PL109750B1 - Method of determining microelements in single cells of blood - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania mikroelementów w pojedynczej komórce krwi przez monitorowanie za pomoca aparatu skanin¬ gowego polaczonego z mikroisonda elektronowa.Dotychczas stosowane sposoby badan mikroele¬ mentów nie pozwalaly na dokladne okreslenie ich jakosci, rozmieszczania, a szczególnie ilosci w po¬ jedynczych komórkach krwi. Mozliwe byly tylko analizy pierwiastków w hoimogenatach duzej ilosci komórek. Me pozwalalo to na powiazanie szcze¬ gólowych badan morfofizjologiicznych, hematolo¬ gicznych i innych z analiza zawartosci pierwiast¬ ków waznych dla profilaktyki zdrowotnej.Znane sa takze sposoby oznaczania pierwiastków w metalurgii droga monitorowania pierwiastków przy pomocy mikrosondy rentgenowskiej sprzezo¬ nej z elektronowym mikroskopem skaningowym.Celem wynalazku jest sposób oznaczania mikro¬ elementów w pojedynczych komórkach krwi dla uzyskania mozliwosci ich porównania w odniesie¬ niu do wzorców chemicznych, przy zastosowaniu tego uzywanego w metalurgii urzadzenia do ozna¬ czania pierwiastków.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze po¬ brana na heparyne próbke krwi rozciencza sie dwukrotnie roztworem fizjologicznym, odwirowuje, przeplukuje sie trzykrotnie w plynie Parkera, a nastepnie trzykrotnie w plynie Parkera zbuforo- wanym do pH 7,3 przy uzyciu buforu fosforano¬ wego. Nastepnie oddzielone komórki umieszcza sie 2 w 2,5% roztworze aldehydu glutarowego w roz¬ tworze fizjologicznym na 8 godz. w temperaturze najkorzystniej 4°C, komórki krwi zostaja w ten sposób utrwalone, po czym odwodnienie przepro- ¦ wadza sie kolejno w gradiencie roztworów aceto¬ nu o stezeniach 50%, 60%, 70%, 80%, 90%j, 95%, a nastepnie trzykrotnie oplukuje sie w acetonie absolutnym przez odwirowanie z szybkoscia do 2000 obrotów na minute przez 10 minut i w trze- 10 ciiej zmianie tego acetonu pozostawia sie komórki na 24 godzin. Odwodnione komórki krwi wkrapla sie w roztworze acetonu na metalowe podstawki wykonane z aluminium lub innego metalu o czy¬ stosci 99,999%|, suszy sie w suszarce prózniowej, ** a nastepnie napyla czystym chemicznie weglem w napylarce prózniowej. Podstawki z napylonymi preparatami komórek krwi umieszcza sie w mi¬ kroskopie skaningowym polaczonym z mikrosonda elektronowa, dokonuje sie obserwacji na monitorze ao telewizyjnym, oraz wykonuje sie analizy i foto¬ grafie, przy czym parametry uzywanego pradu elektrycznego, a szczególnie napiecia przyspieszaja¬ cego dobiera sie do badanej próbki i pierwiastków w niej analizowanych tak, aby wiazka elektronów ta nie przenikala poza badana komórke wglato meta¬ lowego stolika najkorzystniej napiecie 15 kV i na¬ tezenie pradu próbki 5—10 mA, po czym z liczby impulsów wzorca i próbki badanej wylicza sie za¬ wartosc oznaczonego pierwiastka (mikroelementu). *o Po okresleniu liczby impulsów zwiazanych z pro-. 109 750109 750 mieniowaniem rentgenowskim charakterystycznym dla wybranego pierwiastka, oraz dla badanej ko¬ mórki, nastepuje wyliczenie ilosci tego pierwiastka w komórce w % wagowych wedlug wzoru: Cp = K« N w N„ N„ Cw — ilosc gdzie: Kw = wspólczynnik uwzgledniajacy poprawki ab¬ sorpcyjne, — liczba impulsów promieniowania Rtg cha¬ rakterystycznego dla analizowanego pier¬ wiastka w komórce krwi, = liczba impulsów promieniowania Rtg cha¬ rakterystycznego dla analizowanego pier¬ wiastka we wzorcu chemicznymi, badanego pierwiastka we wzorcu okreslona w % wagowym.Przyklad. Przyklad dotyczy badania zawar¬ tosci zelaza w komórce krwi. Pobrano 2 ml krwi zytnej "do strzykawki zawierajacej 200 jednostek heparyny i rozcienczono dwukrotnie roztworem fizjologicznym. Po kazdorazowej zmianie plynu, ko^ morki krwi odwirowano z szybkoscia 2000 obro¬ tów na minute przez 10 minut. Komórki krwi przeplukano trzykrotnie plynem Parkera, a nastep¬ nie trzykrotnie plynieto Parkera zbuforowanego do pH 7,3 za pomoca buforu fosforanowego. Nastepnie zawiesine tych komórek wkroplono do 2,5% roz¬ tworu aldehydu glutarowego w plynlie fizjologicz¬ nym i pozostawiono przez 8 godzin w temperaturze 4°C. Zostaly one w ten sposób utrwalone. Odwod¬ nienie komórek przeprowadzono przez zmiane roz¬ tworów acetonu o rosnacych stezeniach 50%, 60%, 70%, 80%, 90%j, 95%. Nastepnie trzykrotnie oplu¬ kano komórki krwi w roztworze acetonu absolut¬ nego i pozostawiono je w trzelciej zmianie tego acetonu przez 24 godziny w temperaturze 4°C.Odwodnione komórki wkroplono w roiztworze ace¬ tonu na metalowe podstawki wykonane z alumi- num o czystosci 99,99%. Tak przygotowane próbka suszono w suszarce prózniowej, a nastepnie napy¬ lano w napylarce prózniowej czystym chemicznie weglem. Nastepnie podstawki z komórkami krwi wprowadzono do mikroskopu skaningowego pola¬ czonego z mikrosonda elektronowa i zapisywano liczbe impulsów promieniowania rentgenowskiego charakterystyczna dla danego pierwiastka stwier¬ dzona w okresie 40 sekund podczas analizy bada¬ nej komórki.Jako wzorzec przyjeto okreslona liczbe impulsów promieniowania rentgenowskiego charalcterystycz- 10 15 20 25 30 39 40 nego dla tego samego pierwiastka. Dla badanego pierwiastka w komórce krwi stwierdzono srednio 162 impulsy promieniowania Rtg charakterystycz¬ nego dla zelaza.Natomiast dla wzorca zawierajacego 100% zelaza stwierdzono 152216 impulsów w tym samym czasie.Stad tez: 162 C_ = ¦ 0,11% wag. p 15221,6-100% Obliczono tez, ze zawartosc zelaza w analizowa¬ nej komórce krwi wynosi 0,11% wagowych.Prowadzone badania wedlug sposobu przyjetego wedlug wynalazku pozwola na wskazanie zawar¬ tosci pierwiastków w badanej komórce krwi.Zastrzezenie patentowe Sposób oznaczania mikroelementów w komórkach krwi, znamienny tym, ze pobrana najkorzystniej na heparyne próbke krwi rozciencza sie dwukrot¬ nie roztworem fizjologicznym, przy czym przy zmianie plynu komórki krwi odwirowuje sie, a od¬ wirowane komórki przeplukuje sie trzykrotnie ply¬ nem Parkera a nastepnie trzykrotnie plynem Par¬ kera zbuforowanym do pH 7,3 przy uzyciu buforu fosforanowego, nastepnie zawiesine tych komórek wkrapla sie w roztworze fizjologicznym do 2,5% roztworu aldehydu glutaroiwego i pozostawia w nim najkorzystniej przez 8 godzin w temperaturze 4°C, po czym odwadnia sie komórki w roztworze acetonu przez zmiane acetonu o (rosnacych ste¬ zeniach 50%, 60%, 70%}, 80%, 90%, 951%, nastepnie oplukuje sie je w roztworze acetonu absolutnego przez odwirowanie najkorzystniej z szybkoscia do 2000 obrotów na 10 minut i pozostawia w trzeciej zmianie tego acetonu najkorzystniej przez 24 go¬ dziny, po czym odwodnione komórki wkrapla sie w roztworze ocetonu na metalowe podstawki o czy¬ stosci metalu 99^,999%, sulszy sie w suszarce próz¬ niowej i napyla czyistym weglem w napylarce próz¬ niowej i po umieszczeniu podstawki z komórkami w mikroskopie skaningowym polaczonym z mikro- sonda elektronowa wykonuje sie analizy i foto¬ grafie przy okreslonych parametrach pradu ele¬ ktrycznego, a szczególnie napiecia dobieranego do badanej próbki tak, aby wiazka elektronów nie przenikala poza komórke najkorzystniej przy na¬ pieciu .przyspieszajacyni 15 kV i natezeniu pradu próbki 5l—tJO mA, po czym w oparciu o liczbe im¬ pulsów wzorca i próbki badanej wylicza sie za¬ wartosc oznaczonego .pierwiastka.LZGraf. Z-d Nr Z — 1905/81 115 egz. A4 Cena 45 zl PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób oznaczania mikroelementów w komórkach krwi, znamienny tym, ze pobrana najkorzystniej na heparyne próbke krwi rozciencza sie dwukrot¬ nie roztworem fizjologicznym, przy czym przy zmianie plynu komórki krwi odwirowuje sie, a od¬ wirowane komórki przeplukuje sie trzykrotnie ply¬ nem Parkera a nastepnie trzykrotnie plynem Par¬ kera zbuforowanym do pH 7,3 przy uzyciu buforu fosforanowego, nastepnie zawiesine tych komórek wkrapla sie w roztworze fizjologicznym do 2,5% roztworu aldehydu glutaroiwego i pozostawia w nim najkorzystniej przez 8 godzin w temperaturze 4°C, po czym odwadnia sie komórki w roztworze acetonu przez zmiane acetonu o (rosnacych ste¬ zeniach 50%, 60%, 70%}, 80%, 90%, 951%, nastepnie oplukuje sie je w roztworze acetonu absolutnego przez odwirowanie najkorzystniej z szybkoscia do 2000 obrotów na 10 minut i pozostawia w trzeciej zmianie tego acetonu najkorzystniej przez 24 go¬ dziny, po czym odwodnione komórki wkrapla sie w roztworze ocetonu na metalowe podstawki o czy¬ stosci metalu 99^,999%, sulszy sie w suszarce próz¬ niowej i napyla czyistym weglem w napylarce próz¬ niowej i po umieszczeniu podstawki z komórkami w mikroskopie skaningowym polaczonym z mikro- sonda elektronowa wykonuje sie analizy i foto¬ grafie przy okreslonych parametrach pradu ele¬ ktrycznego, a szczególnie napiecia dobieranego do badanej próbki tak, aby wiazka elektronów nie przenikala poza komórke najkorzystniej przy na¬ pieciu .przyspieszajacyni 15 kV i natezeniu pradu próbki 5l—tJO mA, po czym w oparciu o liczbe im¬ pulsów wzorca i próbki badanej wylicza sie za¬ wartosc oznaczonego .pierwiastka. LZGraf. Z-d Nr Z — 1905/81 115 egz. A4 Cena 45 zl PL