NO900048L - Paavisningsmetoder med individ-spesifikke antistoff. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en påvisningsmetode. Den er basert på dannelsen av antigen-antistoffreaktivitets-profiler eller antistofffingeravtrykk som kan bli anvendt for å identifisere dyr og døde gjenstander. Metoden er spesielt verdifull ved hurtig påvisning av store mengder individer. En utførelsesform ifølge metoden er betegnet blokkert fingeravtrykkanalyse. Den er sentrert på påvisning av allergener, autoantigener, definert "selvantigener" og omgivende midler så som patogener, kjemikalier eller toksiner og alle substansene har de samme epitopene eller antistoff-bindingssetene. Med hensyn på påvisning av døde gjenstander er metoden spesielt nyttig for påvisning av sikkerhetsdokumenter og lignende som er av Juridisk betydning, samt verdifulle kunstgjenstander. Ved anvendelse for identifisering av dyr, spesielt mennesker, tillater foreliggende metode påvisning av individer, og kan dermed bli anvendt innenfor områdene rettsmedisin, lovhåndhevning og immigra-sjon .

Påvisning av sikkerhetsdokumenter

En ny generasjon fotokopierende maskiner og foto-offset-maskiner har øket potensialet for forfalskning av forskjellige sikkerhetsdokumenter. Disse maskinene kan produsere nesten perfekte kopier som nesten ikke kan skjelnes fra deres autentiske motstykker. Sikkerhetsdokumenter er tidligere vanligvis blitt behandlet på generelt en eller to måter for å motvirke forfalskninger. Den første metoden bygger på dannelsen av en farve tilknyttet det opprinnelige sikkerhetsdokumentet når forsøk er blitt gjort for å undergrave integriteten derav. Den omfatter impregnering inn i dokumentet et lite organisk molekyl som forandrer farve dersom integriteten til dokumentet blir berørt. Eksempler på sistnevnte er viskelaermerker, kjemisk behandling av dokumentene for å fjerne gyldige signaturer, osv. Kjemikalier anvendt for dette er syre-baseindikatorer så som ftaleiner og sulfonftaleiner som beskrevet i US-patent nr. 2 445 586 og i tysk patent nr. 856 842. Disse molekylene er derimot beklageligvis generelt uoppløselige i vann og det er derfor vanskelig å impregnere disse inn i dokumentene uten anvendelse av organiske oppløsningsmidler som igjen kan innvirke på dokumentene. Problemene knyttet til anvendelse av organiske oppløsningsmidler førte til utviklingen av vannoppløselige indikatorer så som pyrensulfonsyre beskrvet i US-patent nr. 4 136 229, som er oppløselig i vandige oppløsninger og derfor kompatible med dispergeringsteknikkene anvendt for å impregnere forskjellige sikkerhetsdokumenter. En annen tilnærmelse som ofte blir anvendt for å forsikre autentiteten til sikkerhetsdokumentene, er å inkorporere i dokumentet et material som visuelt skjelner kopier laget av originalen. Det beste eksempelet på denne tilnærmelsen er anvendelse av sikkerhetstråder som for tiden anvendes i valutaen til et antall land. Andre teknikker omfatter inkorporering av halografisk bilder. Dette fører til at unike visuelle bilder fremkommer når dokumentene blir undersøkt med enten synlig eller ultrafiolett lys.

Påvisning av individuelle mennesker

De tre mest vanlige ikke-visuelle måtene for påvisning av mennesker er blodtyping, fingeravtrykk og stemmeeksemplarer. Andre metoder omfatter netthinnescans og røntgenbilder av tennene. Blodtyping er basert på eksistensen av grupper av antigener tilstede på blodcellene. F.eks. vedrører ABO-systemet fire forskjellige grupper av blodcelleantigener: A, B, AB og 0. Bokstavene angir antigener tilstede på overflaten av røde blodceller. Type A individer har A antigen; type B individer har B antigen; type AB har begge antigenene; og type 0 har ingen av antigenene. Ved derved å analysere en prøve av blodet til en person er det mulig å identifisere denne personen til en spesiell blodgruppe. Det er selvfølge-lig innlysende at denne metoden kan anvendes for å identifisere et individ ut fra en liten gruppe individer og metoden er begrenset når målet er påvisning av et individ ut fra flere tusen individer. For å gjøre dette er testing for mange flere blodgruppeantigener nødvendig og hver test er en separat analyse. De nyere testene anvender forskjellige isozymer som er tilstede i kroppsvæskene og disse lider av de samme begrensningene som testene for blodtyping. Disse metodene kan ekskludere visse individer, men kan ikke differensiere mellom medlemmer av samme blodgruppe.

Påvisning av individer ved fingeravtrykk er kanskje en mere nøyaktig måte og blir meget anvendt av omtrent alle lov-håndhevningsmyndigheter rundt om i verden. Den er basert på tilsynekomst av karakteristiske mønstre i fingrene til et individ, så som ringer, daler og streker. Når metoden blir anvendt blir en statistisk vurdering gitt når det gjelder grad av overensstemmelse mellom kjente fingeravtrykk tilveiebrakt fra individet, og de fingeravtrykkene som antas å tilsvare individets. Prosedyren er teknisk vanskelig og ofte ikke definitiv. Måten som fingeravtrykkene blir katalogisert på tillater f.eks. tvetydighet.

I mange kriminalsaker er fingravtrykk ikke tilgjengelige.

Den tredje måten for påvisning av individer er å sammenligne et opptak av en stemme med et stemmeeksemplar av individet. Det er selvfølgelig innlysende at denne metoden i de fleste tilfeller har liten verdi fordi det sjelden er tilgang på et opptak av stemmen til et individ fra før den tiden det søkes sammenligning med.

Forskjellige immunologiske/biokjemiske tester basert på genetikk blir rutinemessig anvendt ved opphavsundersøking, ved bestemming av kompatibiliteten til givere og mottakere som er involvert ved transplanterings- eller transfu-sjonsprosedyrer, og også noen ganger som en hjelp for identifikasjon av mennesker og dyr. Idet foreliggende metode kan anvendes for opphavsundersøking eller organ- eller transfusjonstilpassing, er det viktig å bemerke at den tilveiebringer en påvisningsmetode som er basert på et annet prinsipp. De tidligere prosedyrene omfatter serlologisk testing for proteiner kodet av humane leukocytt antigen genloci eller, mere kjent som, HLA kompleks. Til tross for at det finnes mye informasjon vedrørende den genetiske konstruk-sjonen av HLA locuset eksisterer det mange ulemper ved anvendelse av HLA seriologisk typing for identifisering av individer i en stor gruppe. Dette skyldes hovedsakelig kompleksiteten til serumet anvendt for å gjøre undersøkingen, og mangel på utstrakt tilgjengelighet av standard serum som er nødvendig for å utføre prøven, spesielt når dette vedrører arter forskjellig fra mus eller mennesket. Utviklingen av den monoklonale antistoffteknologien medrører betraktelig standardisering til dette feltet. Hver av HLA genene må bli testet i en separat analyse, og mange slike antigener må bli påvist for å identifisere et individ. Dette er en vanskelig prosess når et individ i en stor gruppe skal bli identifisert.

I tillegg til seriologisk og blandet blandet lymfocyttesting for produktene av HLC loci har senere studier identifisert DNA restriksjonsfragmentlengdepolymorfismer (RFLP'er) som er betegnende for forskjellige individer. Disse er blitt anvendt ved opphavstesting og transplanterings- og transfusjons-kompatibilitetstesting. F.eks. har Erlich, US-patent nr. 4 582 788 beskrevet en metode for typing av HLA systemet basert på HLA DNA EFLP 'er. Videre har Jeffreys et al. Nature, utviklet et virksomt nytt påvisningssystem basert på analyse av repeterende DNA sekvenser (betegnet "hypervariable minisatelitf-regioner) i humant DNA. Denne metoden kan også anvendes på dyr (se, Wetton et al. Nature. volum 327, s. 147

(1987)).

Det er å bemerke for fagmannen at ovennevnte metode er nyttig for identifisering av sikkerhetsdokumenter, individer, utføre opphavstester og transplanterings- og transfusjons-kompatibilitetstesting, men at disse metodene er teknisk vanskelige når de blir anvendt for identifisering av individer, og er også tidkrevende og krever ofte anvendelse av dyrt laboratorieutstyr. Det ville derfor være et betydelig bidrag til området dersom en enkelt test kunne bli utviklet for påvisning som er minst like kraftige som de som anvendes nå. Den bør ikke omfatte ulempene til de tidligere testene og fortrinnsvis være basert på et helt annet prinsipp. Systemene som er basert på DNA RFLP, eller DNA "hypervariable mini-satelitt"-regioner, diskriminerer ikke mellom genetisk identiske dyr så som tvillinger, og avhenger av den bestemte DNA proben anvendt for å diskriminere mellom individer som er nært beslektede. Foreliggende metode som er påvirket genetikken til individet på en generell måte, ligner mest på rettsmedisinsk fingeravtrykkingsmetoden på grunn av at den er produktet av normale utviklingsprosesser som er unike for hvert individ. Idet immunsystemet til hvert individ er meget variabelt når det gjelder produsering av antistoffer i respons til antigener og antistoffgenene er kjent for å gjennomgå en høy grad av "somatiske mutasjoner" som effektivt virker som en "tilfeldig antall generator" som fører til ytterligere diversitet av antistoffrepertoaret (omfattende IS antistoffrepertoaret). Foreliggende metode har det til felles med DNA fingeravtrykkingsmetoden at de kan diskriminere mellom nært beslektede individer og koble nyfødte og mødrene. Den har den fordelen at den kan diskriminere mellom Identiske tvillinger og er enkel og hurtig spesielt når den blir anvedt med spytt eller kroppsvæsker forskjellig fra blod.

Foreliggende oppfinnelse betegnet antistoff-fingeravtrykking tilveiebringer en generell påvisningsmetode hvorved døde og levende objekter kan bli identifisert. Den er basert på den opptil nå ukjente oppdagelsen av at mennesker og dyr generelt har tilstede i kroppene derav et hittil ukjent sett av individ-spesifikke, eller IS-antistoffer. Når kroppsvæsken til et individ (eller faste stoffer) inneholdende IS-antistoffer blir screenet mot et panel (en n-dimensjonal oppstilling hvor n er vanligvis 1 eller 2) av mange antigener (vanligvis mer enn 10 000 forskjellige antigener), blir bestemte antigen-antistoffkomplekser dannet. Antigen- antistoffkompleksene blir påvist ved anvendelse av et hensiktsmessig antistoff-bindende detektormolekyl, vanligvis radioaktivt eller enzymer som tilveiebringer et farvet produkt ved reaksjon med substrat. Antigen-antistoff-reaktivitetsprofil, eller antistoff-fingeravtrykk, kan bli anvendt for å Identifisere individuelle mennesker eller dyr.

Hensikten med foreliggende oppfinnelse er derfor å beskrive en enkel immunologisk påvisningsmetode som kan anvendes på mennesker og dyr. Metoden er basert på dannelsen av en antistoff-formidlet immunrespons. Spytt, teras, blod, seru, sæd, urin, svette, lungevaskinger eller andre kroppsvæsker, eller faste stoffer fr kroppen så som vev eller avføring, inneholdende et repertoar av antistoff til organismen blir screenet mot et panel bestående av mange forskjellige antigener og dette fører til dannelsen av antistoff-antigenkomplekser som er meget typiske for organismen som kroppsvæsken ble tilveiebrakt fra. Alle IS-antistoffisotypene er representert og dette muliggjør anvendelse av mange detektormolekyler. Detektormolekylene anvendt for å påvise antigen-antistof fkompleksene er lett tilgjengelige og omfatter antistoffbindende proteiner så som Staphylococcus aureus Protein A., eller antistoffer så som geite anti-humant antistoff eller reumatoid faktor, eller til og med celler med reseptorer for antistoffer, så som lymfocytter. Detektormolekylene blir hensiktsmessig merket med markørmolekyler og eksempler på slike er enzymer, radioaktive isotyper, magnetiserbare metaller eller fotosensitive kjemikalier. Tegnet som blir dannet av detektormolekylene ved binding til antigen-antistoffkompleksene blir deretter analysert visuelt, eller med hensiktsmessige instrumenter så som optiske scannere eller gammabestrålingsscannere. Profilene kan analyseres ved data og lagret for sammenligning ved et senere tidspunkt med profiler fra prøver med ukjent opprinnelse.

I tillegg til å tilveiebringe en metode for påvisning av mennesker og dyr omfatter en annen hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en metode hvorved skadede kroppsdeler fra mennesker eller dyr kan bli identifiserte. Denne situasjonen kan f.eks. oppstå som et resultat av katastrofale hendelser så som ved flystyrt, hvorved kroppsdeler kan bli identifisert ved anvendelse av IS-spesifikke antistoffer.

En ytterligere hensikt med foreliggende oppfinnelse er å beskrive en metode hvorved sikkerhetsdokumenter kan bli identifisert ved inkorporering inn i, eller tilsetting til dokumentet, IS-antistoffer tilveiebrakt fra en eller flere kjente individer, som når undersøkt med en eller flere paneler av antigener tilveiebringer spesielle profiler av antigen-antistoffreaktiviteten, eller antistoff-fingeravtrykk. Sikkerhetsdokumenter kan også bli identifiserte ved inkorporering deri, eller forene med dokumentet, et panel av mange forskjellige antigener, som når screenet med en effektiv mengde av en eller flere bestemte sera inneholdende IS-antistoff, danner bestemte antigen-antistoffkomplekser, som når de blir påvist danner en antigen-antistoffreak-tivitetsprof11, eller antistoff-fingeravtrykk.

En annen hensikt med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en utførelsesform av antistoff-fingeravtrykkmetoden, betegnet blokkert fingeravtrykkanalyse. Metoden bygger på konkurranse mellom en effektiv konsentrasjon av IS-antistoff for epitoper tilstede i et panel av mange eller primære antigener, med lignende epitoper tilstede i andre intigeniske eller sekundære molekyler, vanligvis I oppløsning, og fører til hemming eller blokkering av dannelsen av antigen-antistof fkomplekser på panelet hvorpå antistoff-fingeravtrykket blir dannet, som dermed reduserer antall elementer i fingeravtrykket. Blokkeringsanalysen kan bli anvendt i en enkel analyse for å påvise mange forskjellige sekundære antigeniske molekyler med de samme epitopene som er tilstede på autoantigener, eller antigener fra miljøet så som infeksiøse midler, kjemikalier, toksiner eller syntetiske peptider. Foreliggende metode muliggjør også påvisning av IS-antistoffer med antipatogen, anti-allergen eller autoanti-stoff funksjon. De slik identifiserte IS-antistoffene er i seg selv nyttige for konstruksjon av diagnostikk for patogener eller allergener, terapi eller diagnostikk for autoimmune sykdommer.

En ytterligere hensikt med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe kits som kan bli anvendt for å identifisere dyr eller sikkerhetsdokumenter som består av individspesifikke antistoffer og tilhørende reagenser. Fig. 1 viser foreliggende oppfinnelse eller antistoff-fingeravtrykk tilveiebrakt med individuelt humant sera, inkludert medlemmer av to familier, over flere år og i ett tilfelle ved alvorlig sykdom. Derumet ble screenet mot et panel bestående av titusen forskjellige humane (HeLa celle) antigener og antigen-antistof fkomplekser ble påvist med 125 I-merket S. aureus Protein A som eksponerte Kodak X-AR film. Fig. 2 viser antistoff-fIngeravtrykk av individuelle normale mennesker varierende i alder fra nyfødt til 90år ved anvendelse av et HeLa cellepanel av antigener. Fig. 3 viser antistoff-fingeravtrykk tilveiebrakt med et individuelt normalt humant serum screenet mot forskjellige paneler inneholdende et stort antall antigener preparert fra forskjellige kilder. Fig. 4 viser antistoff-fingeravtrykk av individuelle normale

og syke barn med aldre fra en måned til ett år.

Fig. 5 viser antistoff-fingeravtrykk av individuelle normale og syke barn med alder fra ett år til seks år. Fig. 6 viser antistoff-fingeravtrykk av individuelle normale og syke dyr fra forskjellige arter og med forskjellig alder. Fig. 7 viser antistoffprofIlene av Individer omfattende

forskjellige normale humane familier.

Fig. 8 viser blokkert fingeravtrykkanalyse med sekundære antigener i oppløsning (tilveiebrakt fra forskjellige kilder) anvendt for å konkurrere med et panel humane HeLa-celler primære antigener for IS-antistoffer tilstede I et individuelt normalt humant serum.

Foreliggende oppfinnelse som vedrører antistoff-fInger-avtrykkdannelse (antibody finger printing) og tilveiebringer en generell anvendbar identifikasjonsmetode som er hurtig og enkel. Den er basert på funnet at dyr med et immunsystem reagerer ved tilstedeværelse av fremmede forbindelser, eller antigener, ved igangsetting av en immunrespons som omfatter produksjon av antistoffmolekyler ved lymfocyttceller. Antistoffresponsen blir opprettholdt over en periode på flere år. Oppfinnerne har oppdaget at I løpet av den tidlige utviklingen (fra nyfødt til toårsalderen) av hvert individs immunsystem blir en effektiv individ-spesifikk antistoffrespons (betegnet IS-antistoffrespons) tilveiebrakt og dette omfatter et stort antall forskjellige antistoffmolekyler. IS-antistoffer tilstede 1 kroppsvæskene eller de faste stoffene til mennesker, eller dyr, kan dermed virke effektivt som et individ-spesifikt "fingeravtrykk" til det individet når det blir screenet mot et egnet panel (n er dimensjonsområdet hvor n vanligvis er en eller to) inneholdende multiple antigener. Det effektive antallet antigener eller epitoper (antistoff-bindingsseter) som er tilstede i det antigeniske området er mindre enn 10^<0>og vanligvis høyere enn ettusen, avhengig av nivået av statistisk sikret som er ønsket ved matching eller diskriminering mellom et lite eller et stort antall (høyere enn 100) Individuelle IS-antistoff-"fingeravtrykk". Antigen- antistoffreaktivitetsprofilen tilveiebringer et individ-spesifikt antistoff-fIngeravtrykk når den blir påvist med et hensiktsmessig detektormolekyl.

Foreliggende påvisningsmetode kan bli anvendt for å identifisere mennesker eller en hvilken som helst organisme som produserer IS-antistoff. Metoden kan videre anvendes for å skjelne mellom eller identifisere døde objekter så som blodtransfusjoner, kroppsdeler, kroppsutsondringer eller sikkerhetsdokumenter. Fagfolk innenfor området vil videre sette pris på at elementer av antistoff-fingeravtrykket kan tilveiebringe mye nyttig informasjon om immunstatusen til et Individ.

Et unikt trekk i forliggende påvisningsmetode er at den er følsom overfor tilstedeværende antigener i miljøet. I den blokkerte fingeravtrykkanalysen som er en utførelsesform av foreliggende metode beskrevet nedenfor, er evnen til sekundære antigener så som antigener fra miljøet beskrevet og disse konkorrerer med en effektiv mengde primære antigener i panelet for begrensende IS-antistoffer. Vellykket konkurranse fører til et tap av antigen-antistoffreaksjoner med primære antigener i panelet og påfølgende tap av elementer fra antistoff-fingeravtrykket. Antistoff (inkludert IS-antistoff) som effektivt kryssreagerer med primære antigener i panelet, og med forskjellige sekundære antigener kan anvendes for å identifisere immunologisk lignende primære og sekundære antigener, så som allergener fra miljøet, infeksiøse midler, kjemikalier og toksiner. Blokkert fingeravtrykkanalyse kan også bli anvendt for å påvise konstante antigener som er naturlige eller syntetiske "autoantigener" som har lignende epitoper som primære antigener i panelet (autoantigener er definert som "selv"-antigener). Når de primære antigenene i panelet derimot består av "selv" eller "autoantigener", eller patogener, kan blokkert fingeravtrykkanalyse anvendes for å identifisere miljøantigener med lignende epitoper som autoantigenene eller patogenene, respektivt. Noen IS- antistoffer korresponderer sannsynligvis med "autoanti-stoffer" og kan ved rensning være nyttige i seg selv ved konstruksjon av diagnostiske midler og terapeutiske midler for autoimmune sykdommer.

Dersom de primære antigenene korresponderer til patogenene i miljøet kan blokkert fingeravtrykkanalyse bli anvendt for å identifisere IS-antistoffer med antipatogen funksjon. Disse IS-antistoffene kan også være nyttige ved konstruksjon av anti-patogen diagnostiske midler eller terapeutiske midler, så som vaksiner.

Det er dermed innlysende at denne anvendelsen av metoden beskrevet heri kan anvendes innenfor området diagnostiske midler og terapeutiske midler for autoimmune sykdommer i mennesker og dyr.

Den immunologiske metoden kan også bli anvendt sammen med andre påvisningsmetoder basert på forskjellige prinsipper, så som tradisjonell dannelse av fingeravtrykk, eller genetiske tester så som HLA testing, DNA RFLP analyser, eller DNA fingeravtrykkanalyser. Og disse testene kan samlet danne en spesielt nøyaktig og virkningsfull påvisningsmetode, spesielt i situasjoner som omfatter et stort antall (mer enn hundre<9 individer. Foreliggende metode er fordelaktig i det at den er hurtig, enkel og billig, spesielt når spytt blir anvendt, hvor man dermed unngår problemene med blodtagning.

Den immunologiske metoden anvendt for påvisning av individer omfatter: (a) Tilveiebringing av en effektiv konsentrasjon av IS-antistoffer, fortrinnsvis i oppløsning, fra kroppsvæsken til et individ, så som urin, plasma, serum, spytt, svette, sæd eller vaskinger fra lunge, eller fra de faste stoffene til et individ så som vev eller avføring. IS-antistoffene kan bli tilveiebrakt i tørr tilstand og som fra faste stoffer fra kroppen, resuspendert til oppløsning ved anvendelse av en egnet buffer, så som isotonisk saltvann. Den effektive konsentrasjonen til hver IS-antistoffspesifisitet er mindre enn 1 g/ml, fortrinnsvis omtrent 10 ng/ml - 10 mg/ml. (b) Reagering av antistoffoppløsningen tilveiebrakt i (a) med effektivt panel antigener, hvor panel betegner en n-dimensjonal mengde antigener, hvor n vanligvis er en eller to, for å danne antigen-antistoffkomplekser. Antigenpanelet inneholder multiple forskjellige antigener som vanligvis er på mere enn titusen forskjellige antigener eller epitoper og kan være sammensatt av naturlige antigener preparert fra vevskulturceller, eller frisk dyrevev tilveiebrakt fra mange forskjellige kilder, eller kan bestå av et slikt ekstrakt behandlet med enzymer eller på andre måter for å danne fusjonsproteiner eller degraderingsfragmenter med forskjellig størrelse, eller kan bestå av syntetiske polypeptider, eller kan bestå av blandinger eller subfraksjoner av ovennevnte, såfremt antigener i panelet inneholder epitoper gjenkjent av IS-antistoffene, og såfremt antigenene ikke er forurenset av IS-antistoffene. Antall antigen-antistoffkomplekser kan effektivt økes eller reduseres ved blanding av forskjellige typer antigener anvendt i panelet. Den effektive konsentrasjonen av hvert antigen i panelet er mindre enn lg/mm2 , fortrinnsvis 0,5 nanogram til 1 mg pr. kvadrat-millimeter. Antigenpanelet blir dannet ved separering av antigenene i n-dimensjoner som vanligvis er en eller to, og som kan tilveiebringes ved elektroforese, isoelektrisk fokusering eller på annen måte: (c) påvisning av antigen-antistoffkompleksene med en effektiv mengde av et hensiktsmessig detektormolekyl.

Identiteten til et individ blir bestemt ved sammenligning av den resulterende antigen-antistoffreaktivitetsprofilen, eller antistofffingeravtrykket, med den til en tidligere tilveiebrakt profil som er kjent for å være karakteristisk for individet. Individer eller døde objekter, så som blodtransfusjoner eller vev tilveiebrakt etter flystyrt, kan likeledes skjelnes ved sammenligning av antistoff-fingeravtrykk tilveiebrakt fra hver.

Metoden som den anvendes for å påvise sikkerhetsdokumenter omfatter: (a) som ovenfor; (b) forene en effektiv mengde karakteriserte IS-antistoffer tilveiebrakt fra en eller flere individer i (a) på eller med sikkerhetsdokumentet; (c) reagering av IS-antistoffene forenet på eller med sikkerhetsdokumentet med et bestemt panel antigener; (d) påvisning av mengden av antigen-antistoffkomplekser med en effektiv mengde detektormolekyler.

Påvisningen av sikkerhetsdokumentet blir tilveiebrakt ved sammenligning av antistoff-fingeravtrykket forenet på eller med dokumentet med det til et tidligere tilveiebrakt fingeravtrykk kjent for å være karakteristisk for antistoffene. Likeledes kan et autentisk dokument bli skjelnet fra et falskt dokument ved sammenligning av antistoff-fingeravtrykkene assosiert med hver. Det er å bemerke at metoden anvendt for påvisning av sikkerhetsdokumenter kan være komplemente av ovenfor, dvs.: (a) forene et bestemt panel antigener på eller med sikkerhetsdokumentet; (b) reagering av panelet av antigener med en effektiv konsentrasjon av en eller flere bestemte karakteriserte IS-antistoffer fra et individ tilveiebrakt fra kroppsvæsker eller faste stoffer fra det individet(ene); (c) påvisning av antigen-antistoffkomplekser med en effektiv konsentrasjon av et hensiktsmessig detektormolekyl.

Mange forskjellige analyseteknikker er tilgjengelige for påvisning av antigen-antistoffkomplekser som vanligvis blir betegnet "immunkomplekser". Det er å bemerke for fagfolk at foreliggende oppfinnelse ikke er basert på en forståelse av den molekylære interaksjonen til hvert bestemte antistoff og antigen. Det eneste som er nødvendig er at en metode blir anvendt for påvisning av immunkompleksene dannet som et resultat av individ-spesifIkke antistoffer (IS-antistoffer) som reagerer med multiple antigener tilstede i et panel, eller n-dimensjonområdet, hvor n vanligvis er en eller to.

Forskjellige Immunkompleksanalyser er beskrevet i Methods of Enzymology. volum 73, part B, Editor J.J. Langone og H.V. Vunakis, Academic Press. Immunkompleksanalyser beskrevet deri faller generelt inn I to hovedklasser. I den første klassen er analysene betegnet analyttoverskudd/merket antigenanalyser. Til tross for at disse analysene kan anvendes for å realisere foreliggende oppfinnelse er de omstendige og tidkrevende på grunn av at de generelt blir anvendt for å bestemme tilstedeværelsen av et enkelt antigen. På grunn av at foreliggende metode er basert på en bestemning av reaktivitetsprofilen til multiple antistoffer med multiple antigener, er det å bemerke at for å tilveiebringe denne informasjonen ved anvendelse av analyttoverskudd/merket antigenanalyser ville være meget tidkrevende når multiple forskjellige analyser blir utført for hvert antigen.

Den andre hovedklassen av immunkompleksanalyser omfatter antigen/merket antistoffoverskuddanalyser. Her blir antistof f sammensetningen til normalt serum bestemt ved screening av serumet mot en blanding av antigener som generelt er bundet til, og separert på, en fast overflate. Antistoffet som er tilstede i serumet er i overskudd og dette er innbefattet i betegnelsen "overskudd antistoffanalyse". Antigenblandingen kan bli knyttet til forskjellige faste overflater og deretter analysert ved påføring av serumet. Et annet merket antistoff eller antistoff-bindende molekyl blir påført og viser tilstedeværelse av antistoff bundet til antigenet tilstedet I serumet.

Vanligvis blir det antigeniske materialet separert på en eller annen måte og som oftest ved elektroforese for å muliggjøre hurtig visualisering av reaktivitetprofilen til antistoffene i serumet med multiple antigener. En mengde materialer er blitt anvendt for å konstruere faste bærer-matriser som kan bli anvendt I disse typene av immunkompleksanalyser. Representative materialer omfatter polyakrylamid og agarose. I tillegg kan andre materialer inkludert poly-styrener, polyvinylklorid, polyetylen, cellulose og andre naturlige eller syntetiske polymerer anvendes.

En modifikasjon av ovennevnte teknikk er den såkalte immunoblottingsprosedyren, også kalt Western-blotting, beskrevet av Towbin et al. i Proceedlngs of the National Academv of Science. USA, Volum 76, s. 4350 (1979). Denne består av separering av en antigenblanding i en eller to dimensjoner på en polyakrylamidgel og deretter overføring av antigenene fra gelene på en egnet overflate, f.eks., nitrocellulosepapir. Prosedyren danner et panel av antigener fordelt I en eller to dimensjoner. Antigenpanelet blir deretter inkubert med et blokkeringsmiddel, f.eks. en oppløsning av bovint serumalbumin, og detergenter, så som Tween-20, for å blokkere eller binde til setene på panelet som ikke er okkupert av antigen. Panelet blir deretter inkubert med primære antistoffer, vasket for å fjerne uspesifikt bundede antistoffer, og deretter inkubert med et detektormolekyl som gjenkjenner antigen-antistoffkompleksene, vanligvis gjennom antistoffdelen. Teknikken for immunoblotting er fordelaktig på grunn av at den vanligvis har lavere bakgrunn enn andre teknikker og på grunn av at den kan innbefattes i en dipstick analyse. Foreliggende metode er forskjellig fra de tidligere beskrevne for dannelsen eller påvisning av immunkomplekset på grunn av at den omfatter individ-spesifikke eller IS-antistoffer.

Metoden for påvisning av antistoff bundet til antigen ved anvendelse av et markørmerket antistoff-bindingsmolekyl ville være forskjellig avhengig av naturen til substratmaterialet som antigenet er bundet til, naturen til antigenene og naturen til de involverte antistoffene. IS-antistoffene reagerer på en vanlig måte. Vanlige metoder anvender S. aureus Protein A eller et merket andre antistoff rettet mot det første antistoffet, hvori markøren som oftest er radioaktiv, eller et enzym som kan hydrolysere et substrat som derved produserer påvisbar farve. Farven kan være assosiert med fluidet som omgir matrisen, eller kan være assosiert med selve matrisen. Det er å bemerke at det andre antistoffet vil tilveiebringe et antistoff-fingeravtrykk i forliggende metode, og blir først fortrinnsvis omfattende inkubert med panelet av antigener for å adsorbere ut tilstedeværende andre antistoff-spesifikke IS-antistoffer. Det absorberte andre antistoffet kan deretter bli anvendt som et detektormolekyl når det blir kombinert med et egnet reportermolekyl som er velkjent for fagmannen. Ved absor-bering av det andre antistoffet for å fjerne tilstedeværende IS-antistoffer blir klare IS-antistoff-fingeravtrykksprofiler tilveiebrakt. Immunoblotting muliggjør påvisning av anti-stoffbinding til antigen ved visualisering av farvede partikkelformige presipitater og unngår anvendelse av radioaktive forbindelser. En effektiv konsentrasjon av antistoffer tilstede i immunkompleksene er vanligvis på 1 ng til 10 jjg pr. kompleks pr. mm2 .

Et antall enzymer kan bli koplet til Protein A eller andre antisoff som danner presipitater på en fast overflate I nærvær av et egnet substrat. En spesiell liste omfatter pepperrotperoksydase, glukoseoksydase og alkalisk fosfatase.

I tillegg til å enzymatisk påvise antigen-antistoffkomplekser dannet på en fast matrise eksisterer det ikke-enzymatiske måter for påvisning av immunkomplekset. Mange av disse er velkjente, men kolloidalgullteknikken er spesielt nyttig. Måten som den er konstruert og anvendt på med antistoffer er beskrevet av De Mey et al. i Prot. Biol. Fluids (Editor Pepters), Paragon Press, Oxford, side 943 (1981), og AMi i Immunochemistrv: Applications and Pathology and Blology

(Editor Polak og Van Noorden) og Wright og Sons Ltd., London, s. 83 (1983).

Den foretrukne utførelsesformen av foreliggende oppfinnelse omfatter konstruering av et panel av ett til titusen forskjellige antigener, ved anvendelse av prosedyren immunoblotting beskrevet av Towbin et al. Proceedlngs of the National Academv of Science, volum 76, s. 4350 (1979). De bestemte antigenene anvendt i panelet kan variere avhengig av antall antigen-antistoffreaksjoner som er ønsket. For eksempel inneholder humane HeLa-celler omtrent titusen forskjellige antigener og kan bli preparert og separert elektroforetisk ifølge molekylmassen ved anvendelse av denaturerende polyakrylamid gelelektroforesesystemer, og deretter overført elektroforetisk på en matrise, så som nylon eller nitrocellulosepapir. Antigenene blir preparert Ifølge hensiktsmessige protokoller som f.eks. beskrevet av Francooeur et al. Journal of Immunology. volum 136, s. 1648

(1986). I forhold til tidligere dokumentert anvendelse av immunoblottingsteknologi er foreliggende oppfinnelse basert på dannelsen og påvisningen av immunkomplekser dannet med individspesifikke antistoffer. Et annet individ-spesifikt antistoff-fingeravtrykk blir tilveiebrakt dersom et enkelt individs IS-antistoffer blir reagert med totale HeLa-celleantigener, eller delvis nedbrutte HeLa-celleantigener. I begge tilfellene er IS-antistoffene sannsynligvis like, men HeLa-antigenene har forskjellig molekylmasse og størrelse. Antigenene blir dermed liggende i forskjellige områder av panelet.

Individ-spesifikke antistoffer blir tilveiebrakt fra et individs kroppsvæsker eller faste stoffer, og reagert med antigenpanelet i en tid som er tilstrekkelig for at IS-antistoffene blir bundet til antigenene, vanligvis i 30 minutter til 1 time, men ikke lenger enn 3 dager. IS-antistoffene blir inkubert ufortynnet eller i en hensiktsmessig oppløsning (f.eks. isotonisk saltvann) i en fortynning på omtrent mindre enn en i IO<7>, fortrinnsvis 1:10 eller 1:20. Den effektive konsentrasjonen til hvert antigen i panelet er mindre enn 1 g/mm2 , fortrinnsvis 0,5 nanogram til 1 mg pr. mmz . Nonospesifikt bundede antistoffer blir fjernet ved vasking og immunkompleksene blir påvist ved ytterligere inkubasjon med en effektiv konsentrasjon av et merket detektormolekyl så som<125>I-Protein A, eller med et merket andre antistoff så som alkalisk fosfatase-konjugert geite antl-humant IgG, på forhånd absorbert for å fjerne andre antistoff-spesifikke IS-antistoffer reaktive med antigenpanelet. Antigenpanelet blir vasket for å fjerne uspesifikt bundet detektormolekyler og en effektiv konsentrasjon av substratmaterialet blir tilsatt dersom det andre antistoffet bærer et enzym, resulterende i utvikling av et farvet produkt. Dersom detektormolekylet bærer en radioaktiv markør kan røntgenfilm eller andre teknikker anvendes for å påvise tilstedeværelse av detektormolekyler ved anvendelse av velkjente metoder.

Det er å bemerke at IS-antistoffene tilstede i et spesielt individuelt serum eller annen kroppsvæske eller faste stoffer, kan anvendes for å Identifisere eller skjelne mellom døde objekter, så som blod eller kroppsdeler, eller sikkerhetsdokumenter. For sistnevnte kan et bestemt panel antigener anvendes for dette, og dette blir anvendt for å danne et antistoff-fingeravtrykk med et bestemt individs IS-antistoffer. Sikkerhetsdokumenter omfatter hovedsakelig et hvilket som helst omsettelig instrument som kan omdannes til kontanter, sjekker, reisesjekker, postordre, lotteribillet-ter, omsetningssjekker, gjeldsbrev og andre finansielle dokumenter. I tillegg er andre dokumenter omfattet i betegnelsen sikkerhetsdokumenter. Slike omfatter pass, adgangsbilletter, reisebilletter og lignende. Foreliggende metode kan også anvendes for bestemning av autentiteten til merker festet til klær, så som klær som har varemerke for en bestemt fremstiller.

Forliggende metode kan også bli anvendt for å forsikre autentiteten til kunstgjenstander og lignende. Når det gjelder sikkerhetsdokumenter omfatter foreliggende metode forening med gjenstanden hvor autentiteten skal bli bestemt, et register av antistoff-antigenreaktivitetsprofilen. Den foretrukne metoden er forening av en effektiv konsentrasjon av et spesielt individs IS-antistoffer med sikkerhetsdokumentet, f.eks., i form av tørket plasma på et filterpapir inne i et forseglet rør, og deretter når autentiteten til dokumentet anses å være tilveiebrakt, reagering av antistoffene med et bestemt panel antigener og etter påvisning av immunkompleksene, observering av antigen-antistoffreaktivitetsprofilen, eller antistoffavtrykk ved anvendelse av de samme IS-antistoffene. Alternativt kan det bestemte panelet av antigenene bli forenet med dokumentene og fingeravtrykket tilveiebrakt med bestemte IS-antistoffer. I de tilfellene hvor antigenene er molekyler med liten molekylvekt kan dette bli tilveiebrakt ved Impregnering av antigenene direkte inn i dokumentet ved anvendelse av teknikkene beskrevet i US-patent 4 037 007 og 4 136 226.

En ytterligere måte er kjemisk modifisering av enten sikkerhetsdokumentet, IS-antistoffene, antigenene eller begge, for å tilveiebringe mellom de to, men bevare funksjo-nen til molekylene som er involvert. En metode for binding av antigenpanelet hvor dette kan bli tilveiebrakt er å kjemisk aktivere sikkerhetsdokumentet, ved antagelse av at dette i hvert fall delvis er sammensatt av papir, eller annet lignende kjemisk reaktivt substrat, ved behandling med cyanogenbromid (CNBr). Når CNBr aktivert papir blir kombinert med proteinholdige antigener bindes antigenet irreversibelt til papiret. Prosedyrene for utførelse av denne reaksjonen er velkjent og er beskrevet av Eska i Methods of Enzymology, volum 73, s. 646, Editors Langone og Vunakis (1981). Ytterligere reaksjoner er tilgjengelige og er velkjente for f agmannen.

Når identiteten til sikkerhetsdokumentet er usikkert reageres IS-antistoffene eller antigenpanelet forenet med dette for å danne immunkompleksene med hensiktsmessig antistoff eller antlgenpanel respektivt, og immunkompleksene blir påvist med egnede detektormolekyler. I tillegg til detektormolekylene beskrvet ovenfor kan ytterligere markører bundet til antistoff-bindingsmolekylet (dvs. Protein A eller absorbert andre antistoff) omfatte fluorescens, bioluminescens eller kjemiluminescensmolekyler som beskrevet i US-patent nr. 4 478 817, eller magnetiserbare, eller bestrålningsfølsomme materialer.

Følgende eksempler illustrerer forskjellige aspekter av oppfinnelsen, men det er innlysende for fagmannen at forskjellige forandringer og modifikasjoner kan bli utført deri uten å fravike rammen av oppfinnelsen. F.eks. kan totalt antistoff, inkludert IS-antistoffer, fra et bestemt Individ bli direkte merket ved reaksjon med detektormolekylet, og detektor-IS-antistoffkomplekser deretter inkubert med panelet av antigenene, som dermed danner et antistoff-fingeravtrykk. Et annet eksempel som kanskje kan betegnes antigenfinger-avtrykk, omfatter separering av det totale antistoffet, innbefattet IS-antistoff (f.eks. ved isoelektrisk fokusering), og deretter reagering av antistoffene med en blanding av merkede eller umerkede antigener, eller et bestemt antigendetektormolekyl, og immunkompleksene som blir dannet blir påvist direkte eller etter reaksjon med et merket detektormolekyl.

Eksempel I

" Antistoff- flngeravtrykkdannelse" av mennesker

Et ekstrakt av humane HeLa-celler ble preparert og anvendt for å danne et antigenisk panel som beskrevet i Francoeur et al. Journal of Immunology. volum 136, s. 1648 (1986). HeLa-cellene ble dyrket i standard laboratorie vevskulturmedium, isolert, lysert med en detergent, og sentrifugert for å fjerne uoppløselig debris. Ekstraktet inneholdt omtrent titusen immunogenisk forskjellige antigener og hovedmassen er enda ikke blitt antigenisk definert. Materialet ble utsatt for elektroforese på en natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgel for å separere blandingen med hensyn på molekylmasse. De separerte antigenene tilstede i polyakrylamidgelen ble overført elektroforetisk på Immobilon-papir (tilveiebrakt fra Mlllipore Corporation) og setene på papiret uten bundet antigener ble deretter blokkert ved inkubasjon med en oppløsning Inneholdende 45é instant tørrmelk ved anvendelse av standard teknikker. Papiret ble kuttet i strimler med omtrent 2 mm i vidde. Hver strimmel består av en panel på omtrent titusen forskjellige antigener oppstilt i en dimensjon ifølge molekylmasse. Separate paneler av antigener ble inkubert med individuelt serum (inneholdende IS-antistoffer), fortynnet 1:20 i hensiktsmessig buffer, tilveiebrakt fra forskjellige individer ved forskjellige tidspunkter, i dette tilfellet i tre timer ved romtemperatur med konstant røring. Antigenpanelene ble vasket for å fjerne ubundet eller uspesifikt bundet antistoff, og inkubert med ^<25>I-Protein A i to timer. Etter påfølgende vasking for å fjerne ubundet detektor ble antigenpanelene tørket og utsatt for røntgenfilm i 4 timer ved -70°C med en forsterkende skjerm, og filmen ble fremkalt ifølge kjente teknikker.

Fig. 1 viser to forskjellige eksponeringer av filmen; en lang (3-dag) og kort (8-time) eksponering. Fingeravtrykkene er stabile over en periode på 4 år, 2 måneder for et individ (kolonne 2-4); 6 år, 7 måneder for et annet individ (kolonnene 5 og 6); 7 år for et tredje Individ (kolonnene 7 og 8);

7 år, 4 måneder for et fjerde individ (kolonnene 9-11) og i 8 år, 3 måneder for et femte individ (kolonnene 12-14). Det er innlysende at fingeravtrykkene er nesten Identiske ved tidlige og sene tidspunkter og er konstante over en periode på flere år. Individet hvor fingeravtrykkene er vist i kolonne 9 og 10 ble meget sykt (vasculitis) og hans fingeravtrykk er tilveiebrakt i løpet av denne tilstanden (kolonne 11). Det fremgår at i løpet av sykdommen blir mengden av antistoff-antigenkomplekser øket og intensiteten til fingeravtrykket var dermed sterkere enn når kan var frisk. Mindre forandringer i fingeravtrykket ble påvist. Det andre individet (kolonnene 5 og 6) er datteren til det tredje individet (kolonnene 7 og 8). Mens fingeravtrykket til moren og datteren er unike for disse ser visse elementer i fingeravtrykket ut til æ være felles for begge, og dette tyder på at disse er i et felles miljø og/eller har felles genetisk bakgrunn som influerer likt på Immun respons. Det fjerde individet (kolonnene 9-11) er sønnen til det femte individet (kolonnene 12-14), og igjen, mens fingeravtrykkene til sønnen og moren er unike for hvert individ, er visse elementer i fingeravtrykkene felles for begge. Kolonnene 1 og 15-17 viser fingeravtrykk av ubeslektede individer mens kolonne 18 viser kontrollfingeravtrykk anvendt for kvalitetskontroll. Molekylmassen (Mr) til antigenene anvendt i panelet er vist i kilodalton (Kd).

Eksempel II

Antistoff- antigenreaktivitetsprofiler . eller antistoff-fingeravtrykk av gamle og unge normale mennesker Metoden i foreliggende oppfinnelse kan anvendes på både unge og gamle mennesker. Figur 2 viser antistoff-fingeravtrykkene tilveiebrakt fra serum til normale individer med alder fra nyfødt til 90 år. Antigenpanelet og detektormolekylene anvendt var de samme som beskrevet i eksempel I. Omtrent likt antall hankjønn og hunkjønn er representerte. En individ-spesifikk profil ble tilveiebrakt i alle tilfellene. Noen eller alle IS-antistof f ene i nyfødte blir overført likt fra mor til foster som moderantistoffer generelt erkjent å bli overført fra foster via morkaken, og blir erstattet av barnets egne antistoffer omtrent 6 måneder etter fødselen. De individ-spesifikke (IS) antistoffene ser ut til å være fastslåtte ved omtrent toårsalderen (se også eksemplene IV og V). Kolonnene 1-7, 80-90 år, kolonne 8, 20 år; kolonnene 9-18, 70-79 åt; kolonnene 19-28, 60-69 år; kolonnene 29-38, 50-59 år; kolonnene 39-42, 40-49 år; kolonnene 43-45, 30-39 år; kolonnene 46-49, nyfødte. Kolonne 50 er et kvalitetskontroll-fingeravtrykk. Molekylmassen (Mr) til antigenene i panelet er angitt.

Eksempel III

Antistoff- fingeravtrykk av et enkelt normalt humant serum tilveiebrakt ved screening mot forskjellige paneler av antigener

Normalt humant serum, eller andre kroppsvæsker inneholdende IS-antistoffer, eller lignende væsker fra andre dyr, kan bli screenet mot forskjellige paneler av antigener preparert fra komplekse antigeniske blandinger. Figur 3 presenterer antistoff-fingeravtrykk tilveiebrakt med et enkelt normalt humnt serum og reagert mot paneler av antigener preparert fra humane HeLa-celler, en linje humane cervikale karcinomale celler som vokser i laboratoriet (kolonne 1); WIL-2-celler, en linje humane B-lymfocytter (kolonne 2); CV-1 apeceller (kolonne 3); MDBK-kuceller (kolonne 4); hundemuskelceller (kolonne 5); kylling-embryoceller (kolonne 6); en blanding av forskjellige museceller (kolonne 7); froskeoocytter (kolonne 8); Drosophila-celler (kolonne 9); Bakers gjær (kolonne 10); RY1090 bakterier (kolonne 11). Detektormolekylet som ble anvendt var<125>I-Protein A. Det er tydelig at serumet gir et annet fingeravtrykk med hvert antigenisk panel som blir testet. Det er viktig å poengtere at dette funnet tillater at et stort antall antigener blir anvendt, og tillater videre kryss-sjekking av identiteten til individet.

Eksempel IV

Antistoff- fIngeravtrykk av forskjellige barn, med alder fra to dager til ett år

Sera ble tilveiebrakt fra forskjellige barn enten hankjønn eller hunkjønn og fra både normale og syke. Panelet av antigenene og detektormolekylet anvendt var som beskrevet i eksempel I. Kolonnene 1-26; hunkjønn, 12 måneder, normal; hankjønn, 10 dager, normal; hunkjønn, 12 måneder, syk; hunkjønn, 8 måneder, syk; hunkjønn, 7 måneder, syk; hunkjønn, 1 måned, normal; hunkjønn, 10 måneder, normal; hankjønn, 12 måneder, normal; hankjønn, 4 måneder, syk; hankjønn, 10 måneder, syk; hankjønn, 9 måneder, syk; hankjønn, 10 måneder, syk; hankjønn, 3 måneder, syk; hunkjønn, 2 måneder, normal; hankjønn, 9 måneder, normal; hunkjønn, 2 dager , normal; hunkjønn, 5 måneder, syk; hankjønn, 11 måneder, syk; hankjønn, 3 måneder, normal; hankjønn, 1 måned, syk; hankjønn, 2 dager, normal; hankjønn, 1 måned, normal; hunkjønn, 4 måneder, syk; hankjønn, 5 måneder, syk; hankjønn, 9 måneder, syk; hunkjønn, 2 måneder, syk. Det kan sees at fingeravtrykk av barn som er under ett år generelt er enklere enn fra eldre individer og dette skyldes sannsynligvis at immunsystemet er i dets tidlige utviklingsstadium og at en fullstendig utvikling av IS-antistoffet enda ikke er oppnådd.

Eksempel V

Antistoff- fIngeravtrykk fra forskjellige barn med alder fra ett år til 6 år

Figur 5 viser at både normale og syke barn med alder fra ett til seks år har IS-antistoffer som kan bli anvendt for å danne antistoff-fingeravtrykk i likhet med de eldre individene. Panelet av antigenene og detektormolekylene er beskrevet i eksempel I. Kolonnene 1-12; hunkjønn, 3 år, syk; hankjønn, 1 år, normal; hankjønn, 2 år, syk; hankjønn, 4 år, syk; hunkjønn, 5 år, syk; hunkjønn, 6 år, syk; hunkjønn, 2 år, syk; hankjønn, 2 år, syk; hunkjønn, 5 år, syk; hankjønn, 3 år, syk; hankjønn, 1 år, frisk; hankjønn, 1 år, syk. Eksempel I viser at antistoff-fingeravtrykkene er stabile over flere år, men det er en viss Indikasjon på at fingeravtrykkene blir endret under sykdom. Sammenhengen med sykdom som vi inntil nå har oppdaget er at det i noen tilfeller er en økning i mengden av totalt antistoff som presenterer et mere Intenst fingeravtrykk (se fig. 1, kolonne 11, fig. 5, kolonne 7. Kolonne 13, kvalltetskontroll-fingeravtrykk). Molekylmassen til antigenene i panelet er angitt i kilodalton.

Eksempel VI

Antistoff- fIngeravtrykk av dyr

Fig. 6 viser antistoff-fingeravtrykk av forskjellige dyr. Serum ble tilveiebrakt fra dyrene og testet mot et panel av HeLa celleantigener. Detektormolekylet og antigenene var som beskrevet i eksempel I. Kolonnene 1-3, 6, 15, 16, 19, 20 er serum fra individuelle katter; kolonnene 4, 5, 7, 10-14, 17, 18, 21 er serum fra individuelle hunder; kolonnene 8 og 9 er serum fra individuelle aper; kolonne 22 er set hesteserum; kolonne 23 er et fingeravtrykk for kvalitetskontroll. De forskjellige dyrene varierte fra alder på 2 måneder til 18 år og var omtrent likt representert av hvert kjønn. De fleste dyrene var friske eller hadde milde tilstander, med unn-tagelse av katten og hunden vist I kolonnene 5 og 6, som var meget syke. Fig. 6 viser at antistoff-fingeravtrykkene kan bli tilveiebrakt fra forskjellige dyr samt fra mennekser. Molekylmassen (Mr) av antigenene i panelet er angitt i kilodalton (Kd).

Eksempel VII

Antistoff- fIngeravtrykk fra normale humane familier

Flg. 7 viser antistoff-fingeravtrykk av flere normale humane familier. Barna var alle på 12 år eller eldre. Panelet av antigenene og detektormolekylene som ble anvendt var som beskrevet i eksempel I. Til tross for den genetiske tilknyt-ningen til individene i familiene har hvert individ et unikt antistoff-fingeravtrykk. I noen av tilfellene kan felles "motiver" innenfor fingeravtrykkene bli oppdaget, og disse kan være felles for medlemmene av en familie. Dette tyder på en felles respons overfor sannsynlige vanlige antigener fra miljøet. Fingeravtrykkene er markert i sett av familier hvor medlemmene av familiene er betegnet F (far), M (mor), C (barn). Fingeravtrykk for kvalitetskontroll er betegnet "M". Molekylmassen til antigenene i panelet er angitt i kilodalton .

Eksempel VIII

Blokkert fIngeravtrykkanalyse anvendt for å påvise antigener fra miljøet som kan konkurrere med antigenene 1 panelet for IS- antlstoffbinding

Fig. 8 viser antistoff-fingeravtrykkene av et normalt humant individ, med eller uten tilstedeværelse av konkurrerende sekundære antigener. Røntgenfilmen ble med hensikt over-eksponert for å vise de fine detaljene til fingeravtrykkene. Antigenpanelet besto av separerte humane HeLa-celleantigener, og detektormolekylet var ^^I-Protein A, som beskrvet i eksempel I. Forskjellige blandinger av antigener ble inkubert samtidig med IS-antistoffene og panelet av antigener ved samme tidspunkt i to timer. Alle fingeravtrykkene skal være identiske dersom ingen blokkering oppstår. Kolonne 1 viser ikke noe blokkeringsmiddel og det fremgår at det Ikke er noen blokkering av fingeravtrykket; kolonne 2, viser resultatene når humane HeLa-celleekstrakt blir anvendt som blokkeringsmiddel. To elementer av fingeravtrykket er blokkerte piler, (båndene 3 og 4), og dette tyder på at en eller flere av antigenene tilstede i HeLa celleekstraktet effektivt konkurrerer med to HeLa antigener tilstede i panelet for begrensende IS-antistoffer; kolonnene 3 og 6 viser effekten av blokkering med bakterielle ekstrakter. I hvert tilfelle er tre elementer av fingeravtrykket blokkert (båndene 2, 3 og 4). Kolonne 4 viser resultatene når gjærekstrakt blir anvendt som blokkeringsmiddel. Ett element av fingeravtrykket er blokkert (bånd 3). Kolonne 5 presenterer en kontroll for detektormolekylet hvori serum inneholdende IS-antistoffer ble utelatt. Kontrollen er blank og dette tyder på at fingeravtrykket er et resultat av binding av IS-antistoffer til antigener, og ikke et resultat av at lkke-antistofforbindel-ser blir bundet til antigenene i panelet.

Mange modifikasjoner av metoden og sammensetningene beskrevet ovenfor er innlysende for fagfolk innenfor feltene im munologi, immunologisk kjemisk og genetisk engineering. Slike modifikasjoner er innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse .