PL124997B1 - Method of protection of animal proteins against decomposition - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób zabezpiecza¬ nia bialka zwierzecego przed rozkladem polegajacy na zahamowaniu enzymów proteolitycznych hydro- lizujacych bialko.W normalnych warunkach rozklad bialka powo¬ duja enzymy proteolityczne wystepujace w tkance, jak równiez enzymy proteolityczne bakteryjne.Jak wTiadomo enzymy proteolityczne charaktery¬ zuja sie dosc znaczna trwaloscia i rozkladaja bial¬ ko w procesie autolizy, równiez po smierci orga¬ nizmu.W zwiazku z powyzszym zabezpieczenie bialka spozywczego przed autoliza, jak równiez rozkladem bakteryjnym stanowi bardzo wazny problem za¬ równo w produkcji, jak i przechowywaniu srodków zywnosciowych.Jednym ze znanych i powszechnie stosowanych sposobów zabezpieczania bialka zwierzecego przed rozkladem jest peklowanie, polegajace na nasyce¬ niu miesa roztworem soli kuchennej, saletra i ewentualnie cukrem.Innym znanym sposobem zahamowania rozkladu bialka jest dzialanie na niego zwiazkami chemicz¬ nymi, takimi jak kwas siarkowy, kwas mrówkowy, aldehyd mrówkowy, zwiazki zelazowe i inne.Sposoby te, polegajace na wprowadzaniu do bial¬ ka niefizjologicznych zwiazków chemicznych niosa jednak ze soba mozliwosc toksycznosci i alergiza- cji dla czlowieka, a ponadto moga wplywac ujem¬ nie na walory smakowe produktów spozywczych.Stad tez ogromnego znaczenia zaczely nabierac prace w kierunku znalezienia takich substancji, które jednoczesnie hamowalyby aktywnosc enzy¬ mów proteolitycznych rozkladajacych bialko zwie¬ rzece i bylyby nieszkodliwe dla organizmu ludz¬ kiego.Znane inhibitory proteaz (otrzymywane na przy¬ klad na drodze mikrobiologicznej i syntetycznej, badz tez z organów zwierzecych jaj i roslin) znaj¬ dowaly dotychczas zastosowanie glównie w prze¬ mysle fermentacyjnym i analityce biochemicznej i farmakologicznej, przy czym kazdorazowo stoso¬ wano scisle okreslony inhibitor.Skomplikowany i nieznany dotad calkowicie proces rozkladu bialka zwierzecego, zalezny przede wszystkim od pochodzenia surowca bialkowego wy¬ maga jednak zahamowania jego rozkladu, nie jed¬ nego, scisle okreslonego inhibitora, ale wielu róz¬ nych inhibitorów, nie zawsze jeszcze znanych pro¬ teaz. Stad tez skutki tego dzialania, jak równiez optymalne warunki reakcji inhibitor-proteaza sa trudne do przewidzenia i dla bialka róznego po¬ chodzenia bardzo rózne.Nieoczekiwanie okazalo sie, ze wydatnie mozna zahamowac rozklad bialka zwierzecego substancja pochodzenia roslinnego, nietoksyczna dla organiz¬ mu ludzkiego, a mianowicie za pomoca inhibitora proteaz otrzymanego z ziemniaka.Znane jest wprawdzie z opisu patentowego RFN nr 1909265 zastosowanie inhibitora otrzymanego z \ 124 997124 997 ziemniaka wsród innych inhibitorów proteaz do konserwowania organów i tkanek, tj. do konser¬ wowania watroby, nerek, serca, trzustki, pluc, skó¬ ry i szpiku ale przeznaczonych do transplantacji, a wiec do zachowania w nich procesów zyciowych, 5 w których to procesach rozpad bialka jest ko¬ nieczny.Podane w opisie sposoby konserwacji polegaja badz na zanurzeniu organu w roztworze inhibitora, badz tez na perfuzji poprzez uklad naczyniowy. 10 Kryterium skutecznosci inhibitora jest zdolnosc or¬ ganu do dalszego zycia.W opisie patentowym RFN nr 1909965 wskazano -równiez na mozliwosc zastosowania inhibitora z ziemniaka do konserwowania srodków spozyw- 15 czych.W sposobie wedlug wynalazku inhibitor proteaz otrzymany z ziemniaka stosuje sie do zabezpie¬ czenia przed rozkladem bialka zwierzecego.Sposób zabezpieczenia bialka zwierzecego przed 2o rozkladem wedlug wynalazku, polega na tym, ze na bialko zwierzece dziala sie w temperaturze od —10 do 60°C inhibitorem proteaz otrzymanym z ziemniaka w ilosci wagowej inhibitora do bialka zwierzecego, jak 1 :100—1 :10 000 w zakresie pH ^ 2—10.W sposobie wedlug wynalazku, jako bialko sto¬ suje sie krew zwierzeca oraz miesnie, korzystnie rozdrobnione.Warunki prowadzenia sposobu wedlug wynalaz- ^ ku zapobiegaja w znacznym stopniu degradacji bialka oraz powoduja 3—6 krotne zmniejszenie produktów jego autolizy wykrywalnych metoda Lowry. Ponadto warunki te nie powoduja obnize¬ nia lub utraty aktywnosci inhibitora. 3S Zastosowany inhibitor proteaz bedacy fizjolo¬ gicznym skladnikiem ziemniaka jest nietoksyczny dla organizmu zywego i stanowi srodek calkowicie bezpieczny, dzieki czemu sposób wedlug wynalazku znajduje zastosowanie do konserwacji bialka spo- 40 zywczego.Sposób wedlug wynalazku jest blizej objasniony w przykladach wykonania, które jednakze nie ograniczaja jego zakresu.W przykladach zastosowano dostepne inhibitory tó proteaz, otrzymane metodami opracowanymi w Polsce, z których jedna wedlug polskiego opisu patentowego nr 108237 polega na wyizolowaniu inhibitora proteaz z soku bulw ziemniaka w pro¬ cesie swoistej sorpcji na sorbencie agarozie sprze- ^ gnietej z trypsyna (inhibitor nr I), natomiast dru¬ ga, wedlug polskiego opisu patentowego nr 114210 polega na otrzymaniu inhibitora proteaz z soku bulw ziemniaka w procesie tworzenia kompleksu bialkowo-taninowego (inhibitor nr II). Inhibitor 55 nr III otrzymany byl w skali przemyslowej zmo¬ dyfikowana metoda wedlug patentu nr 114210.Przyklad I. Roztwór bialka kryla miesza sie z inhibitorem nr I zawierajacym w 1 mg bialka 32 jednostki aktywnosci antytrypsynowej w sto- ^ sunku wagowym bialko kryla : inhibitor, jak 244 :1.Calosc inkubuje sie w temperaturze 25°C przez 2 godziny, utrzymujac stale pH roztworu 7,5 za pomoca buforu fosforanowego. Nastepnie reakcje przerywa sie dzialajac na mieszanine inkubacyjna ^ 5%-owym roztworem kwasu trójchlorooctowego.Produkty autolizy rozpuszczalne w kwasie trój- chlorooctowym oznacza sie metoda Lowry i wspólpr.W porównaniu z prób inkubowana bez inhibitora ilosc produktów rozkladu bialka obnizyla sie 0 78%.Przyklad II. Postepuje sie jak w przykla¬ dzie I uzywajac 1 czesc wagowa inhibitora nr I zawierajacego w 1 mg bialka 33 jednostki aktyw- nosci antytrypsynowej na 340 czesci wagowych bialka i utrzymujac stale pH w jednej próbie 7,5, zas w drugiej 9,5. Stwierdzono zmniejszenie ilosci, produktu rozkladu bialka w obecnosci inhibitora odpowiednio o 66% i 88%.Przyklad III. Roztwór bialka kryla miesza sie z inhibitorem nr I zawierajacym w 1 mg bialka 30 jednostek aktywnosci antytrypsynowych w sto¬ sunku wagowym 400 :1 i inkubuje w czasie 6 go¬ dzin w temperaturze 25°C, utrzymujac stale pH 6 w jednej próbie i pH 7,5 w drugiej próbie. Jed¬ noczesnie inkubuje sie roztwór bialka bez inhi¬ bitora. Nastepnie roztwory te, jak równiez roztwór kontrolny nieinkubowany poddaje sie elektrofore¬ zie na zelu poliakrylamidowym metoda Webera i Osborna. Stwierdzono, ze inkubacja dla obu ba¬ danych pH w obecnosci inhibitora wplywa bardzo nieznacznie na obraz elektroforetyczny bialka, na¬ tomiast w wyniku inkubacji bez inhibitora bialko ulega prawie calkowitej autolizie.Przyklad IV. Rozdrobniona poledwice wie¬ przowa zmieszana z inhibitorem nr II zawieraja¬ cym 30 jednostek aktywnosci antytrypsynowej w 1 mg bialka w stosunku wagowym 114:1 inkubuje sie w temperaturze 35°C przez 4 godziny w pH naturalnym w jednej próbie oraz w pH 3,6 w in¬ nej próbie (utrzymujac stale pH za pomoca buforu octanowego). Jednoczesnie dla porównania inkubu¬ je sie próby bez inhibitora. Wszystkie próby pod¬ daje sie elektroforezie na zelu poliakrylamidowym metoda Webera i Osborna. Stwierdzono calkowite zahamowanie rozkladu miozyny i innych bialek miesniowych w próbach zawierajacych inhibitor.Przyklad V. Rozdrobnione zamrozone mieso wieprzowe miesza sie z inhibitorem nr I zawie¬ rajacym w 1 mg bialka 8,5 jednostek aktywnosc; antytrypsynowej w stosunku wagowym bialka mie¬ sa do, bialka inhibitora 984 : l w jednej próbie oraz 49 :1 w drugiej próbie i inkubuje sie w tempera¬ turze 37°C przez 2 godziny utrzymujac stale pH 3,6 za pomoca buforu octanowego (równolegle in¬ kubuje sie próby bez inhibitora). Nastepnie reakcje przerywa sie dzialajac na mieszanine inkubacyjna 5% roztworem kwasu trójchlorooctowego. Ilosc produktów rozkladu bialka (rozpuszczalnych w kwasie trójchlorooctowym) oznaczono metoda Low¬ ry i wspólpr. Stwierdzono, ze w porównaniu z pró¬ bami inkubowanymi bez inhibitora, ilosc produk¬ tów rozkladu bialka obnizyla sie o 61% przy sto¬ sunku inhibitora do bialka miesa 1:984, natomiast przy stosunku 1:49, .produktów rozkladu nie stwierdzono wcale.Przyklad VI. Rozdrobniony miesien karpia miesza sie z inhibitorem nr I zawierajacym w 1 mg bialka 8,5 jednostek aktywnosci antytrypsy¬ nowej w stosunku wagowym 520:1 i inkubuje sie124 997 5 w temperaturze 37°C przez 4 godziny utrzymujac stale pH 3,6 za pomoca buforu octanowego w pierwszej próbie, oraz 9,5 w drugiej próbie za pomoca buforu glicynowego. Jednoczesnie dla porównania inkubuje sie próby bez inhibitora. 5 Nastepnie reakcje przerywa sie dzialajac na mie¬ szanine inkubacyjna 5% roztworem kwasu trój- chlorooctowego. Ilosc produktów rozkladu bialek rozpuszczalnych w kwasie trójchlorooctowym ozna¬ czano metoda Lowry i wspólpr. Stwierdzono, ze 10 w porównaniu z próbami inkubowanymi bez in¬ hibitora ilosc produktów rozkladu bialka obnizyla sie o 88% w próbie inkubowanej przy pH 3,6, a o 82% w próbie inkubowanej przy pH 9,5.Przyklad VII. Rodzrobniony miesien karpia 15 miesza sie z inhibitorem nr II zawierajacym w 1 mg bialka 29,5 jednostek aktywnosci antytrypsy¬ nowej w stosunku wagowym 1136 :1 i inkubuje sie przez 4 godziny w temperaturze pokojowej utrzy¬ mujac stale pH 7,2 za pomoca buforu fosforano- 20 wego. Jednoczesnie inkubuje sie próbe bez inhibi¬ tora. Nastepnie oba roztwory poddaje sie elektro¬ forezie na ielu polyakrylamidowym metoda We¬ bera i Osborna. Uzyskany przy rozdziale elektro- foretycznym obraz wskazuje, ze w obecnosci 25 inhibitora nastepuje tylko bardzo nieznaczny roz¬ klad miozyny i innych biale miesnia, podczas gdy w wyniku inkubacji w nieobecnosci inhibitora miozyna ulegala prawie calkowitemu rozkladowi, a inne bialka bardzo znacznemu. 30 Przyklad VIII. Zamrozonego kryla rozdrab¬ nia sie i miesza z roztworem 0,5 N NaCl zawiera¬ jacym inhibitor nr II o 30 jednostkach aktywnosci antytrypsynowej w 1 mg bialka, w stosunku wa¬ gowym do bialka kryla, jak 1 : 700 w jednej próbie 35 i inhibitor nr III o 12,5 jednostkach aktywnosci antytrypsynowej w 1 mg bialka w stosunku wa¬ gowym jak 1 : 122 w drugiej próbie. Inkubacje prowadzi sie w temperaturze 25°C przez 2 godziny 6 utrzymujac stale pH 7,2 za pomoca buforu fosfo¬ ranowego. Dalej postepuje sie jak w przykladzie I.Stwierdzono, ze w porównaniu z próbami inkubo¬ wanymi bez inhibitora ilosc produktów rozkladu bialka obnizyla sie o 78% przy stosunku bialka preparatu inhibitora do bialka kryla 1 :700, na¬ tomiast o 100% przy stosunku 1 : 122 (produktów rozkladu nie stwierdzono wcale).Przyklad IX. Zamrozonego kryla rozdrabnia sie i miesza z roztworem 0,5 N NaCl zawierajacym inhibitor nr II o aktywnosci antytrypsynowej 29,5 jednostek w 1 mg bialka w proporcji 10 mg prepa¬ ratu na 1 gram kryla, co stanowi okolo 1: 500 w stosunku wagowym aktywnego bialka inhibitorowe¬ go do swiezej tkanki kryla. Mieszanine inkubuje sie przez 4 godziny w temperaturze 0*C. Jednoczes¬ nie inkubuje sie analogiczna próbe bez inhibitora.Obie próby poddaje sie elektroforezie na zelu poly¬ akrylamidowym wedlug metody Webera i Osborna.W próbie inkubowanej w obecnosci inhibitora stwierdzono 3—4 krotnie wiecej miozyny i innych bialek w porównaniu z próba inkubowana bez inhibitora.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób zabezpieczania bialka zwierzecego przed rozkladem za pomoca inhibitora proteaz otrzymanego z ziemniaka, znamienny tym, ze na bialko zwierzece dziala sie w temperaturze od —10 do 60°C inhibitorem proteaz otrzymanym z ziemniaka w ilosci wagowej inhibitora do bialka, jak 1 :100—1 :10 000 w zakresie pH 2—10. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako bialko stosuje sie miesnie zwierzece. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako bialko stosuje sie krew zwierzeca. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie rozdrobnione miesnie zweirzece. PL

Claims (4)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób zabezpieczania bialka zwierzecego przed rozkladem za pomoca inhibitora proteaz otrzymanego z ziemniaka, znamienny tym, ze na bialko zwierzece dziala sie w temperaturze od —10 do 60°C inhibitorem proteaz otrzymanym z ziemniaka w ilosci wagowej inhibitora do bialka, jak 1 :100—1 :10 000 w zakresie pH 2—10.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako bialko stosuje sie miesnie zwierzece.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako bialko stosuje sie krew zwierzeca.
4. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie rozdrobnione miesnie zweirzece. PL