Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania estru metylowego N^karbobenzoksy-NG- nitro-L-arginylo-L-proliny, przeznaczonego do wytwarzania peptydów, w szczególnosci hormo¬ nów luliberyny, bradykininy, hormonu a-melanotropowego i adrenokortykotropowego oraz ich fragmentów i analogów.Znanych jest dotychczas osiem sposobów otrzymywania estru metylowego N** karbobenzoksy-NG-nitro-L-arginylo-L-proliny z N^-karbobenzoksy-N^nitro-L-argininy i chlo¬ rowodorku estru metylowego L-proliny z dodatkiem trzeciorzedowej aminy jako czynnika uwalniajacego grupe a-aminowa estru metylowego L-proliny. Róznia sie one rodzajem aktywacji grupy karboksylowej pochodnej arginylowej lub rodzajem rozpuszczalnika, stosowanego jako srodowisko reakcji. Sposoby te mozna podzielic na cztery grupy. Pierwsza grupa obejmuje trzy sposoby, dla których wspólne jest uzycie dicykloheksylokarbodiimidujako aktywatora. Róznia sie one rodzajem zastosowanego rozpuszczalnika. W sposobie najlepszym w tej grupie, tak pod wzgledem osiagnietej wydajnosci, jak i czystosci otrzymanego produktu, wydajnosc wynosi 74%, a charakterystyka produktu jest nastepujaca: temperatura topnienia 159-161°C i skrecalnosc wlas¬ ciwa [a]D25— 36.04° (c 1.3, dimetyloformamid). Druga grupa obejmuje dwa sposoby, polegajace na aktywowaniu grupy karboksylowej pochodnej arginylowej przy pomocy chloromrówczanu etylu lub izobutylu.Sposób lepszy w tej grupie daje 75% wydajnosci i produkt o nastepujacej charakterystyce: temperatura topnienia 154-156°C i skrecalnosc wlasciwa [a]D25—46.7 (c 0.5, metanol). W trzeciej grupie sa dwa sposoby, których wspólna cecha jest uprzednie wytwarzanie estru aktywnego N*-karbobenzoksy-NG-nitro-L-argininy. Jest to ester z oksymem cykloheksanonu i ester z 2,4- dinitrofenolem. Wydajnosc estru metylowego N*-karbobenzoksy-NG-nitro-L-arginylo-L-proliny otrzymanego przy pomocy estru z oksymem cykloheksanonu wynosi 90%, a przy pomocy estru z 2,4-dinitrofenolem — 60%. Charakterystyka produktu w obydwu przypadkach jest nastepujaca:2 122 751 temperatura topnienia 159-160.5°C i skrecalnosc wlasciwa [<*]d22—35.0° (c 1,dimetyloformamid).Dwie pierwsze grupy sposobów maja zalete prostoty wykonania, ale osiagniete przy ich pomocy wydajnosci nie sa najlepsze. W trzeciej grupie sposobów wydajnosc przy uzyciu estru oksymowego cykloheksanonujest najwyzsza ze wszystkich sposobów znanych, ale niedogodnoscia tego sposobu jest koniecznosc odrebnej syntezy estru aktywnego. Wydajnosc syntezy estru oksymowego cyklo¬ heksanonu wynosi 95%, co w przeliczeniu na wyjsciowa N*-karbobenzoksy-NG-nitro-L-arginine daje 85,5% wydajnosci estru metylowego N*-karbobenzoksy-NG-nitro-L-arginylo-L-proliny.Sposobem, który laczy zalety pierwszej i trzeciej z omawianych grup, to jest prostote wykona¬ nia reakcji i wysoka wydajnosc jest sposób ostatni z osmiu wyzej wspomnianych, znany z Acta Pharm. Suecica 10, 297-308 (1973). Polega on na dzialaniu dicykloheksylokarbodiimidu i 1- hydroksybenzotriazolu na N^-karbobenzoksy-N^nitro-L-arginine w srodowisku dimetyloforma¬ midu, prowadzeniu reakcji przez godzine i wytworzeniu w odrebnym etapie aktywnego estru N-benzotriazolylowego N*=-karbobenzoksy-NG-nitro-L-argininy, na który dalej w drugim odreb¬ nym etapie dziala sie chlorowodorkiem estru metylowego L-proliny z dodatkiem trietyloaminy.Sposób ten daje 82% wydajnosci dipeptydu. Jednakze w celu wyodrebnienia produktu z mieszaniny reakcyjnej stosuje sie tu chromatografie kolumnowa, a czystosc otrzymanego peptydu nie jest najlepsza, gdyz temperatura topnienia produktu wynosi 156-157°C. Powodem tego stanu rzeczy jest odrebne, trwajace godzine wytwarzanie aktywnego estru N-benzotriazolylowego N**- karbobenzoksy-NG-nitro-L-argininy. W tym czasie ester aktywny reaguje wewnatrzczasteczkowo, dajac laktam N*-karbobenzoksy-NG-nitro-L-argininy, który nie ulega aminolizie i którego nie mozna oddzielic od wlasciwego produktu na drodze ekstrakcji lub krystalizacji z ukladu etanol-eter naftowy, ze wzgledu na podobienstwo wlasciwosci chemicznych i charakterystyki rozpuszczalnosci tych dwóch zwiazków. Usuwa sie go na drodze chromatografii kolumnowej, ale tylko czesciowo, gdyz w stosowanym przez autorów sposobu ukladzie rozpuszczalników chloroform-metanol, zarówno produkt wlasciwy jak i produkt uboczny maja podobne wspólczynniki Rf. Jak z powyz¬ szego widac, sposób wytwarzania estru metylowego N -karbobenzoksy-NG-nitro -L-arginylo-L- proliny na drodze kondensacji N*-karbobenzoksy-NG-nitro-L-argininy z chlorowodorkiem estru metylowego L-proliny z dodatkiem trietyloaminy przy pomocy dicykloheksylokarbodiimidu i 1-hydroksybenzotriazolu, z powodu trwajacej godzine preparacji aktywnego estru N- benzotriazolylowego N^karbobenzoksy-NG-nitro-L-argininy, daje produkt uboczny, a mianowi¬ cie laktam N*-karbobenzoksy-NG-nitro-L-argininy, który stwarza trudnosci w wyodrebnieniu glównego produktu z mieszaniny poreakcyjnej.Istota wynalazku polega na jednoetapowym procesie kondensacji N*-karbobenzoksy-N-G~ nitro-L-argininy z chlorowodorkiem estru metylowego L-proliny wobec trietyloaminy, dicyklohe¬ ksylokarbodiimidu i 1-hydroksybenzotriazolu w srodowisku dimetyloformamidu, przy czym najpierw rozpuszcza sie w dimetyloformamidzie, chlorowodorek estru metylowego L-proliny N*-karbobenzoksy-NG-nitro-L-arginine i 1-hydroksybenzotriazol a nastepnie dodaje trietyloa- mine i dicykloheksylokarbodiimid.Sposobem wedlug wynalazku w dimetyloformamidzie rozpuszcza sie chlorowodorek estru metylowego L-proliny, N*-karbobenzoksy-NG-nitro-L-arginine i 1-hydroksybenzotriazol, chlodzi roztwór do —2°C i dodaje trietyloamine i dicykloheksylokarbodiimid. Reakcje prowadzi sie poczatkowo w temperaturze 0°C, a nastepnie w temperaturze 20°C. Schemat przebiegu reakcji przedstawiono na rysunku. Odsaccza sie osad dicykloheksylomocznika i chlorowodorku trietyloa¬ miny, dimetyloformamid odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem z dodatkiem wody w celujego latwiejszego usuniecia, stala pozostalosc wymywa kilkakrotnie eterem az do uzyskania bialej barwy osadu i pozostalosc krystalizuje z metanolu. Uzyskuje sie w pierwszym rzucie produkt z 84% wydajnoscia teoretyczna, liczona na wyjsciowa N*-karbobenzoksy-NG-nitro-L-arginineo nastepu¬ jacej charakterystyce: temperatura topnienia 160.5-161.5°C i skrecalnosc wlasciwa [<*]d21—36.98 (c 1.3 dimetyloformamid). Przesacz po pierwszym rzucie odparowuje sie do sucha, pozostalosc rozpuszcza w chlorku metylenu i faze organiczna ekstrahuje 5% roztworem KHCO3 az do calkowi¬ tego usuniecia 1-hydroksybenzotriazolu, chlorek metylenu usuwa sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem i pozostalosc krystalizuje z metanolu. Otrzymuje sie w drugim rzucie dodatkowo 4% produktu o nastepujacej charakterystyce: temperatura topnienia 160.0-161.5°C i skrecalnosc wlasciwa taka jak rzutu pierwszego.122751 3 Sposobem wedlug wynalazku otrzymuje sie produkt z wysoka wydajnoscia i o wyjatkowo wysokiej czystosci, o czym swiadcza podana wyzej temperatui a topnienia i skrecalnosc wlasciwa, a takze chromatograficzna jednorodnosc w czterech róznych typach ukladów rozpuszczalników.Te wydajnosc i czystosc produktu uzyskuje sie dzieki natychmiastowej aminolizie, wytworzonego w srodowisku reakcji estru benzotriazolylowego N^-karbobenzoksy-NG-nitro-L-argininy z estrem metylowym L-proliny, co zapobiega powstawaniu laktamu N*-karbobenzoksy-NG-nitro-L- argininy. Opracowany sposób charakteryzuje sie oprócz tego prostota wykonania, krótkim cza¬ sem, prowadzacym do produktu koncowego i znacznie mniejszym zuzyciem odczynników i rozpuszczalników w stosunku do sposobów znanych.Wynalazek ilustruje ponizszy przyklad stosowania.Przyklad. Do ochlodzonego do —2°C roztworu 19.87 g (129 mM) chlorowodorku estru metylowego L-proliny i 42.36 g (120 mM) N*-karbobenzoksy-NG-nitro-L-argininy i 20.28 g (120 mM) 80% 1-hydroksybenzotriazolu w 100 mL dimetyloformamidu dodano 16.68 mL (120 mM) trietyloaminy i 27.19 g (132 mM) dicykloheksylokarbodiimidu. Mieszanine reakcyjna mieszano 2.5 godziny w temperaturze 0°C i 17 godzin w temperaturze 20°C. Po tym czasie dodano 20 mL dimetyloformamidu i mieszano jeszcze godzine w temperaturze 20°C. Odsaczono osad dicyklohe- ksylomocznika i chlorowodorku trietyloaminy i rozpuszczalnik odparowano do konsystencji rzadkiego oleju. Dodano 20 mL wody i ponownie odparowano do momentu przejscia pozostalosci w zólty osad, który przemywano eterem etylowym cztery razy po 200 mL az do uzyskania bialej barwy osadu. Surowy produkt krystalizowano z 300 ml metanolu. Otrzymano w pierwszym rzucie 46.68 g produktu, co stanowi 84% wydajnosci teoretycznej. Produkt mial temperature topnienia 160.5-161.5°C. Z przesaczu po pierwszym rzucie odparowano metanol, pozostalosc rozpuszczono w chlorku metylenu i roztwór organiczny ekstrahowano 5% roztworem wodnym KHCO3 az do usuniecia 1-hydroksybenzotriazolu i wysuszono bezwodnym Na2S04. Chlorek metylenu odparo¬ wano pod zmniejszonym cisnieniem i pozostalosc krystalizowano z 50 mL metanolu. Otrzymano 2.39 g produktu, co stanowi 4% wydajnosci teoretycznej. Produkty otrzymane w obydwu rzutach mialy jednakowa skrecalnosc wlasciwa i analize elementarna oraz byly chromatograficznie jedno¬ rodne na 0.20 mm warstwie silikazelu w czterech róznego typu ukladach rozpuszczalników: kwasnym, zasadowym, buforowym i obojetnym. [o|d21 —36.98 (c 1.3, dimetyloformamid).Analiza dla wzoru C20H28N6O7, M = 464.48 C H N obliczone: 51.72% 6.07% 18.09% znalezione: 51.43% 6.46% 18.13% Wspólczynniki Rf: chloroform/metanol/dioksan/stezony amoniak 12:7:5:1 Rf 0.63 chloroform/metanol/kwas octowy 95:5:3 Rf 0.61 aceton/chloroform 1:1 Rf 0.45 n-butanol/kwas octowy/woda 4:1:1 Rf 0.70 n-butanol/kwas octowy/pirydyna/woda 15:3:10:6 Rf 0.71 Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania estru metylowego N*-karbobenzoksy-NG-nitro-L-arginylo-L-prolinyna drodze kondensacji N*-karbobenzoksy-NG-nitro-L-argininy z chlorowodorkiem estru metylo¬ wego L-proliny w obecnosci trietyloaminy, dicykloheksylokarbodiimidu i 1-hydroksybenzotriazo¬ lu w srodowisku dimetyloformamidu, znamienny tym, ze proces kondensacji prowadzi sie jednoetapowo przez rozpuszczenie w dimetyloformamidzie chlorowodorku estru metylowego L-proliny, N*-karbobenzoksy-NG-nitro-L-argininy, 1-hydroksybenzotriazolu i wprowadzenie do otrzymanego roztworu trietyloaminy i dicykloheksylokarbodiimidu.122 751 O O I o o 7n o-o- o II I o o o o m ID O + oo O O I o o o I CN O CM o o I o o o I 8 -* o-o-: (N OM O I o o UD O OD O o + oo LD CN O o II CN o O Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklac 120 egz.Cena 100 zl PLThe subject of the invention is a process for the preparation of N-carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginyl-L-proline methyl ester, intended for the production of peptides, in particular luliberin hormones, bradykinin, a-melanotropic and adrenocorticotropic hormones, and their fragments and analogues. So far, there are eight methods for the preparation of N ** carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginyl-L-proline methyl ester from N, -carbobenzoxy-N-nitro-L-arginine and L-proline methyl ester hydrochloride with the addition of a tertiary amine as L-proline methyl ester α-amino releasing agent. They differ in the type of activation of the arginyl carboxyl group or in the type of solvent used as the reaction medium. These methods can be divided into four groups. The first group includes three methods which share commonality with the use of dicyclohexylcarbodiimide as activator. They differ in the type of solvent used. In the best method in this group, both in terms of the yield achieved and the purity of the product obtained, the yield is 74%, and the product characteristics are as follows: melting point 159-161 ° C and specific conductivity [a] D25-36.04 ° ( c 1.3, dimethylformamide). The second group includes two methods of activating the carboxyl group of the arginyl derivative with ethyl or isobutyl chloroformate. The better method in this group gives 75% yield and a product with the following characteristics: mp 154-156 ° C and specificity [a] D25— 46.7 (c 0.5, methanol). In the third group, there are two methods, the common feature of which is the prior production of N * -carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginine active ester. It is an ester with cyclohexanone oxime and an ester with 2,4-dinitrophenol. The yield of N * -carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginyl-L-proline methyl ester with the cyclohexanone oxime ester is 90% and with the 2,4-dinitrophenol ester 60%. The product characteristics in both cases are as follows: 2 122 751 melting point 159-160.5 ° C and specificity [<*] d22—35.0 ° (c 1, dimethylformamide). The first two groups of methods have the advantage of simplicity of implementation, but achieved with their help the yields are not the best. In the third group of processes, the yield using cyclohexanone oxime is the highest of all known processes, but the disadvantage of this process is the need for a separate synthesis of the active ester. The yield of cyclohexanone oxime ester is 95%, which, based on the starting N * -carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginine, gives 85.5% of the N * -carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginyl-L methyl ester. The method which combines the advantages of the first and third of the groups discussed, i.e. the simplicity of the reaction and high yield, is the last of the eight methods mentioned above, known from Acta Pharm. Suecica 10, 297-308 (1973). It consists in the action of dicyclohexylcarbodiimide and 1-hydroxybenzotriazole on N-carbobenzoxy-N-nitro-L-arginine in the dimethylformamide environment, carrying out the reaction for an hour and producing in a separate stage the active N-benzotriazolyl ester N * = - carbobenzoxy nitro-L-arginine, which is further treated in a second separate stage with L-proline methyl ester hydrochloride with addition of triethylamine. This method gives 82% yield of the dipeptide. However, column chromatography is used to isolate the product from the reaction mixture, and the purity of the peptide obtained is not the best as the melting point of the product is 156-157 ° C. The reason for this is the separate, hourly production of the active N-benzotriazolyl ester N ** - carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginine. During this time, the active ester reacts intramolecularly, giving N * -carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginine lactam, which does not undergo aminolysis and which cannot be separated from the actual product by extraction or crystallization from the ethanol-petroleum ether system, due to similarity of the chemical properties and solubility characteristics of these two compounds. It is removed by column chromatography, but only partially, as in the chloroform-methanol solvent system used by the authors, both the real product and by-product have similar Rf factors. As can be seen from the above, the method of producing N-carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginyl-L-proline methyl ester by condensation of N * -carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginine with L-proline methyl ester hydrochloride with the addition of triethylamine with dicyclohexylcarbodiimide and 1-hydroxybenzotriazole, due to the one hour preparation of the active N-benzotriazolyl ester N-carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginine, gives a by-product, namely the lactam N * -carbobenzoxy-L NG-nitam -arginine, which makes it difficult to isolate the main product from the reaction mixture. The essence of the invention consists in a one-step condensation process of N * -carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginine with L-proline methyl ester hydrochloride in the presence of triethylamine, dicyclohexylcarbodiimide and 1-hydroxy-benzotriazole in the environment of dimethylformamide, first dissolved in dimethylformamide, the hydrochloride of L-proline methyl ester N * -carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginine and 1-hydroxybenzotriazole and then triethylamine and dicyclohexylcarbodiimide are added. According to the invention, L-proline methyl ester hydrochloride, N * -carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginine and 1-hydroxybenzotriazole are dissolved in dimethylformamide, and the solution is cooled to -2 ° C and triethyl is added. and dicyclohexylcarbodiimide. The reactions are run initially at 0 ° C and then at 20 ° C. The diagram of the course of the reaction is shown in the figure. The precipitate of dicyclohexylurea and triethylamine hydrochloride is filtered off, the dimethylformamide is evaporated under reduced pressure with the addition of water for easier removal, the solid residue is washed several times with ether until the precipitate is white, and the residue crystallizes from methanol. In the first step, the product is obtained with 84% theoretical yield, calculated on the starting N * -carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginine with the following characteristics: melting point 160.5-161.5 ° C and specificity [<*] d21-36.98 ( c 1.3 dimethylformamide). The filtrate is evaporated to dryness after the first flush, the residue is dissolved in methylene chloride and the organic phase is extracted with a 5% KHCO3 solution until the 1-hydroxybenzotriazole is completely removed, the methylene chloride is removed under reduced pressure and the residue is crystallized from methanol. In the second wave, an additional 4% of the product is obtained with the following characteristics: melting point 160.0-161.5 ° C and specific rotational behavior as in the first wave. 122 751 3 The method according to the invention produces a product of high efficiency and exceptionally high purity, as evidenced by the above temperature a melting point and specificity, as well as chromatographic homogeneity in four different types of solvent systems. These yields and product purities are obtained by immediate aminolysis of the benzotriazolyl ester produced in the environment of the reaction of the benzotriazolyl ester of N ^ -carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginine with methyl ester of L-arginine -proline, which prevents the formation of the N * -carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginine lactam. The method developed is also characterized by simplicity of implementation, a short time leading to the final product and a considerably lower consumption of reagents and solvents than the known methods. The invention is illustrated by the following example of use. For a solution chilled to -2 ° C, 19.87 g (129 mM) L-proline methyl ester hydrochloride and 42.36 g (120 mM) N * -carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginine and 20.28 g (120 mM) 80% 1- hydroxybenzotriazole in 100 mL of dimethylformamide was added 16.68 mL (120 mM) of triethylamine and 27.19 g (132 mM) of dicyclohexylcarbodiimide. The reaction mixture was stirred 2.5 hours at 0 ° C and 17 hours at 20 ° C. After this time, 20 mL of dimethylformamide was added and the mixture was stirred for another hour at 20 ° C. The precipitate of dicyclohexylurea and triethylamine hydrochloride was filtered off and the solvent was evaporated to a thin oil. 20 mL of water was added and evaporated again until the residue turned yellow, which was washed with diethyl ether four times with 200 mL until the precipitate was white. The crude product was crystallized from 300 ml of methanol. 46.68 g of product were obtained in the first crop, 84% of theory. The product had a melting point of 160.5-161.5 ° C. Methanol was evaporated from the filtrate in the first crop, the residue was dissolved in methylene chloride and the organic solution was extracted with a 5% aqueous KHCO3 solution until 1-hydroxybenzotriazole was removed and dried with anhydrous Na2SO4. The methylene chloride was evaporated under reduced pressure and the residue was crystallized from 50 ml of methanol. 2.39 g of product were obtained, corresponding to 4% of theoretical yield. The products obtained in both runs had the same specific precision and elemental analysis, and were chromatographically homogeneous on a 0.20 mm silica layer in four different types of solvent systems: acidic, basic, buffer and inert. [o | d21 —36.98 (c 1.3, dimethylformamide). Analysis for formula C20H28N6O7, M = 464.48 CHN calculated: 51.72% 6.07% 18.09% found: 51.43% 6.46% 18.13% Rf factors: chloroform / methanol / dioxane / ammonia concentrations 12 : 7: 5: 1 Rf 0.63 chloroform / methanol / acetic acid 95: 5: 3 Rf 0.61 acetone / chloroform 1: 1 Rf 0.45 n-butanol / acetic acid / water 4: 1: 1 Rf 0.70 n-butanol / acetic acid / pyridine / water 15: 3: 10: 6 Rf 0.71 Patent claim A method of producing N * -carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginyl-L-proline methyl ester by condensation of N * -carbobenzoxy-NG-nitro-L-arginine with with L-proline methyl ester hydrochloride in the presence of triethylamine, dicyclohexylcarbodiimide and 1-hydroxybenzotriazol in the dimethylformamide environment, characterized in that the condensation process is carried out in one step by dissolving N-proline methyl ester N-carbinate hydrochloride in dimethylformamide nitro-L-arginine, 1-hydroxybenzotriazole and introducing triethylamine and dicyclohexa into the obtained solution lokarbodiimidu.122 751 OOI oo 7n oo- o II I oooom ID O + oo OOI ooo I CN O CM oo I ooo I 8 - * oo-: (N OM OI oo UD O OD O o + oo LD CN O o II CN o O Pracownia Poligraficzna UP PRL. Apply 120 copies Price PLN 100 PL