PL165020B1 - Sposób oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu i test diagnostyczny do oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu PL - Google Patents

Sposób oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu i test diagnostyczny do oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu PL

Info

Publication number
PL165020B1
PL165020B1 PL30054690A PL30054690A PL165020B1 PL 165020 B1 PL165020 B1 PL 165020B1 PL 30054690 A PL30054690 A PL 30054690A PL 30054690 A PL30054690 A PL 30054690A PL 165020 B1 PL165020 B1 PL 165020B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
fragment
antibodies
thr
ser
glu
Prior art date
Application number
PL30054690A
Other languages
English (en)
Inventor
Maria Swiatkowska
Czeslaw Cierniewski
Andrzej Plucienniczak
Grazyna Plucienniczak
Wojciech J Stec
Andrzej Wilk
Original Assignee
Akad Medyczna
Pan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akad Medyczna, Pan filed Critical Akad Medyczna
Priority to PL30054690A priority Critical patent/PL165020B1/pl
Publication of PL165020B1 publication Critical patent/PL165020B1/pl

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

1. Sposób oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego akty- watora plazminogenu w próbce zawierajacej ten antygen, z zastosowaniem przeciwcial i odczyn- nika dajacego sie oznaczyc analitycznie, znamienny tym, ze badana próbke kontaktuje sie z przeciwcialami dla polipeptydu odpowiadajacego fragmentowi o wzorze (Y )a-A-(Z)b, w którym Y oznacza sekwencje aminokwasów kodowana przez fragment polilinkera, korzystnie Glu, Ser, Z oznacza sekwencje Glu, Ser i/lub sekwencje kodowana przez fragment polilinkera, a = 0 lub 1, b = 0, 1 lub 2, natomiast A oznacza fragment A sn1 7 2 - Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu, po czym oznacza sie wytworzony kompleks antygen-przeciwcialo. 5. Test diagnostyczny do oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu, z zastosowaniem przeciwcial i odczynnika dajacego sie oznaczyc analitycznie, znamienny tym, ze zawiera przeciwciala dla polipeptydu odpo- wiadajacego fragmentowi o wzorze (Y )a-A-(Z)b, w którym Y oznacza sekwencje aminokwa- sów kodowana przez fragment polilinkera, korzystnie Glu, Ser, Z oznacza sekwencje Glu, Ser i/lub sekwencje kodowana przez fragment polilinkera, a = 0 lub 1, b = 0,1 lub 2, natomiast A oznacza fragment A sn1 7 2 - Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazmino- genu, ewentualnie unieruchomione na stalym nosniku lub rozpuszczone w fazie cieklej, przy czym przeciwciala sa zwiazane z odczynnikiem dajacym sie wykryc analitycznie. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu /PAI-1/ i test diagnostyczny do oznaczania i/lub wykrywania inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu.
Aktywatory plazminogenu /PAI-1/ pełnią ważną rolę podczas procesu fibrynolizy, a także w różnych innych procesach fizjologicznych, włączając proces regeneracji, owulacji, implantacji embrionu, różnicowania tkanek, transformacji nowotworowej. Precyzyjna regulacja aktywności aktywatorów plazminogenu, stanowi krytyczny element wielu biologicznych systemów. Taka regulacja może odbywaó się na poziomie tworzenia i rozpuszczania skrzepu lub na poziomie interakcji aktywatorów plazminogenu z komórkami czy też przez działanie specyficznych inhibitorów.
Większość oznaczeń aktywności tkankowego aktywatora plazminogenu jest dwuetapowa, zależy od obecności plazminy i nie odróżnia odmiennych rodzajów inhibitorów. Określenie inhibitorowej aktywności PAI mierzy się ilościowo przez zdolność do hamowania lizy włóknika znakowanego 125
J, pośredniczonej aktywacją plazminogenu przez urokinazę /Loskutoff and Edington, Proc. Nat.Acad.Sci. USA, 74, 3903-3909, 1977/. W tej metodzie jedną jednostkę aktywności PAI określa się jako ilość białka wymaganą do zredukowania aktywności 2IU UK do 50%. W celu oznaczenia ilości PAI używa się metody wiązania aktywatora plazminogenu do ihibitora /Schleef R.R., Wagner N.V., Loskutoff D.J., J.of Cellular Physiology, 134, 269-274, 1989/. Aktywność PAI można oznaczyć również posługując się metodą Verheijena, w której używa się wzrastających stężeń tPA /0-25 IU/ml/, 1pM plazminogenu, oraz 1 pM fibrynogenu degradowanego bromocyjanem. W tych warunkach 1 IU PAI-1 określa ilość inhibitora, która hamuje 1IU tPA /Verheijen J.H., Millast D., Chang G.T.G., Kluft C., Wijngards G., Thromb. Haemostasis, 48, 266-269, 1982/. W niektórych badaniach określających poziom PAI we krwi stosuje się oznaczenia, w których podstawą jest neutralizacja tPA dodanego do próbek osocza, a mierzy się pozostałą aktywność tPA. Metody te są metodami pośrednimi i nie pozwalają precyzyjnie określić poziomu tego inhibitora .
Ostatnio opracowano metodę enzymoimmunologicznego oznaczania ludzkiego PAI-1 w teście ELISA z wykorzystaniem przeciwciał dla tego białka. Test ten polega na tym, że inkubuje się przeciwciała dla PAI-1 z badaną próbką, w której oznacza się ten antygen i po odmyciu nieswoiście związanych białek, inkubuje się kompleks antygen-przeciwciało z przeciwciałami dla PAI-1 związanymi z peroksydazą chrzanową, po czym oznacza się antygen wykrywając znacznik.
Wszystkie te metody wymagają zastosowania rodzimego białka PAI-1, zarówno do uzyskania krzywej wzorcowej, jak i swoistych przeciwciał. PAI-1 występuje w ilościach śladowych w płynach ustrojowych i komórkach, a uzyskanie tego białka metodami klasycznymi przez wyodrębnienie w ilościach wystarczających do przygotowania testu Elisa jest niezwykle skomplikowane i czasochłonne. Z drugiej strony otrzymywane dotychczas ludzkie białko PAI-1 jest niezwykle drogie i niezbyt dostępne.
Wszystkie omówione metody otrzymywania rodzimego PAI-1 są niezwykle skomplikowane, pracochłonne i kosztowne, co zawyża w znacznym stopniu koszty całego testu.
Nieoczekiwanie okazało się, że możliwe jest oznaczanie białka rodzimego PAI-1, w oparciu o metodę, w której stosuje się przeciwciała dla odpowiedniego fragmentu peptydowego. Stwierdzono, że można wykorzystać pełną reakcję krzyżową w teście immunologicznym przeciwciał otrzymanych dla fragmentu białka oraz rodzimej cząsteczki PAI-1.
W odróżnieniu od znanych metod oznaczania PAI-1, odpowiedni fragment peptydowy, a nie całe białko, może służyć do produkcji swoistych przeciwciał stosowanych w sposobie według wynalazku, rozpoznających w ten sam sposób zarówno fragment peptydowy, jak i rodzime białko PAI-1. Fragment ten również stosuje się do uzyskania krzywej wzorcowej.
165 020
Sposób oznaczania 1/lub wykrywana antygenu ludzkiego Inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu w próbce zawierającej ten antygen, z zastosowaniem przeciwciał i odczynnika dającego się oznaczyć analitycznie, polega według wynalazku na tym, że badaną próbkę kontaktuje się z przeciwciałami dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze /Ya-A-/Z/b, “ którym Y oznacza sekwencję aminokwasów kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Glu, Ser.
Z oznacza sekwencję Glu, Ser i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, a · 0 lubi, b = 0, 1 lub 2, natomiast A oznacza fragment Asn^^ - Thr2j2 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu, po czym oznacza się wytworzony kompleks antygen-przeclwclało.
W sposobie według wynalazku stosuje się przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego, korzystnie otrzymanego przez ekspresję zrekombinowanego DNA .
W sposobie według wynalazku stosuje się przeciwciała dla, fragmentu polipeptydowego, korzystnie otrzymanego przez ekspresję zsyntetyzowanego chemicznie.
ONA o sekwencji:
( X )„AACGGCCAGTGGAAGACACCATTCCCAGACAGTAGCACCCACCGCCGCCTCTT
CCACAAATCAGACGGAAGCACTGTCTCTGTGCCAATGATGGCTGAGACCAACAAATT
CAACTATACTGAATTCACCACGCCAGATGGACATTACTACGACATCCTGGAACTGCC
ATACCACGGAGACACT(X)m,
Zrekombinowany wektor otrzymuje się łącząc znanymi metodami wektor z fragmentem DNA kodującym polipeptyd o wzorze /Y/a -A-/Z/&, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie. W sposobie według wynalazku stosuje się przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego zawierającego epitopy antygenowe rozpoznawane przez przeciwciała również w rodzimej cząsteczce PAI-1. Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi cząsteczki PAI-1 od 172 do 232 aminokwasu od N-końca o sekwencji:
172 177 1Θ2
Asn-Gly-Gln-Trp-Ly»-Thr-Pro-Phe-Pro-Asp-Ser-Ser-Thr-Hie-Arg187 19? 197
Arg-Leu-Phe-His-LyB-Ser-Asp-Gly-Ser-Thr-Val-Ser-Val-Pro-Met202 207 212
Met-Ala-Glu-Thr—Asn-Lye-Phe-Asn-Tyr—Thr-Glu-Phe-Thr-Thr-Pro217 222 227
Asp-Gly-His-Tyr—Tyr-A6p-Ile-Leu-Glu-Leu-Pro-Tyr-Hie-Gly-Aap232
Thr.
Gen kodujący fragment polipeptydowy odpowiadający fragmentowi ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu można na przykład otrzymać z oligonukleotydowych fragmentów ligowanych in vitro.
Oligonukleotydowe fragmenty można zsyntetyzować chemicznie na nośniku poprzez kolejne przyłączanie nukleozydów z zablokowanymi grupami czynnymi. Korzystnie do ochrony funkcji aminowej stosuje się grupę izopropoksyacetylową, co przedstawiono w opisie patentowym RP nr 159 234.
Fragmenty oligonukleotydowe zsyntetyzowane chemicznie poddaje się enzymatrycznej reakcji kinazowania, w trakcie której wprowadza się fosforan na końcach 5'za pomocą kinazy polinukleotydowej i ATP. Kinazowane oligonukleotydy liguje się in vitro w dwuniciowe odcinki ograniczone sekwencjami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne. Zligowane odcinki klonuje się w wektorze pomocniczym, stosując właściwe miejsce restrykcyjne polilinkera. Poprawność sekwencji produktów ligowania i klonowania tych fragmentów sprawdza się poprzez sekwencjonowanie metodą MaxamaGilberta. Można stosować różne wektory pomocnicze, np. plazmidowe lub fagowe, przy czym korzystne są plazmidy, np. pUC19. Sklonowane w wektorze odcinki DNA namnaża się w komórkach gospodarza, którymi mogą być bakterie, drożdże i inne. Wektory z wklonowanymi odcinkami izoluje się, a następnie odcinki odzyskuje się po trawieniu restryktazami na drodze elektroforezy w żelu poliakrylomidowym. Odzyskane odcinki włącza się do wektora ekspresyjnego po trawieniu odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Na tym etapie stosuje się różne wektory ekspresyjne, korzystnie plazmidowe lub fagowe. Przykładowo plazmid ekspresyjny pWR 450.1. zawiera gen kodujący B-galaktozydazę. Komórki gospodarcza, korzystnie bakterii transformowane zrekombinowanym wektorem, są po namnożeniu źródłem fragmentu białka ludzkiego PAI-1.
165 020
Wytworzony w ten sposób fragment białka PAI-1 można używać do otrzymywania stosowanych w sposobie według wynalazku przeciwciał, różnymi znanymi metodami, a także do wykreślenia krzywej wzorcowej niezbędnej do ilościowego oznaczania PAI-1.
Przykładowy sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu polega na tym, że immunizuje się zwierzęta polipeptydem odpowiadającym fragmentowi o wzorze /Y/a-A-ZZ/^, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, pobiera się krew i odzyskuje przeciwciała.
Otrzymane w ten sposób przeciwciała można zastosować w sposobie według wynalazku, do oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu oraz do otrzymania testu diagnostycznego według wynalazku.
Wykrywanie i oznaczanie sposobem według wynalazku dogodnie jest prowadzić za pomocą testu diagnostycznego według wynalazku.
Test diagnostyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, Ze zawiera przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze /Υ/θ^-^^/, w którym Y oznacza sekwencję aminokwasów kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Glu, Ser, Z oznacza sekwencję Glu, Ser i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, a = 0 lub 1, b = 0, 1 lub 2, natmiast A oznacza fragment Asn^2 - Thr2j2 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu, ewentualnie unieruchomione na stałym nośniku lub rozpuszczone w fazie ciekłej. Przeciwciała są związane z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie.
Test według wynalazku zawiera przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego, korzystnie otrzymanego przez ekspresję zrekombinowanego DNA.
Test według wynalazku zawiera przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego, korzystnie otrzymanego przez ekspresję zsyntetyzowanego chemicznie DNA o sekwencji:
(X)nAACGGCCAGTGGAAGACACCATTCCCAGACAGTAGCACCCACCGCCGCCTCTT
CCACAAATCAGACGGAAGCACTGTCTCTGTGCCAATGATGGCTGAGACCAACAAATT
CAACTATACTGAATTCACCACGCCAGATGGACATTACTACGACATCCTGGAACTGCC
ATACCACGGAGACACT(X)„,
Zrekombinowany wektor, do ekspresji fragmentu polipeptydowego służącego do wytworzenia zawartych w teście według wynalazku przeciwciał, otrzymuje się łącząc znanymi metodami wektor z fragmentem DNA kodującym polipeptyd o wzorze /Y/z-A-/ZZb, “ którym symbole mają wyżej podane znaczenie.
Korzystnie test według wynalazku zawiera przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi cząsteczki PAI-1 od 172 do 232 aminokwasu od N-końca o sekwencji:
172 1177 182
Asn-Gly-Gln-Trp-Lye-Thr-Pro-Phe-Pro-Aep-Ser-Ser-Thr-His-Arg187 192 197
Arg-Leu-Phe-His-Lys-Ser-Asp-Gly-Ser-Thr-Val-Ser-Val-Pro-Met202 207 212
Met-Al a-G l u-Thr-Asn-Lys-Phe-Asn-T yr-Thr—Glu-Phe-Thr-Thr-Pro217 222 227
Asp-Gly-His-Tyr-Tyr-Asp-Ile-Leu-Glu-Leu-Pro-Tyr-His-Gly-Asp232
Thr.
Test według wynalazku zawiera przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego zawierającego epitopy antygenowe rozpoznawane przez przeciwciała również w rodzimej cząsteczce PAI-1.
125
Do znakowania można stosować enzym, biotynę izotop promieniotwórczy J lub inne znane odczynniki. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się za pomocą sygnału wytwarzanego przez znacznik.
W tak prowadzonym procesie oznaczania lub wykrywania badaną próbkę, oznaczany antygen lub przeciwciało, unieruchamia się na stałym nośniku takim jak płytka plastikowa, bibuła nitrocelulozowa lub inne.
W sposobie i testach do oznaczania ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu można stosować przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze /Y/a-A-/Z/b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, wytworzone różnymi metodami.
6 165 020
Celem uproszczenia w opisie i przykładach uZywane są następujące skróty:
A: adenina Leu: leucyna
CC: cytozyna Lys: lizyna
G: guanina Met: metionina
T: tymina Phe: f cnyloalanina
Ala: alanina Pro: prolina
Arg: arginina Ssr: seryna
Asn: asparagina Thr·: treonina
Asp: kwas asparaginowy Ττρ: tryptofan
Cys: cysteina Tt^: tyrozyna
Gln: glutamina Val: walina
Glu: kwasi glattmicnoy DDN: kwas deoksyrybonuWleCnowy
Gly: glicyna cDNA: komplementarny DNA
His: histydyna Tris-HcL: chlorowodorek trdjhydroksymetylo-amCnometanu
Ile: izoleucyna EDTA: kwas etylenodwuaminoczterooctowy
10xbufor Eco R1 100mM Tris-HCL pH 7,5
1 M NaCL
10 mM B-merkaptoetanol
10xbufor do kknazowania 0,7 M Tris HCL pH 7,6
0,1 M MgCL2
50 mM d^i^re^al
10xbufor llgacyjny: 660 mM Tris-HCL pH 7,6
50 mM MgCL2
50 mM dCtCotpeitol
10 mM ATP
Bufor do ekstrakcji 50 mM Tris-HCL pH 8,0
300 mM octan sodu
PoZywka LB
Bufor TE
Bufor z SDS
Bufor do lizy komórek
Bufor R I
Bufor R II
0,2% SDS
4 mM EDTA
10 g Bacto Trypton
5 g Yeast Extract
5 g NaCL
na 1 litr roztworu
mM Tris^Ht^L pH 8,0 mM EDTA g Tris-HCL pH 8,0 g glicyny g SDS na 1 litr roztworu 150 mg Tris 400 mg SDS ml B-merkaptoetanol ml glicerolu 7 ml wody mM glukoza 10 mM EDTA mM Tris-HCL pH 8,0 4 mg/ml lizozymu /Pharmacia/ 0,2 M NaOH
1% SDS
165 020
Bufor R III 60 ml 5 M octan potasu
11, 5 ml kwas octowy lodowaty 28,5 ml H20
DTT: ditiotreitol
PMSF: fluorek kwasu fenylometylosulfonowego
SDS: siarczan dodecylu sodu
BSA: albumina surowicy wołu /Bovine Serum Albumin/
PBS: zbuforowany roztwór soli fizjologicznej
ATP: trdjfosforan adenozyny.
HPCL: wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa.
EDTA: etylenodiaminotetraoctan
Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia wykres hydrofobowości łańcucha polipeptydowego PAI-1. Fig. 2 przedstawia sekwencję fragmentu genu ludzkiego PAI-1 podzieloną na fragmenty syntetyzowane chemicznie. Fig. 3 przedstawia schemat konstrukcji fragmentu genu dla PAI-1 sklonowanego w wektorze rekombinacyjnym pUC-19 oraz ekspresyjnym pWR 450. Fig. 4 przedstawia elektroforezę w żelu poliakryloamidowym zawierającym SDS ekstraktów białkowych otrzymanych z komórek E.coli oraz oczyszczonego kompleksu białkowego PAI-1 z B-galaktozydazą: 1 - ciałka inkluzyjne rozpuszczone w zbuforowanym roztworze 6 molowego mocznika, 2 - oczyszczone białko hydrobowe B - galaktozydaza - fragment peptydowy PAI-1. Fig. 5 przedstawia schemat rozbicia kompleksu białkowego i oczyszczania fragmentu Asn172-Thr232 PAI-1· Przedstawione odcinki b-galaktozydazy przypadają na długość od 4 do 182 aminokwasów. Fragment PAI-1 po rozbiciu kompleksu składa się z 61 aminokwasów.
Wynalazek jest bliżej wyjaśniony w przykładach wykonania nie ograniczających jego zakresu.
Przykład I.
Etap 1.
A. Synteza oligonukleotydów.
Syntezę 10 oligonukleotydowych fragmentów /fig. 2/ przeprowadza się metodą amidofosforynową na stałym nośniku. Jako nośnik stosuje się szkło o kontrolowanej porowatości, typu LCA-CPG, ze związaną pierwszą Jednostką nukleozydową. Jednostka ta ma przyłączoną na końcu 5'-OH deoksyrybozy blokującą grupę kwasolabilną - dimetoksytrityl /DMT/, którą usuwa się w środowisku kwaśnym. Odsłonięta w ten sposób grupa 5'-OH jednostki nukleozydowej przyłącza prekursor kolejnej jednostki: 3'- amidofosforyn odpowiedniego nukleozydu. Za pomocą jodu w obecności wody dokonuje się utlenienia grupy fosforynowej do fosforanu. Następnie usuwa się DMT z przyłączonej jednostki - tym samym cykl rozpoczyna się na nowo. W celu usunięcia nieprzereagowanych jednostek z wolnymi grupami 5‘-OH stosuje się t.zw. capping, tj. zablokowanie pomyłkowych sekwencji przez acetylowania bezwodnikiem octowym w obecności aktywatorów. Po utworzeniu żądanego oligonukleotydu odcina się go od złoża i usuwa inne grupy wodnym roztworem amoniaku, oczyszcza elektroforetycznie następnie odsala metodą HPLC. /Waters C-18 RP, 10pm/. Oligonukleotydy przechowuje się w porcjach po ok. 0,5 OD.
B. Proces kinazowania i ligacji.
Poszczególne fragmenty nici DNA rozpuszcza się w wodzie destylowanej, tak aby w 5 pl znajdował się 1 pg fragmentu. Miesza się po 5 pl roztworu fragmentów od 1 do 5 /I nić DNA/ i od 5 do 10 /II nić DNA/. Do mieszaniny fragmentów dodaje się 0,1 objętości buforu do kinazowania /50 mM Tris-HCL, 5 pM MgCL2® 5 pl 20 mM ATP, 1 pl kinazy polinukleotydowej B /T4 polinukleotide kinase/. Reakcję prowadzi się przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Miesza się obie nici i inkubuje przez 20 minut w temperaturze 100°C. Po powolnym ostudzeniu dodaje się do każdej próbki po 0,1 objętości buforu do ligacji, po 1 pl 200 mM ATP, i pl ligazy T4. Po dokładnym wymieszaniu reakcję prowadzi się przez 12 godzin w temperaturze 4°C.
C. Hydroliza enzymami.
Do rozpussczooeeg ONA /88 pl/ dodaje się 10xi0pi buforr EcoRi, 2U restrrytaaz EccRI /firmy Pharmacia/ oraz wody do objętości 100pl. Mieszaninę ęnksbuee się w temperaturze 37°C przez 2 ggdziny. Po ttm czasie DNA sstąca ssę etanolem, dodając 3 objętości alkoholu etylowego /99,8%/, wymraża się w -20°C przez 5 minut, a następnie odwirowuje się przy 15 tys. obr., przez
165 020 minut. Osad rozpuszcza się w 20 μΐ buforu TE. W ten sam sposób postępuje się podczas hydrolizy restryktazą Pst I.
D. Rozdział elektroforetyczny.
W celu sprawdzenia czy zligowane fragmenty DNA mają odpowiednią długość, rozdziela się je w 8\ żelu poliakryloamidowym z SDS w TBE. Rozdział prowadzi się przy napięciu 130 V w ciągu 3 godzin. Żel. zzbarwia się bbrmkiem ettdyny /0,3 pg/ml - fiimy SSrra/ przez 20 minut w temperaturze pokojowej, następnie płucze się 0 x wodą destylowaną. Rozdzielone produkty obserwuje się pod lampą UV. W celu oceny wielkości fragmentów DNA podczas elektroforezy używa się następujących wzorców: pUC 19 trawiony Msp, pUC 19 trawiony Bsp RI. Zligowane fragmenty posiadają oczekiwaną długość. Po elektroforezie sprawdzającej wykonuje się elektroforezę preparatywną i uzyskuje się tą drogą fragment, który następnie liguje się z plaa-iyt- pUC 19 trawionym Eco ki i Pst I w sposób wyżej opisany.
E. Przygotowanie kompetentnych komórek.
Z płytki z wysianymi bakteriami DH5, pobiera się jedną kolonię, którą szczepi się na 5 ml pożywki LB. Bakterie hoduje się w etmreraturzt 37°C przez 18 godzin. Do 100 ml pożywki LB dodaje się 0 ml otrzymanej hodowli i prowadzi się hodowlę do gęstości optycznej OD 600=0,3. Zawiesinę bakterii zwirowoje się /5 tys. obr. 00-in./, a osad bakteryjny schładza się i zawiesza w 50 ml buforu SB i umieszcza w temperaturze 0°C. Zwirowuje się jak wyżej, a osad zawiesza w 1/10 objętości wyjściowej buforem SB. Inkubuje się 00 minut w temperaturze o°C. Po tym czasie z zawieszonych komórek pobiera się do sterylnych probówek po 000 gl zawiesiny komórek i inkubuje 30 minut w 0°C. Dodaje się 7 gl DTT i plazmidy /00 gl/. Inkubuje się w lodzie /o°C/ 30 minut, a następnie 45 sekund w 45°C. Ochładza się w lodzie i dodaje 800 gl pożywki LB a następnie inkubuje 1 godzinę w 37°C. Po tym czasie posiewa się na płytki. Wylewa się 000 gl mieszaniny ligacyjnej na płytkę i inkubuje się w 37°C przez 18 godz.
F. Analiza otrzymanych transformatorów.
Po 18 godzinach na płytce z wysianą mieszaniną transformacyjną obserwuje się pojedyńcze kolonie. Do dalszej analizy wybiera się 10 kolonii. 5 ml pożywki szczepi się pojedynczymi koloniami i hoduje w 37°C przez 18 godzin, a następnie izoluje plazmidowy ONA. Preparaktyka plazmi dowego DNA z 5 ml pożywki przebiega w następujący sposób:
Bakterie zwirowuje się /5 minut 5 obr./^n./. Osad bakteryjny zawiesza się w 000 gl buforu RI i przetrzymuje 5 minut w temperaturze 0°C. Dodaje się 400 gl RII /0°C/, a następnie 300 gl RIII /0°C/. Całość zwirowuje się /15 tys. obr./min., 5 minut/. Supernatant przenosi się znad osadu do nowej probówki i dodaje się 0,5 objętości izopropanolu. Wymraża się w -00°C, zwirowuje, osad płucze 70% etanolem i suszy pod próżnią. Osad rozpuszcza się w 000 gl TE i dodaje 00 gl roztworu RNazy o stężeniu 1 mg/ml. Inkubuje się 30 minut w 37°C. Dodaje się 000 gl fenolu. Zbiera się fazę wodną i dodaje 000 gl mieszaniny chloroform/alkohol izo amylowy /04:1, a/a/. Zwirowuje się, zbiera supernatant, czynności powtarza się jeszcze raz. Do fazy wodnej dodaje się 0,1 objętości 3 M objętości 3 M octanu sosu /pH=5.0/ oraz 0,5 objętości etanolu i wymraża 30 minut w -00°C. Zwirowuje się /15 tys. obr./min/, a osad przemywa 70% etanolem i suszy. Osad plazmidowego ONA rozpuszcza się w 40 gl buforu TE.
W celu wybrania klonu zawierającego plazmid pUC 19 z wklonowanym dwuniciowym fragmentem, przeprowadza się analizę otrzymanych ONA plazmidowych przy użyciu enzymów restrykcyjnych EcoRI i Pss I, a ppodduky ttawiieii rozayaetl ssi w ζθΙι prdlekryloamidowym. Τ^κΙ^ιι pp^epowadza się Jak w punkcie C, a rozdział tlektaoforetycany jak w D.
C. Sprawdzenie sekwencji sklonowanych fragmentów.
W celu upewnienia się czy sekwencja sklonowanego fragmentu Jest prawidłowa, fragmenty sekwencjonuje się metodą Maxama i Gilberta /Maxam & Gilbert, Methods in Enzymo^gy, 1980, 65 /.
H. Konstrukcja wektora ekspresyjnego.
Sprawdzony ywunicidwy fragment DNA kodujący rdllptpeyy Asnl72-Thr2l2» liguje się z wektorem ekspresyjnym pWR.450 trawionym enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Pst.I. Uzyskuje się aaekdmbinowany plazmid ekspresyjny pW-PAI-1. Transformowanie komórek bakteryjnych prowadzi się Jak w punkcie E.
165 020
I. Oczyszczanie ciałek inkuzyjnych.
Bakterie z kolonii bakteryjnej zawierającej zrekombinowany plazmid przenosi się do probówki zawierającej 1 ml pożywki LB ° 5 pl ampicyliny o stężeniu 100 pg/ml i inkubuje przez 2 - 5 godzin w temperaturze 07°C z ciągłym wytrząsaniem. Zawiesinę bakterii namnożonych w tej probówce przenosi się do kolby zawierającej 1 l pożywki LB ° 1 ml ampicyliny o stężeniu 100 pg/ml. Hodowlę prowadzi się 14 godzin, w temperaturze 57°C z ciągłym wytrząsaniem. Następnie bakterie zwirowuje się /15 min., 5000 obr./min./ i osad zawiesza się w 200 ml 0,1 N CaC^ /buforowanym Trisem, pH=7,5/. Po inkubacji przez 2 0 minut w łaźni lodowej, zawiesŁnę wiruje się przez 20 minut przy 12000 obr./min. w temeeraturze +4°C i osad ponownie zawiesza się w 220 ml 0,1 M
CaCl£. Po kolejnej inkubacji pnee 2 ęgodiny w jaźni loodoee zzwieesnę wiruje ssę /w dwóch probówkach elrowylzzych/ j.w. Osad o awieszz się w 02 ol j/o oob .probówe MoooW^ ssi ęo 20 ml/ buforu fosforanowego, pH 6.2, a następnie dodaje się po 200 pl 1 N glicerolu i 400 pl 1% glicerolu do obu probówek. Ogrzewa się je do temperatury pokojowej, dodaje pp 44 pl o,, M EDTA, pH B.0 i po krótkiej inkubacji, schładza w łaźni lodowej do temperatury około 0°C. Następnie próbówki wstawia się na 1 minutę do łaźni o temperaturze 42°C /szok tarmeczyy/. Wiruje jak wyżej. Osad po schłodzeniu zawiesza się w 100 ml 100 mN Tris-HCl, pH B.0, zzwinarWjąym 10 mN EDTA, lykzbuje przez 5 minut w temperaturze 0°C i odwirowuje. Osad zawiesza się w 55 mm H0 oM TrtesHCI, 10 eP EDTA, 100 pM B-ME, 1 pM PMS,, 1% Triton Χ-100 , ęB 8.0. Poddaj® się go działaniu ultradźwięków - 10 razy pp 50 sse.. pp czzm odwioewuje jeę i20 200 00r./min., 0emp. o 4 °C/ otrzymując w ten sposób osad ciałek inkluzyjnych, które następnie przemywa się zawieszając je w ml buforu 5 0 mM Τ^β-ΗΙ,Ο , pH 7.4, 1 mM PMS, , 0 i-M EOAA, oo ponownym ich żwirowaniu r^o^pu szcza się je w 9 N moczniku. W celu pozbycia się reszty zanieczyszczeń /neatoiruszczonych ciałek ^^uzyjnych/ zawiesinę ponownie wiruje się /20 000 obr,/een, 00 min, temp. ° 4°C/. W supernatwnzle winna znajdować się główna część białka. Dalsze oczyszczania białka hybrydowego zawierającego fragment Asn172-Dhr202 PAI-1 przeprowadza się na kolumnie EEAE-Marhwcel.
Białka zawarte w ciałkach ^^uzyjnych rozpuszczone w 9 N moczniku dializuje się do roztworu 6 P mocznika, 50 mN Drii-HCl, pH 7.5, zawierającego 10 eP EDTA, 1 mP PNSS. Tye samym buforem równoważy się dwie kolumny wypełnione złożem DETE-MephαceO /o wymiarach 2,5 x 10 cm/. Na jedną z nich nanosi się roztwór białek. Część białka, która po przejściu przez kolumnę nie zwiąże się ze złożem, nanosi się /po 2-3 krotnym rozcieńczeniu tym samym buforem/ na drugą kolumnę. Czysty koniugat wymywa się ze złoża 0,1 P NaCl.
J. Rozbicie kompleksu na drodze reakcji chemicznej.
Oczyszczone białko hybrydowe złożone z fragmentu B-gaOakrozmOwiy oraz fragmentu Asy172-Dhr202
PAI-1 dializuje się wobec buforu 10 eP Trei-HC0, pH 7.5 w celu usunięcia mocznika, a następnie liofilizuje. Rozszczepienie wiązania Ain-G0m przeprowadza się stosując 2P hydroksyloaminę w 6N chlorowodorku guanidyny, pH 9.0. Reakcję prowadzi się w temperaturze 45°C. Rozbicie koniugatu sprawdzana alekrroUoretycznie.
Produkty powstałe w wyniku tej reakcji analizuje się w żelu poOiakryOoaMiOoeym po elektroforezie.
K. Sposób wyodrębniania fragmentu Asn^-Thr232 /PAI-1/ ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora pOazeenogeyz za pomocą HPLC.
Fragment po01pertyOowy odpowiadający fragmentowi Asnw^2-Dht232 /PAI-1/ ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plαiminoganu izoluje się z hydrolizatu otrzymanego w sposób jak opisano w punkcie I za pomocą HPLC. Rozdział chromatograficzny przeprowadzono na kolumnie semlptarαrαtywyeJ TSK G0000SW firey LKB, Szwecja.
Etap 2.
A. Otrzymanie przeciwciał przy wykorzystaniu wytworzonego fragmentu polirartmOowego.
W celu otrzymania surowicy poligonalnej dla fragmentu białka ludzkiego PAI-1 iemunizuje się tym, białkiem króliki. Śródskórnie podaje się na drodze 00 - 40 iyjakcji dawki 50 pg antygenu w 0.5 ml PBS i wymieszanego z 0.5 el kompletnego a01ueaytu Freuda. Po 7 dniach od każdego szczepienia pobiera się krew z żyły usznej królików. Po wyk^epieniu w temperaturze 07°C przez 0.5 - 1.0 godziny, skrzep oddziela się od ścianek probówki i całość pozostawia w temperaturze 4°C na 12 - 24 godziny. Następnie surowicę odciąga się do jałowych probówek wirówkowych i wiruje przy 0 000 obr/min przez 20 minut. Surowicę iyαkrmwzje się podczas inkubacji
165 020 przez 30 minut w temperaturze 56°C. Miano poszczególnych próbek surowic określa się metodę radiolmmunologiczną, oznaczając ich zdolność do wiązania znakowanego antygenu. Surowice o najwyższym mianie przeciwciał przechowuje się w temperaturze -20°C.
B. Oczyszczanie przeciwciał.
Przeciwciała dla fragmentu PAI-1 oczyszcza się z surowicy odpornościowej za pomocą chromatografii powinowactwa. ImmunoadsorDent zawiera fragment białka PAI-1 związany ze zło2em CNBr-Sepharose 4B /Pharmacia/. W celu przygotowania immunoadsorbentu 1 g złoża przemywa się 200 ml roztworu 0.001 mol/l HCl i następnie zawiesza w buforze boranowym /pH 8.3/. Natychmiast dodaje się 20 mg fragmentu białka PAI-1 rozpuszczonego w PBS i delikatnie miesza w temperaturze 4°C przez 2 godz. Po odwirowaniu sprawdza się stężenie białka w supernatancie. Złoże zawiesza się następnie w roztworze glicyny /2 mol/l/ w buforze boranowym o pH 8.3. Po 1-godzinnej inkubacji odwirowuje się je /10 min. 4 000 obr/min/ i przemywa się je 3x buforem boranowym /pH 8.3/, 1x wodą destylowaną, 3x buforem boranowym /pH 8.3/. Z otrzymanym w ten sposób złożem inkubuje się 15 ml surowicy otrzymanej po immunizacji fragmentem białka PAI-1, delikatnie mieszając przez 12 - 14 godzin w temperaturze 4°C. Do mieszaniny dodaje się 1 mM PMSF /Sigma/ oraz 1 mM chlorku benzamidyny /Biochemical/. Po odwirowaniu /10 min., 3 000 obr/min / złoże przemywa się buforem /PBS z 1% Tween 20/, a następnie 4x buforem /1 M/1 NaCl z 1% tween 20 w PBS/. Po każdym wirowaniu sprawdza się zawartość białek w supernantancie poprzez pomiar adsorpcji światła przy 400 nm. Następnie złoże umieszcza się w kolumnie /0,7 x 10 cm/. Przeciwciała specyficznie związane z unieruchomionym na złożu białkiem eluuje się roztworem 0,5 mol/l kwasu octowego i zbiera się do probówek zawierających 100 pl roztworu 2 mol/l Tris Frakcje o dużej zawartości białka łączy się i dializuje wobec PBS rzeez 44 godziny w 4°C.
C. Sprzęganie przeciwciał z peroksydazą.
Użyskane w ten sposób przeciwciała dla fragmentu białka PAI-1 sprzęga się z peroksydazą. W tym celu rozpuszcza się 5 mg HRPO w 1m1 świeżo przygotowanego 0.3 M kwaśnego węglanu sodu /NaHCOj/, pH 8.1. Następnie dodaje się 0.1 ml 1% FDNB w alkoholu absolutnym. Delikatnie wytrząsa się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dodaje 0.0 4 - 0.0Β M NaJO4 /rozpuszcza w wodzie destyl./, delikatnie miesza przez 30 min. w temperaturze pokojowej. Kolor tego roztworu wwiiie stać się zielonożółty. Następnie dodaje się 1.0 ml 0.16 M glikolu etylenowego /rozp. w wwozzi dest./ i delikatnie miesza w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po zakończeniu inkubacji roztwór dializuje się wobec 0.01 M węglanu sodu, pH 9.5, temperatura 4°C /co najmniej 3 1-litrowe zmiany/. Do 3 ml roztworu tak przygotowanego aldehydu peroksydazy /HRPO/ dodaje się 5 mg IgG i delikatnie miesza przez 2-3 godzin w temperaturze pokojowej. IgG rozpuszcza się w 1 ml buforu węglanowego przed zmieszaniem lub dodaje w postaci zllofllizdwanegd proszku wolnego od soli. Po dodaniu IgG wprowadza się 5 mg NaBH4 i pozostawia w 4°C od 3 do 12 godzin. Następnie roztwór dializuje się w 4°C wobec PBS. Jeśli powstaje precypitat, usuwa się go przez wirowanie. Próbkę nanosi się na kolumnę /85 x 1.5 cm/, Sephadex G-100, zrównoważoną PBS. Zbiera się frakcje po 1.5 ml i poziom białka w poszczególnych frakcjach oznacza spektrofotometrycznie. Frakcja IgG znakowanych HRPO schodzi w pierwszym szczycie. Roztwory tego koniugatu przechowuje się w obecności albuminy surowicy wołowej o stężeniu 10 mg/ml w temperaturze -20°C. Etap 3.
Opłaszczanie płytki przeciwciałami i wykonanie testu ELISA.
Studzienki w płytce do testu ELISA opłaszcza się przeciwciałami poliklonalnymi dla fragmentu polipeptydowego Asn^2-Thr232 białka PAI-1 o stężeniu 10 pg/ml, zawieszonymi w 50 mM buforze fosforanowym o pH 7.5. Niezwiązane białko odmywa się, a powierzchnię studzienek opłaszcza albuminą. Testowane próbki osocza rozcieńcza się przed oznaczeniem 50 mM buforem fosforanowym, pH 7.5, zawierającym 0.15 M NACl, 10 mM EDTA, 1% Tween 20 i 1% BSA i dodaje się po 200 pl/dołek. Inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji płytki 5-krotnie przemywa się 0.15 M NaCl zawierającym 0.1% Tween 20. Następnie dodaje
165 020
200 pl koniugatu IgG-HRP / przeciwciała poliklonalne dla całej cząsteczki PAI-1 związane z peroksydazą/ o stężeniu 5 pg/ml. Inkubuje 2 godziny w temperaturze pokojowej i ponownie 5-krotnie przemywa. W celu wywołania reakcji enzymatycznej dodaje 9ię po 200 pl roztworu substratu /0.4 mg/ml ortofenylodiaminy w 0.05 M buforze cytrynianowym, pH 5.0, zawierającym 0.02% H^Oj/. Po 15 minutach inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję hamuje się przez dodanie 50 pl 3 M kwasu siarkowego. Adsorbancję mierzy się przy 490 nm.
Przykład II. Detekcja antygenu PAI-1 w badanej próbce za pomocą przeciwciał dla fragmentu polipeptydowego odpowiadającego fragmentowi Asnj72-Thr 02 dokie^on inhiborooa tkankowego aktywatora plazminogenu.
Do unieruchomionego antygenu dodaje się wyznakowane peroksydazą przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego odpowiadającego fragmentowi ASn172-THr2j2 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu i inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Do wywołania reakcji enzymatycznej stosuje się roztwór substratu - 0.4. mg/ml ortofenylodiaminy w 0.05 M buforze cytrynianowym, pH 5.0, zawierającym 0.02% H2O2/. Po 6 minutach inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję hamuje się przez dodanie 50 pl 3 M kwasu siarkowego. Adsorbancję mierzy się przy 490 nm. Wynik odczytuje się z krzywej wzorcowej dla standartowego roztworu PAI-1.
Przykład III. Diagnostyczny zestaw testowy dla oznaczania poziomu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu składa się z: pojemnika zawierającego zbuforowany roztwór soli fizjologicznej /PBS/, pH 7.5, EDTA, Tween 20; pojemniczka z albuminą surowiczą; pojemniczka z przeciwciałami dla fragmentu polipeptydowego odpowiadającego fragmentowi Asn172Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu; pojemniczka z wyznakowanymi peroksydazą przeciwciałami dla PAI-1; pojemniczka z substratem /ortofenylodiaminą/; pojemniczka z buforem cytrynianowym, pH 5.0 i pojemniczka z 3 M kwasem siarkowym.
165 020
GAATCTAACGGCCAGTGGAAGACACCATTCCCAGACAGTAGCACCCACCGCCGCCTCTTCCA
GATTGCCGGTCACCTTCTCTGGTAACGGTCTGTCATCGTGGCTGGCGGCGGAGAAGOT
CAAATCAGACGGAAGCACTGTCTCTGTGCCAATGATGGCTGAGACCAACAA ATTCAACTATA
GTTTAGTCTGCCTTCGTGACAGAGACACGGTTACTACCGACTGTGGTTGTTTAAGTTGATAT
CTGAATTCACCACGCCAGATGGACATTACTACGACATCCTGGAACTGCCATACCACGGAGAC
GACTTAAGTGGTGCGGTCT ACCTGTA ATGATGCTGTAGGACCTTGACGGTATGGTGCCTCTG
ACT
TGAATCT
3‘
5’
1.CGGTCACCTTCTGTGGTAAGGGTCTGTC
ATCGTGGGTGGCGGCGGACAAGGTGTTlAGTCTGCCTTCG dolna nić
3.TGACAGAGACACGGTTACTACCGACTCTGCTTG
TTTAAGTTGATATGACTTAAGTGGTGCGGTCTAC.CTGTAA
5. TGATGCTGTAGGACCTTGACGGTATGGTGCCTCTGTGAATCT
«.TCACAGAGGCACCAΓACCGTCAAGGTCCTACAGCATCATTAC
7.AGGTAGACCGCACCACTTAAGTCATATCAACT
0.TAAACAACCAGAGTCGGTAGTAACCGTGTCTCTGTCACGA górna nić
9. AGGCAGACTAAACACCTTCTCCGCCGCCACCCAC
10. GATGACAGACCCTTACCACAGAAGGTGACCGGCAATCTAAG.
Fig. 2
165 020
Eco RI Pst I
Fig. 3
165 020
Fig.4
165 020
BETA - GALAKTOZYDAZA : BIAŁKO ΡΛ1
produkty degradacji beta-galaktozydazy białko PAI
oczyszczenie produktów hydrolizy
Fig.5
165 020
Δ
Fig.l
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims (7)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu w próbce zawierającej ten antygen, z zastosowaniem przeciwciał i odczynnika dającego się oznaczyć analitycznie, znamienny tym, że badaną próbkę kontaktuje się z przeciwciałami dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze /Y/a-A-/Z//b> w którym Y oznacza sekwencję aminokwasów kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Glu, Ser, Z oznacza sekwencję Glu, Ser i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, a = 0 lub 1, b = 0, 1 lub 2, natomiast A oznacza fragment Asn^? - Thrj^ ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu, po czym oznacza się wytworzony kompleks antygen-przeciwciało.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego, otrzymanego przez ekspresję zrekombinowanego DNA.
  3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego otrzymanego przez ekspresję zsyntetyzowanego chemicznie DNA o sekwencji.
    (X)„AACGGCCAGTGGAAGACACCATTCCCAGACAGTAGCACCCACCGCCGCCTCTT CCACAAATCAGACGGAAGCACTGTCTCTGTGCCAATGATGGCTGAGACCAACAAATT CAACTATACTGAATTCACCACGCCAGATGGACATTACTACGACATCCTGGAACTGCC
    ATACCACGGAGACACT(X)„,
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego o sekwencji aminokwasów:
    Asn-Gly-Gln-Trp-Lys-Thr—Pro-Phe-Pro-Aap-Sei—Se» Thr-His-ArgArg-Leu-Phe-His-Lye-Ser-Asp-Gly-Sei—Thr—Val-Ser-Val-Pro-MetNet-Ala-Glu-Thr-Asn-Lys-Phe-Asn-Tyr-Thr-Glu-Phe-Thr-Thr-ProAsp-Gly-Hls-Tyι—Tyr—Asp-Ile-Leu-Glu-Leu-Pro-Tyr His-Gly-AspThr.
  5. 5. Test diagnostyczny do oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu, z zastosowaniem przeciwciał i odczynnika dającego się oznaczyć analitycznie, znamienny tym, że zawiera przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze /Y/a-A-/Z/b, w którym Y oznacza sekwencję aminokwasów kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Glu, Ser, Z oznacza sekwencję Glu, Ser i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, a = 0 lub 1, b = 0, 1 lub 2, natomiast A oznacza fragment Asn172 - Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu, ewentualnie unieruchomione na stałym nośniku lub rozpuszczone w fazie ciekłej, przy czym przeciwciała są związane z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie.
  6. 6. Test według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego, otrzymanego przez ekspresję zrekombinowanego DNA.
  7. 7. Test według zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego otrzymanego przez ekspresję zsyntetyzowanego chemicznie DNA o sekwencji:
    (X)„AACGGCCAGTGGAAGACACCATTCCCAGACAGTAGCACCCACCGCCGCCTCTT
    CCACAAATCAGACGGAAGCACTGTCTCTGTGCCAATGATGGCTGAGACCAACAAATT
    CAACTATACTGAATTCACCACGCCAGATGGACATTACTACGACATCCTGGAACTGCC ATACCACGGAGACACT (X )m,
    B. Test według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego o sekwencji:
    165 020
    A»n-Gly-Gln-Trp-Lys-Thr-Pro~Phe-Pro-Asp-Ser-Ser-Thr-His-ArgArg-Leu-PhB-His-Lys-Ser-Aep-Gly-Sei—Thr-Va l -Ser—Val-Pro-MetMet-Ala-Glu-Thr-Asn-LyR-Phe-Asn-Tyr-Thr-Glu-Phe-Thr-Thł—ProAep-Gly-His-Tyr-Tyf—Asp-Ile-Leu-Glu-Leu-Pro-Tyr-His-Gly-AepThr.
    * * *
PL30054690A 1990-04-25 1990-04-25 Sposób oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu i test diagnostyczny do oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu PL PL165020B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL30054690A PL165020B1 (pl) 1990-04-25 1990-04-25 Sposób oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu i test diagnostyczny do oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu PL

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL30054690A PL165020B1 (pl) 1990-04-25 1990-04-25 Sposób oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu i test diagnostyczny do oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu PL

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL165020B1 true PL165020B1 (pl) 1994-10-31

Family

ID=20060941

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL30054690A PL165020B1 (pl) 1990-04-25 1990-04-25 Sposób oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu i test diagnostyczny do oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu PL

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL165020B1 (pl)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101067817B1 (ko) Ａｉｍｐ1 폴리펩티드에 대한 항체를 포함하는 관절염 진단용 조성물
Rittenhouse et al. Peptide mapping by polyacrylamide gel electrophoresis after cleavage at aspartyl-prolyl peptide bonds in sodium dodecyl sulfate-containing buffers
Burlingame et al. Subnucleosome structures as substrates in enzyme-linked immunosorbent assays
Schröder et al. Purification of brain tubulin-tyrosine ligase by biochemical and immunological methods.
ES2240979T3 (es) Enzima para la escision de la region de anclaje de las proteinas superficiales de bacterias gram positivas.
Bulinski et al. Peptide antibody specific for the amino terminus of skeletal muscle alpha-actin.
BENGTSSON‐OLIVECRONA et al. Lipoprotein lipases from cow, guinea‐pig and man: Structural characterization and identification of protease‐sensitive internal regions
Costa-Rodrigues et al. Pex5p, the peroxisomal cycling receptor, is a monomeric non-globular protein
US5445820A (en) Streptolysin O peptide antigens and methods for the determination of streptolysin antibodies
US5457029A (en) Nuclear antigen La
Donahue et al. Three-dimensional structure of the platelet integrin recognition segment of the fibrinogen gamma chain obtained by carrier protein-driven crystallization.
JPH07191024A (ja) イムノアッセイ用合成スタンダード
Schulze et al. Structural and cell-adhesive properties of three recombinant fragments derived from perlecan domain II
Dardik et al. The structure of endothelial cell thrombospondin: Characterization of the heparin‐binding domains
US5789382A (en) Retro-peptide fibroblast growth factor which blocks FGF receptor
Gibson et al. Structural differences in the catalytic subunits of form I and form II ribulose 1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase from Rhodopseudomonas sphaeroides
Pozzi et al. Chemical synthesis and characterization of wild‐type and biotinylated N‐terminal domain 1–64 of β2‐glycoprotein I
PT98589A (pt) Processo de preparacao de um peptido derivado da alfa1-microglobulina humana e de anticorpos de determinacao da alfa1-microbulina humana num liquido e de producao de fita de teste
PL165020B1 (pl) Sposób oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu i test diagnostyczny do oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu PL
Holland et al. Deriving the generic structure of the fibronectin type II domain from the prothrombin Kringle 1 crystal structure.
ES2316911T3 (es) Anticuerpos dirigidos contra el gragmento f1+2 de la protrombina, su preparacion y uso.
PL164992B1 (pl) Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza bakteryjnego do wytworzenia polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwcial reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego inhibitora tkankowegoaktywatora plazminogenu PL
PL164952B1 (pl) Sposób oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego Inhibitora tkankowego aktywatora plazmlnogenu i test diagnostyczny do oznaczania l/lub wykrywania antygenu ludzkiego Inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu PL
PL165793B1 (pl) Sposób wytwarzania polipeptydu, zdolnego do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu
PL164991B1 (pl) Sposób wytwarzania przeciwcial poliklonalnych reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego Inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu PL