PL103456B1 - Sposob oczyszczania amidazy penicylinowej - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania amidazy penicylinowej za pomoca wymieniaczy jonowych. Enzym ten jest stosowany do wytwarzania kwasu 6-aminopenicylanowego metoda hydrolizy penicylin.

Znane sposoby oczyszczania amidazy penicylinowej za pomoca wymieniaczy jonowych polegaja na tym, ze surowy roztwór enzymu, stanowiacy zazwyczaj rozbita mase komórkowa mikroorganizmu wytwarzajacego amidaze (na przyklad Escherichia coli) po usunieciu latwo sedymentujacych czesci komórkowych, poddaje sie wstepnemu oczyszczeniu lub wzbogaceniu, na przyklad przez wytracenie enzymu siarczanem amonu (Bondarieva et al.. Biochemia, 1969, 34, 76), wytracenie enzymu tanina lub wytracenie zanieczyszczen w kwasnym srodowisku (opis zgloszeniowy RFN nr 1907365), sorpcje na glinokrzemianach (opis patentowy nr 83713).

Otrzymany wstepnie oczyszczony roztwór amidazy poddaje sie nastepnie dzialaniu wymieniaczy anionowych i/lub kationowych, przy czym sorpcji ulega amidaza, a zanieczyszczenia pozostaja w wycieku. Zasorbowany enzym eluuje sie z wymieniacza i ewentualnie zageszcza lub liofilizuje.

Z opisu patentowego nr 83168 znany jest równiez sposób oczyszczania amidazy penicylinowej przez wstepne stracenie zanieczyszczen z jej surowego roztworu, sorpcje zanieczyszczen bialkowych na wymieniaczu kationowym i anionowym przy wartosci pH = 5—7, a nastepnie sorpcje amidazy na jonicie i elucje.

Powyzsze metody prowadza do otrzymania roztworu lub liofilizatu amidazy penicylinowej o stopniu oczyszczenia wystarczajacym dla ich dalszego stosowania do hydrolizy penicylin. Jednak duza wada tych metod jest ich wieloetapowosc, powodujaca straty enzymu oraz trudnosci technologiczne, zwlaszcza w duzej skali.

Stwierdzono, ze prowadzenie sorpcji zanieczyszczen bialkowych, znajdujacych sie w surowym roztworze amidazy penicylinowej, na wymieniaczach jonowych w odpowiednich warunkach wartosci pH oraz wartosci przewodnictwa wlasciwego pozwala na uzyskanie preparatu enzymu o wystarczajacej czystosci w prostym, dwuetapowym procesie z pominieciem etapu wstepnego oczyszczania.

Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze surowy roztwór amidazy penicylinowej doprowadza sie do wartosci pH okolo 7—9 i wartosci przewodnictwa wlasciwego ponizej 0,2 mS i kontaktuje sie z wymieniaczem2 103 456 anionowym, a otrzymany roztwór doprowadza sie do wartosci pH okolo 5-7, kontaktuje z wymieniaczem kationowym i ewentualnie zageszcza przez ultrafiltracje. W tych warunkach na wymieniaczach jonowych sorbuja sie prawie wylacznie bialka, zanieczyszczajace amidaze penicylinowa.

Wyjsciowy surowy roztwór amidazy penicylinowej otrzymuje sie z rozbitej masy komórkowej Escherichia coli po usunieciu latwo sedymentujacych czesci komórkowych. Dalsza obróbke tego roztworu prowadzi sie w srodowisku buforu fosforanowego. Usuwanie zanieczyszczen bialkowych za pomoca wymieniacza anionowego prowadzi sie korzystnie w ukladzie kolumnowym. Po naniesieniu calej ilosci roztworu enzymu na kolumne z wymieniaczem anionowym przemywa sie kolumne buforem fosforanowym o takiej samej wartosci pH (okolo 7-9). Zmiane wartosci pH otrzymanego wycieku z kolumny, zawierajacego amidaze penicylinowa, do wartosci pH okolo 5-7 prowadzi sie korzystnie przez dodanie odpowiednie1 ilosci wymieniacza kationowego o malych porach, po czym wymieniacz ten usuwa sie. Sorpcje zanieczyszczen bialkowych na wymieniaczu kationowym prowadzi sie korzystnie w ukladzie stacjonarnym wciagu 1 do kilku godzin, po czym wymieniacz odsacza sie i przemywa, a roztwór ewentualnie zageszcza sie przez ultrafilitracje.

Otrzymany oczyszczony roztwór amidazy penicylinowej jest calkDwicie pozbawiony aktywnosci /3-laktamazowej, ajego czystosc jest wystarczajaca dla wytwarzania preparatów immobilizowanej amidazy penicylinowej, stosowanych przy hydrolizie penicylin. Roztwór ten mozna przechowywac przez wiele tygodni wstanie zamrozonym bez utraty aktywnosci enzymatycznej. Mozna go takze liofilizowac, otrzymujac suchy preparat o nie zmienionej aktywnosci enzymatycznej.

Sposób wedlug wynalazku jest objasniony nastepujacym przykladem.

Przyklad. a) Przygotowanie roztworu surowego enzymu Mase komórkowa Escherichia coli, oddzielona od podloza hodowlanego, przemyta dwukrotnie 0,9% roztworem chlorku sodowego i zawieszona w 0,02 M buforze fosforanowym o wartosci pH = 8,0 w stosunku 1 czesc objetosciowa masy komórkowej na 2 czesci objetosciowe buforu, rozbija sie przez sonifikacje lub w dezintegratorze Browna. Nastepnie uzyskany homogenat oddziela sie od stalych czesci komórkowych przez odwirowanie. Otrzymany roztwór surowego enzymu rozciencza sie woda dejonizowana tak, aby przewodnictwo elektrolityczne nie przekraczalo wartosci 0,17 mS; otrzymuje sie roztwór o stezeniu bialka okolo 20 mg/ml i aktywnosci swoistej amidazy penicylinowej okolo 0,09 j/mg. Roztwór ten wykazuje aktywnosc /Maktamazowa okolo 0,005 j/mg. b) Sorpcja na wymieniaczu anionowym 250 ml roztworu, otrzymanego metoda opisana w punkcie a), nanosi sie w temperaturze 4°C na kolumne (3,8 X 22 cm), wypelniona DEAE—celuloza i uprzednio zrównowazona 0,01 M buforem fosforanowym o wartosci pH = 8,0. Zbiera sie frakcje wycieku z kolumny po 15 ml przy szybkosci wypJ /wu 30 ml/godzine. Po naniesieniu na kolumne calej ilosci roztworu przemywa sie ja 0,01 M buforem fosforanowym o wartosci pH = 8,0. We frakcjach oznacza sie stezenie bialka i aktywnosc amidazy. Frakcje o aktywnosci swoistej enzymu wyzszej od 0,8 j/mg laczy sie i doprowadza wartosc pH otrzymanego roztworu do 5J8 przez powolne dodawanie gestej zawiesiny kationitu Dowex 50 X 8 (w formie kwasowej), po czy.n kationit odsacza »ie. c) Sorpcja na wymieniaczu kationowym 250 ml roztworu, otrzymanego metoda opisana w punkcie b), miesza sie w temperaturze 4°C wciagu 60 minut z 30 ml zelu SP—Sephadex, uzytego w formie kwasowej. Nastepnie zel odsacza sie i przemywa woda, a przesacz zageszcza sie przez ultrafiltracje do objetosci okolo 10 ml. Otrzymuje sie roztwór amidazy penicylinowej o stezeniu bialka okolo 20—30 mg/ml i aktywnosci swoistej amidazy okolo 3,5 j/mg. Roztwór ten nie wykazuje aktywnosci /Maktamazowej i moze byc stosowany bez dalszego oczyszczania do wytwarzania preparatów immobilizowanej amidazy penicylinowej.

Aktywnosc 0-laktamazowa oznacza sie metoda Ogowara i Unezawa, Biochim, Blophys. Acta, 1975, 391, 435.

Claims (2)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób oczyszczania amidazy penicylinowej przez usuwanie zanieczyszczen bialkowych za pomoca makroporowatych wymieniaczy jonowych, znamienny tym, ze surowy roztwór amidazy penicylinowej doprowadza sie do wartosci pH okolo 7-9 i wartosci przewodnictwa wlasciwego ponizej 0,2 mS i kontaktuje sie z wymieniaczem anionowym, a otrzymany roztwór doprowadza sie do wartosci pH okolo 5—7f po czym kontaktuje z wymieniaczem kationowym i ewentualnie poddaje ultrafiltracji.

2. Sposób wedlug zastrz. 1,znamienny tym, ze roztwór doprowadza sie do wartosci pH okolo 5—7 przez dodanie wymieniacza kationowego o malych porach w formie kwasowej. Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 Cena 45 zl