NO873481L

NO873481L - PEPTIDE PREPARATION, PROCEDURE FOR PREPARING THEREOF AND USE OF THE PEPTIDE PREPARATION.

Info

Publication number: NO873481L
Application number: NO873481A
Authority: NO
Inventors: Ernst-Gunnar Samuelsson; Otto Melchior Poulsen
Original assignee: Samuelsson Ernst Gunnar; Otto Melchior Poulsen
Priority date: 1985-12-18
Filing date: 1987-08-18
Publication date: 1987-10-13
Also published as: NO873481D0

Abstract

Peptidpreparat fra hydrolyse av myse inneholdende peptider med en molekylvekt på opp til 6.000 dalton. Et slikt preparat er hypoallergenisk og derfor nyttig i næringsmiddelprodukter og nytelsesmidler, såsom morsmelkerstatninger, splsbar is, proteindrikker og andre produkter, vanligvis inneholdende melk eller melkeprotein, speielt for allergikere eller mennesker med laktosemalabsorpsjon. Preparatet fremstilles ved en kombinasjon av enzymatisk hydrolyse og ultrafiltrering.Peptide preparation from hydrolysis of whey containing peptides with a molecular weight of up to 6,000 daltons. Such a preparation is hypoallergenic and therefore useful in food products and stimulants, such as breast milk substitutes, washable ice cream, protein drinks and other products, usually containing milk or milk protein, especially for allergy sufferers or people with lactose malabsorption. The composition is prepared by a combination of enzymatic hydrolysis and ultrafiltration.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et peptidpreparat fra hydrolyse av myse, en fremgangsmåte for fremstilling av dette ved ultrafiltrering og hydrolyse av myse, så vel som anvendelse av peptidpreparatet som en erstatning for melk eller melkeprotein. The present invention relates to a peptide preparation from the hydrolysis of whey, a method for producing this by ultrafiltration and hydrolysis of whey, as well as the use of the peptide preparation as a substitute for milk or milk protein.

Innen befolkningen foreligger økende problemer med allergi, bl.a. melkeallergi, på samme måte som det finnes personer som ikke kan absorbere laktose. Problemene er spesielt store når det gjelder barn, i det melk og melkeprodukter utgjør en - betydelig andel av deres ernæring dersom de ikke av forskjellige grunner ammes. Within the population, there are increasing problems with allergies, i.a. milk allergy, in the same way that there are people who cannot absorb lactose. The problems are particularly great when it comes to children, as milk and milk products make up a significant proportion of their nutrition if they are not breastfed for various reasons.

Det har vært forsøkt å fremstille morsmelkerstatninger fra f.eks. myse ved en kombinasjon av enzymatisk hydrolyse, varmebehandling og ultrafiltrering, kfr. U.S. patent nr. 4,293,571. Peptidene som derved oppnås har en størrelse på 1.000-10.000 dalton. Imidlertid er det velkjent at peptider på 5.000-10.000 dalton ofte er allergeniske, se f.eks. "Immunochemistry", Pergamon Press 1967, 4., s. 1-10. Attempts have been made to produce breast milk substitutes from e.g. whey by a combination of enzymatic hydrolysis, heat treatment and ultrafiltration, cf. U.S. Patent No. 4,293,571. The peptides thus obtained have a size of 1,000-10,000 daltons. However, it is well known that peptides of 5,000-10,000 daltons are often allergenic, see e.g. "Immunochemistry", Pergamon Press 1967, 4., pp. 1-10.

Fremgangmsåten beskrevet i det nevnte U.S. patentet innbefatter denaturering av proteinene, som utføres ved en varmebehandling, f.eks. ved 100-140'C i fra 10 sek. til 4 min. eller ved 75-100°C i 2-60 min. En slik denaturering innbefatter en stor fare for ødeleggelse av svovelholdige aminosyrer, dannelse av Maillard reaksjonsprodukter som ofte er allergeniske (hapten effekt), samtidig som smaken av produktet ofte ødelegges. Se f.eks. Otani, H. og Tokita, F., Jap.. J. Zootechn. Sei., 1982, 53, s. 344, Otani et al., Jap. J. Zootechn. Sei., 1985, 56, s. 987 og Matsuda, T. et al., J. Food Sei., 1985, 50, s. 618. The procedure described in said U.S. Pat. the patent includes denaturation of the proteins, which is carried out by a heat treatment, e.g. at 100-140'C for from 10 sec. to 4 min. or at 75-100°C for 2-60 min. Such denaturation involves a great danger of destruction of sulphur-containing amino acids, formation of Maillard reaction products which are often allergenic (hapten effect), at the same time that the taste of the product is often destroyed. See e.g. Otani, H. and Tokita, F., Jap.. J. Zootechn. Sei., 1982, 53, p. 344, Otani et al., Jap. J. Zootechn. Sei., 1985, 56, p. 987 and Matsuda, T. et al., J. Food Sei., 1985, 50, p. 618.

Det er nå funnet at dersom et mysebasert paptidpreparat Innbefattende peptider med en molekylvekt på opp til 6.000 dalton tilveiebringes, kan dette inkorporeres som en kompo-nent i næringmiddelprodukter og nytelsesmidler for aller gikere. Preparatet er nyttig i morsmeikerstatninger for små barn så vel som i næringsmidler og nytelsesmidler for personer som står i fare for å utvikle allergi, personer med malabsorpsjon av laktose, som en flytende diett for pasienter som har gårr gjennom kirurgi i mage/tarmkanal, så vel som en proteinkilde for idrettsfolk, spesielt vektløftere, kastere og kroppsbyggere. Det er nyttig i nytelsesmidler såsom is og proteinholdige drikker. It has now been found that if a whey-based peptide preparation including peptides with a molecular weight of up to 6,000 daltons is made available, this can be incorporated as a component in nutritional products and pleasure products for very geeks. The preparation is useful in infant formulas for young children as well as in foods and supplements for people at risk of developing allergies, people with lactose malabsorption, as a liquid diet for patients who have undergone gastrointestinal surgery, as well as as a protein source for athletes, especially weightlifters, throwers and bodybuilders. It is useful in beverages such as ice cream and protein drinks.

Følgelig er preparatet ifølge oppfinnelsen kjennetegent ved - at det innbefatter peptider med en molekylvekt på opp til 6.000 dalton og at det er fritt for allergeniske stoffer, såsom Maillard reaksjonsprodukter og laktose. Consequently, the preparation according to the invention is characterized by - that it includes peptides with a molecular weight of up to 6,000 daltons and that it is free of allergenic substances, such as Maillard reaction products and lactose.

Et spesielt foretrukket peptidpreparaat er kjennetegnet ved at det i det vesentlige består av peptider med en molekylvekt på 2.000-6.000 dalton, spesielt 2.000-2500 dalton, i det små molekyler, såsom frie aminosyrer og salter viser en tendens til å forårsake diaré på grunn av deres osmotiske virkning, hvilket naturligvis er uønsket. A particularly preferred peptide preparation is characterized in that it essentially consists of peptides with a molecular weight of 2,000-6,000 daltons, especially 2,000-2,500 daltons, whereas small molecules such as free amino acids and salts show a tendency to cause diarrhea due to their osmotic effect, which is naturally undesirable.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av det foreliggende peptidet, som er kjennetegnet ved The invention also relates to a method for producing the present peptide, which is characterized by

a) diafiltrering av i det vesentlige kaseinfri myse med vann på en ca. 20.000 dalton membran, om ønsket etter en a) diafiltration of essentially casein-free whey with water at an approx. 20,000 dalton membrane, if desired after one

forutgående konsentrering av mysen,prior concentration of the whey,

b) enzymatisk hydrolysering av myseproteinretentatet fra a) i ett eller flere trinn, hvert hydrolysetrinn termineres med b) enzymatic hydrolysis of the whey protein retentate from a) in one or more steps, each hydrolysis step is terminated with

ultrafiltrering gjennom en ca. 6.000 dalton membran for å høste de resulterende peptidene i permeatet. ultrafiltration through an approx. 6,000 dalton membrane to harvest the resulting peptides in the permeate.

Dersom mysen som benyttes som et utgangsmateriale ikke er hovedsakelig kaseinfri må den, før utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, underkastesgrovfIltrering, sentrifugering eller annen behandling for fjernelse av kaseinrester som eventuelt kan være til sted som komplekser. Mysen renses raskt på en 200.000 dalton membran, dvs. en membran med en "cut-off" verdi på 200.000 dalton, eller ved en pH-regulering til ca. 4,6 og tilsats av et utfellings-middel, fortrinnsvis kalsiumkloris. En hvilken som helst membran med den ønskede "cut-off" verdien kan benyttes her og gjennom beskrivelsen og kravene. Vanligvis er kommersielt tilgjengelige membraner foretrukne, fremstilt av høy resi-stente syntetiske polymerer som også er nyttige for "clean-in place", CIP rensing, dvs. rensing på stedet med f.eks. syre og base. Slike membraner er tilgjengelige f.eks. fra DDS, De Danske Sukkerfabriker, Rhone-Poulenc og Romicon. Membranene benyttet i eksemplene er fra DDS. If the whey used as a starting material is not mainly casein-free, it must, before carrying out the method according to the invention, be subjected to coarse filtration, centrifugation or other treatment to remove casein residues that may be present as complexes. The whey is purified quickly on a 200,000 dalton membrane, i.e. a membrane with a "cut-off" value of 200,000 daltons, or by pH regulation to approx. 4.6 and addition of a precipitating agent, preferably calcium chloride. Any membrane with the desired "cut-off" value can be used here and through the description and requirements. Generally, commercially available membranes are preferred, made from highly resistant synthetic polymers which are also useful for "clean-in place", CIP cleaning, i.e. cleaning in place with e.g. acid and base. Such membranes are available e.g. from DDS, De Danske Sukkerfabriker, Rhone-Poulenc and Romicon. The membranes used in the examples are from DDS.

EP patentsøknad nr. 65663 beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av et proteinhydrolysat som er nyttig som et næringsmiddel for pasienter på en enterisk diett. Fremgangsmåten innbefatter hydrolyse av en myseproteinsuspensjon med et laktoseinnhold på Ikke mer enn 1,0 vekt-# med en protease fra Aspergillus niger, fortrinnsvis etter en basisk for-hydrolyse ved 90-95°C. Om ønsket kan en bakteriell protease fra Bacillus licheniformis også benyttes. Suspensjonen varmebehandles etter hydrolysen, typisk ved 90°C for å inaktivere enzymet eller enzymene. EP Patent Application No. 65663 describes a process for the preparation of a protein hydrolyzate useful as a nutrient for patients on an enteric diet. The method involves the hydrolysis of a whey protein suspension with a lactose content of not more than 1.0 wt-# with a protease from Aspergillus niger, preferably after a basic pre-hydrolysis at 90-95°C. If desired, a bacterial protease from Bacillus licheniformis can also be used. The suspension is heat-treated after the hydrolysis, typically at 90°C to inactivate the enzyme or enzymes.

Et slikt produkt vil ha en betydelig andel av stoffer med en molekylvekt under 2.000 og vil derfor vbise tendens til å forårsake diaré. Videre vil det være et ikke-neglisjerbart innhold av proteiner med en molekylvekt over 6.000 som er allergeniske. Spesielt vil varmebehandlingen for inaktivering av en enzymene forårsake Maillard reaksjonproduketer med en hapteneffekt. Such a product will have a significant proportion of substances with a molecular weight below 2,000 and will therefore tend to cause diarrhoea. Furthermore, there will be a non-negligible content of proteins with a molecular weight above 6,000 which are allergenic. In particular, the heat treatment for inactivating one of the enzymes will cause Maillard reaction products with a hapten effect.

Som en konklusjon vil det omtalte hydrolysatet derfor ikke være egnet for anvendelse som en melkeerstatning for melkeallergikere og små barn, på samme måte som det ikke synes å være nyttig for personer som ikke tåler laktose. As a conclusion, the discussed hydrolyzate will therefore not be suitable for use as a milk substitute for milk allergy sufferers and young children, in the same way that it does not seem to be useful for people who cannot tolerate lactose.

Videre beskriver EP patenskrift nr. 33694 en fremgangsmåte for fremstilling av et stabilt hydrolysat av animalske proteiner, hvori proteinhydrolysatet blandes med et flytende melkeprodukt, f.eks. et retentat fra ultrafiltrering av melk i mengder på minst 50$ basert på det stabiliserte protein-hydrolysatat. Furthermore, EP patent no. 33694 describes a method for producing a stable hydrolyzate of animal proteins, in which the protein hydrolyzate is mixed with a liquid milk product, e.g. a retentate from ultrafiltration of milk in amounts of at least $50 based on the stabilized protein hydrolyzate.

De stabiliserte hydrolysatene er ment for dietetiske ernæring av syke mennesker og feilernærte og underernærte personer, men kan ikke lett tåles av melkeallergikere eller mennekser med laktosemalabsorpsjon. The stabilized hydrolysates are intended for dietary nutrition of sick people and malnourished and malnourished people, but cannot be easily tolerated by milk allergy sufferers or people with lactose malabsorption.

Ved å utelate en denaturerende varmebehandling som beskrevet i U.S. patent nr. 4,293,571 og EP patentsøknad nr. 65663 og ellers gå frem ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, vil det oppnås et produkt som er hypoallergenisk og laktosefritt. By omitting a denaturing heat treatment as described in U.S. Pat. patent no. 4,293,571 and EP patent application no. 65663 and otherwise proceed with the method according to the invention, a product will be obtained which is hypoallergenic and lactose-free.

EP patentsøknad nr. 22019 beskriver riktignok et totalt enzymatisk myseproteinhydrolysat som er i det vesentlige fritt for gjenværende proteiner, definert ved at det ikke har noe innhold av fraksjoner som kan utfelles med 12$ triklor-eddiksyre. Minst 50$ av peptidene inneholder 2-5 aminosyrer, mens innholdet av frie aminosyrer er lavere enn 15%. Fortrinnsvis har 70-90$ av peptidene en kjedlengde under 10. EP patent application no. 22019 does indeed describe a total enzymatic whey protein hydrolyzate which is essentially free of residual proteins, defined as having no content of fractions which can be precipitated with 12% trichloroacetic acid. At least 50$ of the peptides contain 2-5 amino acids, while the content of free amino acids is lower than 15%. Preferably, 70-90$ of the peptides have a chain length below 10.

Produketene er angitt å være nyttige som næringsmiddelprodukter, spesielt ved postkirurgisk behandling med sikte på å gjenetablere metabolismen, idet de kan absorberes direkte gjennom tarmveggen og stimulere enzymproduksjonen. Ingenting sies om allergiproblemer, laktosemalabsorpsjon, ernæring av spedbarn, dvs. de fenomenene hvorpå de foreslåtte anvend-elsene av peptidpreparatet ifølge oppfinnelsen spesielt er basert, og de angitte begrensningskriterlene er ikke til-strekkelig til å sikre et hypoallergenisk og laktrosefritt produkt. The products are indicated to be useful as food products, especially in post-surgical treatment with the aim of re-establishing the metabolism, as they can be absorbed directly through the intestinal wall and stimulate enzyme production. Nothing is said about allergy problems, lactose malabsorption, nutrition of infants, i.e. the phenomena on which the proposed uses of the peptide preparation according to the invention are particularly based, and the stated limitation criteria are not sufficient to ensure a hypoallergenic and lactose-free product.

Utvinningen av hydrolysatet finner sted ved en fremgangmsåte som har visse likhetspunktet med fremgangmsåten ifølge oppfinnelsen, idet den innbefatter enzymatisk hydrolyse av et eventuelt ultrafUtrert og/eller diafiltrert myseprotein til de ønskede små molekylstørrelsene, og samling av det ønskede hydrolysatet ved ultrafiltrering uten mellomliggende enzym-inaktivering. Imidlertid er enzymet som benyttes nødvendigvis et enzym som er I stand til å gjenetablere den humane proteinmetabolismen, fortrinnsvis pankreatin, som er en blanding av spesielt trypsin og kymotrypsin. The recovery of the hydrolyzate takes place by a process which has certain points of similarity with the process according to the invention, as it includes enzymatic hydrolysis of any ultrafiltered and/or diafiltered whey protein to the desired small molecular sizes, and collection of the desired hydrolyzate by ultrafiltration without intermediate enzyme inactivation . However, the enzyme used is necessarily an enzyme capable of re-establishing human protein metabolism, preferably pancreatin, which is a mixture of trypsin and chymotrypsin in particular.

Som nevnt tier imidlertid patentsøknaden når det gjelder anvendelsen av molekylstørrelsene som e kritiske for nyttig-heten av preparatet ifølge oppfinnelsen, på samme måten som den ikke beskriver kombinasjonen av flere enzymer ved hydrolysen. As mentioned, however, the patent application is silent when it comes to the use of the molecular sizes which are critical for the usefulness of the preparation according to the invention, in the same way that it does not describe the combination of several enzymes in the hydrolysis.

Ifølge en foretrukket utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er utgangsmaterialet som benyttes myse fra syre-utfelt kasein. Dette gir en bedre smak enn med f.eks. myse fra melkeproduksjon som, på grunn av et visst innhold av kasein, innbefattende kappa-kasein, viser en tendens til å gi en bitter smak som kan være vanskelig eller umulig å fjerne. According to a preferred embodiment of the method according to the invention, the starting material used is whey from acid-precipitated casein. This gives a better taste than with e.g. whey from dairy production which, due to a certain content of casein, including kappa-casein, shows a tendency to give a bitter taste which may be difficult or impossible to remove.

Hydrolysen kan utføres med forskjellige proteaser, hvorav alle - avhengig av kvaliteten og produksjonsbetingelsene for utgangsmaterialene - kan gi et tilfredsstillende peptidpreparat. Hydrolysen kan følges kontinuerlig ved pH-stat fremgangsmåten, og graden av hydrolyse beregnes på basis av forbruket av NaOh på vanlig måte. Hydrolysegraden angis som prosentandelen spaltede peptidbindinger sammenlignet med det totale antallet peptidbindinger, kfr. J. Adler-Nisson: J. Chem. Technol. Biotechn. 32.138, 1982. Proteasen inaktiveres ikke før ultrafiltrering. I det vesentlige alle proteaser som er akseptable innenfor næringsmiddelindustrien kan anvendes. Eksempler på spesielt nyttige enzymer innbefatter enzymer fra Aspergillus oryzae, såsom "Rhozyme 41 PC" og fra Bacillus licheniformis, såsom "Alcalase 0,6 L" og "Colorase PP" The hydrolysis can be carried out with different proteases, all of which - depending on the quality and production conditions of the starting materials - can give a satisfactory peptide preparation. The hydrolysis can be monitored continuously by the pH-stat method, and the degree of hydrolysis is calculated on the basis of the consumption of NaOh in the usual way. The degree of hydrolysis is expressed as the percentage of cleaved peptide bonds compared to the total number of peptide bonds, cf. J. Adler-Nisson: J. Chem. Technol. Biotech. 32,138, 1982. The protease is not inactivated before ultrafiltration. Essentially all proteases that are acceptable within the food industry can be used. Examples of particularly useful enzymes include enzymes from Aspergillus oryzae, such as "Rhozyme 41 PC" and from Bacillus licheniformis, such as "Alcalase 0.6 L" and "Colorase PP"

(pancreas ekstrakt). "Rhozyme 41 PC" inneholder laucin aminopeptidaser som hydrolyserer hitre paptider og følgelig er nyttig for behandlinen av myse inneholdende små mengder bitre stoffer. Hydrolysen utføres fortrinnsvis i ett eller flere trinn med mellomliggende ultrafiltrering(er). Dette resulterer i et bedre utbytte og en bedre molekylvekt-fordeling. (pancreatic extract). "Rhozyme 41 PC" contains laucine aminopeptidases which hydrolyze fast peptides and are therefore useful for the treatment of whey containing small amounts of bitter substances. The hydrolysis is preferably carried out in one or more stages with intermediate ultrafiltration(s). This results in a better yield and a better molecular weight distribution.

I. Bearbeidelse av myseprotelnI. Processing of the whey protein

Som nevnt er det beste utgangsmaterialet mysefra syreutfelt kasein. Det er også mulig å anvende myse fra melkeproduksjon. Den sistenvnte mysen inneholder varierende mengder kasein. Bare myse inneholdende små mengder kasein kan benyttes siden hydrolyse av kasein fører tilbitre stoffer som kan være vanskelige eller umulige å fjerne. Som nevnte befris mysen for eventuelle rester av kasein, f.eks. ved grovfiltrering (200.000 dalton), og/eller ved syreaddisjon, fortrinnsvis til en pH på ca. 4,6, og tilsats av et utfel-lingsmiddel, fortrinnsvis CaCl2»spesielt i en mengde på 5-40 g/100 1 myse og etterfølgende fjernelse av kaseinet, f.eks. ved dekantering. Deretter kan permeatet inneholdende myseproteiner konsentreres (20.000 dalton) for å redusere mengden av væske som skal behanldes. Høye strømningshastig-heter oppnås ved en pH på 2,0-2,5. Konsentratet diafUtreres med vann for å fjerne laktose, øke pH og konsentrere proteininnholdet til 0,5$-20$. Fremstillingen av laktosefritt myseproteinkonsentrat, WPC, kan bevirkes kontinuerlig. Fremstillingen forløper hurtigst enten avkjølt til ca. 5°C eller oppvarmet til ca. 50° C for å forhindre mikrobiell vekst. Dersom mysen fra syreutfelt kasein eller syre- og CaCl-behandlet myse bare har et ubetydelig innhold av kasein, er grovfiltrering av utgangsmaterialet overflødig. As mentioned, the best starting material is whey from acid-precipitated casein. It is also possible to use whey from milk production. The latter whey contains varying amounts of casein. Only whey containing small amounts of casein can be used since hydrolysis of casein leads to bitter substances which may be difficult or impossible to remove. As mentioned, the whey is freed from any remains of casein, e.g. by coarse filtration (200,000 daltons), and/or by acid addition, preferably to a pH of approx. 4.6, and addition of a precipitating agent, preferably CaCl2, especially in an amount of 5-40 g/100 1 whey and subsequent removal of the casein, e.g. by decanting. The permeate containing whey proteins can then be concentrated (20,000 daltons) to reduce the amount of liquid to be treated. High flow rates are achieved at a pH of 2.0-2.5. The concentrate is diafiltered with water to remove lactose, raise the pH and concentrate the protein content to 0.5$-20$. The production of lactose-free whey protein concentrate, WPC, can be carried out continuously. The production takes place most quickly either cooled to approx. 5°C or heated to approx. 50° C to prevent microbial growth. If the whey from acid-precipitated casein or acid- and CaCl-treated whey only has an insignificant content of casein, coarse filtering of the starting material is redundant.

II. Fremstilling av hydrolysaterII. Preparation of hydrolysates

Myseproteinkonsentrat kan hydrolyseres med forskjellige proteaser, hvorav alle kan gi et tilfredsstillende peptid preparat, avhengig av kvaliteten og produktbetingelsene for utgangsmaterialet som nevnt. Hydrolysen kan følges kontinuerlig og hydrolysegraden beregnes på basis av forbruket av en NaOH. Den minimale hydrolysegraden som må oppnås er angitt nedenfor. Proteasene blir ikke inaktivert før ultrafiltrering. Whey protein concentrate can be hydrolysed with different proteases, all of which can give a satisfactory peptide preparation, depending on the quality and product conditions of the starting material as mentioned. The hydrolysis can be monitored continuously and the degree of hydrolysis calculated on the basis of the consumption of NaOH. The minimum degree of hydrolysis that must be achieved is indicated below. The proteases are not inactivated before ultrafiltration.

Ila. Hydrolyse med to enzymerIla. Hydrolysis with two enzymes

Først hydrolyseres 5$ mysekonsentraat ved 50"C og pH 7,5 med 1,0 g "Rhozym 41 PC" (Aspergillus oryzae - Genencore) pr. liter substrat til 9$ hydrolyse. Ultrafiltrering utføres på en 6.000 dalton membran. First, 5% whey concentrate is hydrolysed at 50°C and pH 7.5 with 1.0 g "Rhozym 41 PC" (Aspergillus oryzae - Genencore) per liter of substrate to 9% hydrolysis. Ultrafiltration is carried out on a 6,000 dalton membrane.

Utbyttet av peptide i UF permeatet utgjør 30-40$ av den innledende proteinmengden. The yield of peptide in the UF permeate amounts to 30-40$ of the initial amount of protein.

Deretter hydrolyseres retentatet fra ultrafiltreringen av "Rhozyme" hydrolysatet videre ved 50° C og pH 7,5 med 0,5 ml "Alcalase 0,6 L" (Bacillus licheniformis - NOVO) pr. liter substrat (utgangsvolum ved den første hydrolysen). Hydrolysen fortsettes til 12$. Utbyttet av paptid i UF permeaatet er 40-45$ av den innledende proteinmengden. Det samlede utbyttet er 70-80$. The retentate from the ultrafiltration of the "Rhozyme" hydrolyzate is then further hydrolysed at 50° C and pH 7.5 with 0.5 ml of "Alcalase 0.6 L" (Bacillus licheniformis - NOVO) per liter of substrate (output volume in the first hydrolysis). The hydrolysis is continued to 12$. The yield of peptide in the UF permeate is 40-45% of the initial amount of protein. The total yield is 70-80$.

Den trinnvise hydrolysen øker det samlede utbyttet. Den mellomliggende ultrafiltreringen benyttes for høsting av peptider dannet i den første hydrolysen, som ellers ville bli videre hysrolysert til frie aminisyrer med en resulterende høyere osmolaritet av produktet. The stepwise hydrolysis increases the overall yield. The intermediate ultrafiltration is used to harvest peptides formed in the first hydrolysis, which would otherwise be further hydrolysed to free amino acids with a resulting higher osmolarity of the product.

IIb. Kombinert hydrolyse med to enzymerIIb. Combined hydrolysis with two enzymes

Fordelaktig benyttes begge enzymer i ett trinn siden dette fører tilet forbedret utbytte og den mellomliggende høstingen unngås. Advantageously, both enzymes are used in one step since this leads to improved yield and the intermediate harvest is avoided.

Ile. Hydrolysemed " Corolase PP" Ill. Hydrolysis with "Corolase PP"

Myseproteinkonsnetratet kan også hydrolyseres med "Corolase PP" (pancreasekstrakt - Rohm) ved 50°C og pH 8,0 (5,0 g pr. kg myseproteinkonsentrat) til 10$hydrolyse. Imidlertid krever dette kaseinfritt myseproteinkonsentrat for å unngå dannelse av hitre peptider. Et utbytte på 50-60$ peptider i UF permeatet oppnås. The whey protein concentrate can also be hydrolysed with "Corolase PP" (pancreas extract - Rohm) at 50°C and pH 8.0 (5.0 g per kg whey protein concentrate) to 10% hydrolysis. However, this requires casein-free whey protein concentrate to avoid the formation of fast peptides. A yield of 50-60$ peptides in the UF permeate is obtained.

Ild. Hydrolyse med " Alcalase 0. 6 L" Fire. Hydrolysis with "Alcalase 0.6 L"

5$ myseproteinkonsentrat kan hydrolyseres ved 50°C og pH 7,5 med "Alcalase 0,6 L" (1,0 ml pr. 1 substrat) til 18$ hydrolyse. Utbyttet av peptid i UF permeatet er ca. 80$. Imidlertid kan fremgangsmåten bare benyttes på i det vesentlige kaseinfritt myseprotein, idet kasein fører til dannelse av bitre peptider. 5$ whey protein concentrate can be hydrolyzed at 50°C and pH 7.5 with "Alcalase 0.6 L" (1.0 ml per 1 substrate) to 18$ hydrolysis. The yield of peptide in the UF permeate is approx. 80$. However, the method can only be used on essentially casein-free whey protein, as casein leads to the formation of bitter peptides.

III. Høsting av peptiderIII. Harvesting of peptides

De hypoallergeniske peptidene høstesfrahydrolysatene ved ultrafiltering og/eller diafiltrering, en kombinasjon er ofte foretrukket, idet forurensning under filtreingen reduserer permeabiliteten av filteret. The hypoallergenic peptides are harvested from the hydrolysates by ultrafiltration and/or diafiltration, a combination is often preferred, since contamination during filtration reduces the permeability of the filter.

Peptidene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan som nevnt benyttes I forskjellige næringsmiddelprodukter og nytelsesmidler. Følgelig kan morsmelkerstatninger fremstilles ved å regulere proteininnholdet i det høstede UF permeatet til 3,0$, tilsette salter, vitaminer, sakkarose, stivelse og fett, og deretter emulgeres blandingen, konsentreres, steriliseres og forstøvnings-tørkes for å tilveiebringe et ferdig produkt som skal fortynnes ved bruk. Det er også mulig å fremstille et flytende konsentrat eller et produkt som er klart for bruk ved en i og for seg kjent fremgangsmåte. As mentioned, the peptides produced by the method according to the invention can be used in various food products and pleasure products. Accordingly, infant formulas can be prepared by adjusting the protein content of the harvested UF permeate to 3.0$, adding salts, vitamins, sucrose, starch and fat, and then emulsifying the mixture, concentrating, sterilizing and spray-drying to provide a finished product which will diluted with use. It is also possible to produce a liquid concentrate or a product that is ready for use by a method known per se.

Oppfinnelsen skal forklares mer utførlig ved hjelp av de følgende eksemplene: The invention shall be explained in more detail by means of the following examples:

EKSEMPEL 1EXAMPLE 1

Fremstilling av morsmelkerstatninger på basis av myse fra syreutfelt kasein Production of breast milk substitutes based on whey from acid-precipitated casein

50.000 liter kaseinfri myse fra syreutfelt kaseinmed et proteininnhold på 0,5$ forbehandles ved grov filtrering på "GR30PP" membraner (200.000 dalton). Det reulterende retentatet er fritt for laktose. Retentatet tilføres deretter til en tank utstyrt med en varmemantel for å holde en konstant temepratur på på 50°C. pH for myseproteinkonsentratet reguleres til 8,0 med pH-meter/titraatorenheten benyttet ved hydrolysen for å holde en konstant pH på ca. 8,0. Forbruktet av NaOH benyttes som et mål for graden av hydrolyse. Tanken er videre utstyrt med en effektiv rører. Når myseproteinkonsentratet er brakt i likevekt ved 50°C og pH 8,0 tilsettes 1,23 kg "Corolase PP", og hydrolysen forløper inntil ca. 40 liter 4,0 N NaOH (10$ hydrolyse) er forbrukt. Dette tar ca. 4 timer. Deretter ultrafiltreres/diafUtreres hydrolysatet på "GR81PP" membraner (6.000 dalton) for å tilveiebringe et hypoallergenisk permeat. Proteininnholdet i permeatet måles kontinuerlig ved 280 nm. Proteininnholdeti permeatet er 2,5 til 3,0$. 125 kg hypoallergenisk peptid oppnås, svarende til 1.000 kg fullstendig morsmelkerstatning. 50,000 liters of casein-free whey from acid-precipitated casein with a protein content of 0.5$ is pre-treated by coarse filtration on "GR30PP" membranes (200,000 daltons). The resulting retentate is free of lactose. The retentate is then fed to a tank equipped with a heating jacket to maintain a constant temperature of 50°C. The pH of the whey protein concentrate is regulated to 8.0 with the pH meter/titrator unit used during the hydrolysis to maintain a constant pH of approx. 8.0. The consumption of NaOH is used as a measure of the degree of hydrolysis. The tank is also equipped with an efficient stirrer. When the whey protein concentrate has been brought to equilibrium at 50°C and pH 8.0, 1.23 kg of "Corolase PP" is added, and the hydrolysis proceeds until approx. 40 liters of 4.0 N NaOH (10$ hydrolysis) is consumed. This takes approx. 4 hours. The hydrolyzate is then ultrafiltered/diafiltered on "GR81PP" membranes (6,000 daltons) to provide a hypoallergenic permeate. The protein content in the permeate is measured continuously at 280 nm. The protein content of the permeate is 2.5 to 3.0%. 125 kg of hypoallergenic peptide is obtained, corresponding to 1,000 kg of complete infant formula.

EKSEMPEL 2EXAMPLE 2

Fremstilling av hypoallergenisk peptid på basis av myse fra osteproduks. 1 on Production of hypoallergenic peptide on the basis of whey from cheese products. 1 Wed

19.200 liter myse fra osteproduksjonmed et protéininmnhold på ca. 0,65$ grovfUtreres som i eksempel 1, eller behandles med en syre og CaCl2som angitt tidligere. Permeatet som utgjør myse renset for partikkelformig kasein, men inneholdede kappa-kasein, tilføres til en annen beholder og konsentreres-/diafiltrers som i eksempel 1. Deretter utgjør retentatet laktosefritt myseproteinkonsentrat. Myseproteinkonsentratet reguleres til pH 7,5 og 50°C, og 2,5 kg "Rhoztme 41 PC" 19,200 liters of whey from cheese production with a protein content of approx. 0.65$ is coarsely ground as in example 1, or treated with an acid and CaCl2 as stated earlier. The permeate, which constitutes whey purified from particulate casein, but containing kappa-casein, is added to another container and concentrated/diafiltered as in example 1. The retentate then constitutes lactose-free whey protein concentrate. The whey protein concentrate is adjusted to pH 7.5 and 50°C, and 2.5 kg "Rhoztme 41 PC"

tilsettes. Hydrolysen fortsettes inntil ca. 18 liter 4,0 N NaOH (9$ hydrolyse) er forbrukt, hvilket tarca. 2 timer. Hydrolysatet ultrafiltreres/diafUtreres som angitt i eksempel 1. Utbyttet av peptider i permeatet er ca. 35$. Retentatet reguleres til pH 7,5 og 50°C, og 1,25 liter "Alcalase 0,6 L" tilsettes. Hydrolysen fortsettes inntilca. 15 liter 4,0 N NaOH (12$ hydrolyse av retentaatet) er forbrukt, hvilket tar ca. 2 timer. "Alcalase 0,6 L" hydrolysatet filtreres/diafUtreres som angitt i eksempel 1. Utbyttet av peptider i UF permeatet er ca. 35$ av myse-proteinkonsentratmengden. Proteininnholdet i det samlede UF permeatet etter hydrolyse med de to enztmene vil være under 1,0$ og UF permeatet konsentrerers derfor 4-5 ganger før det er egnet for anvendelse ved fremstillingen av morsmelkerstatninger. 90 kg hypoallergenisk peptid oppnås svarende til 760 kg fullstendig morsmeikerstatning. is added. Hydrolysis is continued until approx. 18 liters of 4.0 N NaOH (9$ hydrolysis) is consumed, which tarca. 2 hours. The hydrolyzate is ultrafiltered/diafiltered as indicated in example 1. The yield of peptides in the permeate is approx. 35$. The retentate is adjusted to pH 7.5 and 50°C, and 1.25 liters of "Alcalase 0.6 L" are added. Hydrolysis is continued until approx. 15 liters of 4.0 N NaOH (12$ hydrolysis of the retentate) has been consumed, which takes approx. 2 hours. The "Alcalase 0.6 L" hydrolyzate is filtered/diafiltered as indicated in example 1. The yield of peptides in the UF permeate is approx. 35$ of the whey protein concentrate amount. The protein content in the total UF permeate after hydrolysis with the two enzymes will be below 1.0$ and the UF permeate is therefore concentrated 4-5 times before it is suitable for use in the production of breast milk substitutes. 90 kg of hypoallergenic peptide is obtained, corresponding to 760 kg of complete infant formula.

EKSEMPEL 3EXAMPLE 3

60.000 liter myse fra osteproduksjon som har et proteininnhold på 0,85$ forbehandles ved å redusere pH til 4,6 og utfelle med CaC^. Utfelt kasein fjernes ved dekantering, og væsken som har et proteininnhold på 0,70$ diafilteres slik at laktoseinnholdet reduseres til maksimalt 0,1$, og deretter reguleres proteininnholdet til 5$. Dette retentatet varmebehandles ved 70° C i 10 minutter for å inaktivere osteløypen, og deretter tilsettes "Rhozyme" og "Alcalase 2,4 L" samtidig i mengder svarende til E/S 2 og 1,36$. Hydrolysen utføres ved en pH på 7,5 og ved 55° C, og pH holdes ved 7,5 med en pH-stat under hydrolysen. En hydrolysegrad på ca. 17$ oppnmås etter ca. 4 timer, og deretter ultrafUtreres blandingen på en membran med en "cut-off"-verdi på 6.000. 60,000 liters of whey from cheese production which has a protein content of 0.85$ is pre-treated by reducing the pH to 4.6 and precipitating with CaC^. Precipitated casein is removed by decantation, and the liquid, which has a protein content of 0.70$, is diafiltered so that the lactose content is reduced to a maximum of 0.1$, and then the protein content is regulated to 5$. This retentate is heat-treated at 70° C. for 10 minutes to inactivate the cheese loop, and then "Rhozyme" and "Alcalase 2.4 L" are added simultaneously in amounts corresponding to E/S 2 and 1.36$. The hydrolysis is carried out at a pH of 7.5 and at 55° C, and the pH is maintained at 7.5 with a pH stat during the hydrolysis. A degree of hydrolysis of approx. 17$ is collected after approx. 4 hours, and then the mixture is ultrafiltered on a membrane with a "cut-off" value of 6,000.

Ca. 4.500 liter permeat som har et proteininnhold på ca. 3,5$ oppnås. Dette bearbeides ved tilsats av karbohydrater, vitaminer, fett og mineraler i overensstemmelse med bestem-melsene på dette feltet for å tilveiebringe et hypoaller genisk, laktosefritt preparat som kan bearbeides videre ved sterilisering og/eller spraytørking. About. 4,500 liters of permeate which has a protein content of approx. 3.5$ is achieved. This is processed by adding carbohydrates, vitamins, fat and minerals in accordance with the regulations in this field to provide a hypoallergenic, lactose-free preparation that can be further processed by sterilization and/or spray drying.

Når det anvendes to tanker kan prosessen utføres kontinuerlig etter som hydrolyse kan finne sted i én tank, mens ultrafIltrering/diafiltrering av mysen finner sted i den andre tanken. Fremgangsmåten beskrevet ieksempel 1 er betydlig billigere med hensyn på forbruk av enzymer og krav til apparatur enn fremgangsmåten beskrevet i eksempel 2. På den annen side er kravene som stilles til kvaliteten (og følgelig prisen) av den eventuelt konsentrerte mysen benyttet som utgangsmateriale lavere i eksempel 2, på samme måte som utbyttet i eksempel 2 er høyere enn i eksempel 1. Et enda høyere utbytte kan oppnås ved en fremgangsmåte svarende til eksempel 1 ved å anvende en grundig hydrolyse med "Alcalase 0. 6 L". Imidlertid stiller denne prosessen meget strenge krav til mysen som, som nevnt, må være i det vesentlige fri for kasein. På det nåværende tidspunktet er fremgangsmåten ifølge eksempel 3 foretrukket på grunn av dens hensiktsmessighet og den utmerkede kvaliteten for produktet, som er både hypoallergenisk, laktosefritt og har tiltalende smak. When two tanks are used, the process can be carried out continuously as hydrolysis can take place in one tank, while ultrafiltration/diafiltration of the whey takes place in the other tank. The method described in example 1 is significantly cheaper with respect to the consumption of enzymes and requirements for equipment than the method described in example 2. On the other hand, the demands placed on the quality (and consequently the price) of the possibly concentrated whey used as starting material are lower in example 2, in the same way that the yield in example 2 is higher than in example 1. An even higher yield can be obtained by a method corresponding to example 1 by using a thorough hydrolysis with "Alcalase 0.6 L". However, this process places very strict demands on the whey, which, as mentioned, must be essentially free of casein. At the present time, the method of Example 3 is preferred because of its expediency and the excellent quality of the product, which is both hypoallergenic, lactose-free and has a pleasing taste.

Produktene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen viser ingen allergenisitet ved målinger, ingen antistoff-binding observeres i ELISA ved anvendelse av følgende antistoffer: 1. Kommersielle kaninantistoffer, fremstilt av søkerne, mot kasein eller myseprotein. The products produced by the method according to the invention show no allergenicity by measurements, no antibody binding is observed in ELISA using the following antibodies: 1. Commercial rabbit antibodies, produced by the applicants, against casein or whey protein.

II. Sera fra pasienter med kumelkallergi inneholdende II. Sera from patients with cow's milk allergy containing

humane antistoffer mot melkeproteiner.human antibodies against milk proteins.

Videre kan det ikke forårsake PCA reaksjonen i mus som er gjort passivt følsomme med kanin- eller musantistoff mot melkeproteiner, de kan ikke forårsake positiv reaksjon ved in vitro histamin-frigivelsesforsøk ved anvendelse av pasient- sera som angitt ovenfor, og de forårsaker ikke allergi-reaksjoner i provokasjonsforsøk på små barn med klinisk veldokumentert melkeallergi. Peptidene har et optimalt innhold av essensielle aminosyrer og følgelig en høy nærings-verdi, samtidig som produktet er laktosefritt. En 1,5$ vandig oppløsning av peptidene er smaksfri og luktløs. Peptidene i en opp til 10$ vandig oppløsning er oppløselige ved pH 4,5. Ved denne pH-verdien tåler peptidene koking i 10 minutter. Som nevnt har peptidene en størrelse under 6.000 dalton, og de fleste av dem har en molekylvekt på 2.000-2.500 dalton. De har ingen eller meget svak emulgerende evne, på samme måte som de er lite skumbare med en dårlig skumstabilitet. De er derfor nyttige som en erstatning for melk, som angitt i det foregående. Furthermore, it cannot cause the PCA reaction in mice passively sensitized with rabbit or mouse antibody against milk proteins, they cannot cause a positive reaction in in vitro histamine release tests using patient sera as indicated above, and they do not cause allergy reactions in provocation tests on young children with clinically well-documented milk allergy. The peptides have an optimal content of essential amino acids and consequently a high nutritional value, while the product is lactose-free. A 1.5% aqueous solution of the peptides is tasteless and odorless. The peptides in an up to 10% aqueous solution are soluble at pH 4.5. At this pH value, the peptides withstand boiling for 10 minutes. As mentioned, the peptides have a size below 6,000 daltons, and most of them have a molecular weight of 2,000-2,500 daltons. They have no or very weak emulsifying ability, in the same way that they are not foamable with poor foam stability. They are therefore useful as a substitute for milk, as indicated above.

Claims

1. Peptide preparation from the hydrolysis of whey, characterized in that it includes peptides with a molecular weight of up to 6,000 daltons, and optionally amino acids, and in that it is free of allergenic substances and lactose.

2. Peptide preparation according to claim 1, characterized in that it essentially consists of peptides with a molecular weight of 2,000-6,000 daltons, especially 2,000-2,500 daltons.

3. Process for producing a preparation according to claim 1 or 2 by ultrafiltration and hydrolysis of whey, characterized by a) diafiltration of essentially casein-free whey with water at an approx. 20,000 dalton membrane, if desired after prior concentration of the whey, b) enzymatic hydrolysis of the whey protein retentate from a) in one or more steps, each hydrolysis step is terminated by ultrafiltration through an approx. 6,000 dalton membrane to harvest the resulting peptides in the permeate.

4. Method according to claim 3, characterized in that whey from acid-precipitated casein is used.

5 . Method according to claim 3 or 4, characterized in that whey is used which has been made essentially casein-free by coarse filtration, e.g. through a 200,000 dalton membrane, or by adding acid and precipitation with calcium chloride.

6. Method according to claim 3, 4 or 5, characterized in that the hydrolysis is carried out in one or two steps with two different enzymes.

7. Method according to any one of claims 3-6, characterized in that one or more proteases are used.

8. Method according to any one of claims 3-7, characterized in that the hydrolysis is carried out in one or two steps using "Rhozyme 41 PC" and "Alcalase 0.6 L".

9. Use of the peptide preparation according to claim 1 in a suitable concentration as a substitute for milk or milk protein in products which usually contain milk.

10. Use according to claim 9 in products intended for people with allergies or tendencies towards allergies and/or lactose malabsorption tendencies.