

Preparat białka nie wykazuje reakcji z przeciwciałami przeciwko antygenom Escherichia coli w teście typu Western-blot.

Otrzymany polipeptyd reagował z ludzkimi surowicami o swoistości anty-gp120. Z kolei przeciwciała uzyskane na bazie otrzymanego polipeptydu wirusa HIV-1 reagowały zarówno z samym polipeptydem, jak również z białkami wirusa HIV-1 w teście typu Western-blot.

Potwierdzono także zgodność sekwencji dla 34 początkowych aminokwasów za pomocą automatycznego analizatora sekwencji aminokwasowej.

Zaletą sposobu według wynalazku jest to, że w celu wyizolowania białka hybrydowego zawierającego fragment gp120 wirusa HIV-1 z komórek Escherichia coli najpierw oddziela się ścianę komórkową bakterii uzyskując sferoplasty, które łatwo ulegają lizie w roztworach zawierających detergent niejonowy. Izolując ciałka inkluzyjne ze sferoplastów a nie z całych bakterii unika

165 302 się ich zanieczyszczenia elementami ściany komórkowej oraz usuwa się znaczną ilość białek balastowych, a ponadto unika się degradacji enzymatycznej uzyskanego białka przez enzymy zawarte w przestrzeni periplazmatycznej ściany komórkowej. Istotę wynalazku objaśni poniższy przykład:

Przykład.

a) Otrzymanie sferoplastów.

Zastosowano wysokowydajną i niskolizozymową metodę opisaną przez Marvin i Witholt [Marvin H. J. P., Witholt B., (1987), Anal. Biochem. 164, str. 320-330]. Zawiesinę bakterii Escherichia coli, zawierających zrekombinowany plazmid pRA27, schłodzono do temperatury 0°C i odwirowano. Osad bakterii zawieszono w roztworze buforowym o pH 7,4 zawierającym 5 mM Tris-HCl; 0,1 M CaCl2 i inkubowano przez 10 minut w temperaturze 0°C. Zawiesinę odwirowano a osad powtórnie zawieszono w zbuforowanym roztworze chlorku wapnia stosując 40 minutową inkubację w temperaturze 0°C. Po odwirowaniu osad zawieszono w roztworze zawierającym 0,1 M bufor fosforanowy (Na2HPO4/NaH2P04) pH 6,2; 10 mM glicerol i lizozym jaja kurzego w stężeniu 50 pg/ml. Zawiesinę inkubowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej a następnie schłodzono do temperatury 0°C, dodano wersenianu dwusodowego do stężenia 1 mM i odwirowano. Osad zawieszono w roztworze zawierającym 0,1 M bufor Tris-HCl pH 8,0; 10 mM wersenian dwusodowy, inkubowano przez 5 minut w temperaturze 0°C i odwirowano. Osad zawierał sferoplasty Escherichia coli zdolne do namnażania na pożywce izotonicznej.

b) Izolowanie ziarnistości inkluzyjnych.

Osad z sferoplastów zlizowano w roztworze zawierającym 50mM bufor Tris-HCl pH 8,0; 10 mM wersenian dwusodowy; 0,05% Triton Χ-100; 1 mM fluorek fenylometylosulfonowy, stosując pięciokrotnie 1 minutową sonikację. Zawiesinę zamrożono w -70°C a następnie po powolnym rozmrożeniu odwirowano przy 35000 X g. Osad zawierał ciałka inkluzyjne zanieczyszczone elementami komórkowymi.

c) Oczyszczanie białka hybrydowego.

Osad ciałek inkluzyjnych rozcieńczono niewielką ilością wody i nawarstwiono na 20% roztwór sacharozy, odwirowano w ciągu 20 minut przy 18000 X g. Zanieczyszczenia komórkowe o mniejszej gęstości pławnej zatrzymują się na roztworze sacharozy, podczas gdy ziarnistości inkluzyjne osadzają się na dnie probówki. Osad ciałek inkluzyjnych rozpuszczono w roztworze zawierającym 10 mM Tris-HCl, 6M mocznik i odwirowano w ciągu 30 minut przy 60000 X g. Supernatant zawierający białko hybrydowe dializowano w ciągu 12 godzin wobec wody. Wytrącony osad białka hybrydowego odwirowano w ciągu 5 minut przy 4000 X g.

d) Oddzielenie części pochodzącej z wirusa od nośnika β-galaktozydazy.

Białko hybrydowe poddano 36 godzinnej hydrolizie w 75% kwasie mrówkowym w 37°C zgodnie z metodą opisaną przez Landona [Landon M., (1987), Metchods Enzymol. 17, str. 145-149]. Kwas mrówkowy usunięto przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem. Preparat zagęszczono 50 razy. Pozostałość rozcieńczono wodą do poprzedniej objętości i ponownie odparowano. Proces powtarzano aż do obniżenia się stężenia kwasu poniżej 10 mM. W wyniku hydrolizy w cząsteczce białka hybrydowego ulegają rozerwaniu dwa wiązania peptydowe, występujące pomiędzy kwasem asparaginowym a proliną.

e) Oczyszczanie fragmentu glikoproteiny gp120 wirusa HIV-1.

Hydrolizat otrzymany według opisu z części d poddano zobojętnianiu do pH 5,2 za pomocą 1 % NaOH. Wytrącony osad zawierający wyłącznie białka balastowe odwirowano w ciągu 10 minut przy 4000 X g. Supernatant stanowi mieszaninę 3 polipeptydów, które rozdzielono metodą chromatografii jonowymiennej na karboksymetylocelulozie. Preparat dializowano w ciągu 4 godzin w temperaturze 4°C wobec 50 mM buforu fosforowanego pH 6,2 i naniesiono na kolumnę ze złożem zrównoważonym tym samym buforem. Rozdział przeprowadzono za pomocą liniowego gradientu NaCl w zakresie 0,0-0,4M. Otrzymany fragment glikoproteiny gp120 wirusa HIV-1 eluował się przy 0,15 M stężeniu NaCl. Roztwór białka po rozporcjowaniu zamrożono w -70°C i przechowywano w stanie zamrożonym w -20°C. Stężenie białka w preparacie określone na podstawie absorbancji w 280 nm wynosiło 0,8mg/ml. Z 11 hodowli bakteryjnej uzyskano około 20 mg oczyszczonego fragmentu glikoproteiny gp120 otoczki wirusa HIV-1.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób izolowania i oczyszczania białka antygenowego otoczki wirusa HIV-1 z komórek zrekombinowanych bakterii Escherichia coli, znamienny tym, że komórki bakteryjne zawierające zrekombinowany plazmid pRA27 pozbawia się elementów ściany komórkowej, uzyskane sferoplasty poddaje się lizie za pomocą detergentu niejonowego, po czym uwolnione ciałka inkluzyjne oczyszcza się poprzez wirowania w roztworze o zwiększonej gęstości, rozpuszcza się w 6 M roztworze mocznika a po odwirowaniu zanieczyszczeń i usunięciu mocznika poprzez dializę, wytrącone białko hybrydowe poddaje się hydrolizie kwaśnej a następnie zobojętnia do pH 5,2, po czym oddzielony fragment gp120 wirusa HIV-1 oczyszcza się za pomocą chromatografii jonowymiennej na karboksymetylocelulozie.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako niejonowy detergent stosuje się deka(etylenoglikol)monooktylofenyloeter (Triton X-100).
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako roztwór o zwiększonej gęstości stosuje się roztwór wodny sacharozy o stężeniu 20%.