NO904150L

NO904150L - ANTIVIRAL AGENTS AND PROCEDURES FOR AA INCREASE THE ANTIVIRAL ACTIVITY OF AZT.

Info

Publication number: NO904150L
Application number: NO90904150A
Authority: NO
Inventors: Harry E Gruber
Original assignee: Gensia Pharma
Priority date: 1989-01-24
Filing date: 1990-09-24
Publication date: 1990-11-22
Also published as: NO904150D0

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen.Background for the invention.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører antivirale purinnukleosider, purinnukleosidanaloger og forløpere for begge. Oppfinnelsen er også rettet på fremgangsmåter for å øke den antivirale aktivitet av forbindelsen 3'azido-3'deoksytymidin ("AZT") ved tilførsel av AZT i kombinasjon med slike purinforbindelser. The present invention relates to antiviral purine nucleosides, purine nucleoside analogues and precursors of both. The invention is also directed to methods for increasing the antiviral activity of the compound 3'azido-3'deoxythymidine ("AZT") by administering AZT in combination with such purine compounds.

AZT har vist seg lovende som et antiviralt middel, nyttig ved behandling av visse infeksjoner som antas å være bevirket av retrovirus. Spesielt har AZT vist seg lovende mot humant immunodefisiensvirus. AZT has shown promise as an antiviral agent, useful in the treatment of certain infections believed to be caused by retroviruses. In particular, AZT has shown promise against human immunodeficiency virus.

AZT er anvendt for behandling av AIDS i pasienter med AIDS-relatert kompleks og for bruk i AIDS-pasienter som har hatt nylige episoder med pneumocytis carinii-relatert lungebeten-nelse. Det synes å være effektivt i synkende nivåer av human immunodefisiensvirus ("HIV") antigen i humanblodperifere monocytter. Chaisson et al., N. Engl. J. Med., bind 315, side 1610-1611 (1986). AZT has been used for the treatment of AIDS in patients with AIDS-related complex and for use in AIDS patients who have had recent episodes of pneumocytis carinii-related pneumonia. It appears to be effective in decreasing levels of human immunodeficiency virus ("HIV") antigen in human peripheral blood monocytes. Chaisson et al., N. Engl. J. Med., vol. 315, pp. 1610-1611 (1986).

AZT er en tymidinanalog hvori 3<1->hydroksygruppen er erstattet med en azidogruppe. Når den går inn i cellen blir AZT fosforylert til AZT-monofosfat ved den samme cellulære kinase som fosforylerer tymidin. AZT-monofosfat blir så fosforylert til difosfatformer og trifosfatformer ved andre cellulære kinaser. AZT-trifosfat sies å innvirke med retroviral RNA-avhengig DNA-polymerase (eller "revers transkriptase"), slik at viral replikasjon inhiberes. In vitro tester er også sagt å understøtte en mekanisme hvorved AZT-trifosfat innlemmes ved hjelp av virus revers transkriptase inn i DNA-kopier av HIV etter at virus er gått inn i cellen og begynner å replikere. AZT is a thymidine analogue in which the 3<1->hydroxy group is replaced by an azido group. When it enters the cell, AZT is phosphorylated to AZT monophosphate by the same cellular kinase that phosphorylates thymidine. AZT monophosphate is then phosphorylated into diphosphate forms and triphosphate forms by other cellular kinases. AZT triphosphate is said to interact with retroviral RNA-dependent DNA polymerase (or "reverse transcriptase"), so that viral replication is inhibited. In vitro tests are also said to support a mechanism by which AZT triphosphate is incorporated by viral reverse transcriptase into DNA copies of HIV after the virus has entered the cell and begins to replicate.

De voksende DNA-kjeder som innlemmer AZT-trifosfat blir derved tidligere avsluttet på grunn av at AZT ikke kan motta et ytterligere nukleotid ved 3<1->stillingen. AZT har en noe større affinitet for viral revers transkriptase enn for human DNA-polymeraser. Således kan HIV-replikasjon forsinkes uten å blokkere cellereplikasjonen. The growing DNA chains incorporating AZT triphosphate are thereby terminated earlier because AZT cannot receive an additional nucleotide at the 3<1> position. AZT has a somewhat greater affinity for viral reverse transcriptase than for human DNA polymerases. Thus, HIV replication can be delayed without blocking cell replication.

Fosforyleringen av AZT til AZT-monofosfat ved hjelp av tymidinkinase er foreslått som et hastighetsbegrensende trinn ved denne prosess. Richman og Carson, Journal of Experimental Medicine, bind 166, side 1144-1149 (oktober 1987). Richman og Carson anga at AZT ikke kunne fosforyleres til trifosfatformen i de perifere blodmakrofager i friske personer i høye nok konsentrasjoner til å inhibere AIDS-virus revers transkriptase. De foreslo at et lavt nivå for innlemmelse av AZT var relatert til et fire ganger lavere nivå av enzymtymidinkinase sammenlignet med lymfoblastlinjen CEM. Det ble rapportert at denne lavere aktivitet av tymidinkinase var assosiert med en ni ganger lavere akkumulering av AZT-nukleotider og at det ni ganger lavere nivå av AZT-nukleotider var assosiert med en 100 til 1000 gangers reduksjon i antiviral aktivitet i makrofager sammenlignet med CEN-celler. The phosphorylation of AZT to AZT monophosphate by thymidine kinase has been proposed as a rate-limiting step in this process. Richman and Carson, Journal of Experimental Medicine, Volume 166, Pages 1144-1149 (October 1987). Richman and Carson indicated that AZT could not be phosphorylated to the triphosphate form in the peripheral blood macrophages of healthy subjects at high enough concentrations to inhibit AIDS virus reverse transcriptase. They suggested that a low level of AZT incorporation was related to a fourfold lower level of the enzyme thymidine kinase compared to the lymphoblast line CEM. It was reported that this lower activity of thymidine kinase was associated with a nine-fold lower accumulation of AZT nucleotides and that the nine-fold lower level of AZT nucleotides was associated with a 100- to 1000-fold reduction in antiviral activity in macrophages compared to CEN- cells.

Det foreslås her at minst to viktige parametre påvirker hvor mye AZT-trifosfat blir innlemmet i de nylig dannede virale nukleinsyrer og/eller hvorledes effektiv revers transkriptase inhiberes: 1) mengden av AZT-trifosfat som er tilstede og 2) mengden av tymidintrifosfat ("TTP") som er tilstede. Det antas at AZT-trifosfat konkurrerer med TTP for innlemmelse i de nylig syntetiserte nukleinsyrer. En del av reduksjonen i effektivitet av AZT rapportert av Richman og Carson kan således ha vært forbundet med andre faktorer enn fosforylering. F.eks. kan makrofager ha iboende høyere TTP-innhold enn CEM-celler. TTP-innholdene ble imidlertid ikke målt. Viktigheten av mengden av TTP tilstede som en parameter for AZT-innlemmelse er understøttet av virkningen av middelet ribavirin på HIV-replikasjon i nærvær av AZT. Boght et al., Science, bind 235, side 1376-1379 (mars 1987), rapporterte at ribavirin reduserte effektiviteten av AZT mot AIDS-virus i både perifere blodlym-focytter og H9-celler, og at ribavirin nedsetter fosforylering av AZT til mono-, di- og trifosfatformene med en faktor på omtrent 10 i både AIDS-infiserte og uinfiserte celler. Forfatterne foreslo at ribavirin kunne virke ved å nedsette AZT-trifosfatdannelsen ved en økning i TTP-mengden som resulterer i en tilbakekoblingsinhibering av enzymet tymidin kinase slik at fosforyleringen av AZT til AZT-trifosfat med dette enzym ble redusert, eller ved å redusere innvirkningen av AZT-trifosfat med HIV revers transkriptaseenzym. It is proposed here that at least two important parameters influence how much AZT triphosphate is incorporated into the newly formed viral nucleic acids and/or how efficiently reverse transcriptase is inhibited: 1) the amount of AZT triphosphate present and 2) the amount of thymidine triphosphate ("TTP ") that is present. It is believed that AZT triphosphate competes with TTP for incorporation into the newly synthesized nucleic acids. Thus, part of the reduction in effectiveness of AZT reported by Richman and Carson may have been associated with factors other than phosphorylation. E.g. macrophages may have intrinsically higher TTP content than CEM cells. However, the TTP contents were not measured. The importance of the amount of TTP present as a parameter for AZT incorporation is supported by the effect of the drug ribavirin on HIV replication in the presence of AZT. Boght et al., Science, vol. 235, pp. 1376-1379 (March 1987), reported that ribavirin reduced the efficacy of AZT against the AIDS virus in both peripheral blood lymphocytes and H9 cells, and that ribavirin decreases phosphorylation of AZT to mono -, di-, and triphosphate forms by a factor of about 10 in both AIDS-infected and uninfected cells. The authors proposed that ribavirin could act by decreasing AZT triphosphate formation by an increase in the amount of TTP resulting in a feedback inhibition of the enzyme thymidine kinase so that the phosphorylation of AZT to AZT triphosphate by this enzyme was reduced, or by reducing the effect of AZT -triphosphate with HIV reverse transcriptase enzyme.

Bruken av AZT har jo visse ulemper. Det er f.eks. ukjent om AZT kan tolereres over en lengre tid. Nærmere klinisk erfaring er fremdeles i en viss grad begrenset og langtidsvirkningene av kronisk AZT-behandling må fremdeles vurderes. Det er på den annen side kjent at AZT har tallrike bivirkninger, inkluderende benma.rggiftighet. Den mest vanlige bivirkning er således makrocytisk anemi, som kan være alvorlig nok til å kreve blodoverføringer, og som er rapportert å vise seg i 11P til 45 % av pasientene med et CD4 (T4) lymfocyttall på£200/mm<5>. Granulocytopeni er blitt rapportert å forekomme i opp til 55 % av pasientene med et CD4-tall på£200/mm<5>og i opp til 40 % av pasientene med CD4-tall på > 200/mm<5>(henholdsvis 19 % og 13 % av disse pasienter viste granulocytopeni med placebo), Physician's Desk Reference, side 820 (42. utgave 1988). Det er mulig at pasienter med folatdefisiens eller vitamin B12-mangel kan være mer sensitive overfor benmargdepresjonen bevirket av AZT. I mange tilfeller kan pasienter tåle en redusert dose av AZT med resulterende forbedring i tallet av hvite blodlegemer og anemi. Alvorlig hodepine, svimmelhet, søvnløshet og myalgi er også rapportert i en betraktelig større grad i AZT-resipienter. The use of AZT has certain disadvantages. It is e.g. unknown whether AZT can be tolerated over a longer period of time. Closer clinical experience is still to some extent limited and the long-term effects of chronic AZT treatment still need to be assessed. On the other hand, AZT is known to have numerous side effects, including bone marrow toxicity. Thus, the most common side effect is macrocytic anemia, which may be severe enough to require blood transfusions, and which has been reported to occur in 11P in 45% of patients with a CD4 (T4) lymphocyte count of £200/mm<5>. Granulocytopenia has been reported to occur in up to 55% of patients with a CD4 count of £200/mm<5> and in up to 40% of patients with a CD4 count of > 200/mm<5> (19% respectively and 13% of these patients showed granulocytopenia with placebo), Physician's Desk Reference, page 820 (42nd ed. 1988). It is possible that patients with folate deficiency or vitamin B12 deficiency may be more sensitive to the bone marrow depression caused by AZT. In many cases, patients can tolerate a reduced dose of AZT with resulting improvement in white blood cell count and anemia. Severe headache, dizziness, insomnia, and myalgia have also been reported to a significantly greater extent in AZT recipients.

AZT har også vist å ha antibakteriell aktivitet. Det har vært rapporter om en forbedret virkning fra behandling av bakterier med både AZT og antifolatantibiotika, nemlig sulfonamidene. Elwell et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, bind 31, side 274 (1987). Forfatterne spekulerte ikke på mekanismen med den iakttatte økte følsomhet overfor AZT i nærvær av sulfonamider. De rapporterte imidlertid deres kliniske iakt-tagelser at behandling av pasienter med pneumocystis carini lungebetennelsesinfeksjon med både AZT og sulfonamider syntes nyttig. AZT has also been shown to have antibacterial activity. There have been reports of an improved effect from treatment of bacteria with both AZT and antifolate antibiotics, namely the sulfonamides. Elwell et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Volume 31, Page 274 (1987). The authors did not speculate on the mechanism of the observed increased sensitivity to AZT in the presence of sulfonamides. However, they reported their clinical observations that treatment of patients with pneumocystis carini pneumonia infection with both AZT and sulfonamides appeared beneficial.

Enzymet S-adenosylhomocystein ("SAH") hydrolase katalyserer den reversible hydrolyse av S-adeonylhomocystein til adenosin og L-homocystein. Når konsentrasjonen av disse substrater er høyere enn i det mikromolare område begunstiger reaksjonen syntese. Ueland, Pharmacological Reviews, bind 34, side 223-253 (1982). Der er et antall acykliske og karbocykliske analoger av adenosin som er rapportert å skyldes deres antivirale aktivitet til inhibering av SAH-hydrolase. De Clercq, Biochemical Pharmacology, bind 36, side 2567-2575 (1987). Ingen SAH-hydrolaseinhibitorer er blitt rapportert å ha antihuman retroviral eller anti-HIV-aktivitet. The enzyme S-adenosylhomocysteine ("SAH") hydrolase catalyzes the reversible hydrolysis of S-adenoylhomocysteine to adenosine and L-homocysteine. When the concentration of these substrates is higher than in the micromolar range, the reaction favors synthesis. Ueland, Pharmacological Reviews, vol. 34, pp. 223-253 (1982). There are a number of acyclic and carbocyclic analogues of adenosine which have been reported to owe their antiviral activity to inhibition of SAH hydrolase. De Clercq, Biochemical Pharmacology, Volume 36, Pages 2567-2575 (1987). No SAH hydrolase inhibitors have been reported to have antihuman retroviral or anti-HIV activity.

Farmakologiske egenskaper av AICA-ribosid (5-amino-l-A-D-ribofuranosyl-imidazol-4-karboksamid), inkluderende metabolisme og metaboliske virkninger, ble beskrevet av Thomas et al., Journal of Cellular Physiology, bind 103, side 335-344 (1981). AICA-ribosid ble oppdaget i 19 5 0-årene i dyrkningsmedia av bakterier som dyrkes i nærvær av sulfonamidantibiotika. Antifolategenskapene av sulfonamidene bevirker en blokkering i purinmetabolismen som bevirker en oppbygning av AICA-ribosid-monofosfat i cellene som så kataboliseres og utskilles som AICA-ribosid. Etter studier under bruk av kinesiske hamster-lungefibroblaster skrev Thomas et al. at AICA-ribosid, med en konsentrasjon på 200 uM, stanset cellevekst assosiert med pyrimidinmangel som ble reversert ved tilsetning av pyrimidin-uridin. Artikkelen refererer også til en omfattende litteratur om de toksiske virkninger av purinnukleosider som adenosin og deoksyadenosin på celleveksten. Andre forbindelser, som EHNA og deoksykoformycin, som inhiberer adenosindeaminase og bevirker en oppbygning av adenosin og deoksyadenosin, er også cytotoksiske ved pyrimidinmangel. Disse andre molekyler har ytterligere cytotoksiske virkninger i tillegg til enkel pyrimidinmangel. Undersøkelser er foretatt med adenosin og deoksyadenosin som cytotoksiske immunosuppresive forbindelser. Pharmacological properties of AICA riboside (5-amino-1-A-D-ribofuranosyl-imidazole-4-carboxamide), including metabolism and metabolic actions, were described by Thomas et al., Journal of Cellular Physiology, vol. 103, pp. 335-344 (1981 ). AICA riboside was discovered in the 1950s in the culture media of bacteria grown in the presence of sulfonamide antibiotics. The antifolate properties of the sulfonamides cause a block in purine metabolism which causes a build-up of AICA riboside monophosphate in the cells which is then catabolized and excreted as AICA riboside. After studies using Chinese hamster lung fibroblasts, Thomas et al. that AICA riboside, at a concentration of 200 µM, arrested cell growth associated with pyrimidine deficiency that was reversed by addition of pyrimidine-uridine. The article also refers to an extensive literature on the toxic effects of purine nucleosides such as adenosine and deoxyadenosine on cell growth. Other compounds, such as EHNA and deoxycoformycin, which inhibit adenosine deaminase and cause a build-up of adenosine and deoxyadenosine, are also cytotoxic in pyrimidine deficiency. These other molecules have additional cytotoxic effects in addition to simple pyrimidine deficiency. Investigations have been carried out with adenosine and deoxyadenosine as cytotoxic immunosuppressive compounds.

Gruber et al., Annals of the New York Academy of Science, bind 51, side 315-318 (1985) . Gruber et al., Annals of the New York Academy of Science, Volume 51, Pages 315-318 (1985).

Arbeidet om AICA-ribosid av Thomas et al., supra, førte til deres konklusjon om en ekspansjon av ATP- og GTP-mengdene kombinert med et depression av fosforibosylpyrofosfat (PRPP) mengden ved 200 uM AICA-ribosid. Purinmengden (ATP og GTP) ble sagt å være utvidet med omtrent 40 % ved 50 uM og 200 uM AICA-ribosid. Ved 50 uM og 200 uM AICA-ribosid falt PRPP-tilgjengeligheten som målt ved adenininnlemmelsen, med henholdsvis 18 og 82 %. Det ble antatt at den fortsatte virkning av en økning i purinmengdene og en nedsettelse i PRPP-tilgjengeligheten resulterte i en inhibering av enzymorotatfosforibosyl-trans-feraseorotatdekarboksylase (OPRT-ODC). Dette enzym omdanner orotat til uridinmonofosfat. Celler dyrket med konsentrasjon på 50 uM og 200 uM AICA-ribosid fremviste en redusert veksttakt som var reversibel ved tilsetning av uridin til dyrkningsmedia og som viste en medfølgende økning i orotatmengdene i dyrkningsmedia som omgir disse celler. Thomas et al. konkluderte at AICA-ribosid bevirket pyrimidinmangel ved sine virkninger på ATP-, GTP- og PRPP-mengdene. De inhiberende virkninger som var rapportert synes å være resultatet av pyrimidinmangelen alene, mens andre forbindelser som bevirket pyrimidinmangel hadde tallrike andre cytotoksiske virkninger. The work on AICA riboside by Thomas et al., supra, led to their conclusion of an expansion of ATP and GTP levels coupled with a depression of phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP) levels at 200 uM AICA riboside. Purine abundance (ATP and GTP) was said to be expanded by approximately 40% at 50 µM and 200 µM AICA riboside. At 50 µM and 200 µM AICA riboside, PRPP availability as measured by adenine incorporation decreased by 18 and 82%, respectively. It was hypothesized that the continued effect of an increase in purine levels and a decrease in PRPP availability resulted in an inhibition of the enzyme orotate phosphoribosyl-transferaseorotate decarboxylase (OPRT-ODC). This enzyme converts orotate to uridine monophosphate. Cells cultured with concentrations of 50 uM and 200 uM AICA riboside exhibited a reduced growth rate which was reversible upon addition of uridine to the culture media and which showed a concomitant increase in the amounts of orotate in the culture media surrounding these cells. Thomas et al. concluded that AICA riboside caused pyrimidine deficiency by its effects on ATP, GTP and PRPP levels. The inhibitory effects that had been reported appear to be the result of the pyrimidine deficiency alone, while other compounds that caused pyrimidine deficiency had numerous other cytotoxic effects.

Thomas et al. rapporterte også at UTP- og CTP-mengdene ble nedsatt med en faktor på omtrent 10. TTP-mengdene ble ikke målt. Det ble rapportert at ved en mye høyere dose, 700 uM AICA-ribosid ble ATP- og GTP-mengdene ikke forhøyet, men det var fremdeles en reduksjon i PRPP-mengdene. Ved denne AICA-ribosidkonsentrasjon og med denne kombinasjon av iakttatte virkninger var der ingen cytotoksisitet, ingen oratatutskil-ling, men fremdeles en nedsettelse av UTP og CTP. På grunn av at det fremdeles var normal vekst kan mangel på oratat ha indikert en kompensert pyrimidinnedsettelse. Thomas et al. also reported that UTP and CTP amounts were decreased by a factor of approximately 10. TTP amounts were not measured. It was reported that at a much higher dose, 700 µM AICA riboside, ATP and GTP levels were not elevated, but there was still a decrease in PRPP levels. At this AICA riboside concentration and with this combination of observed effects, there was no cytotoxicity, no oratate secretion, but still a reduction of UTP and CTP. Because there was still normal growth, lack of oratate may have indicated a compensated pyrimidine depletion.

Mens AZT er det første antivirale middel som er markedsført med en indikasjon for behandlingen av AIDS, er det kjent å være meget dyrt og giftig, det krever hyppig tilførsel, og det er tilgjengelig bare i begrenset mengde. Det skal således forstås at mer lettere tilgjengelige antivirale midler med mindre giftighet, eller midler som vil nedsette bivirkningene av AZT, eller begge deler, er ønsket og vil være av stor nytte. Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer slike midler. While AZT is the first antiviral agent marketed with an indication for the treatment of AIDS, it is known to be very expensive and toxic, requires frequent administration, and is available only in limited quantities. It should thus be understood that more easily available antiviral agents with less toxicity, or agents that will reduce the side effects of AZT, or both, are desired and will be of great benefit. The present invention provides such means.

Oppsummering av oppfinnelsen.Summary of the invention.

Den foreliggende oppfinnelse er rettet på anvendelse av visse purinnukleosider og nukleotider og analoger eller forløpere derav som antivirale midler, og videre til en fremgangsmåte for å øke den antivirale, antibakterielle og antiparasittiske aktivitet av AZT som går ut på tilførsel av AZT i kombinasjon med en terapeutisk effektiv mengde av en slik purinforbindelse. Foretrukne antiretrovirale purinforbindelser er dem som virker til å nedsette TTP-nivåene eller som virker til å inhibere enzym 5-adenosylhomocysteinhydrolasen eller begge deler. De antivirale og antiretrovirale purinnukleosider inkluderer Al CA, AICA-ribosid og karbocyklisk AICA-ribosid, idet AICA-ribosid foretrekkes. Foretrukne antivirale og antiretrovirale purinnukleosidforløpere inkluderer 5-amino-31 -(2-metyl-l-propoksykarbonyl)-l-p-D-ribofuranosyl-imidazol-4-karboksamid, 5-amino-3'-(1-propoksykarbonyl)-l-p-D-ribofuranosyl-imidazol-4-karboksamid, og 2',3'-cyklokarbonat AICA-ribosid. Den første forløper synes også å ha noen analog aktivitet. The present invention is directed to the use of certain purine nucleosides and nucleotides and analogues or precursors thereof as antiviral agents, and further to a method for increasing the antiviral, antibacterial and antiparasitic activity of AZT which involves the administration of AZT in combination with a therapeutic effective amount of such a purine compound. Preferred purine antiretroviral compounds are those that act to decrease TTP levels or that act to inhibit the enzyme 5-adenosylhomocysteine hydrolase or both. The antiviral and antiretroviral purine nucleosides include Al CA, AICA riboside, and carbocyclic AICA riboside, with AICA riboside being preferred. Preferred antiviral and antiretroviral purine nucleoside precursors include 5-amino-3'-(2-methyl-1-propoxycarbonyl)-1-β-D-ribofuranosyl-imidazole-4-carboxamide, 5-amino-3'-(1-propoxycarbonyl)-1-β-D-ribofuranosyl-imidazole -4-carboxamide, and 2',3'-cyclocarbonate AICA riboside. The first precursor also appears to have some analogous activity.

Blant andre faktorer vedrører den foreliggende oppfinnelse den erkjennelse at purinnukleosid AICA-ribosidet, AlCA-ribosidfor-løperne, og visse AICA-ribosidanaloger har antiviral aktivitet og at kombinasjonen av AZT med disse forbindelser øker den antivirale aktivitet av AZT. Iakttatte økninger i den antivirale virkning av AZT inkluderer virkninger med en faktor med størrelsesorden 10 eller mer. Følgelig, ved å anvende AZT i forbindelse med slike purinnukleosider eller analoger, eller forløpere derfor, kan den nødvendige konsentrasjon av AZT nedsettes, slik at AZT-relaterte bivirkninger og giftighet nedsettes, sammen med doseringssekvensen, og utgiftene til AZT-behandling nedsettes også. Among other factors, the present invention relates to the recognition that the purine nucleoside AICA riboside, the AlCA riboside precursors, and certain AICA riboside analogs have antiviral activity and that the combination of AZT with these compounds increases the antiviral activity of AZT. Observed increases in the antiviral activity of AZT include effects by a factor of 10 or more. Accordingly, by using AZT in conjunction with such purine nucleosides or analogs, or precursors thereof, the required concentration of AZT can be decreased, so that AZT-related side effects and toxicity are decreased, along with the dosage sequence, and the expense of AZT treatment is also decreased.

Ved et relatert aspekt er den foreliggende oppfinnelse rettet på en fremgangsmåte for å nedsette eller forhindre replikasjon av et virus, særlig et retrovirus, som omfatter tilførsel av en terapeutisk effektiv mengde av AZT i forbindelse med en terapeutisk effektiv mengde av et purinnukleosid eller analog, eller forløper derav, som øker innlemmelsen av AZT-trifosfat i DNA ved revers transkriptase. In a related aspect, the present invention is directed to a method of reducing or preventing the replication of a virus, particularly a retrovirus, comprising administering a therapeutically effective amount of AZT in conjunction with a therapeutically effective amount of a purine nucleoside or analog, or precursor thereof, which increases the incorporation of AZT triphosphate into DNA by reverse transcriptase.

Med et ytterligere aspekt er oppfinnelsen rettet på en fremgangsmåte for å nedsette eller forhindre replikasjon av et retrovirus, særig et humant retrovirus, omfattende tilførsel av en terapeutisk effektiv mengde av en SAH-hydrolaseinhibitor. Det er blitt bestemt at AICA og AICA-ribosid er kraftige inhibitorer av SAH-hydrolase, selv ved en konsentrasjon så lav som 10 uM. De ovenfor anførte purinnukleosidanaloger og forløpere virker også til å inhibere SAH-hydrolase. Disse purinnukleosider kan tilføres uten AZT for å nedsette eller forhindre viral replikasjon og kan anvendes alene for behandling av pasienter med AIDS eller HIV-infeksjoner. In a further aspect, the invention is directed to a method for reducing or preventing the replication of a retrovirus, particularly a human retrovirus, comprising administering a therapeutically effective amount of a SAH hydrolase inhibitor. It has been determined that AICA and AICA riboside are potent inhibitors of SAH hydrolase, even at a concentration as low as 10 µM. The purine nucleoside analogs and precursors listed above also act to inhibit SAH hydrolase. These purine nucleosides can be administered without AZT to reduce or prevent viral replication and can be used alone for the treatment of patients with AIDS or HIV infections.

Visse anticancermedisiner synes å konkurrere med TTP for innlemmelse i nukleidsyrene. Deres aktiviteter antas å være begrenset ved deres fosforyleringstakt. Følgelig, ved et ytterligere aspekt er den foreliggende oppfinnelse rettet på å øke aktivitetene av disse midler, f.eks. 5-fluorouracil og 2'-deoksy-5-fluorouridin, ved å tilføre dem i forbindelse med et purinnukleosid eller analog derav som AICA-ribosid som nedsetter TTP-nivåene. Certain anticancer drugs appear to compete with TTP for incorporation into the nucleic acids. Their activities are thought to be limited by their phosphorylation rate. Accordingly, in a further aspect, the present invention is directed to increasing the activities of these agents, e.g. 5-fluorouracil and 2'-deoxy-5-fluorouridine, by adding them in conjunction with a purine nucleoside or analogue thereof such as AICA-riboside which lowers TTP levels.

Dosen av forbindelsene i samsvar med oppfinnelsen for de beskrevne anvendelser vil normalt være i området fra omtrent 1 til omtrent 1000 mg/kg/døgn, foretrukket fra omtrent 10 til omtrent 300 mg/kg/døgn, spesielt omtrent 10 til omtrent 100 mg/kg/døgn. The dose of the compounds according to the invention for the described uses will normally be in the range from about 1 to about 1000 mg/kg/day, preferably from about 10 to about 300 mg/kg/day, especially about 10 to about 100 mg/kg /day and night.

Kort beskrivelse av tegningene.Brief description of the drawings.

Fig. l(a) De antivirale virkninger av AICA-ribosid og AZT under anvendelse av en murin vektor ("BAG") fylt med et murint virus ("MA") i den humane makrofage cellelinje U937, ført til en rottefibroblastlinje og selektert i neomycin. p-verdiene sammenligner behandlede med Fig. 1(a) The antiviral effects of AICA riboside and AZT using a murine vector ("BAG") loaded with a murine virus ("MA") in the human macrophage cell line U937, transferred to a rat fibroblast line and selected in neomycin. The p-values compare treated with

ubehandlede celler.untreated cells.

Fig. l(b) De antivirale virkninger av AICA-ribosid og AZT under anvendelse av en neomycinresistens genholdig vektor ("N2") sammen med en murin hjelpercelle og infeksjon av rottefibroblaster. p-verdiene sammenligner behandlede med ubehandlede celler. Fig. 2 Reduksjon i virustiter (antall syncitia) etterfulgt av 24 timers preinkubasjon av CEN-human T-cellelinje med a) AICA-ribosid og b) AZT før infeksjon med HIV. Fig. 3 Reduksjon i virustiter (antall syncitia) ved tilsetning av AICA-ribosid til CEN-human T-cellelinje ved tidspunktet for infeksjon med HIV. Fig. 4 Reduksjon i virustiter som prosent av kontroll gjen-nomsnittlig fra tre forsøk på HIV-infiserte CEN-humane T-celler, hver foretatt i triplikat, under anvendelse av a) AICA-ribosid, og b) AZT. p-verdiene sammenligner behandlede med ubehandlede celler. Fig. 5 Reduksjon i virustiter som prosent av kontroll etter 24 timers preinkubasjon av HIV-infisert human T-cellelinje SupT-1 med a) AICA-ribosid og b) AZT. p-verdiene sammenligner behandlede med ubehandlede celler. Fig. 6 Reduksjon i virustiter som prosent av kontroll gjen-nomsnittlig fra tre forsøk under anvendelse av AZT i kombinasjon med AICA-ribosid i HIV-infiserte humane T-cellelinjer a) CEM og b) SupT-1. Fig. 7 Reduksjon i virustiter som prosent av kontroll under anvendelse av 1) AICA-ribosid, 2) 5-amino-3'-(2-metyl-1-propoksykarbonyl)-1-p-D-ribofuranosyl-imidazol-4-karboksamid (eller "3'-isobutoksykarbonyl AICA-ribosid") (preparater A og B), og 3) 5-amino-3'-(1-propoksykarbonyl) -l-(3-D-ribofuranosyl-imidazol-4-karboksamid i HIV-infiserte SupT-l-celler. Fig. 8 Vekstkurver som viser virkningen av AICA-ribosid i nærvær av AZT, på T-cellevekst under anvendelse av a) CEM og b) SupT-l-cellelinjer og c) på B-cellevekst under anvendelse av WI-L2-cellelinje. Fig. 1(b) The antiviral effects of AICA riboside and AZT using a neomycin resistance gene-containing vector ("N2") together with a murine helper cell and infection of rat fibroblasts. The p-values compare treated with untreated cells. Fig. 2 Reduction in virus titer (number of syncitia) following 24 h preincubation of CEN human T cell line with a) AICA riboside and b) AZT before infection with HIV. Fig. 3 Reduction in virus titer (number of syncitia) by addition of AICA riboside to CEN human T-cell line at the time of infection with HIV. Fig. 4 Reduction in virus titer as percent of control averaged from three experiments on HIV-infected CEN human T cells, each performed in triplicate, using a) AICA riboside, and b) AZT. The p-values compare treated with untreated cells. Fig. 5 Reduction in virus titer as a percentage of control after 24 hours pre-incubation of HIV-infected human T-cell line SupT-1 with a) AICA riboside and b) AZT. The p-values compare treated with untreated cells. Fig. 6 Reduction in virus titer as percent of control averaged from three experiments using AZT in combination with AICA riboside in HIV-infected human T-cell lines a) CEM and b) SupT-1. Fig. 7 Reduction in virus titer as a percentage of control using 1) AICA riboside, 2) 5-amino-3'-(2-methyl-1-propoxycarbonyl)-1-β-D-ribofuranosyl-imidazole-4-carboxamide ( or "3'-isobutoxycarbonyl AICA riboside") (preparations A and B), and 3) 5-amino-3'-(1-propoxycarbonyl)-1-(3-D-ribofuranosyl-imidazole-4-carboxamide in HIV -infected SupT-1 cells Fig. 8 Growth curves showing the effect of AICA riboside in the presence of AZT on T-cell growth using a) CEM and b) SupT-1 cell lines and c) on B-cell growth under application of WI-L2 cell line.

Fig. 9 Vekstkurver som viser virkningen av AICA-ribosid på Fig. 9 Growth curves showing the effect of AICA riboside on

T-cellevekst og B-cellevekst.T-cell growth and B-cell growth.

Fig. 10 Virkning av inkubasjonstid og AICA-ribosidkonsentrasjon på SAH-hydrolaseaktivitet. Fig. 10 Effect of incubation time and AICA riboside concentration on SAH hydrolase activity.

Definisj oner.Definitions.

Som anvendt heri har følgende betegnelser de følgende betyd-ninger, med mindre det motsatte uttrykkelig er angitt. As used herein, the following terms have the following meanings, unless the contrary is expressly stated.

Betegnelsen "alkyl" refererer til mettede alifatiske grupper, inkluderende rette, forgrenede og karbocykliske grupper. The term "alkyl" refers to saturated aliphatic groups, including straight, branched and carbocyclic groups.

Betegnelsen "alkenyl" refererer til umettede alkylgrupper med minst en dobbeltbinding (f.eks. CH3CH=CH(CH<2>)<2->) og inkluderer både rettkjedede og forgrenede alkenylgrupper. The term "alkenyl" refers to unsaturated alkyl groups with at least one double bond (eg, CH3CH=CH(CH<2>)<2->) and includes both straight-chain and branched-chain alkenyl groups.

Betegnelsen "alkynyl" refererer til umettede grupper med minst en trippelbinding (f.eks. CH3OC(CH<2>)<2->) og inkluderer både rettkjedede og forgrenede grupper. The term "alkynyl" refers to unsaturated groups with at least one triple bond (eg, CH3OC(CH<2>)<2->) and includes both straight and branched chain groups.

Betegnelsen "aryl" refererer til aromatiske hydrokarbyl- og heteroaromatiske grupper som har minst en aromatisk ring. The term "aryl" refers to aromatic hydrocarbyl and heteroaromatic groups having at least one aromatic ring.

Betegnelsen "alkylen" refererer til rettkjedede og forgrenede alkylengrupper som er biradikaler, og inkluderer f.eks. grupper som etylen, propylen, The term "alkylene" refers to straight chain and branched alkylene groups which are biradicals, and includes e.g. groups such as ethylene, propylene,

Betegnelsen "hydrokarbyl" angir et organisk radikal sammensatt av karbon og hydrogen som kan være alifatisk (inkluderende alkyl-, alkenyl- og alkynylgrupper og grupper som har en blanding av mettede og umettede bindinger), alicycliske (karbocykliske), aryl (aromatisk) og kombinasjoner derav, og kan referere til rettkjedede, forgrenede eller cykliske strukturer eller radikaler med en kombinasjon derav, såvel som radikaler substituert med ett eller flere halogenatomer eller heteroatomer som nitrogen, oksygen og svovel, og deres funksjonelle grupper (som amino-, alkoksy-, aryloksy-, lakton-grupper o.l.) som vanligvis forefinnes i organiske forbindelser og radikaler. The term "hydrocarbyl" denotes an organic radical composed of carbon and hydrogen which may be aliphatic (including alkyl, alkenyl and alkynyl groups and groups having a mixture of saturated and unsaturated bonds), alicyclic (carbocyclic), aryl (aromatic) and combinations thereof, and may refer to straight-chain, branched or cyclic structures or radicals with a combination thereof, as well as radicals substituted with one or more halogen atoms or heteroatoms such as nitrogen, oxygen and sulphur, and their functional groups (such as amino-, alkoxy-, aryloxy -, lactone groups etc.) which are usually found in organic compounds and radicals.

Betegnelsen "hydrokarbyloksykarbonyl" refererer til gruppen The term "hydrocarbyloxycarbonyl" refers to the group

hvori R<1>er en hydrokarbylgruppe. Betegnelsen "hydrokarbylkarbonyl" refererer til gruppen hvori R' er en hydrokarbylgruppe. Betegnelsen "ester" refererer til en gruppe med en wherein R<1> is a hydrocarbyl group. The term "hydrocarbylcarbonyl" refers to the group in which R' is a hydrocarbyl group. The term "ester" refers to a group with a

binding, og inkluderer både acylestergrupper og karbonat- bond, and includes both acyl ester groups and carbonate

estergrupper.ester groups.

Betegnelsen "halo" eller "halogen" refererer til fluor, klor, brom og jod. The term "halo" or "halogen" refers to fluorine, chlorine, bromine and iodine.

Betegnelsen "karbonatester" refererer til gruppen The term "carbonate ester" refers to the group

hvori R' er hydrokarbyl, og forbindelser med minst en wherein R' is hydrocarbyl, and compounds with at least one

slik gruppe.such group.

Betegnelsen "acylester" refererer til gruppen The term "acyl ester" refers to the group

slik gruppe.such group.

Betegnelsen "blandet ester" refererer til forbindelser med minst en karbonatestergruppe og minst en acylestergruppe. The term "mixed ester" refers to compounds with at least one carbonate ester group and at least one acyl ester group.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen.Detailed description of the invention.

Den foreliggende oppfinnelse er rettet på anvendelse av purinnukleosidantivirale midler og fremgangsmåter for å øke den antivirale, antibakterielle og antiparasittiske aktivitet av AZT, og vedrører særlig fremgangsmåter for å øke effektiviteten av AZT mot retrovirus som AIDS (HIV) virus. Oppfinnelsen tilveiebringer bruk av AICA-ribosid, AICA-ribosidforløpere og visse AICA-ribosidanaloger og analoge forløpere som antivirale, særlig antiretrovirale midler. Oppfinnelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for å forhindre eller redusere retroviral aktivitet ved inhibering av SAH-hydrolase og ved å nedsette tymidintrifosfatmengdene. The present invention is directed to the use of purine nucleoside antiviral agents and methods for increasing the antiviral, antibacterial and antiparasitic activity of AZT, and particularly relates to methods for increasing the effectiveness of AZT against retroviruses such as the AIDS (HIV) virus. The invention provides for the use of AICA riboside, AICA riboside precursors and certain AICA riboside analogues and analogue precursors as antiviral, particularly antiretroviral agents. The invention also provides methods for preventing or reducing retroviral activity by inhibiting SAH hydrolase and by decreasing thymidine triphosphate levels.

Virkningene av bruken av disse purinnukleosidforbindelser, inkluderende AICA-ribosid, som antivirale midler og for å øke den antivirale aktivitet av AZT er blitt påvist in vitro. Disse purinnukleosidforbindelser vil bli anvendt for å øke aktiviteten av AZT ved behandling av virale, bakterielle og parasittiske infeksjoner i pasienter. For å tilføre disse molekyler til pasienter antas det at de oftest vil bli tilført oralt. Disse forbindelser kan også tilføres intravenøst, ved direkte intramuskulær injeksjon, subkutant, topisk på huden eller slimhinnene, rektalt eller ved inhalasjon. Preparater egnet for farmasøytisk bruk er velkjent. Nyttige forløpere er dem som når de innføres i kroppen metaboliseres til deres aktive AICA-ribosidform. Andre forløpere er dem som metaboliseres til karbocyklisk AICA-ribosid ("(+/-)-5-amino-l- [|3-2 ' a, 3 ' a-dihydroksy-4113- (hydroksymetyl) cyklopentyl] imidazol-4-karboksamid"). The effects of the use of these purine nucleoside compounds, including AICA riboside, as antiviral agents and to enhance the antiviral activity of AZT have been demonstrated in vitro. These purine nucleoside compounds will be used to increase the activity of AZT in the treatment of viral, bacterial and parasitic infections in patients. In order to supply these molecules to patients, it is assumed that they will most often be supplied orally. These compounds can also be administered intravenously, by direct intramuscular injection, subcutaneously, topically on the skin or mucous membranes, rectally or by inhalation. Preparations suitable for pharmaceutical use are well known. Useful precursors are those which, when introduced into the body, are metabolized to their active AICA riboside form. Other precursors are those that are metabolized to carbocyclic AICA riboside ("(+/-)-5-amino-1- [|3-2 ' a, 3 ' a-dihydroxy-4113-(hydroxymethyl) cyclopentyl] imidazole-4- carboxamide").

Ettersom purinnukleosid AICA-ribosidet kan metaboliseres til urinsyre kan denne forbindelse anvendes med allopurinol eller andre midler som forhindrer urinsyresyntese, eller med et urikosurisk middel som probenecid. Visse midler, som meto-treksat, hvis metabolitter inhiberer AICA-ribotidtransformy-lase, kan også anvendes i forbindelse med forbindelsen i samsvar med oppfinnelsen. De kan bevirke en forhøyelse av endogent syntetisert AICA-ribotid. Videre kan karbocyklisk AICA-ribosid, som ikke nedbrytes til urinsyre, anvendes for å bekjempe viral ineffektivitet eller å øke aktiviteten av AZT. Ved et antall forsøk er AICA-ribosid påvist å være et effektivt antiviralt middel. AICA-ribosid antas å bevirke en reduksjon i TTP-mengdene og således en økning i tymidinkinaseaktiviteten. Dette øker i sin tur evnen av AZT-trifosfat til å konkurrere med TTP for det reverse transkriptaseenzym og for innlemmelse i virale nukleinsyrer. AILA og AICA-ribosid er også blitt oppdaget å være meget kraftige inhibitorer av S-adenosylhomocystein ("SAN") hydrolase, et enzym som omdanner SAN til adenosin og homocystein. Inhibering av dette enzym bevirker en oppbygning av SAN, som i sin tur inhiberer den enzymatiske omdannelse av S-adenosylmetionin ("SAN") til SAN. Den sistnevnte inhibering kan bevirke destabilisering av viralt mRNA som normalt blir stabilisert ved 5'-metylering generert ved omdannelsen av SAN til SAN. As the purine nucleoside AICA riboside can be metabolized to uric acid, this compound can be used with allopurinol or other agents that prevent uric acid synthesis, or with a uricosuric agent such as probenecid. Certain agents, such as methotrexate, whose metabolites inhibit AICA ribotide transformylase, can also be used in connection with the compound according to the invention. They can cause an elevation of endogenously synthesized AICA ribotide. Furthermore, carbocyclic AICA riboside, which is not degraded to uric acid, can be used to combat viral inefficiency or to increase the activity of AZT. In a number of trials, AICA riboside has been shown to be an effective antiviral agent. AICA riboside is believed to cause a decrease in TTP amounts and thus an increase in thymidine kinase activity. This in turn increases the ability of AZT triphosphate to compete with TTP for the reverse transcriptase enzyme and for incorporation into viral nucleic acids. AILA and AICA riboside have also been discovered to be very potent inhibitors of S-adenosylhomocysteine ("SAN") hydrolase, an enzyme that converts SAN to adenosine and homocysteine. Inhibition of this enzyme causes a build-up of SAN, which in turn inhibits the enzymatic conversion of S-adenosylmethionine ("SAN") to SAN. The latter inhibition can cause destabilization of viral mRNA which is normally stabilized by 5'-methylation generated by the conversion of SAN to SAN.

Tilførsel av AZT og f.eks. AICA-ribosid, i forbindelse med hverandre, enten sammen i en blanding eller separat, bør ha i det minste additive virkninger. I tillegg vil hvilket som helst av de nye purinnukleosid-syntesemellomprodukter (etter det første gjennomførte trinn for purinsyntesen) eller deres nukleosider eller baser antas å bli hurtig omdannet til AICA-ribotid og vil være nyttig. Et eksempel er SA1 CA (succinyl-aminoimidazolkarboksamid) ribotid eller dets nukleosid eller base. Andre eksempler inkluderer aminoimidazolkarboksylsyre-ribosid. Supply of AZT and e.g. AICA riboside, in conjunction with each other, either together in a mixture or separately, should have at least additive effects. In addition, any of the new purine nucleoside synthesis intermediates (after the first step of purine synthesis) or their nucleosides or bases are believed to be rapidly converted to AICA ribotide and would be useful. An example is SA1 CA (succinyl-aminoimidazole carboxamide) ribotide or its nucleoside or base. Other examples include aminoimidazole carboxylic acid riboside.

Som angitt i de etterfølgende eksempler 3 og 4, hvis resultater delvis er vist i fig. 6, er tilførsel av AICA-ribosid med bare 50 uM i forbindelse med AZT funnet dramatisk å øke den antivirale aktivitet for en gitt dose av AZT. AICA, AICA-ribosid og derivatforbindelsene som er beskrevet og angitt heri kan anvendes for å øke den antivirale aktivitet av AZT mot virus og særlig mot retrovirus og humane retrovirus, inkluderende HIV. As indicated in the following examples 3 and 4, the results of which are partially shown in fig. 6, administration of AICA riboside at only 50 µM in conjunction with AZT has been found to dramatically increase the antiviral activity for a given dose of AZT. AICA, AICA riboside and the derivative compounds described and indicated herein can be used to increase the antiviral activity of AZT against viruses and in particular against retroviruses and human retroviruses, including HIV.

Det er trifosfatformen av AZT som anses å være antiviral. AZT går inn i cellene og fosforyleres til trifosfatet. I retrovirus, i tillegg til å inhibere revers transkriptase, antas AZT-trifosfat å bli innlemmet i DNA ved revers transkriptase og virke som en kjedeterminator. Selv om man ikke ønsker å bindes til de etterfølgende foreslåtte virkningsmåter, antas det at disse forbindelser hjelper AZT-trifosfatet til å konkurrere med TTP for innlemmelse i det virale DNA ved hjelp av den virale reverse transkriptase og videre ved å destabilisere syntetiserte virale nukleinsyrer ved forhindring eller nedsettelse av metylering fulgt av inhibering av SAN-hydrolase. Hypomety-lering av andre cellebestanddeler som membranfosfolipider og proteiner kan også bidra til denne antivirale aktivitet. It is the triphosphate form of AZT that is considered to be antiviral. AZT enters the cells and is phosphorylated to the triphosphate. In retroviruses, in addition to inhibiting reverse transcriptase, AZT triphosphate is thought to be incorporated into DNA by reverse transcriptase and act as a chain terminator. While not wishing to be bound by the subsequent proposed modes of action, it is believed that these compounds help the AZT triphosphate compete with TTP for incorporation into the viral DNA by the viral reverse transcriptase and further by destabilizing synthesized viral nucleic acids by preventing or reduction of methylation followed by inhibition of SAN hydrolase. Hypomethylation of other cell components such as membrane phospholipids and proteins can also contribute to this antiviral activity.

Behandling med slike purinnukleosider som AICA-ribosid, i tillegg til SAN-hydrolaseinhibering, skulle bevirke en reduksjon i TTP-mengdene og derfor en forhøyelse i tymidin-kinaseaktivitet og en økning i evnen til AZT-trifosfat til å konkurrere med TTP for innlemmelse i nydannede nukleinsyrer ved retroviral revers transkriptase. Med hensyn til den sistnevnte virkningsmåte antas det at purinnukleosider eller analoger som AICA-ribosid bevirker en pyrimidinmangelvirkning som nedsetter TTP-mengden (såvel som CTP- og UTP-mengdene) og at nedsettelsen av TTP-mengden er koblet med en økning i aktiviteten av tymidinkinasen, som er blitt postulert å være det hastighetsbegrensende trinn i fosforylering av AZT til AZT-trifosfat. Behandling med purinnukleosider eller analoger som AICA-ribosid antas å resultere i nedsatte nivåer av TTP og økte nivåer av AZT-trifosfat, med det resultat at mer AZT-trifosfat innlemmes i det virale DNA ved den retrovirale reverse transkriptase eller inhibering av denne og således en mer effektiv antiviral aktivitet pr. AZT-behandling. Treatment with such purine nucleosides as AICA riboside, in addition to SAN hydrolase inhibition, should cause a reduction in TTP levels and therefore an elevation in thymidine kinase activity and an increase in the ability of AZT triphosphate to compete with TTP for incorporation into newly formed nucleic acids by retroviral reverse transcriptase. With respect to the latter mode of action, it is believed that purine nucleosides or analogs such as AICA riboside cause a pyrimidine-depleting effect that decreases the amount of TTP (as well as the amounts of CTP and UTP) and that the decrease in the amount of TTP is coupled with an increase in the activity of the thymidine kinase , which has been postulated to be the rate-limiting step in the phosphorylation of AZT to AZT triphosphate. Treatment with purine nucleosides or analogues such as AICA riboside is believed to result in decreased levels of TTP and increased levels of AZT triphosphate, with the result that more AZT triphosphate is incorporated into the viral DNA by the retroviral reverse transcriptase or its inhibition and thus a more effective antiviral activity per AZT treatment.

Den foreslåtte virkning av purinnukleosider som AICA-ribosid som antivirale midler og som midler som øker sensitiviteten av retrovirus overfor AZT, ble testet under anvendelse av flere retrovirale assay. Assayene ble gjennomført under anvendelse av celler under kultur. I eksempel 1 ble virkningene av AICA-ribosid og AZT på celleveksten bedømt. Som vist i fig. 8 ble det påvist at kombinasjonen av AZT og AICA-ribosid ikke bevirket en nedsettelse i B-celleveksten og først ved 500 uM AICA-ribosid ble T-celleveksten selektivt endret. Fig. 9 viser lignende resultater med AICA-ribosid tilsatt alene til to T-cellelinjer (CEN og SupTl) og en B-cellelinje (WI-L2). The proposed action of purine nucleosides such as AICA riboside as antiviral agents and as agents that increase the sensitivity of retroviruses to AZT was tested using several retroviral assays. The assays were carried out using cells in culture. In Example 1, the effects of AICA riboside and AZT on cell growth were assessed. As shown in fig. 8, it was demonstrated that the combination of AZT and AICA-riboside did not cause a reduction in B-cell growth and only at 500 uM AICA-riboside was T-cell growth selectively altered. Fig. 9 shows similar results with AICA riboside added alone to two T cell lines (CEN and SupT1) and one B cell line (WI-L2).

Som beskrevet i eksempel 2 ble flere retrovirale assaysystemer anvendt for å teste den antivirale aktivitet av forskjellige purinnukleosidforbindelser. Et assaysystem anvendte en replikasjonsdefektiv murin leukemiviruskonstruksjon ("N2") inneholdende en selekterbar markør (neomycin resistensgenet). N2-viruskonstruksjonen er tilstede i produsentcellelinjen eller "hjelper"-cellelinjen også benevnt N2 som inneholder en annen retroviral konstruksjon som koder for produksjon av retrovirus-proteinene nødvendige for innlemmelsen og som derfor kan pseudotype N2-vektoren inn i et infektivt amfotropt murint retrovirus. Dette infektive retrovirus, som nå inneholder et neomycinresistensgen, oppnås fra produsentcellelinjen og anvendes for å infisere celler, i dette tilfelle 208F rotte-fibroblastceller, som ikke har noen neomycinresistens. As described in Example 2, several retroviral assay systems were used to test the antiviral activity of various purine nucleoside compounds. One assay system used a replication-defective murine leukemia virus construct ("N2") containing a selectable marker (the neomycin resistance gene). The N2 virus construct is present in the producer cell line or "helper" cell line also referred to as N2 which contains another retroviral construct which codes for the production of the retrovirus proteins necessary for its incorporation and which can therefore pseudotype the N2 vector into an infectious amphotropic murine retrovirus. This infectious retrovirus, now containing a neomycin resistance gene, is obtained from the producer cell line and used to infect cells, in this case 208F rat fibroblast cells, which have no neomycin resistance.

208F-cellene ble behandlet eller ikke behandlet med et selektivt antiviralt middel. Neomycin ble så innført til de dyrkede celler. Bare de celler som inneholder neomycin-resistensgenet som bæres av et retrovirus som ikke drepes av det antivirale middel vil vokse og derfor jo mindre antallet av kolonier er desto mer effektiv er det antivirale middel. Med andre ord, ved dette assay, representerte hver koloni en viruspartikkel som hadde gått inn i en celle men ikke ble drept av det antivirale middel slik at cellen fikk vokse til en koloni i nærvær av neomycin. God korrelasjon mellom antimurin retroviral aktivitet og antihuman retroviral aktivitet er blitt iakttatt. 208F-rottefibroblastlinjen er den som er beskrevet av Miller et al., PNAS, bind 80, side 4709-4713 (1983). Triplikate petriskåler ble anvendt for hvert forsøk. Fig. lb og lc viser resultatene av disse assay. I N2-koloniassayet ble The 208F cells were treated or not treated with a selective antiviral agent. Neomycin was then introduced into the cultured cells. Only those cells containing the neomycin resistance gene carried by a retrovirus that are not killed by the antiviral agent will grow and therefore the smaller the number of colonies the more effective the antiviral agent. In other words, in this assay, each colony represented a virus particle that had entered a cell but was not killed by the antiviral agent so that the cell was allowed to grow into a colony in the presence of neomycin. Good correlation between antimurine retroviral activity and antihuman retroviral activity has been observed. The 208F rat fibroblast line is that described by Miller et al., PNAS, vol. 80, pp. 4709-4713 (1983). Triplicate Petri dishes were used for each experiment. Fig. 1b and lc show the results of these assays. In the N2 colony assay,

0,01 uM AZT vist å ha noe bedre antiviral aktivitet enn 500 uM AICA-ribosid. 0.01 uM AZT shown to have slightly better antiviral activity than 500 uM AICA riboside.

Et annet, lignende assaysystem ble anvendt hvori en human makrofaglinje (U837) som bærer den BAG-retrovirale vektorkonstruksjon (med neomycinresistens og Ø-galaktosidase markør-gener), Cepko, PNAS, bind 84, side 156-160 (1987), ble infisert med MA (amfotropt MLV (murint leukemivirus)). HA ble anvendt for pseudotyping av den replikasjonsdefektive BAG-vektor, som så ble tilført 208F-celler. Ved dette assay, hvor resultatene er vist i fig. lc, var 0,01 uM AZT og 500 uM AICA-ribosid begge effektive mot murine retrovirus. Data som finnes i fig. 1 er lignende data fra ytterligere forsøk som viser virkningen av AZT og AICA-ribosid på humane CEN-cellelinjer infisert med det humane retorvirus HIV. Another, similar assay system was used in which a human macrophage line (U837) carrying the BAG retroviral vector construct (with neomycin resistance and Ø-galactosidase marker genes), Cepko, PNAS, vol. 84, pp. 156-160 (1987), was infected with MA (amphotropic MLV (murine leukemia virus)). HA was used for pseudotyping the replication-defective BAG vector, which was then introduced into 208F cells. In this assay, the results of which are shown in fig. lc, 0.01 µM AZT and 500 µM AICA riboside were both effective against murine retroviruses. Data found in fig. 1 are similar data from additional experiments showing the effect of AZT and AICA riboside on human CEN cell lines infected with the human retor virus HIV.

Resultatene av eksempel 3, hvori AICA-ribosid eller AZT ble preinkubert før HIV-infeksjonen i det CEN-syncytiale assay, vist i fig. 2. AICA-ribosid viste antiviral virkning ved 5 uM og 5 0 uM doseringer, lignende de antivirale virkninger av 0,01 uM og 0,1 uM AZT doseringer. Resultatene av lignende forsøk hvori cellene ikke var preinkubert med AICA-ribosid før infeksjonen er angitt i fig. 3. Disse resultater indikerer at AICA-ribosid var mer effektivt som et antiviralt middel med preinkubasjon. The results of Example 3, in which AICA riboside or AZT was preincubated before the HIV infection in the CEN syncytial assay, shown in Fig. 2. AICA riboside showed antiviral activity at 5 µM and 50 µM dosages, similar to the antiviral effects of 0.01 µM and 0.1 µM AZT dosages. The results of similar experiments in which the cells were not preincubated with AICA riboside prior to infection are shown in Fig. 3. These results indicate that AICA riboside was more effective as an antiviral agent with preincubation.

Virustiterresultatene av tre assay gjennomført som i eksempel 3 ble tatt som gjennomsnitt og avsatt som prosentvis andel av kontrollen og er vist i fig. 4. AZT var 100 % effektiv mot AIDS-virus ved eller over 10 uM i eksempel 4 SupT-1 syncytialt assay, som vist i fig. 5b. Bruken av AZT ved lavere konsentrasjoner (0,01 uM til 1 uM), så vel som AICA-ribosid ved konsentrasjoner på 5 p til 500 uM, var mindre enn 100 % effektive, men hadde godt doseresponsforhold med forhindring av syncytialdannelse, som vist i fig. 5a og 5b. The virus titer results of three assays carried out as in example 3 were taken as an average and set aside as a percentage of the control and are shown in fig. 4. AZT was 100% effective against AIDS virus at or above 10 µM in the Example 4 SupT-1 syncytial assay, as shown in FIG. 5b. The use of AZT at lower concentrations (0.01 uM to 1 uM), as well as AICA riboside at concentrations of 5 p to 500 uM, were less than 100% effective, but had good dose-response relationships with prevention of syncytial formation, as shown in fig. 5a and 5b.

Andre assay gjennomført som beskrevet i eksemplene 3 og 4 viste signifikant at bruken av 50 uM AICA-ribosid i kombinasjon med AZT ved 0,01 uM på HIV i to forskjellige humane T-cellelinjer ga det samme nivå av antiviral virkning som fra ti til hundre ganger denne mengde av AZT alene. Ved det GEM-syncytiale assay, var en dose på 1,0 uM AZT likeså effektiv som 0,01 uM AZT når det sistnevnte ble tilført i kombinasjon med 5 0 uM AICA-ribosid (fig. 6a). I dette eksempel kan dosen av AZT således reduseres hundre ganger for den samme virkning når det anvendes AZT uten AICA-ribosid. Lignende, ved SupT-1 assayet, var 0,1 uM AZT like så effektivt som 0,01 uM AZT-koadministrert med 50 uM AZT (fig. 6b). Fig. 10, som avsetter resultatene i eksempel 5, viser inhiberingen av SAN-hydrolase med AICA-ribosid. Other assays carried out as described in Examples 3 and 4 significantly showed that the use of 50 uM AICA riboside in combination with AZT at 0.01 uM on HIV in two different human T cell lines produced the same level of antiviral activity as from ten to hundred times this amount of AZT alone. In the GEM syncytial assay, a dose of 1.0 µM AZT was as effective as 0.01 µM AZT when the latter was added in combination with 50 µM AICA riboside (Fig. 6a). In this example, the dose of AZT can thus be reduced a hundredfold for the same effect when using AZT without AICA riboside. Similarly, in the SupT-1 assay, 0.1 µM AZT was as effective as 0.01 µM AZT co-administered with 50 µM AZT (Fig. 6b). Fig. 10, which plots the results of Example 5, shows the inhibition of SAN hydrolase by AICA riboside.

AICA-ribosid kan kjemisk modifiseres til å gi en AICA-ribosid-forløper hvori en eller flere av (2'-, 3'- eller 5'-) hydrok-syloksygenene i ribosyldelen er substituert med en hydrokarbyloksykarbonyl- eller hydrokarbylkarbonyldel. Disse forbindelser virker som forløpere for AICA-ribosid og blir bedre absorbert fra mage-tarmsystemet. Det antas at den modifiserende estersidegruppe tillater bedre absorpsjonsegenskaper fra mage-tarmsystemet og i påskyndet første passeringsmetabolisme, så vel som at mer middel gjøres tilgjengelig for å krysse blod-hjernebarrieren. Når forløpermolekylet nærmer seg eller når det aktive sete, kan intakte modifiserende grupper endogent spaltes til å regenerere AICA-ribosidet. Det er beskrevet en rekke forløpere av AICA-ribosid med fordelaktige terapeutiske egenskaper, nyttige som antivirale midler og egnet for å øke aktiviteten av AZT. Strukturen av disse forløperforbindelser er avbildet i tabell I og fremstillingen av representative forbindelser er angitt der. Lignende modifikasjoner kan gjøres ved hjelp av de metoder som er beskrevet for å generere forløpere av karbocyklisk AICA-ribosid. Karbocyklisk AICA-ribosid kan fremstilles ved hjelp av metoden beskrevet i Arita et al., Nucleic Acids Research Symposium Series, bind 12, side 25-28 (1983), som rapporterer fremstillingen av denne forbindelse for bruk som en utgangsforbindelse. AICA riboside can be chemically modified to give an AICA riboside precursor in which one or more of the (2'-, 3'- or 5'-) hydroxyloxygens in the ribosyl moiety are substituted with a hydrocarbyloxycarbonyl or hydrocarbylcarbonyl moiety. These compounds act as precursors for AICA riboside and are better absorbed from the gastrointestinal system. It is believed that the modifying ester side group allows for better absorption properties from the gastrointestinal system and in accelerated first pass metabolism, as well as making more agent available to cross the blood-brain barrier. As the precursor molecule approaches or reaches the active site, intact modifying groups can be endogenously cleaved to regenerate the AICA riboside. A number of precursors of AICA riboside have been described with beneficial therapeutic properties, useful as antiviral agents and suitable for enhancing the activity of AZT. The structure of these precursor compounds is depicted in Table I and the preparation of representative compounds is indicated there. Similar modifications can be made using the methods described to generate carbocyclic AICA riboside precursors. Carbocyclic AICA riboside can be prepared by the method described in Arita et al., Nucleic Acids Research Symposium Series, Vol. 12, pp. 25-28 (1983), which reports the preparation of this compound for use as a starting compound.

Resultatene i eksempel 4 under anvendelse av forskjellige AICA-ribosidforløpere som antivirale midler er avsatt i fig. 7. Disse forsøk viste at forløperne var så effektive som AICA-ribosid ved konsentrasjoner på 5 0 uM. Hver forløper hadde betydelig antiviral aktivitet ved dette SupTl-syncytiale forsøk for antiviral aktivitet mot HIV. The results of Example 4 using different AICA riboside precursors as antiviral agents are plotted in Fig. 7. These experiments showed that the precursors were as effective as AICA riboside at concentrations of 50 µM. Each precursor had significant antiviral activity in this SupT1 syncytial assay for antiviral activity against HIV.

Foretrukne forløperforbindelser som anvendes ved oppfinnelsen inkluderer dem med følgende formel: Preferred precursor compounds used in the invention include those of the following formula:

(I) (IN)

hvoriin which

xl'x2ol3 x3uavhengig er hydrogen eller xl'x2ol3 x3independent is hydrogen or

eller or

hvori R]_ og R2uavhengig er hydrokarbyl, foretrukket med fra 1 til omtrent 24 karbonatomer, eller to av X]_, X 2 og X3tatt sammen danner en cyklisk karbonatgruppe, med den betingelse at ikke samtlige av X^, X2og X3er hydrogen. Foretrukne R^og R2grupper inkluderer lavere alkylgrupper, og særlig foretrukne er dem med minst ett sekundært karbonatom. Hydrokarbylgrupper med mer enn 24 karbonatomer kan anvendes og ansees å være innenfor wherein R]_ and R 2 are independently hydrocarbyl, preferably having from 1 to about 24 carbon atoms, or two of X]_, X 2 and X 3 taken together form a cyclic carbonate group, with the proviso that not all of X 1 , X 2 and X 3 are hydrogen. Preferred R 1 and R 2 groups include lower alkyl groups, and particularly preferred are those with at least one secondary carbon atom. Hydrocarbyl groups with more than 24 carbon atoms may be used and are considered to be within

rammen for den foreliggende oppfinnelse.the scope of the present invention.

Foretrukne forbindelser inkluderer dem med en eller to estergrupper. Mest foretrukket er dem med en estergruppe. Særlig foretrukket er forbindelser med en estergruppe ved enten 3'- eller 5<1->stillingen av ribosylringen. Preferred compounds include those with one or two ester groups. Most preferred are those with an ester group. Particularly preferred are compounds with an ester group at either the 3'- or 5<1->position of the ribosyl ring.

En foretrukket klasse av forbindelser er karbonatesterne.A preferred class of compounds are the carbonate esters.

Særlig foretrukket er forbindelser hvori X]_ eller X3er Particularly preferred are compounds in which X]_ or X3 are

I en særlig foretrukket forbindelse er X^og X2hydrogen og X3er isobutoksykarbonyl. In a particularly preferred compound, X 1 and X 2 are hydrogen and X 3 is isobutoxycarbonyl.

De foretrukne karbonatesterforbindelser og acylesterforbin-delser i samsvar med forbindelsen kan passende fremstilles ved hjelp av det følgende reaksjonsskjema: eller The preferred carbonate ester compounds and acyl ester compounds corresponding to the compound can be conveniently prepared by means of the following reaction scheme: or

hvori X]_, X2, X3, R]_ og R2er som definert i forbindelse med formel (I) . wherein X]_, X2, X3, R]_ and R2 are as defined in connection with formula (I).

Reaksjonen (1) gjennomføres ved å kombinere II, AICA-ribosidet, og III, det passende syreklorid eller klorformiat, i løsnings-middelet. Syrekloridet kan passende fremstilles ved konvensjonelle metoder som f.eks. reaksjon av den tilsvarende syre med tionylklorid. Noen syreklorider er kommersielt tilgjengelige. Mange klorformiater er kommersielt tilgjengelige. Også klorformiatene kan fordelaktig fremstilles ved konvensjonelle metoder som er kjent for den fagkyndige på området ved reaksjon av fosgen med den passende alkohol. Reaksjon (1) gjennomføres ved en temperatur på fra omtrent -10°C til omtrent 5°C, foretrukket fra omtrent -5°C til omtrent 0°C, og er generelt fullstendig i løpet av omtrent to til omtrent fire timer. For lett håndtering gjennomføres reaksjonen i løsningsmidler. Passende løsningsmidler inkluderer dimetylformamid (DNF), pyridin, metylenklorid og lignende. Passende gjennomføres reaksjonen ved vanlig trykk. Reaksjonsproduktet eller produktene isoleres ved konvensjonelle prosedyrer som kolonnekromatografering, krystallisasjon o.l. Det innsees at reaksjonen kan resultere i en blanding av produkter, d.v.s. mono-, di- og triestere ved 2'-, 3'- og/eller 5'-stillingene av ribosyldelen. Produktesterne kan separeres ved hjelp av konvensjonelle metoder som tynnsjiktkromatografering (TLC), høytrykksvæskekromatografering (HPLC), kolonnekromatografering, krystallisasjon o.l. som vil være vel kjent for den fagkyndige på området. Reaction (1) is carried out by combining II, the AICA riboside, and III, the appropriate acid chloride or chloroformate, in the solvent. The acid chloride can conveniently be prepared by conventional methods such as, for example, reaction of the corresponding acid with thionyl chloride. Some acid chlorides are commercially available. Many chloroformates are commercially available. The chloroformates can also be advantageously prepared by conventional methods known to those skilled in the art by reacting phosgene with the appropriate alcohol. Reaction (1) is carried out at a temperature of from about -10°C to about 5°C, preferably from about -5°C to about 0°C, and is generally complete within about two to about four hours. For easy handling, the reaction is carried out in solvents. Suitable solvents include dimethylformamide (DNF), pyridine, methylene chloride and the like. Appropriately, the reaction is carried out at normal pressure. The reaction product or products are isolated by conventional procedures such as column chromatography, crystallization etc. It is realized that the reaction may result in a mixture of products, i.e. mono-, di- and triesters at the 2', 3' and/or 5' positions of the ribosyl moiety. The product esters can be separated using conventional methods such as thin layer chromatography (TLC), high pressure liquid chromatography (HPLC), column chromatography, crystallization etc. which will be well known to the person skilled in the art.

5'-monoesterne kan passende fremstilles ved hjelp av følgende reaksjonsskjerna til å gi et mellomprodukt som er blokkert ved 2'- og 3'-posisjonene. The 5' monoesters can conveniently be prepared by the following reaction pathway to give an intermediate which is blocked at the 2' and 3' positions.

hvori X^a er eller in which X^a is or

og DbAg er et avblokkerende and DbAg is an unblocker

middel.medium.

Reaksjon (2) gjennomføres ved å kombinere II, IV, V og VI. Selv om reaksjonskomponentene kan kombineres i en hvilken som helst rekkefølge kan det være foretrukket å addere II til en blanding av IV, V og VI. Reaksjonen gjennomføres ved en temperatur fra omtrent 10°C til omtrent 25°C, foretrukket fra omtrent 15°C til omtrent 25°C og generelt fullstendig i løpet av omtrent fem timer. Mellomproduktet VI isoleres ved hjelp av konvensjonelle prosedyrer. Reaction (2) is carried out by combining II, IV, V and VI. Although the reaction components can be combined in any order, it may be preferred to add II to a mixture of IV, V and VI. The reaction is carried out at a temperature of from about 10°C to about 25°C, preferably from about 15°C to about 25°C and generally complete within about five hours. Intermediate VI is isolated using conventional procedures.

Reaksjon (3) er reaksjonen mellom mellomproduktet VII med det passende syreklorid eller klorformiat og gjennomføres som beskrevet i forbindelse med reaksjon (1). Reaction (3) is the reaction between intermediate VII with the appropriate acid chloride or chloroformate and is carried out as described in connection with reaction (1).

Reaksjon (4) er et eventuelt trinn for om ønsket å fjerne den cykliske blokkerende gruppe fra 2'- og 3'-stillingene. Den gjennomføres ved å omsette det passende avblokkerende middel med IX. Passende avblokkerende midler inkluderer H+<->harpiks i vann/aceton, tetraetylammoniumfluorid/THF, eddiksyre/vann o.l. Slike avblokkerende reaksjoner er konvensjonelle og vel kjente for de fagkyndige på området. Reaction (4) is an optional step for, if desired, removing the cyclic blocking group from the 2' and 3' positions. It is carried out by reacting the appropriate unblocking agent with IX. Suitable deblocking agents include H+<->resin in water/acetone, tetraethylammonium fluoride/THF, acetic acid/water, and the like. Such unblocking reactions are conventional and well known to those skilled in the art.

Blandede esterforbindelser kan passende fremstilles ved først å omsette AlCA-ribosidet med det passende syreklorid i henhold til reaksjon (1) og addere acylestergruppen og deretter omsette den acylestersubstituerte forbindelse med det passende klorformiat ved hjelp av reaksjon (1) for å oppnå den blandede ester. Mixed ester compounds can be conveniently prepared by first reacting the AlCA riboside with the appropriate acid chloride according to reaction (1) and adding the acyl ester group and then reacting the acyl ester substituted compound with the appropriate chloroformate using reaction (1) to obtain the mixed ester.

For å lette forståelsen av oppfinnelsen følger resultatene av en rekke forsøk. De etterfølgende eksempler vedrørende den foreliggende forbindelse skal selvfølgelig ikke forstås spesifikt å begrense rammen for oppfinnelsen, og slike ekvi-valenter av oppfinnelsen som nå er kjent eller utviklet senere skal ansees å falle innenfor rammen for oppfinnelsen som angitt i det etterfølgende. In order to facilitate the understanding of the invention, the results of a number of experiments follow. The following examples relating to the present compound shall of course not be understood to specifically limit the scope of the invention, and such equivalents of the invention that are now known or developed later shall be considered to fall within the scope of the invention as stated below.

EKSEMPEL 1EXAMPLE 1

Lymfoblastassay for bedømmelse av antivirale kandidateffekter på cellevekst. Lymphoblast assay for assessment of antiviral candidate effects on cell growth.

Flere lymfoblastlinjer ble anvendt i forbindelse med varierende doser av antivirale midler for å bestemme deres virkninger på celleveksten. Ved denne metode kan en daglig celletall-bestemmelse over en tidsperiode, ettertilsetning av antivirale midler, sammenlignes med den normale cellevekstkurve. Several lymphoblast lines were used in conjunction with varying doses of antiviral agents to determine their effects on cell growth. With this method, a daily cell count determination over a period of time, after the addition of antiviral agents, can be compared with the normal cell growth curve.

To representative T-cellelinjer, SupT-1 og GEM, og en B-cellelinje, WI-L2, ble dyrket til mid-logfase 5 x IO<5>celler/ml i 50 ml RPMI 1640 (Irvine Scientific) supplert med 10 % varmeinaktivert føtalt kalveserum (Gemini-Bioproducts) og 1 % glutamin (Gibco) for å standardisere inokuleringsbetingelsene og sikre en populasjon av logaritmisk voksende celler. Two representative T-cell lines, SupT-1 and GEM, and one B-cell line, WI-L2, were grown to mid-log phase 5 x 10<5> cells/ml in 50 ml RPMI 1640 (Irvine Scientific) supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum (Gemini-Bioproducts) and 1% glutamine (Gibco) to standardize the inoculation conditions and ensure a population of logarithmically growing cells.

Et passende antall T-25 flasker (Corning) ble inokulert med jevnt suspenderte celler med 0,5 x 10^ celler/ml i 20 ml friske vekstmedia. Inkluderende en kontrollbetingelse ble hvert sett av flasker behandlet med et doseområde av antiviral forbindelse for hver cellelinje. Hver dosebetingelse ble gjentatt i An appropriate number of T-25 flasks (Corning) were inoculated with uniformly suspended cells at 0.5 x 10 5 cells/ml in 20 ml of fresh growth media. Including a control condition, each set of flasks was treated with a dose range of antiviral compound for each cell line. Each dose condition was repeated in

triplikat. Alle flasker ble inkubert i fem døgn ved 37°C i en 5 % CO2inkubator. triplicate. All bottles were incubated for five days at 37°C in a 5% CO2 incubator.

Hver 24 timer i fem døgn ble tre 0,2 ml prøver av hver flaske fortynnet i 9,8 ml isoton (Fisher Scientific) og telt på en celleteller (Coulter Co.)- Gjennomsnitt for hver flaske ble opptegnet og gjennomsnitt av hver triplikate antivirale dose ble så gjennomsnittsberegnet og opptegnet. Fig. 8a viser at konsentrasjonen av AICA-ribosid fra 0 til 50 pM i kombinasjon med konsentrasjoner av AZT fra 0 til 10 pM hadde liten eller ingen virkning på GEM-cellevekst. Bare ved 500 pM AICA-ribosid var der en tydelig nedsettelse i celleveksten. Nedsettelsen i cellevekst varierte ikke tydelig ved denne 500 pM AICA-ribosidkonsentrasjon når AZT-konsentrasjonen ble variert fra 0,01 til 10,0 pM AZT. Resultatene i fig. 8b med SupT-1 cellelinjen var ganske tilsvarende. Fig. 8c viser ingen tydelig virkning på veksten av WI-L2-celler ved alle AICA-ribosidkonsentrasjoner og AZT-konsentrasjoner. Fig. 9 viser virkningene av AICA-ribosid på B-cellevekst versus T-cellevekst. AICA-ribosid hadde ingen virkning på WI-L2 (B-celle) vekst ved konsentrasjoner opp til 500 uM. AICA-ribosid viste fra omtrent 30 til omtrent 50 % reduksjon i T-cellevekst (CEN og SupT-1) celler ved en konsentrasjon på 500 uM. Every 24 hours for five days, three 0.2 ml samples from each bottle were diluted in 9.8 ml isotone (Fisher Scientific) and counted on a cell counter (Coulter Co.) - Means for each bottle were recorded and averages of each triplicate antiviral dose was then averaged and recorded. Fig. 8a shows that the concentration of AICA riboside from 0 to 50 pM in combination with concentrations of AZT from 0 to 10 pM had little or no effect on GEM cell growth. Only at 500 pM AICA riboside was there a clear reduction in cell growth. The reduction in cell growth did not vary significantly at this 500 pM AICA riboside concentration when the AZT concentration was varied from 0.01 to 10.0 pM AZT. The results in fig. 8b with the SupT-1 cell line was quite similar. Fig. 8c shows no clear effect on the growth of WI-L2 cells at all AICA riboside concentrations and AZT concentrations. Fig. 9 shows the effects of AICA riboside on B cell growth versus T cell growth. AICA riboside had no effect on WI-L2 (B cell) growth at concentrations up to 500 µM. AICA riboside showed from about 30 to about 50% reduction in T cell growth (CEN and SupT-1) cells at a concentration of 500 µM.

EKSEMPEL 2EXAMPLE 2

Koloniresistensassay for deteksjon av antivirale forbindelser. Ved dette kolonidannende bioassay for karakterisering av antivirale forbindelser mot retrovirus, ble en replikasjonsdefektiv retroviral vektorkonstruksjon med evne til å meddele neomycinresistens (U937/BAG eller N2) pseudotype-bestemt, en enkelt celle ble infisert og under neomycinseleksjon tillates resipientcellen å danne en koloni. Ettersom hver infeksjon gjør en neomycinresistent celle i stand til å frembringe en separat gruppe av celler, kan kolonier telles, og resulterer i et lineært forhold mellom antallet av kolonier og den første rekke av viruskonsentrasjoner. Ved denne metode kan mulige antivirale kandidater screenes. Tre separate murine retrovirusassay ble anvendt for å påvise den antivirale effektivitet av purinnukleosidene beskrevet heri. Resultatene er vist i fig. 1. Colony resistance assay for the detection of antiviral compounds. In this colony-forming bioassay for the characterization of antiviral compounds against retroviruses, a replication-defective retroviral vector construct capable of conferring neomycin resistance (U937/BAG or N2) was pseudotyped, a single cell was infected and, under neomycin selection, the recipient cell was allowed to form a colony. As each infection enables a neomycin-resistant cell to produce a separate group of cells, colonies can be counted, resulting in a linear relationship between the number of colonies and the initial series of virus concentrations. By this method, possible antiviral candidates can be screened. Three separate murine retrovirus assays were used to demonstrate the antiviral efficacy of the purine nucleosides described herein. The results are shown in fig. 1.

U937/BAG + MA:U937/BAG + MA:

U9 37-celler som bar en retroviral vektorkonstruksjon benevnt BAG (Cepko, supra) ble dyrket til 5,0 x IO<5>celler pr. ml i RPNI 1640 (Irvine Scientific) supplert med 10 % varmeinaktivert føtalt bovint serum (Gemini-Bioproducts), 1 % 200 mM glutamin (Gibco) og 500 ug/ml neomycin (Sigma). 10 ml 5 x IO<5>celler/ml ble høstet og resuspendert i 2 ml media inneholdende murint amfotropt virus (IO<4>titer) og inkubert i et løst korket sentrifugerør i en time ved 37°C og 5 % CO2. Cellene ble sentrifugert og resuspendert i 20 ml RPMI 1640 inneholdende 10 % varmeinaktivert føtalt bovint serum og 1 % 200 mM glutamin og inkubert over natten i tolv til seksten timer ved 37°C og 5 % C02. 1 ml log-fase 208F rottefibroblaster ble platet ut i a-MEN (Irvine Scientific) med 10 % varmeinaktivert føtalt bovint serum og 1 % 200 mM ved 1 x IO<5>celler/ml, i en passende antall på 60 mm dyrkingsskåler (Corning) og fikk feste seg i inkubator i 30 minutter. 208F-cellene ble forbehandlet før infeksjon med 4 ug/ml polybrene (Sigma) over natten (12 til 16 timer) for å sikre en ensartet og kinetisk viral infeksjon. Antiviralt middel eller midler ble tilsatt i passende mengder og celler ble preinkubert i 24 timer før infeksjon med retrovirus. U9 37 cells carrying a retroviral vector construct named BAG (Cepko, supra) were grown to 5.0 x 10 cells per day. ml in RPNI 1640 (Irvine Scientific) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (Gemini-Bioproducts), 1% 200 mM glutamine (Gibco), and 500 ug/ml neomycin (Sigma). 10 ml of 5 x 10<5> cells/ml were harvested and resuspended in 2 ml of media containing murine amphotropic virus (10<4> titer) and incubated in a loosely capped centrifuge tube for one hour at 37°C and 5% CO2. The cells were centrifuged and resuspended in 20 ml RPMI 1640 containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum and 1% 200 mM glutamine and incubated overnight for twelve to sixteen hours at 37°C and 5% CO 2 . 1 ml log-phase 208F rat fibroblasts were plated in a-MEN (Irvine Scientific) with 10% heat-inactivated fetal bovine serum and 1% 200 mM at 1 x 10<5> cells/ml, in an appropriate number of 60 mm culture dishes ( Corning) and allowed to adhere in an incubator for 30 minutes. The 208F cells were pretreated before infection with 4 µg/ml polybrene (Sigma) overnight (12 to 16 h) to ensure a uniform and kinetic viral infection. Antiviral agent or agents were added in appropriate amounts and cells were preincubated for 24 hours before infection with retrovirus.

U937/BAG + MA-celler ble pelletisert ved 1200 o.p.m. i fem minutter og supernatanten inneholdende neomycinresistent virus ble høstet. 2 ml ble anbragt på forbehandlet 208F rottefibroblaster (cellene var grovt 50 % sammenflytende). Platene ble så inkubert i ytterligere 24 timer. U937/BAG + MA cells were pelleted at 1200 r.p.m. for five minutes and the supernatant containing neomycin-resistant virus was harvested. 2 ml were placed on pretreated 208F rat fibroblasts (cells were roughly 50% confluent). The plates were then incubated for a further 24 hours.

Neomycinseleksjon ble igangsatt på passende plater under anvendelse av 500 ug/ml neomycin i dyrkingsmedia. Seleksjon ble fortsatt, idet media ble endret tre ganger pr. uke, i åtte døgn. På den åttende dag etter infeksjon ble samtlige plater renset to ganger med fosfatbufret saltløsning og fiksert med 1 ml 95 % metanol (Sigma) i 30 minutter. Metanolen ble fjernet og platene fikk tørke i luften over natten. Neomycin selection was initiated on appropriate plates using 500 µg/ml neomycin in culture media. Selection was continued, as the media was changed three times per week, for eight days. On the eighth day after infection, all plates were cleaned twice with phosphate-buffered saline and fixed with 1 ml of 95% methanol (Sigma) for 30 minutes. The methanol was removed and the plates were allowed to air dry overnight.

Etter tørking ble platene farget med 2 ml 1:20 Glemsa (Sigma) i en time. Fargingen ble aspirert og platene renset med destillert vann. Alle kolonier inneholdende 5 0 eller flere celler ble opptelt. After drying, the plates were stained with 2 ml of 1:20 Glemsa (Sigma) for one hour. The staining was aspirated and the plates cleaned with distilled water. All colonies containing 50 or more cells were counted.

N2: N2:

20 8F rottefibroblaster ble dyrket i a-MEN supplert med 10 % varmeinaktivert føtalt kalveserum og 1 % mM glutamin. Log-faseceller ble platet ut på 60 mm plater med 1 x IO<5>celler i 5 ml pr. plate, fikk feste seg og ble forbehandlet over natten med 4 ug/ml polybrene. 24 timer før infeksjon ble passende mengder antiviral forbindelse tilsatt for hver betingelse. Ved infeksjonsdagen ble 50 ul av IO<5>titer N2-virus tilsatt de passende plater og fikk inkubere i 24 timer. 20 8F rat fibroblasts were cultured in α-MEN supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum and 1% mM glutamine. Log-phase cells were plated on 60 mm plates with 1 x 10<5> cells in 5 ml per plate, allowed to adhere and pretreated overnight with 4 ug/ml polybrene. 24 h before infection, appropriate amounts of antiviral compound were added for each condition. On the day of infection, 50 µl of 10<5>titer N2 virus was added to the appropriate plates and allowed to incubate for 24 hours.

Neomycinseleksjon (500 ug/ml) ble igangsatt den neste dag og fortsatt i åtte døgn etter infeksjon, idet media ble endret tre ganger pr. uke. På den åttende dag i seleksjonen ble platene renset med to vaskinger av PBS, fiksert med 9 5 % metanol, og farget med 1:20 Glemsa cellefarge. Alle kolonier med 50 eller flere aggregatceller ble opptalt. Resultatene under anvendelse av AICA-ribosid og AZT som antivirale midler er vist i fig. la-lb. Neomycin selection (500 ug/ml) was started the next day and continued for eight days after infection, with the media being changed three times per day. week. On the eighth day of selection, plates were cleaned with two washes of PBS, fixed with 95% methanol, and stained with 1:20 Glemsa cell stain. All colonies with 50 or more aggregate cells were counted. The results using AICA riboside and AZT as antiviral agents are shown in Fig. la-lb.

EKSEMPEL 3EXAMPLE 3

HIV-syncytialdannende assay for antiviral aktivitet under anvendelse av CEM-SS celler. HIV syncytial-forming assay for antiviral activity using CEM-SS cells.

Det følgende cytomorfologiske infektivitetsbioassay ble anvendt for karakterisering av antiviral aktivitet mot HIV-1. I det følgende assay infiserer en enkelt infeksiøs enhet av virus en enkelt celle og initierer et synlig uttrykk for denne infeksjon, d.v.s. et syncytium. Ettersom en enkelt infeksiøs enhet fører til en separat respons, foreligger et lineært forhold mellom antallet av viralt induserte cytopatiske virkninger og den første rekke av viruskonsentrasjon. Anvendelse av denne prosedyre i assay for virusinaktivering tillater bedømmelse av det antivirale kandidatmiddel. The following cytomorphological infectivity bioassay was used to characterize antiviral activity against HIV-1. In the following assay, a single infectious unit of virus infects a single cell and initiates a visible expression of this infection, i.e. a syncytium. As a single infectious entity leads to a separate response, there is a linear relationship between the number of virally induced cytopathic effects and the first order of virus concentration. Application of this procedure in the virus inactivation assay allows evaluation of the candidate antiviral agent.

CEM-SS (syncytiumsensitiv Leu 3a-positiv GEM-cellelinje) celler ble dyrket i RPNI 1640 cellekulturmedia (Irvine Scientific) supplert med 10 % varmeinaktivert føtalt bovint serum (Gemini Bioproducts) og 1 % 200 uM glutamin (Gibco). Log-faseceller ble oppdelt 1:2 med vekstmedium dagen før etablering av assayet for å standardisere utplatingsbetingelsene og å sikre en populasjon av logaritmisk voksende celler. 96 brønnplater (Costar) ble forbehandlet med 50 ul 50 ug/ml poly-l-lysin (NW = 295.000-Sigma) ("PLL") og ble etterlatt ved romtemperatur i 60 minutter. Resterende PLL ble fjernet med to vaskinger av PBS. Platene ble lagret i inkubatoren inntil de ble anvendt. CEM-SS (syncytium-sensitive Leu 3a-positive GEM cell line) cells were grown in RPNI 1640 cell culture media (Irvine Scientific) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (Gemini Bioproducts) and 1% 200 µM glutamine (Gibco). Log-phase cells were split 1:2 with growth medium the day before establishing the assay to standardize the plating conditions and to ensure a population of logarithmically growing cells. 96 well plates (Costar) were pretreated with 50 µl of 50 µg/ml poly-l-lysine (NW = 295,000-Sigma) ("PLL") and were left at room temperature for 60 minutes. Residual PLL was removed with two washes of PBS. The plates were stored in the incubator until they were used.

På assaydagen ble cellene telt og nok celler ble høstet til å plate hver brønn med 5,0 x 10<4>celler pr. brønn i et volum på 200 ul (eller 20 ml av 5,0 x 10^ celler/ml var passende for hver 96-brønners mikrotiterplate). On the day of the assay, the cells were counted and enough cells were harvested to plate each well with 5.0 x 10<4> cells per well. well in a volume of 200 µl (or 20 ml of 5.0 x 10^ cells/ml was appropriate for each 96-well microtiter plate).

Cellene ble platet ut på de PLL forbehandlede mikrotiterplater med 5,0 x 10<4>celler/brønn i et volum på 200 ul. Etter å ha tillatt fastsetting i 30 minutter ved 37°C og 5 % CO2ble det eller de antivirale midler tilsatt i de angitte mengder og de behandlede plater ble forhåndsinkubert i 24 timer. The cells were plated on the PLL-pretreated microtiter plates with 5.0 x 10<4> cells/well in a volume of 200 µl. After allowing fixation for 30 minutes at 37°C and 5% CO 2 , the antiviral agent(s) were added in the indicated amounts and the treated plates were pre-incubated for 24 hours.

HIV-1 virusstammen (isolert fra infiserte H-9 celler) ble fortynnet i dyrkingsmedium og ga 100 SFU (syncytitialdannende enheter) pr. brønn. Fortynnet HIV-1 virus, 20 ul, ble tilsatt til de passende brønner. Samtlige plater ble så inkubert i fem døgn ved 37°C og 5 % CO2. Ved døgn 5 etter infeksjonen ble cellene gitt en 10 0 ul mediaendring. Ved døgn 7 etter infeksjonen ble en syncytiatelling foretatt ved 40X. Resultatene er avsatt i fig. 2 - 4 og 6a. The HIV-1 virus strain (isolated from infected H-9 cells) was diluted in culture medium and yielded 100 SFU (syncytial forming units) per well. Diluted HIV-1 virus, 20 µl, was added to the appropriate wells. All plates were then incubated for five days at 37°C and 5% CO2. At day 5 post-infection, the cells were given a 100 µl media change. At day 7 after infection, a syncytia count was performed at 40X. The results are set out in fig. 2 - 4 and 6a.

EKSEMPEL 4EXAMPLE 4

HIV-syncytialdannende assay for antiviral aktivitet under anvendelse av SupT-l-celler. HIV syncytial-forming assay for antiviral activity using SupT-1 cells.

Assayet ble gjennomført ved å følge prosedyren beskrevet i eksempel 3 med unntagelse av at SupT-l-cellene ble anvendt. Under anvendelse av SupT-l-cellene ble mediet ikke endret ved døgn 5 etter infeksjon og syncytia ble telt ved døgn 5 etter infeksjon ved 40X. Resultatene er avsatt i fig. 5, 6b og 7. The assay was carried out following the procedure described in Example 3 with the exception that the SupT-1 cells were used. Using the SupT-1 cells, the medium was not changed at day 5 post infection and syncytia were counted at day 5 post infection at 40X. The results are set out in fig. 5, 6b and 7.

EKSEMPEL 5EXAMPLE 5

SAN-hydrolaseinhibering.SAN hydrolase inhibition.

Virkningen av inkubasjonstid og AICA-ribosidkonsentrasjon på SAN-hydrolaseaktivitet ble bestemt som følger. Fem prøver av SAN-hydrolase ble inkubert ved de følgende AICA-ribosidkonsentrasjoner: 0, 10, 25, 50 og 100 uM. Inkubasjonsbufferen besto av 25 mM kaliumfosfat, pH 7,0, 1 mM EDTA, ImM DTT og 0,04 % BSA. Totalt enzym tilsatt til inkubasjonsblandingen var 10 ug. Ved de angitte tidspunkt ble 10 ul prøve trukket ut og underkastet assay i det etterfølgende assaysystem: 25 mM kaliumfosfat, pH 7,9, 40 mM DL-homocystein, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 uM EHNA, 0,1 % BSA og 10 UM U-<14>C adenosin (590 m Ci/mmol). Reaksjonen ble stanset ved å tilsette 15 ul 30 % TCA. Prøvene ble så sentrifugert og 15 ul ble fjernet og tilført Kodak cellulose 13254 TCL-plater sammen med SAN og adenosinmarkører. Platene ble så fremkalt i et løsningsmiddel-system av 1-butanol:metanol:H2O:ammoniumhydroksyd (60:20:20:2). Adenosinet og S-adenosylhomocystein ble gjort synlig under UV-lys og punktene ble skåret ut fra platen. Radioaktiviteten av punktene ble bestemt ved hjelp av væskescintillasjonsspektro-metri. Kinaktiverings_verd"i"er ble Destemt fra hellingen av log % (V/V x 100) versus tid (minutter) vist i fig. 10a. Fra en grafisk fremstilling av den resiproke verdi av Kj_nakt-j_ver-j_ng versus 1/AICA-ribosidkonsentrasj on ble verdiene for K]_ (X-intersept) og Kmaks(Y-intersept) bestemt (fig. 10b). The effect of incubation time and AICA riboside concentration on SAN hydrolase activity was determined as follows. Five samples of SAN hydrolase were incubated at the following AICA riboside concentrations: 0, 10, 25, 50 and 100 µM. The incubation buffer consisted of 25 mM potassium phosphate, pH 7.0, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, and 0.04% BSA. Total enzyme added to the incubation mixture was 10 µg. At the indicated times, 10 µl of sample was withdrawn and assayed in the following assay system: 25 mM potassium phosphate, pH 7.9, 40 mM DL-homocysteine, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 µM EHNA, 0.1% BSA and 10 UM U-<14>C adenosine (590 m Ci/mmol). The reaction was stopped by adding 15 µl of 30% TCA. The samples were then centrifuged and 15 µl were removed and applied to Kodak cellulose 13254 TCL plates along with SAN and adenosine markers. The plates were then developed in a solvent system of 1-butanol:methanol:H 2 O:ammonium hydroxide (60:20:20:2). The adenosine and S-adenosylhomocysteine were made visible under UV light and the spots were cut from the plate. The radioactivity of the dots was determined by liquid scintillation spectrometry. Kinactivation values were determined from the slope of log % (V/V x 100) versus time (minutes) shown in Fig. 10a. From a graphical presentation of the reciprocal value of Kj_nakt-j_ver-j_ng versus 1/AICA riboside concentration, the values for K]_ (X-intercept) and Kmax(Y-intercept) were determined (Fig. 10b).

EKSEMPEL 6EXAMPLE 6

Fremstilling av karbonatestere av AICA-ribosid.Preparation of carbonate esters of AICA riboside.

Karbonatestere av AICA-ribosid ble fremstilt ved hjelp av den følgende prosedyre. Karbonatestere av karbocyklisk AICA-ribosid ble tilsvarende fremstilt. En 7 0 mmol porsjon av AICA-ribosid suspenderes i en blanding av 5 0 ml N,N-dimetylformamid og 50 ml pyridin og deretter avkjølt i et issaltbad. Til den resulterende blanding ble passende klorformiat (94 mmol, et 20 % overskudd) tilsatt under vannfri betingelser i løpet av en periode på omtrent 15 til 30 minutter under konstant omrøring. Saltbadet fjernes. Reaksjonsblandingen fikk oppvarme seg til romtemperatur i løpet av en til to timer. Reaksjonsforløpet overvåkes ved hjelp av TLC på silikagel, under eluering med 6:1 metylenklorid:metanol. Forsvinning av AICA-ribosid indikerer fullført reaksjon. Løsningsmidlene fjernes ved avdamping under høyt vakuum (badtemperatur under 40°C). Resten kromatograferes på en silikagelkolonne fylt med metylenklorid og elueres initialt med metylenklorid og deretter med metylenklorid:metanol 95:5. Fraksjoner som viste identiske (TLC) mønstre ble slått sammen og deretter ble eluatet inndampet til å gi et skum som tørkes over natten under høyt vakuum ved romtemperatur. Carbonate esters of AICA riboside were prepared using the following procedure. Carbonate esters of carbocyclic AICA riboside were similarly prepared. A 70 mmol portion of AICA riboside is suspended in a mixture of 50 ml of N,N-dimethylformamide and 50 ml of pyridine and then cooled in an ice-salt bath. To the resulting mixture was added the appropriate chloroformate (94 mmol, a 20% excess) under anhydrous conditions over a period of about 15 to 30 minutes with constant stirring. The salt bath is removed. The reaction mixture was allowed to warm to room temperature within one to two hours. The course of the reaction is monitored by means of TLC on silica gel, eluting with 6:1 methylene chloride:methanol. Disappearance of AICA riboside indicates completion of reaction. The solvents are removed by evaporation under high vacuum (bath temperature below 40°C). The residue is chromatographed on a silica gel column filled with methylene chloride and eluted initially with methylene chloride and then with methylene chloride:methanol 95:5. Fractions showing identical (TLC) patterns were pooled and then the eluate was evaporated to give a foam which was dried overnight under high vacuum at room temperature.

Utbyttet av produkt-karbonatester er omtrent 45 til 65 %. Selv om det primære produkt er 5'-karbonatester fremstilles også andre produktestere. The yield of product carbonate ester is approximately 45 to 65%. Although the primary product is 5'-carbonate ester, other product esters are also produced.

EKSEMPEL 7EXAMPLE 7

Fremstilling av 3'-isobutoksykarbonyl AICA-ribosid.Preparation of 3'-isobutoxycarbonyl AICA riboside.

En oppløsning av AICA-ribosid (18,06 g, 70 mmol) i en blanding av pyridin (50 ml) og N,N-dimetylformamid (50 ml) ble avkjølt i en issaltblanding. Det ble tilsatt isobutylklorformiat A solution of AICA riboside (18.06 g, 70 mmol) in a mixture of pyridine (50 mL) and N,N-dimethylformamide (50 mL) was cooled in an ice-salt mixture. Isobutyl chloroformate was added

(11,47 g, 94 mmol) sakte i løpet av en periode på 30 minutter under konstant omrøring. Den initiale rødfarge av reaksjonsblandingen ble blekgul i løpet av omtrent 40 minutter. Omrøring ble fortsatt i to timer etterfulgt av TLC på silikagel, eluering med metylenklorid:metanol 9:1 (Rf = 0,3) som indikerte fullført reaksjon. Metanol (2 ml) ble tilsatt for å nøytralisere ureagerte reagenser. Løsningsmidlene fra reaksjonsblandingen ble fjernet ved avdamping under høyvakuum (badetemperatur omtrent 40°C). Den klebrige masse som var tilbake var kromatografert over en silikagelkolonne fylt med en 9:1 metylenklorid:metanolblanding. Kolonnen ble eluert med den samme blanding og flere reaksjoner ble samlet. Fraksjoner som viste like TLC-punkter ble samlet og inndampet og ga et hvitaktig skum. Produktet isolert fra skummet hadde den tilhørende struktur basert på NMR-spektrum: 3'-isobutyloksy-karbonyl-AICA-ribosid. Utbytte 8,5 g, smp. 71 til 73°C (ikke (11.47 g, 94 mmol) slowly over a period of 30 min with constant stirring. The initial red color of the reaction mixture turned pale yellow in about 40 minutes. Stirring was continued for two hours followed by TLC on silica gel, eluting with methylene chloride:methanol 9:1 (Rf = 0.3) indicating completion of reaction. Methanol (2 mL) was added to neutralize unreacted reagents. The solvents from the reaction mixture were removed by evaporation under high vacuum (bath temperature approximately 40°C). The sticky mass that remained was chromatographed over a silica gel column filled with a 9:1 methylene chloride:methanol mixture. The column was eluted with the same mixture and several reactions were collected. Fractions showing similar TLC points were pooled and evaporated to give a whitish foam. The product isolated from the foam had the corresponding structure based on the NMR spectrum: 3'-isobutyloxycarbonyl-AICA riboside. Yield 8.5 g, m.p. 71 to 73°C (not

noe skarp smp.), IR (nujol) 1725 cm-<1>(-OC02CH2CH(CH3)2),NMR(DMSO-dg), 5 ppm, 0,9 [d, 6H (CH3)2], 1,9 (m, 1H, CH av isobutylsidekjede), 3,6 (m, 2H, 5'-CH2), 3,9 (d, 2H, CH2av isobutylsidekjede), 4,1 (m, 1H, 4'-CH), 4,6 (1, 1H, 2'-CH), 5,01 (dd, 1H, 3'-CH), 5,45-5,55 (m, 2H, 1'-CH og 5'-OH), 5,92 (d, 1H, 2-OH), 6,02 (br.s, 2H, 5-NH2), 6,6-6,9 (br.d, 2H, 4-CONH2), 7,35 (S, 1H, 2-CH). somewhat sharp m.p.), IR (nujol) 1725 cm-<1>(-OC02CH2CH(CH3)2),NMR(DMSO-dg), 5 ppm, 0.9 [d, 6H (CH3)2], 1, 9 (m, 1H, CH of isobutyl side chain), 3.6 (m, 2H, 5'-CH2), 3.9 (d, 2H, CH2 of isobutyl side chain), 4.1 (m, 1H, 4'-CH) , 4.6 (1, 1H, 2'-CH), 5.01 (dd, 1H, 3'-CH), 5.45-5.55 (m, 2H, 1'-CH and 5'-OH ), 5.92 (d, 1H, 2-OH), 6.02 (br.s, 2H, 5-NH2), 6.6-6.9 (br.d, 2H, 4-CONH2), 7 .35 (S, 1H, 2-CH).

Spektra av denne forbindelse ble sammenlignet med spektra for dens utgangsforbindelse, AICA-ribosidet og viste at 3'-CH (som vises ved 4,05 ppm i AICA-ribosidet), hadde skiftet nedover med 1 ppm som skyldtes en substitusjon på oksygenet knyttet til det samme karbonatom, mens posisjonene for alle de andre protoner forble uendret for det meste, og bekreftet på denne måte at substitusjonen var på 3'-C. The spectra of this compound were compared with those of its parent compound, the AICA riboside, and showed that the 3'-CH (appearing at 4.05 ppm in the AICA riboside) had shifted down by 1 ppm due to a substitution on the oxygen attached to the same carbon atom, while the positions of all the other protons remained mostly unchanged, thus confirming that the substitution was at 3'-C.

Selv om NMR av produktet i eksempel 7 indikerte at det var minst 80 % av 3'-isobutoksykarbonatesteren, viste HPLC-analyse flere topper. Fraksjonene tilsvarende hver topp ble samlet og analysert ved HPLC. Hver topp viste også nærvær av to hovedprodukter, betegnet A og B. Ett av dem (produkt A) ble bestemt å være AICA-ribosid og det annet (produkt B) ble isolert i små mengder ogkarakterisertsom AICA-ribosid-2',3'-cyklisk karbonat basert på dets NMR og massespektraldata. NMR(DMSO-dg) 5 ppm, 3,6-3,7 (m, 2H, 5'-CH2), 4,3 (q, 1H, 4'-CH), 5,35 (m, 1H, 3'-CH), 5,6 (m, 1H, 2'-CH), 5,2-6,7 (br, IN, 5'-OH), 5,8-6,0 (br, 2H, 5-NH2), 6,1 (d, 1H, l'-CH), 6,7-6,95 (br, d, 2H, 4-CONH2), 7,45 (S, 1H, 2-CH). Massespektrum (FAB)M<+>, 284, M<+1>285,M<+2>286. Disse data bekreftet strukturen av forbindelsen (produkt B) som 2',3'-cyklisk karbonat av AICA-ribosid. En foretrukket syntesemetode av denne forbindelse er angitt i det følgende eksempel 8. Although NMR of the product of Example 7 indicated that it was at least 80% of the 3'-isobutoxycarbonate ester, HPLC analysis showed several peaks. The fractions corresponding to each peak were collected and analyzed by HPLC. Each peak also showed the presence of two major products, designated A and B. One of them (product A) was determined to be AICA riboside and the other (product B) was isolated in small amounts and characterized as AICA riboside-2',3' -cyclic carbonate based on its NMR and mass spectral data. NMR(DMSO-dg) 5 ppm, 3.6-3.7 (m, 2H, 5'-CH2), 4.3 (q, 1H, 4'-CH), 5.35 (m, 1H, 3 '-CH), 5.6 (m, 1H, 2'-CH), 5.2-6.7 (br, IN, 5'-OH), 5.8-6.0 (br, 2H, 5 -NH 2 ), 6.1 (d, 1H, 1'-CH), 6.7-6.95 (br, d, 2H, 4-CONH 2 ), 7.45 (S, 1H, 2-CH). Mass spectrum (FAB) M<+>, 284, M<+1>285, M<+2>286. These data confirmed the structure of the compound (product B) as the 2',3'-cyclic carbonate of AICA riboside. A preferred method of synthesis of this compound is indicated in the following example 8.

EKSEMPEL 8EXAMPLE 8

Fremstilling av AICA 2',3<1->cyklisk karbonat.Preparation of AICA 2',3<1->cyclic carbonate.

Til en suspensjon av AICA-ribosid (5,16 g, 20 mmol) i pyridin (50 ml), ble p-nitrofenylklorformiat (92,5 g, 25 mmol) tilsatt på en gang og omrørt ved romtemperatur i fem døgn og ved slutten av denne tid indikerte TLC på silikagel, eluering med metylenklorid:metanol (6:1 Rf = 0,4), fullført reaksjon. Pyridin fra reaksjonsblandingen ble fjernet ved avdamping. Resten ble kromatografert over en silikagelkolonne, eluert med metylenklorid:metanol (9:1). Fraksjonene som viste identisk TLC ble slått sammen og inndampet og ga et skum (utbytte To a suspension of AICA riboside (5.16 g, 20 mmol) in pyridine (50 mL), p-nitrophenyl chloroformate (92.5 g, 25 mmol) was added all at once and stirred at room temperature for five days and at the end of this time, TLC on silica gel, eluting with methylene chloride:methanol (6:1 Rf = 0.4), indicated reaction completion. Pyridine from the reaction mixture was removed by evaporation. The residue was chromatographed over a silica gel column, eluted with methylene chloride:methanol (9:1). The fractions showing identical TLC were pooled and evaporated to give a foam (yield

4,0 g). Dette produkt var identisk med AICA-ribosid 2',3'-cyklisk karbonat, isolert som ett av biproduktene fra syntesen beskrevet i eksempel 7 ogkarakterisert vedNMR og massespek-tralanalyse. 4.0 g). This product was identical to AICA riboside 2',3'-cyclic carbonate, isolated as one of the by-products from the synthesis described in example 7 and characterized by NMR and mass spectral analysis.

EKSEMPEL 9EXAMPLE 9

Fremstilling av 5'-acetyl AICA-ribosid.Preparation of 5'-acetyl AICA riboside.

Til en blanding av tørr HCl-gass (9,0 g) oppløst i tørt aceton (115 ml) og absolutt etanol (138 ml), ble det tilsatt AICA-ribosid (12,9 g). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i to timer. Fullført reaksjon ble overvåket ved hjelp av TLC. Reaksjonsblandingen ble omrørt i ytterligere to timer ved romtemperatur og ved dette tidspunkt indikerte TLC at reaksjonen var fullstendig. Reaksjonsblandingen ble helt sakte ut i en iskald blanding av ammoniumhydroksyd (18 ml) og vann To a mixture of dry HCl gas (9.0 g) dissolved in dry acetone (115 ml) and absolute ethanol (138 ml) was added AICA riboside (12.9 g). The mixture was stirred at room temperature for two hours. Completed reaction was monitored by TLC. The reaction mixture was stirred for an additional two hours at room temperature at which time TLC indicated that the reaction was complete. The reaction mixture was slowly poured into an ice-cold mixture of ammonium hydroxide (18 mL) and water

(168 ml). pH i oppløsningen ble innstilt til omtrent 8 ved tilsetning av noen ml ammoniumhydroksyd. Reaksjonsblandingen ble konsentrert til 100 ml. Ammoniumkloridbunnfallet ble fjernet ved filtrering. Filtratet ble konsentrert på nytt for utfelling av ytterligere ammoniumklorid. Etter filtrering ble filtratet inndampet til tørrhet. Resten ble ekstrahert tre ganger med 200 ml porsjoner av metylenklorid. Avdamping av metylenklorid ga et skum som blekarakterisert vedhjelp av NMR-spektroskopi til å være produktene 2',3'-isopropyliden AICA-ribosid som ble anvendt i den etterfølgende reaksjon uten ytterligere rensing. (168 ml). The pH of the solution was adjusted to about 8 by adding a few ml of ammonium hydroxide. The reaction mixture was concentrated to 100 ml. The ammonium chloride precipitate was removed by filtration. The filtrate was re-concentrated to precipitate additional ammonium chloride. After filtration, the filtrate was evaporated to dryness. The residue was extracted three times with 200 ml portions of methylene chloride. Evaporation of methylene chloride gave a foam which was characterized by NMR spectroscopy to be the product 2',3'-isopropylidene AICA riboside which was used in the subsequent reaction without further purification.

Til en oppløsning av 2', 3<1->isopropyliden AICA-ribosid i 25 ml tørt pyridin avkjølt i en issaltblanding ble 10 ml eddiksyrean-hydrid tilsatt dråpevis under omrøring. Blandingen ble oppvarmet til romtemperatur i løpet av en periode på to timer. Reaksjonen ble vist å være fullstendig ved hjelp av TLC (9:1 metylenklorid:metanol). Løsningsmidlene ble fjernet fra reaksjonsblandingen ved avdamping. Resten ble koevaporert to ganger med to 25 ml mengder av N,N-dimetylformamid. Produktet ble behandlet med 100 ml 80 % eddiksyre i 24 timer. Fullført reaksjon ble indikert ved hjelp av TLC på silikagel under eluering med 6:1 metylenklorid:metanol. Vann og eddiksyre ble fjernet ved avdamping under redusert trykk. Resten ble koevaporert fire ganger med 100 ml mengder vann for å fjerne eddiksyren. Resten ble krystallisert fra 25 ml 1:1 etanol:vann. Det krystallinske produkt ble samlet ved filtrering, vasket med vann og tørket under vakuum og ga 3,0 g av det ovenfor identifiserte produkt med smp. 165 - 166°C. To a solution of 2', 3<1->isopropylidene AICA riboside in 25 ml of dry pyridine cooled in an ice-salt mixture, 10 ml of acetic anhydride was added dropwise with stirring. The mixture was warmed to room temperature over a period of two hours. The reaction was shown to be complete by TLC (9:1 methylene chloride:methanol). The solvents were removed from the reaction mixture by evaporation. The residue was coevaporated twice with two 25 mL portions of N,N-dimethylformamide. The product was treated with 100 ml of 80% acetic acid for 24 hours. Complete reaction was indicated by TLC on silica gel eluting with 6:1 methylene chloride:methanol. Water and acetic acid were removed by evaporation under reduced pressure. The residue was coevaporated four times with 100 mL portions of water to remove the acetic acid. The residue was crystallized from 25 ml of 1:1 ethanol:water. The crystalline product was collected by filtration, washed with water and dried under vacuum to give 3.0 g of the above-identified product, m.p. 165 - 166°C.

IR (nujol), 1745 cm-<1>(OCOCH3), NMR (DMSO-d6), 5 ppm 2,0 (S, 3H, COCH3), 4,0-4,1 (m, 2H, 5'-CH2), 4,1-4,4 (m, 3H, 2'-CH, 3'-CH, 4'-CH), 5,3 (d, 1H, l'-CH), 5,4-5,6 (m, 2H, 3'-OH, 4'-OH), 5,7-5,9 (br, 2H, 5-NH2), 6,6-7,0 (br, d, 2H, CONH2), 7,3 (5, 1H, 2-CH). IR (nujol), 1745 cm-<1>(OCOCH3), NMR (DMSO-d6), 5 ppm 2.0 (S, 3H, COCH3), 4.0-4.1 (m, 2H, 5'- CH2), 4.1-4.4 (m, 3H, 2'-CH, 3'-CH, 4'-CH), 5.3 (d, 1H, 1'-CH), 5.4-5 .6 (m, 2H, 3'-OH, 4'-OH), 5.7-5.9 (br, 2H, 5-NH2), 6.6-7.0 (br, d, 2H, CONH2 ), 7.3 (5, 1H, 2-CH).

Ved å anvende de følgende prosedyrer beskrevet i eksemplene 6 til 9 og i den detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen ble forbindelsene anført i tabell I fremstilt. Forbindelsene anført i tabellene II og III fremstilles også ved hjelp av disse prosedyrer. Using the following procedures described in Examples 6 to 9 and in the Detailed Description of the Invention, the compounds listed in Table I were prepared. The compounds listed in Tables II and III are also prepared using these procedures.

Claims

1. Method for increasing the antiviral effect of AZT, characterized by adding AZT together with AICA riboside.

2. Method for increasing the antiviral effect of AZT, characterized by adding AZT in connection with an AICA riboside precursor.

3. Method as set forth in claim 2, characterized in that the AICA precursor is selected from the group consisting of 5-amino-3'(2-methyl-1-propoxycarbonyl)-1-|3-D-ribofuranosyl-imidazole-4 -carboxamide and 5-amino-3'(1-propoxycarbonyl)-1-β-D-ribofuranosyl-imidazole-4-carboxamide.

4. Method as stated in claim 2, characterized in that the AICA riboside precursor comprises a modified AICA riboside with an AICA ribosyl part and at least one hydrocarbyloxycarbonyl or hydrocarbylcarbonyl part per equivalent weight AICA ribosyl moiety.

5. Method as stated in claim 4, characterized in that at least one of the hydroxyl oxygens in the ribosyl part of the precursor is substituted with a hydrocarbyloxycarbonyl or hydrocarbylcarbonyl part.

6. Method as stated in claim 4, characterized in that at least one of the hydroxyl oxygens of the ribosyl part in the precursor is substituted with a hydrocarboxycarbonyl part.

7. Process as stated in claim 4, characterized in that the precursor has from one to two hydrocarbyloxycarbonyl parts or hydrocarbylcarbonyl parts per equivalent weight of AICA ribosyl moiety.

8. Method as stated in claim 2, characterized in that the precursor has the formula wherein X^ , X2 and X3 are independently hydrogen,

or wherein R 1 and R 2 are independently hydrocarbyl, or two of X 1 _ , X 2 and X 3 taken together form a cyclic carbonate group, with the proviso that not all of X 1 , X 2 and X 3 are hydrogen.

9. Process as stated in claim 8, characterized in that R 1 and R 2 in the precursor are hydrocarbyl groups with a secondary carbon atom.

10. Method as stated in claim 8, characterized by that or X3 in the precursor 0 H is -COR2 .

11. Method as stated in claim 10, characterized in that R2 in the precursor has a secondary carbon atom.

12. Method for increasing the antiviral action of AZT, characterized by administering AZT together with a therapeutically effective amount of an agent for inhibiting SAN hydrolase.

13. Method as stated in claim 12, characterized in that the agent for inhibiting SAN hydrolase is a purine nucleoside.

14. Method as stated in claim 13, characterized in that the purine nucleoside is AICA riboside.

15. Method as stated in claim 13, characterized in that the purine nucleoside is an AICA riboside precursor.

16. Method as stated in claim 14, characterized in that the AICA riboside is added in an amount of from 1 mg/kg/day to approximately 1000 mg/kg/day.

17. Method as stated in claim 14, characterized in that the AICA riboside precursor is added in an amount of from 1 mg/kg/day to approximately 1000 mg/kg/day.

18. Method for increasing the antiviral activity of AZT, characterized by adding AZT together with a therapeutically effective amount of a purine nucleoside or a purine nucleoside analogue which increases the incorporation of AZT triphosphate into DNA by means of reverse transcriptase.

19. Method as stated in claim 18, characterized in that the purine nucleoside is AICA riboside.

20. Method as stated in claim 18, characterized in that the purine nucleoside increases AZT triphosphate incorporation by reducing thymidine triphosphate incorporation into DNA.

21. Method as stated in claim 18, characterized in that the purine nucleoside analogue is carbocyclic AICA riboside.

22. Method as stated in claim 20, characterized in that the purine nucleoside reduces the incorporation of thymidine triphosphate by reducing the intracellular thymidine triphosphate.

23. Method as stated in claim 20, characterized in that the purine nucleoside reduces incorporation of thymidine triphosphate by increasing thymidine kinase activity.

24. Method as stated in claim 22 or 23, characterized in that the purine nucleoside is AICA riboside.

25. Method for reducing or preventing viral infectivity, characterized by the administration of a therapeutically effective amount of AICA riboside.

26. Method as stated in claim 25, characterized in that the viral infectivity is caused by a retrovirus.

27. Method as stated in claim 26, characterized in that the retrovirus is a human retrovirus.

28. Method as stated in claim 27, characterized in that the human retrovirus is human immunodeficiency virus (HIV).

29. Method as stated in one or more of claims 25, 26, 27 and 28, characterized in that the AICA riboside is supplied in amounts of from 1 mg/kg/day to approximately 10 00 mg/kg/day.

30. Procedure for reducing or preventing viral infectivity, characterized by the administration of a therapeutically effective amount of an AICA riboside precursor.

31. Method as stated in claim 30, characterized in that the viral infectivity is caused by a retrovirus.

32. Method as stated in claim 31, characterized in that the retrovirus is a human retrovirus.

33. Method as stated in claim 32, characterized in that the human retrovirus is human immunodeficiency virus (HIV).

34. Procedure as specified in one or more of claims 30, 31, 32 and 33, characterized in that the AICA riboside precursor is supplied in amounts of from 1 mg/kg/day to approximately 1000 mg/kg/day.

35. Method as stated in claim 30, characterized in that the AICA riboside precursor is selected from the group consisting of 5-amino-3'-(2-methyl-1-propoxy-carbonyl)-1-p-D-ribofuranosyl-imidazole-4-carboxamide, 5 -amino-3'-(1-propoxycarbonyl)-1-p-D-ribofuranosyl-imidazole-4-carboxamide, and 2',3'-cyclocarbonate AICA riboside.

36. Method for increasing the antiviral effect of AZT, characterized by adding AZT together with AI CA.

37. Method for increasing the antiviral effect of AZT, characterized by adding AZT together with an AICA riboside analogue.

38. Method as stated in claim 37, characterized in that the AICA riboside analogue is 5-amino-3'-(2-methyl-1-propoxycarbonyl)-1-p-D-ribofuranosyl-imidazole-4-carboxamide.

39. Method as stated in claim 37, characterized in that the AICA riboside analogue is carbocyclic AICA riboside.

40. Method as stated in claim 37, characterized in that the AICA riboside analogue is a carbocyclic AICA riboside precursor.

41. Method as specified in one or more of claims 1, 2, 8, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 24, 25, 29, 30, 34, 35 and 38, characterized in that it includes supply of an agent to prevent uric acid synthesis.

42. Method for increasing the antibacterial effect of AZT, characterized by adding AZT together with AICA riboside or an AICA precursor or both.

43. Method for increasing the anticancer effect of agents with activities related to their phosphorylation rate, characterized by supplying the anticancer agents together with AICA riboside or an AICA riboside precursor or both.

44. Method for anticancer chemotherapy, characterized by administration of AICA riboside.

45. Method as stated in claim 44, characterized in that the cancer is a T-cell malignancy.

46. Method as stated in claim 13, characterized in that the agent for inhibiting SAN hydrolase is carbocyclic AICA riboside.

47. Method as stated in claim 13, characterized in that the agent for inhibiting SAN hydrolase is a carbocyclic AICA riboside precursor.