NO875348L - Fortilsetning og for inneholdende samme. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører fortilskudd og for som inneholder dette fortilskudd, som kan bli brukt profylaktisk og i behandling av sykdom i marine vekselvarme organismer, spesielt for å unngå sykdom hos atlantisk laks i oppdrett ved lav vanntemperatur.

"Hitrasjuken" eller hemorrhagisk syndrom, har vært den mest økonomisk betydningsfulle sykdommen i norsk lakseoppdrett siden den ble oppdaget i 1977. Betegnelsen "Hitra-sjuke" refererer seg til øya der sykdommen i første rekke oppsto som et problem. Sykdommen rammer fisk i alle aldersgrupper i sjøvann og er mest utbredt om vinteren. "Hitra-sjuke" er nesten utelukkende en sykdom som rammer atlantisk laks i oppdrett (Salmo salar L.), selv om det er kjent at sykdommen forekommer blant regnbue-ørret. (Salmo gairdneri Richardson). Kun to ganger har den blitt konstatert utenfor Norge, dvs. henholdsvis fra Skottland og Færøyene. En lignende sykdom kalt "Bremnes sjuke" har påført norske lakseoppdrettere store tap i løpet av de to siste årene, og en sykdom tilsynelatende lik sistnevnte, den såkalte "Laksepest" har også blitt rapportert fra Færøyene.

"Hitrasjuke" blirkarakterisert vedblødninger, ødem og i det siste stadiet av sløvhet og koma. Årsaken er omdiskutert. Obduksjonsfunn hos voksen laks med subklinisk sykdom varierte

fra ubetydelig til blødende diatese med utbredt ødem.

Ved lysmikroskopiske undersøkelser så en dilaterte kapillærer, arterioler med nekroser i veggene og tromber. Trombene bestod av sammensmeltede erythrocytter og fibrin. I elektromikroskopet hadde endotelcellene pyknotiske kjerner med kondensert kromatin. Cytoplasma inneholdt store mengder laminære strukturer og elektrontette granula. Ødelagte erythrocytter klebet seg til det degenererte endotelet og sammensmeltede erythrocytter dannet partielle eller fullstendige tilstopninger i mikrovaskulaturen. Mikrotromber var hyppig forekommende. Det var ingen trombocytter i trombene; disse var sammensatt av erythrocytter eller reticulocytter. Klinisk friske oppdrettslaksunger i ferskvann hadde samme slags forandringer, men i atskillig mindre grad. Ville laksunger hadde derimot en normal mikrovaskulatur. Funnene tydet på at det foregår disseminert intravaskulær koagulering (DIC) ved Hitrasjuke hos oppdrettslaks. Dette er senere blitt bekreftet ved hematologiske undersøkelser.

De ovenstående observasjonene ble videre avspeilet i fore-komsten av intravaskulær koagulering, og i den reduserte osmotiske resistens i erythrocytter fra laks med subklinisk Hitra-sjuke.

Våre forundersøkelser av fisk som hadde "Bremnes-sjuke" har avdekket klare likheter mellom denne sykdommen og "Hitrasjuken"; svakheten i de røde blodlegemene øker sammenlignet med fiskekontroller og det foregår en aktivering av koaguleringssystemet tilsvarende DIC.

Det er allerede kjent at celleveggenes struktur i vekselvarme dyr som jevnlig opplever forandringer i omgivelsestemperaturen, er svært avhengig av fettsyresammensetningen i foret (Cossins og Lee, 1985 et al., 1986), og membran lipoidene er de eneste strukturelle cellekomponentene man kjenner til som tar del i prosessen med temperaturtilpasning.

Etter det man vet i dag foregår det et selektivt opptak av umettede fettsyrer i fosfolipiden ved lav vanntemperatur. Dette selektive opptaket av fettsyrer er antatt å være av betydning for restrukturering av cellemembranene under temperatur akklimatiseringen.

Imidlertid mangler man en evaluering av de fysiske verdier som oppnås ved denne restruktureringen av cellemembranene hos vekselvarme organismer.

Som et utgangspunkt antok derfor oppfinnerene at utilstrekkelig forsyning av og/eller produksjon av umettede fettsyrer kunne føre til svekkelse av membranenes struktur og funksjon, og i siste instans føre til sykdom. (Salte, Thomassen og Wold, Norsk Fiskeoppdrett 1987.)

En forundersøkelse ble igangsatt for å avgjøre om et høyt kost-tilskudd av umettede fettsyrer forbedrer de fysiske verdiene for cellemembranene hos oppdrettslaks ved lave sjøtemperaturer som kommer til uttrykk ved osmotisk resistens i røde blodlegemer mot hypotoniske saltløsninger, dersom dette er til-felle, om en slik restrukturering av cellemembranene er av potensiell verdi i forebyggingen av sykdom som har med membran degenerasjon og dysfunksjon å gjøre. Våre resultater viser at det er mulig å forbedre de fysiske egenskapene til cellemembraner hos atlantisk laks ved lave sjøtemperaturer ved hjelp av kostmanipulasjoner/variasjoner, her uttrykt ved osmotisk resistens i røde blodlegemer mot hypotoniske saltløsninger.

Virkning på sykdom eller snarere forebygging av sykdom for-bundet med cellemembran dysfunksjon ved lav vanntemperatur, blir således demonstrert, og dette antas å være relevant for vekselvarme marine dyr generelt sett. Ifølge den foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet et spesielt fortilskudd og ut-arbeidet en ny formulering som er basert på å forhindre "Hitra-sjuke" eller behandle vekselvarme dyr som har "Hitra-sjuke" eller lignende sykdommer. Disse for og fortilskudd erkarakteriserti de medfølgende patentkrav 1-7.

Vi har overraskende funnet at en økning av n-3 flerumettede fettsyrer i fiskeforet, spesielt (All Z) 5, 8, 11, 14, 17 eicosapentaen syre (EPA) og (All Z) 4, 7, 10, 13, 16, 19 docosahexaen syre til et høyere nivå enn det som er antatt optimalt fra et kost- eller vekstsynspunkt, vil forhindre kaldtvanns-sykdommer som beskrevet ovenfor.

Eksempel:

To hundre klinisk friske laks av Sunndalsøra-stamme som gikk den første vinteren i sjøen, (gjennomsnittsvekt 1 kg) ble til-feldig valgt ut fra bestanden ved AKVAFORSK's sjøanlegg, Aver-øy. Fiskene ble satt over i ei not for seg og foret med et pelletert mjukfor, som besto av 47,2% protein ensilasje, 38,5% bindemiddel og 14,2% EPA/DHA-konsentrat som inneholdt 30% 20:5 n-3 +22:6 n-3. Dette ga ca. 36% fett i tørrstoffet.

Ti fisk ble plukket ut ved tid 0 (før den første EPA/DHA for ingen), videre etter 12 timer, og etter 6, 9 og 16 dager etter den første foringen. De ble bedøvet med et slag mot hodet, og heparinblod ble tatt via halevena.

Metoden som ble brukt for å måle cellemembran fragiliteten var en modifisering av en prosedyre som først ble nyttet for patte-dyr-erythrocytter (Parpart et al., 1947) og senere tilpasset kjerneholdige erythrocytter (Kariya, 1950; Sulya et al., 1963; Ezell et al., 1968). En stamløsning bestående av natrium klorid i fosfatbuffer tilsvarende en 9% NaCl oppløsning ble laget. Bruksløsningen ble laget av denne stamløsningen ved å fortynne den med destillert vann; en rekke med konsentrasjoner fra 0.30% til 0.9%, i trinn på 0.02% NaCl og med en pH på 7.3. Testen ble utført ved å tillegge 50^il med blod til hver 5 ml i bruks-løsning. Disse ble blandet, plassert i inkubator som hadde samme temperatur som det omkringliggende sjøvannet (målt, notert ved hver prøvetaking) i en time, sentrifugert ved 1.500 x g i ti minutter. Prosent hemolyse ble bestemt ved å måle den optiske tettheten ved 540 nm, med maksimum hemolyse tilsvarende den løsningen som ved avlesning hadde den høyeste optiske tettheten .

Resultatet er vist på den vedlagte figur 1 hvor % NaCl konsentrasjon (x-aksen) er plottet mot % hemolyse (y-aksen) for å konstruere fragilitetskurver.

Dess lenger ut en kurve går mot venstre på figuren, jo sterk-ere er de røde cellemembranene. Fra venstre representerer de tre første kurvene: 6 dager på EPA/DHA konsentrat, 12 timer, 9 dager og 16 dager (kurvene er sammenfallende); 64 dager og nullpunkt (kontroller). Kurven lengst til høyre er innlemmet som en kontrast for å vise svakheten i celle-membranene hos laks som har "Hitra-sjuke".

Etter 12 timers foring ved vanntemperatur på 5.9° hadde den osmotiske resistens i erythrocytter (røde blodlegemer) mot hypotoniske saltløsninger økt betraktelig (p<0.05); den sjette dagen var økningen enda tydeligere.

Ni dager etter den første foringen hadde fragilitets kurven vendt tilbake til tolv timers nivået. Det ovennevnte hendelsesforløpet er typisk for en homeostatisk regulert prosess og den er i overensstemmelse med hypotesen om homeoviskøs tilpasning. Videre er den forenlig med tidligere rapporter om membranenes tilpasningsevne til temperatur- og diett manipuler-ing (Cossins og Sinensky, 1984) Den nødvendige tiden for å fremkalle forandring i de fysiske verdiene i erythrocyttenes cellemembraner i dette eksemperimentet, dvs. omtrent tolv timer, var overraskende kort.

På den 20. dagen ble den gjenværende fisken delt i 3 grupper; der hver gruppe bestod av ca. 50 stk. Gruppe 1 som ikke ble håndtert fortsatte i samme not og på det samme EPA/DHA-rike foret. Gruppe 2 ble håvet, bedøvet med chlorobutanol, individmerket og satt tilbake igjen til Gruppe 1. Gruppe 3 ble håvet, bedøvet, individmerket og transportert (tauet i en liten not) over hundre meter, hvorpå de ble satt i ei not som hadde hatt stor dødelighet pga. "Hitrasjuke" inntil en uke tidligere. En ti-dagers behandling med oxolinsyre i denne nota (10mg/kg/fisk-/dag) ble avsluttet dagen før fisken i Gruppe 3 ankom.

I løpet av de tre første ukene nådde den kumulative dødelig-heten bare 2.0% blant fisk som hadde fått EPA/DHA-for til tross for gjentatte påkjenninger; tilsvarende tall for de øvrige nøter var henholdsvis 7.6 og 6.4%. I Gruppe 3, døde 8% øyeblik-kelig i forbindelse med dele- og transportprosessen. Imidlertid, i løpet av de tre første ukene etter delingen, døde 8.7% av fiskene i Gruppe 3 sammenlignet med 9.1% i kontrollgruppen.

I denne forbindelse må det understrekes at kontrollfisken i

en del av tidsrommet var beskyttet med anti-biotika mot poten-sielle patogener (sjukdomsfremkallende bakterier).

Innholdet av n-3 fettsyrer er for tiden ikke deklarert som kommersielt produsert fiske-for. Imidlertid er det kjent at fett i norskprodusert for hovedsakelig har sitt utspring i marine kilder, slik som loddeolje og loddemel som inneholder slike fettsyrer. Innholdet av EPA/DHA i slike oljer vil variere avhengig av årstidene så vel som av fangstområdene. Det kan like-vel anslåes at prosentandelen av EPA/DHA i foret, som vanligvis inneholder mellom 17 og 22 vektprosent fett, vil være i størrelsesorden 1,5-3 vektprosent, noe som vil tilsvare ca. 3-6 Cal.

Flerumettede fettsyrer av n-3 serien er antatt å være essensielle for saltvannsfisk, og bør som sådan tilføres gjennom foret. De optimale behov har til nå bare blitt bestemt for et begrenset antall arter og uten at man har tatt med i betraktning forhold vedrørende cellemembranstyrke ved lav temperatur og mulige sykdommer. De fleste studier har blitt utført på regnbueørret, og ut fra disse har det blitt anslått et minimumkrav på 2-4 cal %. (T. Watenabe; Comp Biochem Phy-sical Vol 73B, No. 1, 1982.)

Tar man alt dette i betraktning, vil et tilskudd på 1,5-3 vekt prosent EPA/DHA (dvs. ca. 3-6 Cal.) måtte betraktes som et minimum for å unngå "Hitra-sjuke", ifølge våre eksperimenter. Når vanlig for-fett blir brukt, vil EPA/DHA finnes i kombinasjon med mettet fett og kolestrol, noe som kan tenkes å svekke effekten av EPA/DHA sammenlignet med bruk av denne fraksjonen som et spesielt utformet f6r-tilskudd.

Det finnes tre vanlige typer fiskefor:

- Tørrfor, der vanninholdet er mindre eller lik 10 vektprosent. - Mykfor som inneholder oppmalt protein for tilsatt bindemel og som inneholder 30 vektprosent, eller mer, vann.

Våtfor - når for-substansen er brukt hel eller eller oppmalt - tilsatt opptil 10% bindemel, vitaminer og mineraler osv.

I samsvar med oppfinnelsen vedr. alle disse fortyper burde ekstra doser av n-3 umettede syrer tilsettes slik at den totale mengden av disse syrene i det minste utgjør 3,5 vektprosent basert på den totale mengde tørrstoff i foret.

Selv om det såvidt vites ikke har blitt utført noen spesielle studier på behovet hos atlantisk laks, arktisk røye eller kveite, vil det normale fettinnholdet i kommersielt tilgjenge-lig for være i størrelsesorden 15-25 vektprosent, dette til-svarer et EPA/DHA innhold mindre enn 3% av vekten selv når fiskeolje blir brukt. Ifølge oppfinnelsen kan også fettinnholdet være vesentlig høyere enn 25%, f. eks. 30-40%, forut-satt at dette er høykvalitets fett som gir en stor del av n-

3 flerumettede fettsyrer.

På grunn av den komplekse sammensetning av de marine oljer har det vært vanskelig å isolere og rense de enkelte n-3 flerumettede syrer slik som EPA og DHA i store mengder. Imidlertid,

i den norske, utlagte patentsøknad nr. 157307, er det beskrevet en prosess utviklet av søkerne som er velegnet for produksjonen av EPA/DHA konsentrater som inneholder minst 25 vektprosent EPA og 3 5 vektprosent DHA i form av etyl ester. Denne prosess ble opprinnelig utviklet for produksjon av farmasøytiske pro-dukter, men vil også passe for produksjon av fortilskudd i samsvar med denne oppfinnelsen. Foret og fortilskuddet vil være anvendelig ikke bare for voksen laks og flyndre, men også som for til småfisk og fiskeyngel.

Som beskrevet ovenfor peker resultatene av våre studier på at det kan være nødvendig med en økning av n-3 fettsyrer over det nivå som vanligvis er anvendt. Dette er oppnådd i samsvar med oppfinnelsen ved tilskudd av marine oljekonsentrater som inneholder en økt prosentandel av flerumettede fettsyrer av n-3 serien, spesielt EPA og DHA.

Fortilskuddet kan være i form av EPA/DHA konsentrat som inneholder minst 22 vektprosent eller mer av disse syrene eller deres derivater. I tillegg til en blanding av n-3 fettsyrer, kan syrene også bli brukt alene. Det finnes materiale som in-dikerer at rene syrer og høy konsentrasjon vil øke virkningen av fortilskuddet.

Claims (7)

1. Fortilskudd til profylaktisk bruk eller til behandling av sykdom i marine vekselvarme dyr, spesielt for å forhindre "Hitra-sjuke" i atlantisk oppdrettslaks, som har som aktive komponenter n-3 flerumettede fettsyrer slik som (All Z) 5, 8, 11, 14, 17 eicosapentaen syre og (All Z) 4, 7, 10, 13, 16, 19 docosahexaen syre eller et fordøyelig derivat som salt, ester eller amid av nevnte syrer i kombinasjon med passende bærere, stabilisatorer, antioxidanter osv.

2. Fortilsetning ifølge krav 1, karakterisert ved at det inneholder minst 22 vektprosent n-3 fettsyrer eller fettsyre-derivater.

3. Fortilsetning ifølge krav 2, karakterisert ved at n-3 fettsyren er (All Z) 5, 8, 11, 14, 17 eicosapentaen syre eller et derivat av den samme.

4. Fortilsetning ifølge krav 2, karakterisert ved at n-3 fettsyre er (All Z) 4, 7, 10, 13, 16, 19 docosahexaen syre eller et derivat av den samme.

5. Fortilskudd ifølge krav 2, karakterisert ved at fortilskuddet inneholder minst 18 vektprosent av (All Z) 5, 8, 11, 14, 17 eicosapentaen syre, minst 12 vektprosent av (All Z) 4, 7, 10, 13, 16, 19 - docosahexaen syre eller deres derivater i form av et ernæringsmessig akseptabelt salt, ester eller amid.

6. For for vekselvarme dyr, slik som atlantisk laks, arktisk røye eller kveite, i tørr, myk eller våt form som inneholder proteiner, fett og vegetabilske substanser og eventuelle bindemidler, konserveringsmidler, vitaminer osv., som har et fettinnhold fra 15-40 vektprosent, beregnet på grunnlag av tørrforinnholdet og som inneholder minst 3.5 vektprosent n-3 flerumettede fettsyrer, slik som EPA/DHA.

7. For til profylaktisk bruk og i behandling av sykdom i vekselvarme dyr, karakterisert ved at det inneholder fortilskudd ifølge hvilket som helst av de foregående kravene 1-5.