Przedmiotem wynalazku jest sposób usuwania 2-ketoglukonianu z mieszaniny zawierajacej 2-ke- togulonian i 2-ketoglukonian na drodze fermentacji, pozwalajacy na otrzymanie 2-ketogulonianu prak¬ tycznie wolnego od 2-ketoglukonianu.Kwas 2-keto-L-gulonowy jest waznym pólpro¬ duktem do wytwarzania witaminy C. W wyniku kondensacji L-sorbozy z acetonem w obecnosci kwasu siarkowego, utlenienia nadmanganianem i hydrolizy pochodnej dwuizopropylidenowej w temperaturze wrzenia, otrzymuje sie kwas 2-keto- -L-gulonowy. Zostalo to opisane w Helv. Chim.Acts 17, 311 (1934) i w opisie patentowym St.Zjedn. Ameryki nr 2301811. Wytwarzanie kwasu 2-keto-L-gulonowego droga ostroznego utleniania L-sorbozy kwasem azotowym zostalo zastrzezone w brytyjskim opisie patentowym nr 443901 i w ho¬ lenderskim opisie patentowym nr 59584. Selektyw¬ na redunkcja kwasu 2,5-dwuketoglukonowego, w wyniku której otrzymuje sie mieszanine kwasu 2-ketoglukonowego i 2-ketogulonowego, oraz na¬ stepna hydroliza kwasu 2-ketogulonowego do kwa¬ su askorbinowego zostaly opisane w opisie paten¬ towym nr 114409.Przedmiotem wynalazku jest sposób usuwania 2-ketoglukonianu z mieszaniny zawierajacej 2-ke- togulonian, droga fermentacji wybranego szczepu z gatunku Pseudomonas, co ulatwia wyodrebnienie i oczyszczenie kwasu askorbinowego, wytwarzane- 10 15 20 25 30 go nastepnie droga hydrolizy pozostalego nienaru¬ szonego 2-ketogulonianu.Kwas 2,5-dwuketoglukonowy jest uzytecznym pólproduktem w syntezie witaminy C. Wytwarza sie go droga biosyntetyczna z glukozy, stosujac sposób opisany w opisie patentowym St. Zjedn.Ameryki nr 3790444. Selektywna redukcja kwasu •2,5-dwuketoglukonowego w brzeczce fermentacyj¬ nej w sposób opisany w opisie patentowym nr 114409 prowadzil do otrzymywania mieszaniny w stosunku 85 : 15 kwasu 2-ketogulonowego i 2-keto¬ glukonowego. Po hydrolizie otrzymuje sie miesza¬ nine kwasu askorbinowego i kwasu arytorbowego.. Pozadane jest aby kwas 2-ketoglukonowy, obecny w poddawanej redukcji brzeczce fermentacyjnej opidanej powyzej, zostal usuniety lub aby jego stezenie zostalo znacznie zmniejszone. Pozostaly kwas 2-ketogulonowy powinien przy tym pozostac nienaruszony, tak aby w wyniku hydrolizy po¬ wstal tylko kwas askorbinowy.Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób usu¬ wania 2-ketoglukonianu z mieszaniny zawierajacy 2-ketogulonian i 2-ketoglukonian, polegajacy na dzialaniu na te mieszanine dawka wzrostowa wy¬ branego drobnoustroju Pseudomonas fluorescens szczep WRRLB 10 lub Pseudomonas fluorescens szczep ATCG 13430 w prowadzeniu fermentacji az do praktycznie calkowitego usuniecia 2-keto¬ glukonianu. 117 461117 461 Zbadano wiele drobnoustrojów pod katem ich zdolnosci metabolizowania kwasu 2-ketoglukono- wego do dwutlenku wegla i wody bez naruszenia wspólbocznego kwasu 2-ketogulonówego. Z bada¬ nych drobnoustrojów, wyzej wymienione szczepy nalezace do gatunku Pseudomonas- okazaly sie byc zdolne do selektywnego rozkladania kwasu 2-keto- glukonowego. Robocze hodowle, które sa powszech¬ nie dostepne, zostaly zdeponowane pod nadanymi mu numerami. Fachowiec moze latwa otrzymac potrzebny mu szczep z odpowiedniej kolekcji. Tak wiec, numery kolekcji sa wystarczajaca identyfi¬ kacja danego szczepu.. Szczepy stosowane w sposobie wedlug wynalazku mozna rozmnazac w wodnej pozywce odzywczej zawierajacej zródlo przyswajalnego wegla, przy¬ swajalnego azotu i sole nieorganiczne. DoA pozywki dla inokulum pierwszego stopu korzystne jest orga¬ niczne zródlo azotu, takie jak pepton i ekstrakt miesny. Dla inokulum drugiego etapu korzystny jest wyciag naukowy kukurydzy, fosforanu jedno- wodoroamonowy i mocznik. Skladniki te korzyst¬ ne sa takze dla pozywek produkcyjnych.Porcje z 24-godzinnej hodowli w kolbach odpo¬ wiedniego szczepu Pseudomonas fluorescens w ilosci wystarczajacej do otrzymania 5% inokulunr przenosi sie do pozywki odzywczej znajdujacej sie w fermentorze w temperaturze lazni 28—30°C, mieszanej- mieszadlem mechanicznym o okolo 1700 obrotach/minute i napowietrznej okolo 0,75 obje- tosciami powietrza na objetosc brzeczki na minute.Po uplywie okolo 20 godzin odpowiednia porcje hodowli do sporzadzenia 5% inokulum przenosi sie do fermentatora zawierajacego pozywke z wycia¬ giem namokowym kukurydzy, nieorganicznymi so¬ lami amonowymi i mocznikiem. Zwiekszenie wzrostu uzyskuje sie dodajac 0,5 g/litr glukozy.Rozmnazanie prowadzi sie w temperaturze okolo 28—30°C, przy obrotach mieszadla 1700 obrotów na minute i napowietrzeniu 0,75 objetosciami po¬ wietrza na objetosc brzeczki na minute. Po uply¬ wie 8 godzin dodaje sie mieszanine 2-ketogluko- nianu i 2-ketogulohianu otrzymana podczas selektywnej redukcji 2,5-dwuketoglukonianiu (opis patentowy nr 114409), Jak wspomniano fermentacje kontynuuje sie az do praktycznie calkowitego roz¬ kladu 2-ketoglukonianu, co ocenia sie za pomoca wysokocisnieniowej chromatografii cieczowej (okolo 24 godziny). Szybkosc rozkladu 2-ketoglukonianu mozna zwiekszyc dodajac dodatkowo 5 g/litr wy¬ ciagu namodowego kukurydzy lub 0,5—1,0 g/litr mocznika.Dodawana mieszanine 2-ketoglukpnianu i 2-keto- gulonianu mozna otrzymywac droga selektywnej redukcji czystego lub surowego 2,5-dwuketogluko- nianu lub korzystnie droga redukcji brzeczki fer¬ mentacyjnej zawierajacej mieszanine otrzymana z 2,5-dwuketoglukonianu wytwarzanego biosynte- tycznie z glukozy.Zmieniajac ilosc borowodorku metalu alkalicznego stosowanego na mol 2,5-dwuketoglukonianu, otrzy¬ muje sie w redukowanej brzeczce fermentacyjnej mieszaniny 2-ketogulonianu i 2-ketoglukonianu o stosunku od 85 :15 do 45 :55.Na ogól, brzeczki fermentacyjne zawierajace wie¬ cej 2-ketogulonianu w stosunku do 2-ketoglukonia¬ nu (85: 15) sa bardziej korzystne do dalszego przerobu, to znaczy rozkladu 2-ketoglukonianu 5 podczas fermentacji Pseudomonas i nastepnej hy¬ drolizy pozostalego nienaruszonego k\^asu 2-keto- gulonowego do kwasu askorbinowego.W opisie i zastrzezeniach okreslenie 2,5-dwuketo- glukonian, 2-ketoglukonian i 2-ketogulonian doty¬ cza zarówno wolnych kwasów jak i ich soli.Nastepujace przyklady ilustruja sposób wedlug wynalazku, przy czym przyklady I i II dotycza wytwarzania^ zwiazków wyjsciowych 15 Przyklad I. Przygotowuje sie nastepujaca wodna pozywke: ' 10 45 50 55 60 Skladnik Glukoza Wyciag namokowy kukurydzy KH2P04 K2HP04 MgS04-7H20 CaC03 pH == 6,2 — — — — — — G/litr 25 5 0,5 0,5 0,2 6,3 25 Kolbe trzesawkowa zawierajaca jeden litr po¬ zywki autoklawuje sie w ciagu 30 minut w tem¬ peraturze 121°C. Wartosc pH pozywki po ochlo- 30 dzeniu wynosi 6,0. Do kolby dodaje sie 5 ml ko¬ mórek drobnoustroju Acetobacter cerinus IFO 3263 ze skosów agarowych w postaci 20 ml zawiesiny w jalowej wodzie. Kolbe wstrzasa sie na trzesawce obrotowej w temperaturze okolo 28°C, w ciagu 35 okolo 24 godzin.Porcje hodowli wzrostowej wystarczajaca do sporzadzenia 5% inokulum dodaje sie do fermen- tora o pojemnosci 4 litrów, zawierajacego 2 litry pozywki produkujacej o nastepujacym skladzie: 40 Skladnik G/litr Glukoza — 110 Wyciag namokowy kukurydzy — 0,5 H(NH4)2P04 , — 0,58 KH2P04 — 1,5 MgS04-7H20 ' — 0,5 Mocznik — 0,5 CuS04-5H20 — 1 mg Kwas nikotynowy — 300 mikrogramów pH = 6,0 Fermentacje prowadzi sie w temperaturze okolo 28°C, przy mieszaniu 1700 obrotami na minute i napowietrzaniu 0,75 objetosciami powietrza na objetosc brzeczki na minute. Po uplywie okolo 20 godzin od rozpoczecia fermentacji dodaje sie 55 g/litr wysterylizowanej glukozy. Wartosc pH utrzymuje sie za pomoca dodawania wodnego roz¬ tworu wodorotlenku sodowego. Fermentacje pro¬ wadzi sie az do uzyskania 95% kwasu 2,5-dwuke- toglukonowego z glukozy.Przyklad II. Do szybko mieszanego roztworu 20 litrów przesaczonej brzeczki fermentacyjnej za- 65 wierajacej 10% 2,5-dwuketoglukonianu sodowego117 461 (0,84 mola) z przykladu I, dodaje sie w tempera- turze 0°C 42,4 ml 2,2 molarnego NaBH4 w 7 m NaOH (0,93 mola wodoru), z szybkoscia 1 ml/mi¬ nute. Wartosc pH roztworu wzrasta gwaltownie z 3,65 do 10,2. Otrzymana zawiesine saczy sie, pH przesaczu doprowadza do 1,6 stezonym kwasem siarczkowym, wytracony osad odsacza sie i od¬ rzuca. Wartosc pH przesaczu doprowadza sie do 7,0 wodorotlenkiem sodowym. Stosunek 2-ketogulo- nianu do 2-ketoglukonianu wynosi 85 : 15.Przyklad III. Przygotowuje sie nastepujaca wodna pozywke: MgS04-7H20 Mocznik KH2P04 0,5 2 1 Skladnik Wyciag miasny Wyciag drozdzowy Pepton Glukoza NaCl G/litr 4 4 4 10 2 pH = 6,2 Skladnik Wyciag namokowy kukurydzy (NH4)2HP04 KH2P04 MgS04-7H20 Glukoza Mocznik pH == 7,0 G/litr — 8 — 1 — 1 — 0,5 — 10 — 2 Fermentacje prowadzi sie w temperaturze okolo 28—30°C, przy 1700 obrotach na minute i przy napowietrzaniu 0,75 objetosciami powietrza na objetosc brzeczki na minute. Fermentacje prowa¬ dzi sie w ciagu okolo 20 godzin i nastepnie porcje wystarczajaca do sporzadzenia 5% inokulum przenosi sie do fermentora o pojemnosci 4 litry zawierajace 2 litry nastepujacej pozywki.Skladnik G/litr Wyciag namokowy kukurydzy — 10 (NH4)2HP04 — 2 10 15 20 Kolbe trzesawkowa zawierajaca jeden litr po¬ zywki autoklawuje sie w ciagu 30 minut w tempe¬ raturze 121°C. Komórki Pseudomonas fluorescens 25 NRRL B10 ze skosów agarowych dodaje sie do kolby, która nastepnie wstrzasa sie na trzesawce w ciagu okolo 24 godzin, w temperaturze okolo 28°C.Porcje hodowli wzrostowej wystarczajaca dla uzyskania 5% inokulum dodaje sie do 2 litrów mieszanej w fermentorze o pojemnosci 4 litry na¬ stepujacej pozywki: 35 40 45 50 55 pH = 7,0 Namnazanie prowadzi sie w temperaturze okolo 28—30°C, przy 1700 obrotach na minute i przy napowietrzaniu 0,75 objetosciami powietrza na objetosc brzeczki na minute. Fermentacje prowadzi sie wciagu 8 godzin i nastepnie porcje wystarcza¬ jaca do sporzadzenia 10% inokulum przenosi sie do fermentora zawierajacego zredukowana brzecz¬ ke fermentacyjna z przykladu II o pH 7,0. Fer¬ mentacje kontynuuje sie w temperaturze 28—30°C, przy 1700 obrotach na minute i napowietrzaniu 0,75 objetosciami powietrza na objetosc brzeczki na minute, az do praktycznego zakonczenia rozkladu 2-ketoglukonianu.Przesaczona brzeczke fermentacyjna mozna dalej przerabiac dodajac ksylen i stezony kwas siarkowy i ogrzewajac podczas mieszania, w temperaturze 65°C, w ciagu okolo 5 godzin. Kwas askorbinowy wyodrebnia sie z mieszaniny reakcyjnej i oczysz¬ cza droga rekrystalizacji.Przyklad IV. Do roztworu 15 g 2,5-dwuketo- glukonianu sodowego w 150 ml wody dodaje sie podczas mieszania w temperaturze 0°C 6,61 g we¬ glanu sodowego. Wartosc pH roztworu wzrasta do 9,57 Dodaje sie 0,49 g borowodorku sodowego i roz¬ twór miesza w temperaturze 0QC w ciagu okolo 15 minut, otrzymujac mieszanine -85 : 15 2-ketogu- lonianu i 2-ketoglukonianu.Brzeczke zawierajaca komórki wzrostowe Pseudo¬ monas fluorescens ATCC 13430 dodaje sie do po¬ wyzszego zobojetnionego roztworu i rozklada 2-ke- toglukonian w sposób opisany.w przykladzie III.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób usuwania 2-ketoglukonianu z miesza¬ niny zawierajacej 2-ketogulonian i 2-ketoglukonian, znamienny tym, ze na mieszanine te dziala sie hodowla wzrostowa wybranego drobnoustroju Pseu¬ domonas fluorescens szczep NRRL B10 lub Pseudo¬ monas fluorescens szczep ATCC 13430 w wodnym roztworze pozywki fermentacyjnej i fermentacje prowadzi sie az do praktycznie calkowitego usu¬ niecia 2-ketoglukonianu. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie mieszanine 2-ketoglukonianu i 2-keto- gulonianu znajdujaca sie w selektywnie reduko¬ wanej brzeczce fermentacyjnej otrzymywanej dro¬ ga redukcji borowodorkiem 2,5-dwuketoglukonianu wytwarzanego przez dzialanie biologiczne na glu¬ koze. PL PL PL PL