PL164992B1 - Method of constructing a recombinet vector for cloning and/or expressing in bacterial host cells the production of polypeptide capable to generate antibodies specifically reacting with protein of the human tisue inhibitor of plasminogen activator - Google Patents
Method of constructing a recombinet vector for cloning and/or expressing in bacterial host cells the production of polypeptide capable to generate antibodies specifically reacting with protein of the human tisue inhibitor of plasminogen activatorInfo
- Publication number
- PL164992B1 PL164992B1 PL30054590A PL30054590A PL164992B1 PL 164992 B1 PL164992 B1 PL 164992B1 PL 30054590 A PL30054590 A PL 30054590A PL 30054590 A PL30054590 A PL 30054590A PL 164992 B1 PL164992 B1 PL 164992B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- fragment
- antibodies
- polypeptide
- plasminogen activator
- protein
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 31
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 31
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 25
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title description 7
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 title description 5
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 title description 5
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 title description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 72
- 239000002797 plasminogen activator inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 51
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 claims abstract description 23
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 5
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 102000010752 Plasminogen Inactivators Human genes 0.000 description 40
- 108010077971 Plasminogen Inactivators Proteins 0.000 description 40
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 11
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 108010022233 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Proteins 0.000 description 7
- 102100039418 Plasminogen activator inhibitor 1 Human genes 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000609255 Homo sapiens Plasminogen activator inhibitor 1 Proteins 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 4
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 102000043283 human SERPINE1 Human genes 0.000 description 4
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 4
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 3
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 2
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 2
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- -1 isopropoxyacetyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LOTKRQAVGJMPNV-UHFFFAOYSA-N 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(F)C([N+]([O-])=O)=C1 LOTKRQAVGJMPNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MXVMRHIWTSFDPU-UHFFFAOYSA-N 2-chlorobenzenecarboximidamide Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1Cl MXVMRHIWTSFDPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101000610236 Nostoc sp. (strain PCC 7120 / SAG 25.82 / UTEX 2576) Protein PatA Proteins 0.000 description 1
- 102100037882 Perilipin-5 Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- DEQXHPXOGUSHDX-UHFFFAOYSA-N methylaminomethanetriol;hydrochloride Chemical compound Cl.CNC(O)(O)O DEQXHPXOGUSHDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010309 neoplastic transformation Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical group OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza bakteryjnego do wytworzenia polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu (PAI-l).i tym polipeptydem; i/lub reagującego specyficznie z przeciwciałami dla tego inhibitora oraz z przeciwciałami dla tego polipeptydu. Aktywatory plazminogenu (PAI-1) pełnią ważną rolę podczas procesu fibrynolizy, a także w różnych innych procesach fizjologicznych, włączając proces regeneracji, owulacji, implantacji' embionu, różnicowania tkanek, transformacji nowotworowej. Precyzyjna regulacja aktywności aktywatorów plazminogenu stanowi krytyczny element wielu biologicznych systemów. Taka regulacja może odbywać się na poziomie tworzenia i rozpuszczania skrzepu lub na poziomie interakcji aktywatorów plazminogenu z komórkami czy też przez działanie specyficznych inhibitorów.The invention relates to a method of constructing a recombinant cloning vector and / or expression in bacterial host cells to produce a polypeptide capable of producing antibodies specifically reactive with a human tissue plasminogen activator inhibitor (PAI-1) protein and the polypeptide; and / or reacts specifically with antibodies to that inhibitor and with antibodies to that polypeptide. Plasminogen activators (PAI-1) play an important role during the fibrinolysis process, as well as in various other physiological processes, including the process of regeneration, ovulation, embionation, tissue differentiation, and neoplastic transformation. The precise regulation of plasminogen activator activity is a critical component of many biological systems. Such regulation may take place at the level of clot formation and dissolution, or by the interaction of plasminogen activators with cells, or by the action of specific inhibitors.
Większość oznaczeń aktywności tkankowego aktywatora plazminogenu jest dwuetapowa, zależy od obecności plazminy i nie odróżnia odmiennych rodzajów inhibitorów. Określenie inhibitorowej aktywności PAI mierzy się ilościowo przez zdolność do hamowania lizy włóknika znakowanego 125J, pośredniczonej aktywacją plazminogenu przez urokinazę (Loskutoff and Edington, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 3903-3909, 1977). W tej metodzie jedną jednostkę aktywności PAI określa się jako ilość białka wymaganą do zredukowania aktywności 2IU UK do 50%. W celu oznaczenia ilości PAI używa się metody wiązania aktywatora plazminogenu do inhibitora (Schleef R. R., Wagner N. V., Loskutoff D. J., J. of CellularPhysiology, 134,269-274, 1989). Aktywność PAI można oznaczyć również posługując się metodą Verheijena, w której używa się wzrastających stężeń tPA (0-25 IU/ml), 1 μΜ plazminogenu oraz 1 μΜ fibrynogenu degradowanego bromocyjanem. W tych warunkach 1IU PAI-1 określa ilość inhibitora, która hamuje 1IU tPA (Verheijen J. H., Mullast D., Chang G. T. G., Kluft C., Wijngards G., Thromb. Haemostasis, 48,26(^^-^(36^, 1982). W niektórych badaniach określających poziom PAI we krwi stosuje się oznaczenia, w których podstawą jest neutralizacja tPA dodanego do próbek osocza, a mierzy się pozostałą aktywność tPA. Metody te są metodami pośrednimi i nie pozwalają precyzyjnie określić poziomu tego inhibitora.Most assays of tissue plasminogen activator activity are two-step, dependent on the presence of plasmin and do not distinguish between different types of inhibitors. Determination of the inhibitory activity of PAI is quantified by the ability to inhibit the lysis of 125 J-labeled fibrin mediated by urokinase activation of plasminogen (Loskutoff and Edington, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 3903-3909, 1977). In this method, one unit of PAI activity is defined as the amount of protein required to reduce the 2IU UK activity to 50%. To quantify the amount of PAI, the method of binding the plasminogen activator to the inhibitor is used (Schleef RR, Wagner NV, Loskutoff DJ, J. of Cellular Physiology, 134, 269-274, 1989). PAI activity can also be determined using the Verheijen method, in which increasing concentrations of tPA (0-25 IU / ml), 1 μΜ of plasminogen and 1 μΜ of fibrinogen degraded by cyanogen bromide are used. Under these conditions, 1IU PAI-1 determines the amount of inhibitor that inhibits 1IU tPA (Verheijen JH, Mullast D., Chang GTG, Kluft C., Wijngards G., Thromb. Haemostasis, 48.26 (^^ - ^ (36 ^, 1982) Some studies of blood PAI use assays that neutralize tPA added to plasma samples and measure residual tPA activity, which are indirect methods and do not accurately determine the level of this inhibitor.
Ostatnio opracowano metodę enzymoimmunologicznego oznaczania ludzkiego PAI-1 w teście ELISA z wykorzystaniem przeciwciał dla tego białka. Test ten polega na tym, że inkubuje się przeciwciała dla PAI-1 z badaną próbką, w której oznacza się ten antygen i po odmyciu nieswoiście związanych białek, inkubuje się kompleks antygen-przeciwciało z przeciwciałami dla PAI-1 związanymi z peroksydazą chrzanową, po czym oznacza się antygen wykrywając znacznik.Recently, an enzyme-immunological ELISA assay for human PAI-1 has been developed using antibodies to this protein. In this test, the antibodies to PAI-1 are incubated with the test sample in which this antigen is determined, and after washing the non-specific bound proteins, the antigen-antibody complex is incubated with the antibodies to PAI-1 bound to horseradish peroxidase, and then the antigen is determined by detecting the label.
Wszystkie te metody wymagają zastosowania rodzimego białka PAI-1, zarówno do uzyskania krzywej wzorcowej, jak i swoistych przeciwciał. PAI-1 występuje w ilościach śladowych w płynach ustrojowych i komórkach, a uzyskanie tego białka metodami klasycznymi przez wyodrębnienie w ilościach wystarczających do przygotowania testu Elisa jest niezwykle skomplikowane i czasochłonne. Z drugiej strony otrzymywane dotychczas ludzkie białko PAI-1 jest niezwykle drogie i niezbyt dostępne.All these methods require the use of the native PAI-1 protein, both for the standard curve and for specific antibodies. PAI-1 is present in trace amounts in body fluids and cells, and obtaining this protein by classical methods by isolating it in amounts sufficient to prepare the Elisa test is extremely complicated and time-consuming. On the other hand, the human PAI-1 protein obtained so far is extremely expensive and not very accessible.
W szystkie omówione metody otrzymania rodzimego PAI-1 są niezwykle skomplikowane, pracochłonne i kosztowne, co zawyża w znacznym stopniu koszty całego testu.All of the discussed methods of obtaining native PAI-1 are extremely complicated, time-consuming and expensive, which significantly increases the cost of the entire test.
Nieoczekiwanie okazało się, że możliwe jest oznaczanie białka rodzimego PAI-1 metodą, w której stosuje się fragment peptydowy otrzymany przy pomocy zrekombinowanego wektora skonstruowanego sposobem według wynalazku. Stwierdzono, że można wykorzystać pełną reakcję krzyżową w teście immunologicznym przeciwciał otrzymanych dla fragmentu białka oraz rodzimej cząsteczki PAI-1.Surprisingly, it turned out that it is possible to determine the native PAI-1 protein by a method that uses a peptide fragment obtained with a recombinant vector constructed according to the invention. It has been found that a complete cross-reactivity can be used in the immunoassay of the antibodies obtained for the protein fragment and the native PAI-1 molecule.
W odróżnieniu od znanych metod oznaczania PAI-1, wytworzony przy pomocy zrekombinowanego wektora skonstruowanego sposobem według wynalazku, fragment peptydowy, a nie całe białko służy do produkcji swoistych przeciwciał rozpoznających w ten sposób zarówno fragment peptydowy, jak i rodzime białko PAI-1. Fragment ten również stosuje się do uzyskania krzywej wzorcowej.In contrast to the known methods of PAI-1 determination, the peptide fragment produced with the use of a recombinant vector constructed according to the invention, and not the whole protein, serves to produce specific antibodies thus recognizing both the peptide fragment and the native PAI-1 protein. This fragment is also used to obtain the standard curve.
Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza bakteryjnego do wytworzenia polipeptydu zdolnego do wytwarzania przeciwciał reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu (PAI-1) i tym polipeptydem, przez łączenie fragmentów DNA, polega według wynalazku na tym, że wektor łączy się z DNA kodującym polipeptyd odpowiadający fragmen4 towi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym Y oznacza sekwencje aminokwasów kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Glu, Ser, Z oznacza sekwencję Glu, Ser i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, a = 0 lub 1, b = 0, 1 lub 2, natomiast A oznacza fragment Asnr72 - Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu.The method of constructing a recombinant vector for cloning and / or expression in bacterial host cells to produce a polypeptide capable of producing antibodies specifically reactive with the human tissue plasminogen activator inhibitor (PAI-1) protein and said polypeptide by joining DNA fragments according to the invention consists in: that the vector binds to a DNA encoding a polypeptide corresponding to the fragment of formula (Y) aA- (Z) b, wherein Y is the amino acid sequence encoded by the polylinker fragment, preferably Glu, Ser, Z is the sequence Glu, Ser and / or the encoded sequence by a polylinker fragment, a = 0 or 1, b = 0, 1 or 2, and A is the Asnr72-Thr232 fragment of the human tissue plasminogen activator inhibitor.
W sposobie według wynalazku zrekombinowany wektor otrzymuje się korzystnie przez łączenie wektora z zsyntezowanym chemicznie DNA odpowiadającym cDNA o sekwencji:In the method according to the invention, the recombinant vector is preferably obtained by linking the vector to the chemically synthesized DNA corresponding to the cDNA having the sequence:
( X ) „AACGGCCAGTGGAAGACACCATTCCCAGACAGTAGCACCCACCGCCGCCTCTT(X) 'AACGGCCAGTGGAAGACACCATTCCCAGACAGTAGCACCCACCGCCGCCTCTT
CCACAAATCAGACGGAAGCAGTGTCTCTGTGCCAATGATGGCTGAGACCAACAAATTCCACAAATCAGACGGAAGCAGTGTCTCTGTGCCAATGATGGCTGAGACCAACAAATT
CAACTATACTGAATTCACCACGCCAGATGGACATTACTACGACATCCTGGAACTGCCCAACTATACTGAATTCACCACGCCAGATGGACATTACTACGACATCCTGGAACTGCC
ATACCACGGAGACACT(X)m, gdzie X oznacza GAATCT, n przyjmuje wartość 1 lub 0, a m przyjmuje wartość 0, 1 lub 2.ATACCACGGAGACACT (X) m , where X is GAATCT, n is 1 or 0, and m is 0, 1 or 2.
Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się zsyntezowany chemicznie DNA kodujący fragment cząsteczki PAI-1 od 172 do 232 aminokwasu od N-końca o sekwencji:Preferably, in the method according to the invention, chemically synthesized DNA encoding a fragment of the PAI-1 molecule from 172 to 232 amino acids from the N-terminus with the sequence:
172 177 182172 177 182
Asn-Gly-Gln-Trp-Lys-Thr-Pro-Phe-Pro-Asp-Ser-Sef—Thr—Hi s-Arg187 192 197Asn-Gly-Gln-Trp-Lys-Thr-Pro-Phe-Pro-Asp-Ser-Sef — Thr — Hi s-Arg 187 192 197
Arq-Leu-Phe-Hi s-Lys-Ser-Asp-Gl y-Ser-Thr-'7«* l -Ser-Va l -Pro-Met202 207 212Arq-Leu-Phe-Hi s-Lys-Ser-Asp-Gl y-Ser-Thr-'7 «* l -Ser-Va l -Pro-Met202 207 212
Met-Ala-Glu-Thr-Asn-Lys-Phe-Asn-Tyr-Thr-Glu-Phe-Thr-Thr-Pro217 r—,Met-Ala-Glu-Thr-Asn-Lys-Phe-Asn-Tyr-Thr-Glu-Phe-Thr-Thr-Pro217 r—,
-Gly-AspAsp-Gly-His-Tyr-Tyr-Asp-Ile-Leu-Glu-Leu-Pro-Tyr-His-Gly-AspAsp-Gly-His-Tyr-Tyr-Asp-Ile-Leu-Glu-Leu-Pro-Tyr-His
Zrekombinowany sposobem według wynalazku wektor służy do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza bakteryjnego do wytworzenia fragmentu polipeptydowego zawierającego epitopy antygenowe rozpoznawane przez przeciwciała również w rodzimej cząsteczce PAI-1.The vector recombinant according to the invention is used for cloning and / or expression in bacterial host cells to produce a polypeptide fragment containing antigenic epitopes recognized by antibodies also in the native PAI-1 molecule.
Stosowany w procesie prowadzonym sposobem według wynalazku gen kodujący fragment polipeptydowy odpowiadający fragmentowi ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu można na przykład otrzymać z oligonukleotydowych fragmentów ligowanych in vitro.The gene encoding the polypeptide fragment corresponding to the fragment of the human tissue plasminogen activator inhibitor used in the process of the invention can be obtained, for example, from in vitro ligated oligonucleotide fragments.
Oligonukleotydowe fragmenty można zsyntetyzować chemicznie na nośniku poprzez kolejne przyłączanie nukleozydów z zablokowanymi grupami czynnymi. Korzystnie do ochrony funkcji aminowej stosuje się grupę izopropoksyacetylową, co przedstawiono w opisie patentowym RP nr 159 234.Oligonucleotide fragments can be chemically synthesized on the support by sequentially adding blocked active group nucleosides. Preferably, an isopropoxyacetyl group is used to protect the amine function, as described in the Polish patent specification No. 159,234.
Fragmenty oligonukleotydowe zsyntetyzowane chemicznie podaaje się enzymatycznej reakcji kinazowania, w trakcie której wprowadza się fosforan na końcach 5’ za pomocą kinazy polinukleotydowej i ATP. Kinazowane oligonukleotydy liguje się in vitro w dwuniciowe odcinki ograniczone sekwencjami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne. Zligowane odcinki klonuje się w wektorze pomocniczym, stosując właściwe miejsce restrykcyjne polilinkera. Poprawność sekwencji produktów ligowania i klonowania tych fragmentów sprawdza się poprzez sekwencjonowanie metodą Maxama-Gilberta. Można stosować różne wektory pomocnicze, np. plazmidowe lub fagowe, przy czym korzystne są plazmidy, np. pUC19. Sklonowane w wektorze odcinki DNA namnaża się w komórkach gospodarza, którymi mogą być bakterie, drożdże i inne. Wektory z wklonowanymi odcinkami izoluje się, a następnie odcinki odzyskuje się po trawieniu restryktazami na drodze elektroforezy w żelu poliakryloamidowym. Odzyskane odcinki włącza się do wektora ekspresyjnego po trawieniu odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Na tym etapie stosuje się różne wektory ekspresyjne, korzystnie plazmidowe lub fagowe. Przykładowo plazmid ekspresyjny pWR 450.1. zawiera gen kodujący β-galaktozydazę. Komórki gospodarza, korzystnie bakterii, transformowane zrekombinowanym wektorem są po namnożeniu źródłem fragmentu białka ludzkiego PAI-1.Chemically synthesized oligonucleotide fragments are subjected to an enzymatic kinase reaction in which phosphate is introduced at the 5 'ends using polynucleotide kinase and ATP. The kinased oligonucleotides are ligated in vitro into double-stranded stretches delimited by restriction enzyme recognition sequences. The ligated segments are cloned into a helper vector using the appropriate polylinker restriction site. The correctness of the sequence of the ligation and cloning products of these fragments was checked by Maxam-Gilbert sequencing. Various helper vectors, e.g. plasmid or phage vectors, can be used, with plasmids, e.g. pUC19 being preferred. DNA stretches cloned in the vector are multiplied in host cells, which can be bacteria, yeast and others. Vectors with cloned sections are isolated, and the sections are then recovered after digestion with restrictionases by polyacrylamide gel electrophoresis. The recovered sections are inserted into the expression vector after digestion with the appropriate restriction enzymes. Various expression vectors, preferably plasmid or phage vectors, are used in this step. For example, the expression plasmid pWR 450.1. contains the gene encoding β-galactosidase. Host cells, preferably bacteria, transformed with the recombinant vector are the source of the human PAI-1 protein fragment after amplification.
Wytworzony sposobem według wynalazku zrekombinowany wektor służy do otrzymania fragmentu białka PAl-1, który można stosować do otrzymywania przeciwciał różnymi znanymi metodami, a także do wykreślenia krzywej wzorcowej niezbędnej do ilościowego oznaczania PAI-1.The recombinant vector produced by the method according to the invention serves to obtain a fragment of the PA1-1 protein, which can be used for the production of antibodies by various known methods, and also to plot a standard curve necessary for the quantification of PAI-1.
Przykładowy sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu polega na tym, że immunizuje się zwierzęta polipeptydem odpowiadającym fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, pobiera się krew i odzyskuje przeciwciała.An exemplary method of producing polyclonal antibodies reactive specifically with a human tissue plasminogen activator inhibitor protein is to immunize animals with a polypeptide corresponding to the fragment of formula (Y) aA- (Z) b, wherein the symbols have the above meanings, blood is collected and recovered. antibodies.
Otrzymane przy pomocy zrekombinowanego wektora wytworzonego sposobem według wynalazku przeciwciała można zastosować do oznaczania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu oraz do otrzymania testu diagnostycznego do oznaczania tego antygenu.The antibodies obtained with the recombinant vector according to the invention can be used to determine the antigen of a human tissue plasminogen activator inhibitor and to obtain a diagnostic test for the determination of this antigen.
Przykładowy sposób oznaczania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu polega na tym, że badaną próbkę, korzystnie materiału biologicznego, kontaktuje się z przeciwciałami dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, po czym oznacza się wytworzony kompleks antygen-przeciwciało.An exemplary method of determining the antigen of a human tissue plasminogen activator inhibitor is that a test sample, preferably of biological material, is contacted with antibodies to the polypeptide corresponding to the fragment of formula (Y) a -A- (Z) b, wherein the symbols have the meaning given above. and the resulting antibody-antigen complex is determined.
W innej przykładowej metodzie najpierw wytwarza się kompleks dwuskładnikowy antygenu PAT-1 w próbce z pierwszym przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, po czym wytwarza się kompleks trójskładnikowy przez skontaktowanie kompleksu dwuskładnikowego z drugim przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, przy czym jako jedno z tych przeciwciał stosuje się przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z)t,, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie. Obecność kompleksu trójskładnikowego wykrywa się za pomocą sygnału tworzonego przez odczynnik dający się oznaczyć analitycznie lub wyznakowanego przeciwciała przeciwimmunoglobulinowego.In another exemplary method, the binary complex of the PAT-1 antigen in the sample is first produced with a first antibody capable of reacting with said antigen, and then the ternary complex is formed by contacting the binary complex with a second antibody capable of reacting with said antigen, one of which of these antibodies, antibodies are used for the polypeptide corresponding to the fragment of formula (Y) a -A- (Z) t, wherein the symbols are as defined above. The presence of the ternary complex is detected by a signal generated by an analytically measurable reagent or a labeled anti-immunoglobulin antibody.
Badaną próbkę, w której wykrywa się i oznacza antygen PAI-1 kontaktuje się i inkubuje z przeciwciałami reagującymi specyficznie z tym antygenem. Utworzenie kompleksu dwuskładnikowego antygen-przeciwciało wykrywa się i oznacza za pomocą środka wykrywającego i sygnalizującego reakcję immunologiczną, jak na przykład przeciwciało reagujące specyficznie z PAI-1 znakowane odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie.A test sample in which the PAI-1 antigen is detected and determined is contacted and incubated with antibodies reactive specifically with the antigen. The formation of a binary antigen-antibody complex is detected and determined by an immunological detection and signaling agent such as, for example, an antibody reactive specifically with PAI-1 labeled with an analytically determinable reagent.
Środek wykrywający i sygnalizujący reakcję immunologiczną może być obecny podczas inkubowania antygenu z przeciwciałem. Na przykład można bezpośrednio wyznakować przeciwciała kontaktowane z badaną próbką i po przemyciu produktu reakcji uzyskać sygnał. Środkiem jest wówczas sam znacznik. Środek wykrywający można też dodać dopiero po wytworzeniu kompleksu dwuskładnikowego i usunięciu nieprzereagowanego materiału. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się wówczas następująco: dwuskładnikowy kompleks antygenprzeciwciało po odmyciu kontaktuje się z drugim przeciwciałem reagującym specyficznie zAn agent for detecting and signaling an immune response may be present when the antigen is incubated with the antibody. For example, the antibodies contacted with the test sample can be directly labeled and the signal obtained after washing the reaction product. The center is then the marker itself. The detection agent can also be added only after the formation of the two-component complex and removal of unreacted material. Detection and determination are then carried out as follows: the two-component antigen-antibody complex after washing is contacted with a second antibody that reacts specifically with
164 992164 992
PAI-1, przy czym jako jedno z tych przeciwciał stosuje się przeciwciało dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie. Pozostałym (pierwszym lub drugim) przeciwciałem może być przeciwciało dla całej cząsteczki PAI-1. Otrzymuje się wówczas kompleks trójskładnikowy przeciwciało-antygenprzeciwciało. Drugie przeciwciała mogą być bezpośrednio znakowane odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie. Alternatywnie, jako środek stosuje się układ dwuskładnikowy zawierający drugie przeciwciała tworzące kompleks trójskładnikowy, który wykrywa się za pomocą przeciwciała przeciwimmunoglobulinowego.PAI-1, wherein one of these antibodies is an antibody for a polypeptide corresponding to the fragment of formula (Y) a-A- (Z) b in which the symbols are as defined above. The residual (first or second) antibody can be the antibody to the entire PAI-1 molecule. The ternary antibody-antigen-antibody complex is then obtained. Second antibodies may be directly labeled with an analytically determinable reagent. Alternatively, the agent is a two-component system containing second antibodies forming a ternary complex that is detected by an anti-immunoglobulin antibody.
Do znakowania można stosować enzym, biotynę, izotop promieniotwórczy, przykładowo 125J lub inne znane odczynniki. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się za pomocą sygnału wytwarzanego przez znacznik.An enzyme, biotin, radioisotope, for example 125 J, or other known reagents can be used for labeling. Detection and determination are carried out by means of the signal produced by the label.
W tak prowadzonym procesie oznaczania lub wykrywania badaną próbkę oznaczany antygen lub jedno z przeciwciał, korzystnie pierwsze, unieruchamia się na stałym nośniku, takim jak płytka plastikowa, bibuła nitrocelulozowa lub inne.In such a determination or detection process, the test sample, the antigen to be determined or one of the antibodies, preferably the first, is immobilized on a solid support, such as a plastic plate, nitrocellulose paper or the like.
Wykrywanie i oznaczanie dogodnie jest prowadzić za pomocą testu diagnostycznego. Przykładowy test diagnostyczny zawiera przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z),, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, ewentualnie unieruchomione na stałym nośniku lub rozpuszczone w fazie ciekłej. Przeciwciała są związane z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie.Detection and determination is conveniently carried out by a diagnostic test. An exemplary diagnostic assay comprises antibodies to a polypeptide corresponding to a fragment of formula (Y) a-A- (Z), wherein the symbols have the above meanings, optionally immobilized on a solid support or dissolved in a liquid phase. The antibodies are bound to an analytically detectable reagent.
Alternatywnie test diagnostyczny zawiera pierwsze przeciwciała reagujące specyficznie z białkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu oraz układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawierający drugie przeciwciała zdolne do specyficznego reagowania z ludzkim inhibitorem tkankowego aktywatora plazminogenu i ewentualnie przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe, przy czym jedne z tych przeciwciał stanowią przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z), w którym symbole mają wyżej podane znaczenie.Alternatively, the diagnostic assay comprises first antibodies reactive specifically with a human tissue plasminogen activator inhibitor protein and a system for detecting an antigen-antibody complex comprising second antibodies capable of specifically reacting with a human tissue plasminogen activator inhibitor and optionally anti-immunoglobulin antibodies, one of which is antibodies to a polypeptide corresponding to the fragment of formula (Y) aA- (Z), wherein the symbols are as defined above.
Korzystnie pierwsze przeciwciała są związane z fazą stałą lub ciekłą.Preferably the first antibodies are bound to a solid or a liquid phase.
Test może dodatkowo zawierać nośnik stały lub ciekły dla związania próbki zawierającej antygen.The test may additionally contain a solid or a liquid carrier to bind the sample containing the antigen.
Układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawiera drugie przeciwciała bezpośrednio związane z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie albo też układ ten zawiera trzecie przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe związane ze znacznikiem.The system for detecting an antigen-antibody complex comprises second antibodies directly linked to an analytically detectable reagent, or the system comprises third anti-immunoglobulin antibodies bound to a label.
W sposobie i testach do oznaczania ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu można stosować przeciwciła dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)a-A(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, wytworzone różnymi metodami.In the method and assays for determining human tissue plasminogen activator, antibodies to a polypeptide corresponding to the fragment of formula (Y) a-A (Z) b, wherein the symbols have the above meanings, prepared by various methods.
Celem uproszczenia w opisie i przykładach używane są następujące skróty:For simplicity, the following abbreviations are used in the description and examples:
A: adeninaA: adenine
C: cytozynaC: cytosine
G: guaninaG: guanine
T: _ tyminaT: _ thymine
Ala: alaninaAla: alanine
Arg: argininaArg: arginine
Asn: asparaginaAsn: asparagine
Asp: kwas asparaginowyAsp: aspartic acid
Cys: cysteinaCys: cysteine
Gin: glutaminaGin: glutamine
Glu: kwas glutaminowyGlu: glutamic acid
Gly: glicynaGly: glycine
His: histydynaHis: Histidine
Ile: izoleucynaHow much: isoleucine
Leu: leucynaLeu: leucine
Lys: lizynaLys: lysine
Met: metioninaMet: methionine
Phe: fenyloalaninaPhe: phenylalanine
Pro: prolinaPro: proline
Ser: serynaCheese: serine
Thr: treoninaThr: threonine
Trp: tryptofanTrp: tryptophan
Tyr: tyrozynaTyr: tyrosine
Val: walinaVal: valine
DNA: kwas dezoksyrybonukleinowy cDNA: komplementarny DNADNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary DNA
Tris-HCl: chlorowodorek trójhydroksymetyloaminometanuTris-HCl: trihydroxymethylaminomethane hydrochloride
EDTA: kwas etylenodwuaminoczterooctowy x bufor Eco R1 100M Tris-HCl pH 7,5EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid x Eco R1 buffer 100M Tris-HCl pH 7.5
MNaCl x bufor do kinazowania x bufor ligacyjny:MNaCl x kinase buffer x ligation buffer:
Bufor do ekstrakcjiExtraction buffer
Pożywka LBLB medium
Bufor TETE buffer
Bufor z SDSSDS buffer
Bufor do lizy komórekCell lysis buffer
Bufor RIRI buffer
Bufor R ΠBuffer R Π
Bufor R III mM β-merkaptoetanol OT M Tris-HCl pH 7,6 0.1MMgCl2 50 mM ditiotreitol 660 mM Tris-HCl pH Ifi 50 mM MgCl2 50 mM ditiotreitol 10 mM ATP 50mMTris-HCl pH 8,0 300 mM octan sodu 0.2% SDS 4 mM EDTA 10g Bacto Trypton 5g Yeast Extract 5g NaCl na 1 litr roztworu mM Tris-HCl pH 8,0 1 mM EDTA 0 OglCri-HCCl pH 8,0 77g glicynyBuffer R III mM β-mercaptoethanol OT M Tris-HCl pH 7.6 0.1MMgCl2 50 mM dithiothreitol 660 mM Tris-HCl pH Ifi 50 mM MgCl2 50 mM dithiothreitol 10 mM ATP 50mMTris-HCl pH 8.0 300 mM sodium acetate 0.2% SDS 4 mM EDTA 10g Bacto Trypton 5g Yeast Extract 5g NaCl per 1 liter of mM Tris-HCl solution pH 8.0 1 mM EDTA 0 OglCri-HCCl pH 8.0 77g glycine
1g SDS na 1 litr roztworu 15 mg TriT1 g of SDS per liter of 15 mg of TriT solution
400 mg SDS ml β-merkaptoetanol ml glicerolu ml wody400 mg SDS ml β-mercaptoethanol ml glycerol ml water
M mM EDTA mM Tris-HCL pH 8,0 4 mg/ml lizozymu (Pharmacia) 0,2 M NaOOM mM EDTA mM Tris-HCL pH 8.0 4 mg / ml Lysozyme (Pharmacia) 0.2 M NaOO
1% SDS ml 5 M octan potasu1% SDS ml 5M potassium acetate
11.5 ml kwas octowy lodowaty11.5 ml glacial acetic acid
28.5 ml H2O28.5 ml of H2O
DTT: ditiotreitolDTT: dithiothreitol
PMSF: fluorek kwasu fenylometylosulfonowego SDS: siarczan dodecylu soduPMSF: phenylmethylsulfonic acid fluoride SDS: sodium dodecyl sulfate
BSA: albumina surowicy wołu (Bovine Serum Albumin) PBS: zbuforowany roztwór soli fizjologicznej ATP: trójfosforan adenozynyBSA: Bovine Serum Albumin PBS: buffered saline ATP: adenosine triphosphate
HPLC: wysokociśnieniowa chromatografia cieczowaHPLC: high pressure liquid chromatography
164 992164 992
EDTA: etylenodiaminotetraoctanEDTA: ethylenediaminetetraacetate
Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia wykres hydrofobowości łańcucha polipeptydowego PAI-1. Figura 2 przedstawia sekwencję fragmentu genu ludzkiego PAI-1 podzieloną na fragmenty syntetyzowane chemicznie. Figura 3 przedstawia schemat konstrukcji fragmentu genu dla PAJ-1 sklonowanego w wektorze rekombinacyjnym pUC-19 oraz ekspresyjnym pWR 450. Figura 4 przedstawia elektroforezę w żelu poliakryloamidowym zawierającym SDS ekstraktów białkowych otrzymanych z komórek E.coli oraz oczyszczonego kompleksu białkowego PAI-1 z β-galaktozydazą: 1 - ciałka inkluzyjne rozpuszczone w zbuforowanym roztworze 6molowego mocznika, 2 - oczyszczone białko hydrobowe β-galaktozydaza - fragment peptydowy PAI-1. Figura 5 przedstawia schemat rozbicia kompleksu białkowego i oczyszczania fragmentu Asn172-Thr232 PAI-1. Przedstawione odcinki β-galaktozydazy przypadają na długość od 4 do 182 aminokwasów. Fragment PAI-1 po rozbiciu komplesku składa się z 61 aminokwasów.In the accompanying drawings, Figure 1 is a graph of the hydrophobicity of the PAI-1 polypeptide chain. Figure 2 shows the sequence of the human PAI-1 gene fragment divided into chemically synthesized fragments. Figure 3 shows a diagram of the construction of a gene fragment for PAJ-1 cloned in the pUC-19 recombinant vector and the pWR 450 expression vector. Figure 4 shows SDS polyacrylamide gel electrophoresis of protein extracts obtained from E. coli cells and the purified PAI-1 protein complex with β- with galactosidase: 1 - inclusion bodies dissolved in a buffered solution of 6mol urea, 2 - purified hydrobial protein β-galactosidase - PAI-1 peptide fragment. Figure 5 shows a scheme for the disruption of the protein complex and the purification of the Asn172-Thr232 fragment of PAI-1. The portions of β-galactosidase shown are 4 to 182 amino acids long. The PAI-1 fragment after disruption of the complex consists of 61 amino acids.
Wynalazek jest bliżej wyjaśniony w przykładach wykonania nie ograniczających jego zakresu.The invention is explained in more detail in non-limiting examples.
Przykład LExample L.
Etap 1.Level 1.
A. Synteza oligonukleotydów.A. Oligonucleotide synthesis.
Syntezę 10 oligonukleotydowych fragmentów (fig. 2) przeprowadza się metodą amidofosforynową na stałym nośniku. Jako nośnik stosuje się szkło o kontrolowanej porowatości, typu LCA-CPG, ze związaną pierwszą jednostką nukleozydową. Jednostka ta ma przyłączoną na końcu 5’ -OH deoksyrybozy blokującą grupę kwasolabilną - dimetoksytrityl (DMT), którą usuwa się w środowisku kwaśnym. Odsłonięta w ten sposób grupa 5’-OH jednostki nukleozydowej przyłącza prekursor kolejnej jednostki 3’-amidofosforyn odpowiedniego nukleozydu. Za pomocą jodu w obecności wody dokonuje się utlenienia grupy fosforynowej do fosforanu. Następnie usuwa się DMT z przyłączonej jednostki - tym samym cykl rozpoczyna się na nowo. W celu usunięcia nieprzereagowanych jednostek z wolnymi grupami 5’-OH stosuje się t.zw. capping, tj. zablokowanie pomyłkowych sekwencji przez acetylowanie bezwodnikiem octowym w obecności aktywatorów. Po utworzeniu żądanego oligonukleotydu odcina się go od złoża i usuwa inne grupy wodnym roztworem amoniaku, oczyszcza elektroforetycznie następnie odsala metodą HPLC, (Waters C-18 RP, 10 gm). Oligonukleotydy przechowuje się w porcjach po około 0,5 OD.The synthesis of 10 oligonucleotide fragments (Fig. 2) is carried out by the phosphoramidite method on a solid support. A controlled pore glass, LCA-CPG type, bonded to the first nucleoside unit is used as the support. This unit has an acid labile blocking group dimethoxytrityl (DMT) attached to the 5'-OH end of deoxyribose, which is removed in an acidic environment. The thus exposed 5'-OH group of the nucleoside unit joins the precursor of the next 3'-phosphoramidite unit of the corresponding nucleoside. With the help of iodine in the presence of water, the phosphite group is oxidized to phosphate. The DMT is then removed from the attached unit - thereby starting the cycle all over again. In order to remove unreacted units with free 5'-OH groups, the so-called capping, ie blocking of wrong sequences by acetylation with acetic anhydride in the presence of activators. After formation of the desired oligonucleotide, it is cleaved from the bed and the other groups are removed with aqueous ammonia, purified by electrophoresis then desalted by HPLC (Waters C-18 RP, 10 gm). Oligonucleotides are stored in aliquots of about 0.5 OD.
B. Proces kinazowania i ligacji.B. The kinase and ligation process.
Poszczególne fragmenty nici DNA rozpuszcza się w wodzie destylowanej, tak aby w 5 gl znajdował się 1 gg fragmentu. Miesza się po 5 gl roztworu fragmentów od 1 do< 5 (I nić DNA) i od 5 do 10 (Π nić DNA). Do mieszaniny fragmentów dodaje się OJ objętości bufom do kinazowania (50 mM Tris-HCl, 5 gM MgCh), 5 gl 20mM ATP, 1 gl kinazy polinukleotydowej B (T4 polinukleotide kinase). Reakcję prowadzi się przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Miesza się obie nici i inkubuje przez 20 minut w· temperaturze 100°C. Po powolnym ostudzeniu dodaje się do każdej próbki po 0,1 objętości buforu do ligacji, po 1 gl 200 mM ATP, 1 gl ligazy T4. Po dokładnym wymieszaniu reakcję prowadzi się przez 12 godzin w temperaturze 4°C.The individual fragments of the DNA strand are dissolved in distilled water so that there is 1 gg of the fragment in 5 gL. 5 g of fragment solution from 1 to <5 (1 strand of DNA) and 5 to 10 (1 strand of DNA) are mixed. To the fragment mixture, OJ volumes of kinase buffers (50 mM Tris-HCl, 5 gM MgCl 3), 5 gM of 20mM ATP, 1 g of polynucleotide kinase B (T4 polynucleotide kinase) are added. The reaction is carried out for 4 hours at 37 ° C. Both strands are mixed and incubated for 20 minutes at 100 ° C. After slow cooling, 0.1 volume of ligation buffer, 1 µl of 200 mM ATP, 1 µl of T4 ligase are added to each sample. After mixing thoroughly, the reaction is run for 12 hours at 4 ° C.
C. Hydroliza enzymami.C. Hydrolysis with enzymes.
Do rozpuszczonego DNA (80 gl) dodaje się 10x10 gl buforu EcoRi, 2U restryktazy EcoRI (firmy Pharmacia) oraz wody do objętości 100 gl. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Po tym czasie DNA strąca się etanolem, dodając 3 objętości alkoholu etylowego (99.8%), wymraża się w -20°C przez 5 minut, a następnie odwirowuje się przy 15 tys. obr., przez 5 minut. Osad rozpuszcza się w 20 gl buforu TE. W ten sam sposób postępuje się podczas hydrolizy restryktazą Pst I.To the dissolved DNA (80 µl) is added 10x10 µl of EcoRi buffer, 2U of EcoRI restrictase (from Pharmacia) and water to a volume of 100 µl. The mixture is incubated at 37 ° C for 2 hours. After this time, the DNA was precipitated with ethanol by adding 3 volumes of ethyl alcohol (99.8%), frozen at -20 ° C for 5 minutes, and then centrifuged at 15,000. rotate for 5 minutes. The pellet is dissolved in 20 g of TE buffer. The same is done for the hydrolysis with Pst I-restrictionase.
D. Rozdział elektroforetyczny.D. Electrophoretic separation.
W celu sprawdzenia czy zligowane fragmenty DNA mają odpowiednią długość, rozdziela się je w 8% żelu poliakryloamidowym z SDS w TBE. Rozdział prowadzi się przy napięciu 130V w ciągu 3 godzin. Żel zabarwia się bromkiem etydyny (0,5 gg/ml - firmy Serva) przez 20 minut w temperaturze pokojowej, następnie płucze się 2 x wodą destylowaną. Rozdzielone produkty obserwuje się pod lampą Uv. W celu oceny wielkości fragmentów DNA podczas elektroforezy używa się następujących wzorców: pUC 19 trawiony Msp, pUC 19 trawiony Bsp RI. ZligowaneIn order to check that the ligated DNA fragments are of the correct length, they are separated on an 8% SDS polyacrylamide gel in TBE. Separation is carried out at 130V for 3 hours. The gel is stained with ethidium bromide (0.5 gg / ml - by Serva) for 20 minutes at room temperature, then rinsed twice with distilled water. The separated products are observed under a Uv lamp. The following standards were used to estimate the size of the DNA fragments during electrophoresis: pUC 19 digested with Msp, pUC 19 digested with Bsp RI. Obliged
164 992 fragmenty posiadają oczekiwaną długość. Po elektroforezie sprawdzającej wykonuje się elektroforezę preparatywną i uzyskuje się tą drogą fragment, który następnie liguje się z plazmidem pUC 19 trawionym Eco RI i PstI w sposób wyżej opisany.164,992 fragments are of the expected length. After checking electrophoresis, preparative electrophoresis is performed and a fragment is obtained in this way, which is then ligated with the pUC19 plasmid digested with Eco RI and PstI as described above.
E. Przygotowanie kompetentnych komórek.E. Preparation of competent cells.
Z płytki z wysianymi bakteriami DH5, pobiera się jedną kolonię, którą szczepi się na 5 ml pożywki LB. Bakterie hoduje się w temperaturze 37°C przez 18 godzin. Do 100 ml pożywki LB dodaje się 2 ml otrzymanej hodowli i prowadzi się hodowlę do gęstości optycznej OD 600=0,3. Zawiesinę bakterii zwirowuje się (5 tys. obr. 20 min.), a osad bakteryjny schładza się i zawiesza w 50 ml buforu SB i umieszcza w temperaturze 0°C. Zwirowuje się jak wyżej, a osad zawiesza w 1/2 objętości wyjściowej buforem Sb. Inkubuje się 20 minut w temperaturze 0°C. Po tym czasie z zawieszonych komórek pobiera się do sterylnych probówek po 200 pl zawiesiny komórek i inkubuje 30 minut w 0°C. Dodaje się 7 pl DTT i plazmidy (20 pl). Inkubuje się w lodzie (0°C) 30 minut, a następnie 45 sekund w 45°C. Ochładza się w lodzie i dodaje 800 pl pożywki LB, a następnie inkubuje 1 godzinę w 37°C. Po tym czasie posiewa się na płytki. Wylewa się 200 pl mieszaniny ligacyjnej na płytkę i inkubuje się w 37°C przez 18 godzin.From the DH5 plate, one colony is picked and inoculated onto 5 ml of LB medium. The bacteria are grown at 37 ° C for 18 hours. 2 ml of the obtained culture are added to 100 ml of LB medium and the culture is cultivated to an optical density of OD 600 = 0.3. The bacterial suspension is centrifuged (5,000 rotations, 20 minutes), and the bacterial pellet is cooled and suspended in 50 ml of SB buffer and placed at 0 ° C. It is centrifuged as above and the pellet is suspended in 1/2 of its original volume in buffer Sb. Incubation is made for 20 minutes at 0 ° C. After this time, 200 µl of the cell suspension are collected from the suspended cells into sterile tubes and incubated for 30 minutes at 0 ° C. 7 µl of DTT and plasmids (20 µl) are added. Incubation on ice (0 ° C) for 30 minutes followed by 45 seconds at 45 ° C. It is cooled on ice and 800 µl of LB medium is added, followed by incubation for 1 hour at 37 ° C. After this time, it is seeded into plates. 200 µl of the ligation mixture is poured onto the plate and incubated at 37 ° C for 18 hours.
F. Analiza otrzymanych transformantów.F. Analysis of the obtained transformants.
Po 18 godzinach na płytce z wysianą mieszaniną transformacyjną obserwuje się pojedyncze kolonie. Do dalszej analizy wybiera się 10 kolonii. 5 ml pożywki szczepi się pojedynczymi koloniami i hoduje w 37°C przez 18 godzin, a następnie izoluje plazmidowy DNA. Preparatyka plazmidowego DNA z 5 ml pożywki przebiega w następujący sposób.Single colonies are observed on the plate with the inoculated transformation mixture after 18 hours. 10 colonies are selected for further analysis. 5 ml of medium is inoculated with single colonies and cultured at 37 ° C for 18 hours, followed by isolation of plasmid DNA. Preparation of plasmid DNA from 5 ml of medium is as follows.
Bakterie zwirowuje się (5 minut 5 obrJmin.). Osad bakteryjny zawiesza się w 200 pl buforu RI i przetrzymuje 5 minut w temperaturze 0°C. Dodaje się 400 pl RII (0°C), a następnie 300 pl RUI (0°C). Całość zwirowuje się (15 tys. obr./min., 5 minut). Supernatant przenosi się znad osadu do nowej probówki i dodaje się 2,5 objętości izopropanolu. Wymraża się w -20°C, zwirowuje, osad płucze 70% etanolem i suszy pod próżnią. Osad rozpuszcza się w 200 pl TE i dodaje 20 pl roztworu RNazy o stężeniu 1 mg/ml. Inkubuje się 30 minut w 37°C. Dodaje się 200 pl fenolu. Zbiera się fazę wodną i dodaje 200 pl mieszaniny chloroform/alkohol izoamylowy (24:1, v/v). Zwirowuje się, zbiera supematant, czynność powtarza się jeszcze raz. Do fazy wodnej dodaje się 0,1 objętości 3 M octanu sodu (pH=5,2) oraz 2,5 objętości etanolu i wymraża 30 minut w -20°C. Zwirowuje się (15 tys. obr./min.), a osad przemywa 70% etanolem i suszy. Osad plazmidowego DNA rozpuszcza się w 40 pl buforu TE.The bacteria are centrifuged (5 minutes 5 rpm). The bacterial pellet is resuspended in 200 µl of RI buffer and kept for 5 minutes at 0 ° C. Add 400 µl RII (0 ° C) followed by 300 µl RUI (0 ° C). The whole is spun down (15,000 rpm, 5 minutes). The supernatant is transferred from the pellet to a new tube and 2.5 volumes of isopropanol are added. It is frozen at -20 ° C, centrifuged, rinsed with 70% ethanol and dried in vacuo. The precipitate is dissolved in 200 µl of TE and 20 µl of RNase solution at 1 mg / ml is added. Incubation is 30 minutes at 37 ° C. 200 µl of phenol are added. The aqueous phase is collected and 200 µl of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1, v / v) are added. It spins, collects the supematant, the activity is repeated once more. 0.1 volumes of 3M sodium acetate (pH = 5.2) and 2.5 volumes of ethanol are added to the aqueous phase and frozen for 30 minutes at -20 ° C. It is centrifuged (15,000 rpm), and the precipitate is washed with 70% ethanol and dried. The plasmid DNA pellet is dissolved in 40 µl of TE buffer.
W celu wybrania klonu zawierającego plazmid pUC 19 z wklonowanym dwuniciowym fragmentem, przeprowadza się analizę otrzymanych DNA plazmidowych przy użyciu enzymów restrykcyjnych EcoRI i Pst I, a produkty trawienia rozdziela się w żelu poliakryloamidowym. Trawienie przeprowadza się jak w punkcie C, a rozdział elektroforetyczny jak w D.In order to select a clone containing the pUC19 plasmid with the cloned double-stranded fragment, analysis of the obtained plasmid DNA is performed with the restriction enzymes EcoRI and Pst I, and the digestion products are separated on a polyacrylamide gel. Etching is performed as in point C and electrophoretic separation as in D.
G. Sprawdzenie sekwencji sklonowanych fragmentów.G. Check the sequence of cloned fragments.
W celu upewnienia się czy sekwencja sklonowanego fragmentujest prawidłowa, fragmenty sekwencjonuje się metodą Maxama i Gilberta (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 1980, 65).To ensure that the sequence of the cloned fragment is correct, the fragments are sequenced by the method of Maxam and Gilbert (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 1980, 65).
H. Konstrukcja wektora ekspresyjnego.H. Construction of the expression vector.
Sprawdzony dwuniciowy fragment DNA kodujący polipeptyd Asnm- Thr232, liguje się z wektorem ekspresyjnym pWR.450 trawionym enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Pst.I. Uzyskuje się zrekombinowany plazmid ekspresyjny pW-PAI-1. Transformowanie komórek bakteryjnych prowadzi się jak w punkcie E.A verified double-stranded DNA fragment encoding the Asnm-Thr232 polypeptide is ligated with the pWR.450 expression vector digested with the restriction enzymes EcoRI and Pst.I. A recombinant pW-PAI-1 expression plasmid is obtained. The transformation of bacterial cells is carried out as in point E.
I. Czyszczenie ciałekI. Cleaning of corpuscles
Bakterie z kolonii bakteryjnej zawierającej zrekombinowany plazmid przenosi się do probówki zawierającej 1 ml pożywki LB + 5 pl ampicyliny o stężeniu 100 g/ml i inkubuje przezBacteria from the bacterial colony containing the recombinant plasmid are transferred to a tube containing 1 ml LB medium + 5 µl ampicillin at a concentration of 100 g / ml and incubated for
2-5 godzin w temperaturze 37°C, z ciągłym wytrząsaniem. Zawiesinę bakterii namnożonych w tej probówce przenosi się do kolby zawierającej 11 pożywki LB + 1ml ampicyliny o stężeniu 100 pg/ml. Hodowlę prowadzi się 14 godzin, w temperaturze 37°C z ciągłym wytrząsaniem. Następnie bakterie zwirowuje się (15 min., 5000 obr./min.) i osad zawiesza się w 200 ml 0,1 M CaCl2 (buforowanym Trisem, pH=7,5). Po inkubacji przez 20 minut w łaźni lodowej, zawiesinę wiruje się przez 20 minut przy 12000 obr./min. w temperaturze +4°C i osad ponownie zawiesza się w 200 ml 0,1 M CaCl2. Po kolejnej inkubacji przez 2 godziny w łaźni lodowej zawiesinę wiruje się (w dwóch probówkach wirowniczych) j.w. Osad zawiesza się w 20 ml (do obu probówek dodaje się po 20 ml) buforu fosforanowego, pH 6.2, a następnie dodaje się po 200 gl i 1 M glicerolu i 400 μΐ 1% glicerolu do obu probówek. Ogrzewa się je do temperatury pokojowej, dodaje po 40 gl 0,5 M EDTA, pH 8,0 i po krótkiej inkubacji schładza w łaźni lodowej do temperatury około 0°C. Następnie probówki wstawia się na 1 minutę do łaźni o temperaturze 42°C (szok termiczny). Wiruje jak wyżej. Osad po schłodzeniu zawiesza się w 100 ml 100 mM Tris-Hcl, pH 8.0, zawierającym 10 mM EDTA, inkubuje przez 5 minut w temperaturze 0°C i odwirowuje. Osad zawiesza się w 35 ml 100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 100 mM β-ΜΕ, 1 mM PMSF, 1% Triton Χ-100, pH 8.0. Poddaje się go działaniu ultradźwięków -10 razy po 30 sek., po czym odwirowuje się (20 000 obr./min., 30 min., temp. +4°C) otrzymując w ten sposób osad ciałek inkluzyjnych, które następnie przemywa się zawieszając je w 35 ml buforu 50 mM Tris-HCl, pH 7,4,1 mM PMSF, 1 mM EDTA. Po ponownym ich żwirowaniu rozpuszcza się je w 9 M moczniku. W celu pozbycia się reszty zanieczyszczeń (nierozpuszczonych ciałek inkluzyjnych) zawiesinę ponownie wiruje się (20 000 obr./min., 30 min., temp. +4°C). W supematancie winna znajdować się główna część białka. Dalsze oczyszczania białka hybrydowego zawierającego fragment PAI-1 przeprowadza się na kolumnie chromatograficznej DEAESephacel.2-5 hours at 37 ° C with constant shaking. The suspension of bacteria grown in this tube is transferred to a flask containing 11 LB medium + 1 ml of 100 pg / ml ampicillin. The cultivation is carried out for 14 hours at 37 ° C with constant shaking. The bacteria are then centrifuged (15 min, 5000 rpm) and the pellet resuspended in 200 ml 0.1 M CaCl2 (Tris buffered, pH = 7.5). After incubating for 20 minutes in an ice bath, the suspension is centrifuged for 20 minutes at 12,000 rpm. at + 4 ° C and the pellet is resuspended in 200 ml 0.1 M CaCl2. After another incubation for 2 hours in an ice bath, the suspension is centrifuged (in two centrifuge tubes) as above. The pellet is resuspended in 20 ml (20 ml are added to both tubes) of phosphate buffer, pH 6.2, and then 200 µl and 1 M glycerol and 400 µl of 1% glycerol are added to both tubes. They are warmed to room temperature, 40 g of 0.5 M EDTA, pH 8.0 each, are added and, after a short incubation, cooled in an ice bath to about 0 ° C. The test tubes are then placed in a 42 ° C bath (thermal shock) for 1 minute. Whirls as above. After cooling, the pellet is resuspended in 100 ml of 100 mM Tris-Hcl, pH 8.0, containing 10 mM EDTA, incubated for 5 minutes at 0 ° C and centrifuged. The pellet is resuspended in 35 ml of 100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 100 mM β-, 1 mM PMSF, 1% Triton Χ-100, pH 8.0. It is subjected to ultrasound -10 times for 30 seconds, then centrifuged (20,000 rpm, 30 minutes, temperature + 4 ° C), thus obtaining a sediment of inclusion bodies, which are then washed with suspension. them in 35 ml of 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA. After they are centrifuged again, they are dissolved in 9 M urea. In order to get rid of the remaining impurities (undissolved inclusion bodies), the suspension is again centrifuged (20,000 rpm, 30 min., Temperature + 4 ° C). The main part of the protein should be present in the supernatant. Further purifications of the hybrid protein containing the PAI-1 fragment are performed on a DEAESephacel chromatography column.
Białka zawarte w ciałkach inkluzyjnych rozpuszczone w 9 M moczniku dializuje się do roztworu 6 M mocznika, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, zawierającego 10 mM EDTA, 1 mM PMSF. Tym samym buforem równoważy się dwie kolumny wypełnione złożem DEAE-Sephacel (o wymiarach 2,5 x 10 cm). Na jedną z nich nanosi się roztwór białek. Część białka, która po przejściu przez kolumnę nie zwiąże się ze złożem, nanosi się (po 2-3 krotnym rozcieńczeniu tym samym buforem) na drugą kolumnę. Czyste białko hybrydowe wymywa się ze złoża 0,1 M NaCl.The proteins contained in the inclusion bodies dissolved in 9 M urea are dialyzed against a solution of 6 M urea, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, containing 10 mM EDTA, 1 mM PMSF. The same buffer is used to equilibrate two DEAE-Sephacel columns (2.5 x 10 cm). On one of them a protein solution is applied. The part of the protein which will not bind to the matrix after passing through the column is applied (after 2-3 fold dilution with the same buffer) to the second column. The pure hybrid protein is eluted from 0.1 M NaCl bed.
J. Rozbicie kompleksu na drodze reakcji chemicznej.J. Disruption of the complex by chemical reaction.
Oczyszczone białko hybrydowe złożone z fragmentu β-galaktozydazy oraz fragment Asn172-Thr232 PAI-1 dializuje się wobec buforu 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 w celu usunięcia mocznika, a następnie liofilizuje. Rozszczepienie wiązania Asn-Gly przeprowadza się stosując 2M hydroksyloaminę w 6M chlorowodorku guanidyny, pH 9.3. Reakcję prowadzi się w temperaturze 45°C. Rozbicie koniugatu sprawdzano elektroforetycznie.The purified hybrid protein consisting of the β-galactosidase fragment and the Asn172-Thr232 PAI-1 fragment are dialyzed against 10 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5 to remove urea, and then lyophilized. Cleavage of the Asn-Gly bond is performed using 2M hydroxylamine in 6M guanidine hydrochloride, pH 9.3. The reaction is carried out at a temperature of 45 ° C. The breakdown of the conjugate was checked by electrophoresis.
Produkty powstałe w wyniku tej reakcji analizuje się w żelu pcliakryloamidowym po elektroforezie.The products resulting from this reaction are analyzed on the pcliacrylamide gel after electrophoresis.
K. Sposób wyodrębniania fragmentu Asn172-Thr232 (PAI-1) ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu za pomocą HPLC.K. Method for isolation of the Asn172-Thr232 (PAI-1) fragment of the human tissue plasminogen activator inhibitor by HPLC.
Fragment polipeptydowy odpowiadający fragmentowi Asn172-Thr232 (PAI-1) ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu izoluje się z hydrolizatu otrzymanego w sposób opisany w punkcie I za pomocą HPLC. Rozdział chromatograficzny przeprowadzono na kolumnie semipreparatywnej TSK G3000SW firmy LKB, Szwecja.The polypeptide fragment corresponding to the Asn172-Thr232 (PAI-1) fragment of the human tissue plasminogen activator inhibitor is isolated from the hydrolyzate prepared as described in point I by HPLC. The chromatographic separation was performed on a TSK G3000SW semi-preparative column from LKB, Sweden.
Etap 2.Stage 2.
A. Otrzymanie przeciwciał.A. Obtaining antibodies.
W celu otrzymania surowicy poliklonalnej dla fragmentu białka ludzkiego PAI-1 immunizuje się tym białkiem króliki. Śródskórnie podaje się na drodze 30 - 40 injekcji dawki 50 gg antygenu w 0,5 ml PBS i wymieszanego z 0,5 ml kompletnego adiuwantu Freuda. Po 7 dniach od każdego szczepienia pobiera się krew z żyły usznej królików. Po wykrzepieniu w temperaturze 37°C przez 0,5 -1.0 godziny, skrzep oddziela się od ścianek probówki i całość pozostawia w temperaturze 4°C na 12 - 24 godziny. Następnie surowice odciąga się do jałowych probówek wirówkowych i wiruje przy 3000 obr/min przez 20 minut. Surowicę inaktywuje się podczas inkubacji przez 30 minut w temperaturze 56°C. Miano poszczególnych próbek surowic określa się metodą radioimmunologiczną, oznaczając ich zdolność do wiązania znakowanego antygenu. Surowice o najwyższym mianie przeciwciał przechowuje się w temperaturze -20°C.In order to obtain a polyclonal serum for a fragment of the human PAI-1 protein, rabbits are immunized with this protein. The intradermal route is 30-40 injections of 50 g of antigen in 0.5 ml of PBS mixed with 0.5 ml of Freud's complete adjuvant. The ear vein of rabbits is blood collected 7 days after each vaccination. After clotting at 37 ° C for 0.5-1.0 hours, the clot is detached from the walls of the tube and left at 4 ° C for 12-24 hours. The sera are then withdrawn into sterile centrifuge tubes and centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes. The serum is inactivated by incubation for 30 minutes at 56 ° C. The titer of individual sera samples is determined by radioimmunoassay, determining their ability to bind the labeled antigen. Sera with the highest antibody titer are stored at -20 ° C.
B. Oczyszczanie przeciwciał.B. Purification of antibodies.
Przeciwciała dla fragmentu PAI-1 oczyszcza się z surowicy odpornościowej za pomocą chromatografii powinowactwa. Immunoadsorbent zawiera fragment białka PAI-1 związany ze złożem CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia). W celu przygotowania immunoadsorbentu 1g złożaAntibodies to the PAI-1 fragment are purified from the antiserum by affinity chromatography. The immunoadsorbent contains a PAI-1 protein fragment bound to CNBr-Sepharose 4B resin (Pharmacia). In order to prepare the immunoadsorbent, 1 g of resin
164 992 przemywa się 200 ml roztworu 0,001 mol/l HCl i następnie zawiesza w buforze boranowym (pH 8.3). Natychmiast dodaje się 20 mg fragmentu białka PAI-1 rozpuszczonego w PBS i delikatnie miesza w temperaturze 4°C przez 2 godziny. Po odwirowaniu sprawdza się stężenie białka w supematancie. Złoże zawiesza się następnie w roztworze glicyny (2 mol/l) w buforze boranowym o pH 8.3. Po 1-godzinnej inkubacji odwirowuje się je (10 min. 4 000 obi./min.) i przemywa się je 3 x buforem boranowym (pH 8.3), 1 x wodą dest., 3 x buforem octanowym (pH 4.0), 1 x wodą dest. i 2 x buforem boranowym (pH 8.3). Z otrzymanym w ten sposób złożem inkubuje się 15 ml surowicy otrzymanej po immunizacji fragmentem białka PAI-1, delikatnie mieszając przez 12-14 godzin w temperaturze 4°C. Do mieszaniny dodaje się 1 mM PMSF (Sigma) oraz 1 mM chlorku benzamidyny (Biochemical). Po odwirowaniu (10min., 3000 obrJmin.) złoże przemywa się 4% buforem (PBS z 1% Tween 20), a następnie 4xbuforem (1 M/1 NaCl z 1% Tween 20 w PBS). Po każdym wirowaniu sprawdza się zawartość białek w supemantancie poprzez pomiar adsorpcji światła przy 400 nm. Następnie złoże umieszcza się w kolumnie (0.7 x 10 cm). Przeciwciała specyficznie związane z unieruchomionym na złożu białkiem eluuje się roztworem 0,5 mol/l kwasu octowego i zbiera się do probówek zawierających 100 l roztworu 2 mol/l Tris. Frakcje o dużej zawartości białka łączy się i dializuje wobec PBS przez 24 godziny w 4°C.The 164,992 is washed with 200 ml of 0.001 mol / l HCl solution and then suspended in borate buffer (pH 8.3). 20 mg of the PAI-1 protein fragment dissolved in PBS is immediately added and gently stirred at 4 ° C for 2 hours. After centrifugation, the protein concentration in the supernatant is checked. The bed is then suspended in a glycine solution (2 mol / l) in borate buffer pH 8.3. After incubation for 1 hour, they are centrifuged (10 min. 4,000 rpm) and washed 3 x with borate buffer (pH 8.3), 1 x with distilled water, 3 x with acetate buffer (pH 4.0), 1 x distilled water and 2 × borate buffer (pH 8.3). The resin obtained in this way is incubated with 15 ml of serum obtained after immunization with the PAI-1 protein fragment, with gentle agitation for 12-14 hours at 4 ° C. 1 mM PMSF (Sigma) and 1 mM benzamidine chloride (Biochemical) are added to the mixture. After centrifugation (10 min, 3000 rpm), the media is washed with 4% buffer (PBS with 1% Tween 20) followed by 4x buffer (1 M / 1 NaCl with 1% Tween 20 in PBS). After each centrifugation, the protein content of the supemantant is checked by measuring the light adsorption at 400 nm. The bed is then placed in a column (0.7 x 10 cm). Antibodies specifically bound to the protein immobilized on the resin are eluted with 0.5 mol / L acetic acid and collected in tubes containing 100 L of 2 mol / L Tris. High protein fractions are pooled and dialyzed against PBS for 24 hours at 4 ° C.
C. Sprzęganie przeciwciał z peroksydazą.C. Conjugation of antibodies to peroxidase.
U zyskane w ten sposób przeciwciała dla fragmentu białka PAI-1 sprzęga się z peroksydazą. W tym celu rozpuszcza się 5 mg HRPO w 1ml świeżo przygotowanego 0.3 M kwaśnego węglanu sodu (NaHCO3), pH 8.1. Następnie dodaje się 0,1 ml 1% FDNB w alkoholu absolutnym. Delikatnie wytrząsa się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dodaje 0.04 - 0.08 M NaJO4 (rozpuszcz. w wodzie destyl.), delikatnie miesza przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Kolor tego roztworu winien stać się zielonożółty. Nstępnie dodaje się 1,0 ml 0,16 M glikolu etylenowego (rozp. w wodzie dest.) i delikatnie miesza w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po zakończeniu inkubacji roztwór dializuje się wobec 0.01 M węglanu sodu, pH 9.5, temperatura 4°C (co najmniej 3 1-litrowe zmiany). Do 3 ml roztworu tak przygotowanego aldehydu peroksydazy (HRPO) dodaje się 5 mg IgG i delikatnie miesza przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej. IgG rozpuszcza się w 1 ml buforu węglanowego przed zmieszaniem lub dodaje w postaci zliofilizowanego proszku wolnego od soli. Po dodaniu IgG wprowadza się 5 mg NaBH4 i pozostawia w 4°C od 3 do 12 godzin. Następnie roztwór dializuje się w 4°C wobec PBS. Jeśli powstaje precypitat, usuwa się go przez wirowanie. Próbkę nanosi się na kolumnę (85 x 1,5 cm), Sephadex G-100, zrównoważoną PBS. Zbiera się frakcje po 1,5 ml i poziom białka w poszczególnych frakcjach oznacza spektrofotometrycznie. Frakcja IgG znakowanych HRPO schodzi w pierwszym szczycie. Roztwory tego koniugatu przechowuje się w obecności albuminy surowicy wołowej o stężeniu 10 mg/ml w temperaturze -20°C.The thus obtained antibodies to the PAI-1 protein fragment are conjugated to peroxidase. For this purpose, 5 mg of HRPO are dissolved in 1 ml of freshly prepared 0.3 M sodium bicarbonate (NaHCO3), pH 8.1. Then 0.1 ml of 1% FDNB in absolute alcohol is added. It is shaken gently for 1 hour at room temperature. Add 0.04 - 0.08 M NaJO4 (dissolved in distilled water), gently stir for 30 minutes at room temperature. The color of this solution should turn green-yellow. First, 1.0 ml of 0.16 M ethylene glycol (dissolved in distilled water) are added and the mixture is gently stirred at room temperature for 1 hour. After incubation, the solution is dialyzed against 0.01 M sodium carbonate, pH 9.5, temperature 4 ° C (at least 3 1 liter changes). 5 mg of IgG are added to 3 ml of the thus prepared peroxidase aldehyde (HRPO) solution and gently stirred for 2-3 hours at room temperature. IgG is dissolved in 1 ml of carbonate buffer before mixing or added as a salt-free lyophilized powder. After the addition of IgG, 5 mg of NaBH4 are introduced and the mixture is left at 4 ° C for 3 to 12 hours. The solution is then dialyzed at 4 ° C against PBS. If a precipitate is formed, it is removed by centrifugation. The sample is applied to a column (85 x 1.5 cm), Sephadex G-100, equilibrated in PBS. Fractions of 1.5 ml are collected and the protein level in the individual fractions is determined spectrophotometrically. The HRPO labeled IgG fraction comes down in the first peak. Solutions of this conjugate are stored in the presence of 10 mg / ml bovine serum albumin at -20 ° C.
Etap 3.Stage 3.
Opłaszczanie płytki przeciwciałami i wykonanie testu ELISA.Coating the plate with antibodies and performing an ELISA test.
Studzienki w płytce do testu ELISA opłaszcza się przeciwciałami poliklonalnymi dla fragmentu polipeptydowego Asn172-Thr232 białka PAI-1 o stężeniu 10 gg/ml, zawieszonymi w 50 mM buforze fosforanowym o pH 7.5. Niezwiązane białko odmywa się, a powierzchnię studzienek opłaszcza albuminą surowiczą. Testowane próbki osocza rozcieńcza się przed oznaczeniem 50 mM buforem fosforanowym, pH 7.5, zawierającym 0.15 M NaCl, 10 mM EDTA, 1% Tween 20 i 1% BSA i dodaje się po 200 gl/dołek. Inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji płytki 5-krotnie przemywa się 0,15 M NaCl zawierającym 0,1% Tween 20. Następnie dodaje 200 gl koniugatu IgG-HRP (przeciwciała poliklonalne dla całej cząsteczki PAI-1 związane z peroksydazą) o stężeniu 5 fig/ml. Inkubuje 2 godziny w temperaturze pokojowej i ponownie 5-krotnie przemywa. W celu wywołania reakcji enzymatycznej dodaje się po 200 gl roztworu substratu (0,4 mg/ml ortofenylodiaminy w 0,05 M buforze cytrynianowym, pH 5,0, zawierającym 0.02% H2O2). Po 15 minutach inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję jamuje się przez dodanie 50 gl 3 M kwasu siarkowego. Adsorbancję mierzy się przy 490 nm.The wells of the ELISA plate are coated with polyclonal antibodies to the polypeptide fragment of the PAI-1 protein Asn172-Thr232 at a concentration of 10 gg / ml, suspended in 50 mM phosphate buffer at pH 7.5. Unbound protein is washed away and the surface of the wells is coated with serum albumin. The test plasma samples are diluted prior to assay with 50 mM phosphate buffer, pH 7.5, containing 0.15 M NaCl, 10 mM EDTA, 1% Tween 20 and 1% BSA, and 200 g / well are added. Incubate for 2 hours at room temperature. After incubation, the plates are washed 5 times with 0.15 M NaCl containing 0.1% Tween 20. Then 200 g of IgG-HRP conjugate (polyclonal antibodies for the whole PAI-1 molecule bound to peroxidase) are added at a concentration of 5 g / ml. Incubates 2 hours at room temperature and washes again 5 times. 200 g of substrate solution (0.4 mg / ml of orthophenyldiamine in 0.05 M citrate buffer, pH 5.0 containing 0.02% H 2 O 2) are added to induce the enzymatic reaction. Color appears after 15 minutes of incubation and the reaction is jammed by adding 50 µl of 3M sulfuric acid. Adsorbance is measured at 490 nm.
Przykład II. Detekcja antygenu PAI-1 w badanej próbce za pomocą przeciwciał dla fragmentu polipeptydowego odpowiadającego fragmentowi Asn172-Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu.Example II. Detection of the PAI-1 antigen in the test sample with antibodies to the polypeptide fragment corresponding to the Asn172-Thr232 fragment of the human tissue plasminogen activator inhibitor.
164 992164 992
Do unieruchomionego antygenu dodaje się wyznakowane peroksydazą przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego odpowiadającego fragmentowi Asnr72-Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu i inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Do wywołania reakcji enzymatycznej stosuje się roztwór substratu - ortofenylodiaminy w 0,05 M buforze cytrynianowym pH 5,0, zawierającym 0,02% H2O2). Po 6 minutach inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję hamuje się przez dodanie 50 μΐ 3M kwasu siarkowego. Adsorbancję mierzy się przy 490 nm. Wynik odczytuje się z krzywej wzorcowej dla standardowego roztworu PAI-1.The peroxidase-labeled antibodies for the polypeptide fragment corresponding to the Asnr72-Thr232 fragment of the human tissue plasminogen activator inhibitor are added to the immobilized antigen and incubated for 2 hours at room temperature. To induce the enzymatic reaction, a substrate solution - orthophenyldiamine in 0.05 M citrate buffer pH 5.0 containing 0.02% H2O2) is used. After 6 minutes of incubation, color appears and the reaction is stopped by the addition of 50 µM of 3M sulfuric acid. Adsorbance is measured at 490 nm. The result is read from the standard curve for the standard PAI-1 solution.
Przykład DI. Diagnostyczny zestaw testowy dla oznaczania poziomu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu składa się z: pojemnika zawierającego zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS), pH 7.5, EDTA, Tween 20; pojemniczka z albuminą surowiczą; pojemniczka z przeciwciałami dla fragmentu polipeptydowego odpowiadającego fragmentowi Asnr72-Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu; pojemniczka z wyznakowanymi peroksydazą przeciwciałami dla PAI-1; pojemniczka z substratem (ortofenylodiaminą); pojemniczka z buforem cytrynianowym, pH 5.0 i pojemniczka z 3 M kwasem siarkowym.Example DI. A diagnostic test kit for determining the level of human tissue plasminogen activator inhibitor consists of: a container containing a buffered saline solution (PBS), pH 7.5, EDTA, Tween 20; a container with serum albumin; an antibody container for the polypeptide fragment corresponding to the Asnr72-Thr232 fragment of the human tissue plasminogen activator inhibitor; a container with peroxidase labeled antibodies to PAI-1; a container with a substrate (orthophenyldiamine); a container with citrate buffer, pH 5.0 and a container with 3 M sulfuric acid.
164 992164 992
GAATCTAACGGCCAGTGGfiAGACACCAATCCGAGACAClAGCACCCACCGCCGCCTCTiCCAGAATCTAACGGCCAGTGGfiAGACACCAATCCGAGACAClAGCACCCACCGCCGCCTCTiCCA
GAUGCCGGTCACCTTCTGTGGT.A AGGGTCTGT<CATCGT.JGGIGGCGGCGGAGAAGGIGAUGCCGGTCACCTTCTGTGGT.A AGGGTCTGT <CATCGT.JGGIGGCGGCGGAGAAGGI
CAAAICAGΛCGGΛΛGCCCCITCTCTGTGCCAATGAIGGCIGAGΛCCAAC/tAAIICAACIAIACAAAICAGΛCGGΛΛGCCCCITCTCTGTGCCAATGAIGGCIGAGΛCCAAC / tAAIICAACIAIA
GIIIAGICIGCCIICGIGACA,GAGΛCΛCGGTTΛCTΛCCGACTGTGGIIGIIIAAGIIGAIAIGIIIAGICIGCCIICGIGACA, GAGΛCΛCGGTTΛCTΛCCGACTGTGGIIGIIIAAGIIGAIAI
CIGAAIICACCACGCCAGATGGACATTACIACGACAICCIGGAACIGCCAιIACCACGGAQACCIGAAIICACCACGCCAGATGGACATTACIACGACAICCIGGAACIGCCAιIACCACGGAQAC
GACTIAAGTGGTGCGGTCTΛCCTGTAATGATGCTGTAGGACCIIGACGGIΛIGGIGCCICTGGACTIAAGTGGTGCGGTCTΛCCTGTAATGATGCTGTAGGACCIIGACGGIΛIGGIGCCICTG
ACT ^AATCTACT ^ AATCT
3' 5'3 '5'
1. CGGICACCIICIGIGGIAAGGGICIGIC1. CGGICACCIICIGIGGIAAGGGICIGIC
2. AICGIGGGIGGCGGCCGAOAAAGTITITΛA;TCTGCCIICG dddna nić;2. AICGIGGGIGGCGGCCGAOAAAGTITITΛA ; TCTGCCIICG dddna thread;
3.IGACAGAGACΛCGGTTΛCTACCG.ACTCIGGIIG3.IGACAGAGACΛCGGTTΛCTACCG.ACTCIGGIIG
4.IIIAAGIIGAIAIGACIIAAGIGGIGCGGTCIACCIGIAA4.IIIAAGIIGAIAIGACIIAAGIGGIGCGGTCIACCIGIAA
5. IGAIG.CIGIA.GGACCTIGACGGTΛTGGTGCCCτCTGIGAAICI5. IGAIG.CIGIA.GGACCTIGACGGTΛTGGTGCCCτCTGIGAAICI
6. ICACAGAGGCA.CCAI.ACCGICAA^GGTCCTACAGCAICAιΊIAC6. ICACAGAGGCA.CCAI.ACCGICAA ^ GGTCCTACAGCAICAιΊIAC
7. A^GGIAGACCGCACCACTIAAGICAIAICAACI7. A ^ GGIAGACCGCACCACTIAAGICAIAICAACI
9. IAAACΛΆCCAGAGTCGGΪ/ΰTΛΛCCGTG7C7CIGIΓACGA górne nić9.IAAACΛΆCCAGAGTCGGΪ / ΰTΛΛCCGTG7C7CIGIΓACGA upper thread
9. AGGCAGACTΛA.ACACCTTCICCGCCGCCACCC.AC9. AGGCAGACTΛA.ACACCTTCICCGCCGCCACCC.AC
10. GAIGACAGACCCIIACCACAGAAGGTGACCGGCAAICIAAG.10. GAIGACAGACCCIIACCACAGAAGGTGACCGGCAAICIAAG.
Fig. 2Fig. 2
Eco RIEco RI
Pst IPst I
pWR450pWR450
EcoRi, Pst I »4 ~EcoRi, Pst I »4 ~
Fig.3Fig.3
164 992164 992
PAI-1PAI-1
. 4 BCTA - GALAKTOZYDAZA : BIAŁKO PAI. 4 BCTA - GALACTOSIDASE: PAI PROTEIN
produkty degradacji bela-galaktozydazy białko PAIdegradation products of bela-galactosidase protein PAI
oczyszczenie produktów hydrolizypurification of the hydrolysis products
Fig.5Fig 5
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 złPublishing Department of the UP RP. Circulation of 90 copies. Price: PLN 10,000
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL30054590A PL164992B1 (en) | 1990-04-25 | 1990-04-25 | Method of constructing a recombinet vector for cloning and/or expressing in bacterial host cells the production of polypeptide capable to generate antibodies specifically reacting with protein of the human tisue inhibitor of plasminogen activator |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL30054590A PL164992B1 (en) | 1990-04-25 | 1990-04-25 | Method of constructing a recombinet vector for cloning and/or expressing in bacterial host cells the production of polypeptide capable to generate antibodies specifically reacting with protein of the human tisue inhibitor of plasminogen activator |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL164992B1 true PL164992B1 (en) | 1994-10-31 |
Family
ID=20060940
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL30054590A PL164992B1 (en) | 1990-04-25 | 1990-04-25 | Method of constructing a recombinet vector for cloning and/or expressing in bacterial host cells the production of polypeptide capable to generate antibodies specifically reacting with protein of the human tisue inhibitor of plasminogen activator |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL164992B1 (en) |
-
1990
- 1990-04-25 PL PL30054590A patent/PL164992B1/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gitt et al. | Evidence that a human soluble beta-galactoside-binding lectin is encoded by a family of genes. | |
| Aota et al. | The short amino acid sequence Pro-His-Ser-Arg-Asn in human fibronectin enhances cell-adhesive function. | |
| AU697227B2 (en) | Enzyme for cleavage of the anchor region of surface proteins from gram positive bacteria | |
| BENGTSSON‐OLIVECRONA et al. | Lipoprotein lipases from cow, guinea‐pig and man: Structural characterization and identification of protease‐sensitive internal regions | |
| US5457029A (en) | Nuclear antigen La | |
| Donahue et al. | Three-dimensional structure of the platelet integrin recognition segment of the fibrinogen gamma chain obtained by carrier protein-driven crystallization. | |
| EP0255011A2 (en) | Human inter-alpha-trypsin inhibitor gene | |
| US5445820A (en) | Streptolysin O peptide antigens and methods for the determination of streptolysin antibodies | |
| Routsias et al. | Epitope mapping of the Ro/SSA60KD autoantigen reveals disease‐specific antibody‐binding profiles | |
| CA2103551A1 (en) | Method for production of an iga binding protein derived from group b streptococci | |
| Kotula et al. | Functional characterization of recombinant human red cell alpha-spectrin polypeptides containing the tetramer binding site | |
| Morgan et al. | The structure of streptokinase I. Cyanogen bromide fragmentation, amino acid composition and partial amino acid sequences | |
| Ahmed et al. | Opioid binding properties of the purified kappa receptor from human placenta | |
| KUPRYSZEWSKI et al. | Solid‐phase synthesis of trypsin inhibitor CMTI III from squash seeds (Cucurbita maxima) | |
| Hitchcock-DeGregori et al. | Tropomyosin lysine reactivities and relationship to coiled-coil structure | |
| PL164992B1 (en) | Method of constructing a recombinet vector for cloning and/or expressing in bacterial host cells the production of polypeptide capable to generate antibodies specifically reacting with protein of the human tisue inhibitor of plasminogen activator | |
| PL164991B1 (en) | Method of producing polyclonal antibodies specifically reacting with protein of the human tissue inhibitor of plasminogen activator | |
| Cahill et al. | An immunochemical approach to the identification of the MBTA binding site of the nicotinic acetylcholine receptor of Torpedocalifornica | |
| PL164952B1 (en) | Method of determining and/or detecting the antigen of human tissue inhibitor of plasminogen activator and diagnostic test therefor | |
| PL165793B1 (en) | A method of producing a polypeptide capable of producing antibodies that react specifically with the human tissue plasminogen activator inhibitor protein | |
| PL165020B1 (en) | Method of determining and/or detecting the antigen of human tissue inhibitor of plasminogen activator and diagnostic test therefor | |
| JP2634683B2 (en) | Antibodies to fibrin; immunogenic peptides suitable for antibody preparation, methods for determining fibrin, and antibody-based preparations | |
| PL164564B1 (en) | Method for making polypeptides, recombined vector and method for its forming, method for making antibodies, method and test for determination of human tissue activator of plasminogen or antibodies for that protein | |
| PL164144B1 (en) | Method for making polypeptides, recombined vector and method for its forming, method for making antibodies, method and test for determination of human tissue activator of plasminogen or antibodies for that protein | |
| US5039791A (en) | Peptide fragments of tissue plasminogen activator |