PL165248B1

PL165248B1 - Method of hemines

Info

Publication number: PL165248B1
Application number: PL29221991A
Authority: PL
Inventors: Alfreda Padzik-Graczyk; Jerzy Konarski; Julitta Sobczynska
Original assignee: Wojskowa Akad Tech
Priority date: 1991-10-29
Filing date: 1991-10-29
Publication date: 1994-11-30
Also published as: PL292219A1

Abstract

Sposób otrzymywania hemin, ewentualnie w postaci niższych estrów alkilowych, przez traktowanie hemoglobiny lub koncentratu erytrocytów rozpuszczalnikiem organicznym i czynnikiem kwasowym, znamienny tym, że po potraktowaniu hemoglobiny lub koncentratu erytrocytów rozpuszczalnikiem organicznym i czynnikiem kwasowym, związek heminowy lub jego niższy ester alkilowy oddziela się od białka przez ekstrakcję niepolarnym lub niskopolarnym rozpuszczalnikiem, ewentualnie z dodatkiem czynnika kompleksującego, po czym ewentualnie wydziela się produkt.Method for obtaining hemin, optionally in the form of lower alkyl esters, by treating the hemoglobin or erythrocyte concentrate with an organic solvent and agent acidic, characterized in that after treatment with hemoglobin or a concentrate of erythrocytes an organic solvent and an acidic agent, a heminic compound or a compound thereof the lower alkyl ester is separated from the protein by non-polar or low-polar extraction a solvent, optionally with the addition of a complexing agent, and then optionally the product is isolated.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania hemin, ewentualnie w postaci niższych estrów alkilowych.The invention relates to a process for the preparation of hemin, optionally in the form of lower alkyl esters.

Określenie heminy obejmuje pochodne z różnymi ligandami przy żelazie hemowym, zwłaszcza heminę i/lub hematynę.The term hemin includes derivatives with various ligands on the heme iron, especially hemin and / or hematin.

Hemina lub jej ester, np. metylowy jest produktem wyjściowym do otrzymywania hematoporfiryny i jej pochodnych (HpD) oraz pochodnych protoporfiryny, stosowanych np. jak ofotosensybilizatory w fotodynamicznej metodzie diagnozy i terapii nowotworów.Hemin or its ester, e.g. methyl, is the starting product for the preparation of hematoporphyrin and its derivatives (HpD) and protoporphyrin derivatives, used e.g. as ophthalmic sensors in the photodynamic method of diagnosis and cancer therapy.

Dotychczas opracowano wiele metod otrzymywania heminy, hematyny albo ich metylowego estru z hemoglobiny.To date, many methods have been developed to obtain hemin, hematin or their methyl ester from hemoglobin.

Najczęściej stosowana jest metoda Hamsika i wsp., zmodyfikowana następnie przez Grinsteina (J.Biol. Chem. 167, 515, 1947), prowadząca do otrzymania hematyny (hydroksyhemina).The most commonly used method is the method of Hamsik et al., Later modified by Grinstein (J. Biol. Chem. 167, 515, 1947), leading to the preparation of hematin (hydroxyhemin).

W pierwszej ze wspomnianych metod hemoglobinę w postaci proszku rozkłada się traktując ją acetonowym roztworem kwasu szczawiowego, natomiast w metodzie Grinsteina w etapie tym stosuje się metanolowy roztwór kwasu szczawiowego. Następnie oddziela się hem zaokludowany na białku (globinie) przez kilkakrotne odmycie acetonem lub gorącym metanolem.In the first-mentioned method, hemoglobin in powder form is broken down by treating it with an acetone solution of oxalic acid, while in Grinstein's method, this step uses a methanolic solution of oxalic acid. Then the heme occluded on the protein (globin) is separated by washing several times with acetone or hot methanol.

165 248165 248

Jest to bardzo uciążliwe technologicznie i wymaga użycia olbrzymich ilości rozpuszczalnika.It is technologically very onerous and requires the use of huge amounts of solvent.

Hem zaokludowany na białku stanowi około 80% całkowitej jego ilości, stąd dokładne odmycie jest bardzo ważnym etapem.Hemoccluded on the protein constitutes about 80% of its total amount, hence thorough washing is a very important step.

Na kilkakrotne odmywanie hemu metanolem można sobie pozwolić w metodzie laboratoryjnej, natomiast w skali przemysłowej procedura taka jest niemożliwa do zaakceptowania. Wielokrotne odmywanie rozpuszczalnikiem, takim jak metanol, jego mieszanina z etanolem lub mieszanina metanolu, etanolu i wody prowadzi się także w sposobie znanym z opisu patentowego St. Zjedn. Am. nr 4 33(0463.Several times the heme was washed with methanol in a laboratory method, while on an industrial scale such a procedure is unacceptable. Multiple washing with a solvent such as methanol, its mixture with ethanol, or a mixture of methanol, ethanol and water is also carried out in the process known from US Patent No. US Am. No.4 33 (0463.

W sposobie tym hemoglobinę przeprowadza się w postać stałą i kilkakrotnie ekstrahuje (odmywa) heminę metanolem w obecności kwasu chlorowodorowego. W innym przykładzie wykonania kwas chlorowodorowy dodaje się do koncentratu czerwonych krwinek, osad odsącza się i suszy, a następnie kilkakrotnie ekstrahuje mieszaniną metanol/etanol. W procesie tym na 1 kg heminy zużywa się ponad 10001 rozpuszczalnika.In this process, the hemoglobin is solidified and the hemin is extracted (washed) several times with methanol in the presence of hydrochloric acid. In another embodiment, hydrochloric acid is added to a concentrate of red blood cells, the precipitate is filtered off and dried, and then extracted several times with methanol / ethanol. In this process, more than 10,001 solvent is used for 1 kg of hemin.

Sposób według wynalazku pozwala otrzymać związek heminowy w skali przemysłowej, bez użycia olbrzymich ilości rozpuszczalnika oraz konieczności wdychania jego par, co nie jest obojętne dla zdrowia.The method according to the invention allows to obtain a hemin compound on an industrial scale, without the use of huge amounts of solvent and the need to inhale its vapors, which is not indifferent to health.

Obecnie stwierdzono, że zużycie rozpuszczalników, zwłaszcza tak szkodliwych jak metanol można znacznie, tj. kilkanaście razy ograniczyć i uzyskać produkt z wysoką wydajnością, jeżeli do oddzielenia związku heminowego od białka zastosuje się niepolarny lub niskopolarny rozpuszczalnik, ewentualnie z dodatkiem czynnika kompleksującego.It has now been found that the consumption of solvents, especially those as harmful as methanol, can be significantly, i.e. several times reduced, and obtain a product with high yield, if a non-polar or low-polar solvent, possibly with the addition of a complexing agent, is used to separate the hemin compound from the protein.

Sposób według wynalazku polega na tym, że hemoglobinę lub koncentrat erytrocytów traktuje się najpierw rozpuszczalnikiem organicznym i czynnikiem kwasowym, a następnie oddziela się związek heminowy lub jego niższy ester alkilowy zaokludowany na białku przez ekstrakcję niepolarnym lub niskopolarnym rozpuszczalnikiem , ewentualnie z dodatkiem czynnika kompleksującego i w razie potrzeby, wydziela się produkt.The method according to the invention consists in treating the hemoglobin or erythrocyte concentrate first with an organic solvent and an acidic agent, and then separating the heminic compound or its lower alkyl ester occluded on the protein by extraction with a non-polar or low-polar solvent, possibly with the addition of a complexing agent and, if necessary, the product is isolated.

W procesie według wynalazku związek heminowy zaokludowany na białku oddziela się korzystnie przez ekstrakcję ciągłą.In the process according to the invention, the hemin compound occluded on the protein is preferably separated by continuous extraction.

Jako materiał wyjściowy można stosować krew rozdzielaną znanymi sposobami, korzystnie jest jednak użyć masę erytrocytarną, np. przeterminowaną, którą poddaje się znanej obróbce, np. acetonem.Blood separated by known methods may be used as the starting material, but it is preferable to use an erythrocyte mass, e.g. expired mass, which is subjected to a known treatment, e.g. with acetone.

Hemoglobinę lub koncentrat erytrocytów traktuje się zakwaszonym rozpuszczalnikiem organicznym, rozkładając ją na związek heminowy i białko (globinę). Można stosować różne rozpuszczalniki, zwłaszcza polarne, np. alkohole, jak metanol, etanol, propanol albo ich mieszaniny: ketony, jak aceton, metyloetyloketon. Korzystne są alkohole. Rozpuszczalnik organiczny zakwasza się do pH poniżej 4,5 zwłaszcza do pH 3-2.Hemoglobin or a concentrate of erythrocytes is treated with an acidified organic solvent, decomposing it into a hemin compound and a protein (globin). Various solvents, especially polar solvents, e.g. alcohols, such as methanol, ethanol, propanol, or mixtures thereof: ketones, such as acetone, methyl ethyl ketone, can be used. Alcohols are preferred. The organic solvent is acidified to a pH below 4.5, in particular to a pH of 3-2.

Choć do osiągnięcia odpowiedniej wartości pH można stosować kwasy, jednakże stwierdzono, że najkorzystniejsze są halogenki kwasowe, np. chlorek acetylu, propionalu i inne.Although acids can be used to achieve the desired pH value, acid halides, e.g., acetyl, propional, and others have been found to be most preferred.

Otrzymaną mieszaninę rozdziela się odzyskując z roztworu pierwszą frakcję związku heminowego lub jego estru.The resulting mixture is separated by recovering the first fraction of the hemin compound or its ester from the solution.

Pozostałość zawierająca białko wraz z zaokludowanym związkiem heminowym lub jego estrem poddaje się ekstrakcji ciągłej rozpuszczalnikiem niepolarnym albo niskopolarnym, ewentualnie z dodatkiem czynnika kompleksującego.The protein-containing residue, together with the occluded hemin compound or its ester, is subjected to continuous extraction with a non-polar or low-polar solvent, optionally with the addition of a complexing agent.

Stwierdzono, że odpowiednimi rozpuszczalnikami niepolarnymi lub niskopolarnymi są rozpuszczalniki o stałej dielektrycznej wynoszącej co najwyżej 5. Należy do nich np. ester, chloroform, czterochlorek węgla i ich mieszaniny.Solvents with a dielectric constant of 5 or less have been found to be suitable non-polar or low-polar solvents. These include, for example, ester, chloroform, carbon tetrachloride, and mixtures thereof.

Są one nieoczekiwanie skuteczne w połączeniu z czynnikami kompleksującymi o charakterze zasadowym, np. z grupy obejmującej aminy, amidy, korzystnie dimetyloformamid, formamid, trietyloaminę, etylenodiaminę.They are surprisingly effective in combination with complexing agents of a basic nature, e.g. from the group consisting of amines, amides, preferably dimethylformamide, formamide, triethylamine, ethylenediamine.

Dodaje się je do niepolarnego lub niskopolarnego rozpuszczalnika w ilości od 0 do około 10%, zwłaszcza 0,5-3% wagowych.They are added to the non-polar or low-polar solvent in an amount of from 0 to about 10%, especially 0.5-3% by weight.

Ekstrakcję można prowadzić pod ciśnieniem normalnym lub obniżonym.The extraction can be carried out under normal pressure or under reduced pressure.

Związek heminowy lub jego ster wydziela się z roztworu różnymi sposobami, np. przez wytrącenie za pomocą odpowiedniego alkoholu, acetonu, mieszaniny wodno-alkoholowej, wodno-acetonowej, lub alkoholowo-acetonowej.The hemin compound or its rudder is separated from the solution by various methods, e.g. by precipitation with the appropriate alcohol, acetone, hydroalcoholic, hydroacetone or alcoholacetone mixture.

165 248165 248

Prowadzenie procesu sposobem według wynalazku daje nieoczekiwanie korzystny efekt techniczny, polegający na znacznym zmniejszeniu ilości rozpuszczalnika w stosunku do znanej metody.Carrying out the process according to the invention gives an unexpectedly advantageous technical effect, consisting in a significant reduction of the amount of solvent in relation to the known method.

W sposobie według wynalazku do wytworzenia 1 kg heminy zużywa się około 80 litrów rozpuszczalnika, podczas gdy w znanej metodzie do otrzymania 1 kg heminy stosowano około 800 litrów kwasu octowego lub około 1000 litrów alkoholu.In the method according to the invention, about 80 liters of solvent are used to produce 1 kg of hemin, while in the known method, about 800 liters of acetic acid or about 1000 liters of alcohol are used to obtain 1 kg of hemin.

Niżej podane przykłady ilustrują sposób według wynalazku nie ograniczając jego zakresu.The following examples illustrate the process of the invention without limiting its scope.

Przykład . Etap I . Jaoo produk t wyjściowy zastosowano preeterminowaną maęę erytro cytarną.An example. Stage I. The starting product used was erythrocyte preconditioned.

W reaktorze z mieszadłem o pojemności 5 litrów umieszczono 2 litry acetonu i przy ostrym mieszaniu wlano 1 litr masy eeytrncytaenej. Całość mieszano 15 minut, a następnie mieszaninę rozlewano do tulei wirówki o pojemności 1 litra i wirowano 10 minut.2 liters of acetone were placed in a 5 liter stirred reactor, and 1 liter of carbon dioxide was poured in with vigorous stirring. The mixture was mixed for 15 minutes, then the mixture was poured into a 1 liter centrifuge sleeve and vortexed for 10 minutes.

Roztwór acetonu oddzielono, j hemoglobinę suszono pod wyciągiem. Aceton regenerowano na kolumnie i zawracano powtórnie do reakcji.The acetone solution was separated and the hemoglobin was dried in a fume hood. The acetone was regenerated on the column and recycled back to the reaction.

Etap II. Do reaktora o pojemności 5 litrów wlewano 2,5 litra metanolu i ostro mieszając wysypywano 500 g suchej hemoglobiny, a następnie z wkraplaczj dodawano 60 ml chlorku acetylu ostro mieszając przez 30 minut. Następnie sprawdzono pH mieszaniny (pH 2-3) i wirowano. Roztwór metanolowy poddano destylacji w celu usunięcia nadmiaru rozpuszczalnika. Z zagęszczonego roztworu wypada I-sza frakcja osadu estru metylowego heminy.Stage II. 2.5 L of methanol was poured into a 5 L reactor and 500 g of dry hemoglobin was poured with sharp stirring, and then 60 mL of acetyl chloride was added from the dropping funnel with sharp stirring for 30 minutes. The pH of the mixture was then checked (pH 2-3) and centrifuged. The methanol solution was distilled to remove excess solvent. The first fraction of the hemin methyl ester precipitate falls out of the concentrated solution.

Osad globiny z zaokludowanym na nim estrem metylowym heminy przeniesiono do aparatu SoKleta i poddano ekstrakcji ciągłej chloroformem z dodatkiem dimetyloformamidu.The globin precipitate with hemin methyl ester occluded on it was transferred to the SoKlet apparatus and subjected to continuous extraction with chloroform with the addition of dimethylformamide.

Na 985 ml chloroformu dodano 15 ml dimetyloformamidu. W ten sposób 1 litr tej mieszaniny pozwala wyekstrahować heminę z 1 kg masy reakcyjnej. Ekstrakcję prowadzono tak długo, że ekstrahujący chloroform był prawie bezbarwny.15 ml of dimethylformamide was added per 985 ml of chloroform. Thus, 1 liter of this mixture makes it possible to extract hemin from 1 kg of the reaction mass. Extraction was carried out for so long that the extracting chloroform was almost colorless.

Następnie roztwór chloroformowy zagęszczono do ok. 1/3 objętości przez destylację i wytrącano metanolem.The chloroform solution was then concentrated to ca 1/3 volume by distillation and precipitated with methanol.

Wytrącony osad estru metylowego heminy sączono pod próżnią. Tak otrzymany ester metylowy heminy oczyszczano metodą chromatografii cieczowej (HPLC).The precipitated hemin methyl ester was filtered off with suction. The hemin methyl ester thus obtained was purified by liquid chromatography (HPLC).

Z 1000 g hemoglobiny otrzymano około 12 g suchego estru heminy.About 12 g of dry hemin ester was obtained from 1000 g of hemoglobin.

Przykład II. Proces prowadzono analogicznie jak w przykładzie I z tym, że do ekstrakcji ciągłej stosowano chloroform bez dodatku czynnika kompleks^ącego.Example II. The process was carried out in the same way as in Example 1, except that chloroform without the addition of a complexing agent was used for the continuous extraction.

Przykład III. Etap I prowadzono analogicznie jak w przykładzie I.Example III. Stage I was carried out in the same way as in example I.

Edtap II. Do 2,51 etanolu dodawano 500 g suchej hemoglobiny, a następnie z wkraplaczj dodawano 60 ml chlorku aenaionylu ostro mieszając przez 30 minut. Konieczna kontrola pH mieszaniny (2-3). Następnie mieszaninę wirowano. Z roztworu etanolowego oddestylowano nadmiar rozpuszczalnika. Z zagęszczonego roztworu wypada I-szt frakcja estru etylowego heminy. Osad białka z rJokludowJaym nt nim estrem etylowym heminy poddawano w aparacie Sox1cSj ekstrakcji ciągłej czterochlorkiem węgla z dodatkiem etylenodiaminy (3% wagowe). 1 litr tej mieszaniny pozwolił wyekstrahować heminę z 1,2 kg hemoglobiny. Następnie roztwór czterochlorku węgla z dodatkiem etylenodiaminy zagęszczono przez oddestylowanie rozpuszczalnika i osad wytrącano roztworem acetonowo-metanolowym. Wytrącony osad estru etylowego heminy suszono i oczyszczono metodą chromatografii cieczowej (HPLC).Edtap II. 500 g of dry hemoglobin was added to 2.5 L of ethanol, and then 60 mL of aenaionyl chloride was added from the addition funnel with vigorous stirring for 30 minutes. It is necessary to control the pH of the mixture (2-3). The mixture was then swirled. Excess solvent was distilled off from the ethanol solution. The 1-pc hemin ethyl ester fraction falls out of the concentrated solution. The protein precipitate with the hemin ethyl ester therein was subjected to continuous extraction in the Sox1cSj apparatus with carbon tetrachloride with the addition of ethylenediamine (3% by weight). 1 liter of this mixture allowed to extract hemin from 1.2 kg of hemoglobin. Then, the solution of carbon tetrachloride with the addition of ethylenediamine was concentrated by distilling off the solvent, and the precipitate was precipitated with an acetone-methanol solution. The precipitate of hemin ethyl ester was dried and purified by liquid chromatography (HPLC).

Przykład IV. Otrzymywanie estru metylowego heminy przebiegało jak w przykucie I, natomiast ekstrakcję estru heminy rJokludnwJnegn na białku prowadzono eterem etylowym z 3% dodatkiem SeieSyloaminy. Ekstrację prowadzono aż do uzyskania bezbarwnego roztworu w kolumnie ekstrakcyjnej. 1 litr tej mieszany ekstrahuje ester metylowy heminy z 1,5 kg białka.Example IV. Obtaining hemin methyl ester proceeded as in attachment I, while extraction of hemin ester rJocludnwJnegn on the protein was carried out with ethyl ether with 3% addition of SeieSylamine. Extraction was carried out until a colorless solution was obtained in the extraction column. 1 liter of this mixed extracts hemin methyl ester from 1.5 kg of protein.

Po ekstrakcji roztwór zagęszczano przez oddestylowanie rozpuszczalnika, a następnie wytrącano roztworem JceSonnwnoJlkt)holoo7m.After extraction, the solution was concentrated by distilling off the solvent, and then precipitated with a JceSonnwnoJlkt) holoo7m solution.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.Publishing Department of the UP RP. Circulation of 90 copies

Cena 10 000 złPrice: PLN 10,000

Claims

Patent claims

A method for obtaining hemin, optionally in the form of lower alkyl esters, by treating the hemoglobin or erythrocyte concentrate with an organic solvent and an acidic agent, characterized in that after treating the hemoglobin or erythrocyte concentrate with an organic solvent and an acidic agent, the heminic compound or its lower alkyl ester is separated from the protein by extraction with a non-polar or low-polar solvent, optionally with the addition of a complexing agent, then optionally isolating the product.

2. The method according to p. The process of claim 1, characterized in that the hemin compound or a lower alkyl ester thereof is separated from the protein by continuous extraction.

3. The method according to p. The method of claim 1, wherein the hemoglobin or erythrocyte concentrate is treated with a polar organic solvent.

4. The method according to p. The process of claim 3, wherein an alcohol such as methanol, ethanol, propanol or mixtures thereof is used.

5. The method according to p. The process of claim 1, wherein the acidic agent is an acid halide.

6. The method according to p. The process of claim 5, wherein acetyl or propionyl chloride is used.

7. The method according to p. The process of claim 1 or 2, characterized in that a solvent with a dielectric constant of at most 5 is used as the non-polar or low-polar solvent.

8. The method according to p. The process of claim 7, wherein chloroform, carbon tetrachloride, ether or mixtures thereof are used.

9. The method according to p. The process of claim 1, characterized in that the complexing agent is added in an amount up to 10% by weight with respect to the non-polar or low-polar solvent.

10. The method according to p. The process of claim 9, wherein the complexing agent is used in an amount of 0.5 to 3% by weight.

11. The method according to p. A process as claimed in claim 1 or 9, characterized in that an amine or an amide is used as the complexing agent.

12. The method according to p. The method of claim 1, wherein the erythrocyte waste hemoglobin is used.