NO873233L - Fremgangsmaate for helingsforbedring av epitelsaar hos pattedyr. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår epitelsårheling hos pattedyr ved bruk av omental angiogen faktor 1ipidfraksjoner.

US-PS 4 456 596 beskriver sårhelingspreparater bestående av glycosfingolipid, et glycosteroid og et polypeptid. Schafer bruker i dette patent topisk påføring av blandingen. Glucosfingolipidet ifølge dette patent antydes å fremme middel- og endefasehelingsfremmende prolyferering av fibro-blaster og epitelceller ved anvendelse topisk på hudsåret for å vise øket helbredelse etter ca. 6 til 10 uker. Det bemerkes at Schafers materiale synes å arbeide kun etter at vascularisering og kapilarisering har begynt (se det hervær-ende krav 9).

Andre patenter angår anvendelse av naturlige stoffer for sårhelbredelse slik som fibrinogen fra plasma (US-PS 4 427 650) collagenfibre for medisinsk bruk (US-PS 4 420 339, 4 233 360 og 3 949 073), glycoprotein fra spytt for sårbehandling (US-PS 3 522 229), sulfonert glycopeptid som anti inflammator-iske midler (US-PS 3 518 243), bregneekstrakt (US-PS 3 395 223) som ikke synes å være lipid, og lavmolekylvektsproteiner fra blod (US-PS 3 672 954).

Sårheling sees også med organiske forbindelser slik som fenylforbindelser (US-PS 4 333 940) og syreanhydrider (2 788 308 samt 3 341 410). Andre aromatiske forbindelser er piperidin- og pyridinderivater (US-PS 3 321 484, 3 318 901 og 4 282 250) anti-inflammatorisk indol-eddiksyreestere (US-PS 3 271 394), cytokrompreparater for ulcerøse sår (US-PS 3 017 325) og 3 809 760. Stereoider er kjent for anti-inflammatorisk virkning (se US-PS 3 047 470 og 3 767 683 og 2 845 381), flavylium aromatiske salter (US-PS 4 376 781).

Dyresår rapporteres helbredet med langkjede polyumettede syrer av fiskeolje og terpiner pluss oleinsyre og kerosen hovedsakelig for å beskytte såret (US-PS 4 447 418) på samme måte som polykaprolakton (US-PS 4 186 190), det skal også henvises til US-PS 4 186 190.

Vitamin A og D, olivenolje og et aromatisk hydroksylderivat benyttes i en lotion (US-PS 3 622 668). Innvendig bruk av preparater inkludert prostaglandiner for å behandle koagulert blod beskrives i US-PS 4 211 782. En moluskekstrakt som beskyttende middel brukes sammen med et aktivt medikament for å behandle sår (US-PS 4 455 298) og det finnes en blanding for sårbehandling som omfatter succrose, glucose, aminosyrer og lipider som næringsmiddel (se US-PS 4 029 773).

Foreliggende oppfinnelse angår heling av epitelsår hos pattedyr ved hjelp av omental lipidfraksjoner. Figur 1 viser metoden med isolering av omental lipidfraksjon-ene. Figur 2 viser epitelsårheling i forsøks- og kontrollhunder. Figur 3 viser sårheling av en kontrollhund som startet den tredje dag da det opprinnelige sår ble frembragt. Figur 4 viser midlere sårhelingslukningshastighet som hellingen som gis ved lineær regresjon av logg (såret areal) som en funksjon av tiden (i uker).

Det finnes ingen teknikk som dreier seg om omentum-, omentum-fraksjon- eller omental lipidfraksjonsbehandling av epitelsår. Materialet ifølge oppfinnelsen er således nytt hva angår epitelsårheling, såkalt epitalierisering.

Angiogenese og kjemiske faktorer som medierer eller inhiberer den angiogene prosess har viktige inplikasjoner ved alvorlige sykdommer (se f. eks. Auerbach, R. (1981) i "Lymphoklnes", utg. E. Pick, Academic Press, vol. 4, s- 69). Anglogene faktorer er renset fra forskjellige patologiske kilder (Schor, A.M. et al (1983)) vev i små mengder (D'Amore, P.A. et al- (1981). Vanlige vev, tilgjengelig i store mengder, som inneholder potent angiogen aktivitet, tilveiebringer muligheter for isolering, strukturell analyse og utstrakte dyre- og kliniske studier. En kloroform-metanolekstrakt fra felin omentum er tidligere angitt (Goldsmith, H. et al. "JAMA" 252:15, p. 2034) for å oppnå utmerket angiogen aktivitet etter en enkelt injeksjon i sentral cornea hos kaniner. Det skal også henvises til den paralleltløpende US-SN 642 624. Komponentene av denne ekstrakt er nu fraksjonert og hovedglucosfingolipidkomponentenekarakterisert. De anglogene aktiviteter, målt ved kylling chorioalantoinmembran (CAM) analysen (Folkman, J. (1974) "Cancer Res." 34:2109 av fraksjonene og rensede glucosfingolipider er også bestemt. Nøytrale glucosfingolider og spesielle gangliocider er nylig angitt å ha forbindelse med et antall cellulære responser og er vist å modulere aktivitet for resptorer for diverse vekstfaktorer (Bremer, E.G., et al. (1984) "J. Cell. Biol." 259:6818 ). Søkerens studier indikerer at eksogene glykolipi-der kan påvirke angiogeneseresponsen i kyllingegg chorioal-lantoin membransystemet. Denne Informasjon finnes i den paralleltløpende US-SN 782 724.

HPLC kvalitetmetanol og andre reagens kvalitet oppløsnings-midler og kjemikalier ble oppnådd fra Fisher Chemical Scientific (Fairlawn, NJ); Iatrobeads 6RS-8060 og 6RS-8010 var fra Iatron Industries (Tokyo, Japan) DEAE-Sephadex (A-25) var fra Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ); Unisil var fra Clarkson Chemical Company (Williamsport, PA); og HPTLC plater var oppnådd fra E. Merck (Darmstadt, Tyskland). Gangllosid- og glycolipidstandarder ble fremstilt som tidligere beskrevet (Velman, M.D., et al. (1977) "J. Lipid Res." 18:371-378; Ledeen, R.W., et al. (1978) i "Research Methods in Neurochemistry" vol. 4, utg. Marks and R. Rodnight Plenum Publishing Corp., N.Y. s. 371-410). V. cholera neuraminidase ble oppnådd fra Sigma Chemical Co. (St. Louis,

MO).

Fraksjonering av omentumekstrakter:

Omentum fra voksne hunnkatter ble skåret ut og hakket opp som tidligere angitt (Goldsmith, et al. Supra). Omentumprepara-tene ble homogenisert i kold fosfatbufret saltoppløsning (PBS) og sentrifugert ved 4°C i 20 min. i 250 ml plastflasker ved 1600 g. Etter sentrifugering ble den flytende kake fjernet og homogenisert i 20 volumer kloroformrmetanol (2:1). Ekstrakten ble sentrifugert ved 200 g i 10 min. for å fjerne partikkelformig materiale og den klare supernatant ble fordampet til tørr tilstand/fl i vakuum/f R for å oppnå rålipidekstrakten CLE, også kjent som CMFr.

CMFr ble oppløst i heksan (ca. 60 ml/10 g ekstrakt) og 0,66 volumer 95$ etanol ble tilsatt (Galanos, D.S. et al. (1962) J. Lipid. Res. 3:134). Fasene ble grundig blandet og tillatt separering. Den nedre fase ble fjernet og den øvre fase, heksansjiktet, reekstrahert med 95$ etanol. De nedre faser ble kombinert og reekstrahert med et friskt volum heksan og heksanfåsene kombinert. Fasene ble så bragt til tørr tilstand/fl i vakuum/fR for å oppnå heksan over fasematerialet (heksan-UP), også kjent som HxCMFr, og etanol nedre fasematerialet (etanol-LP), også kjent som ETCMFr. Heksan-fasen inneholdt omtrent 98$ av materialet i CMFr og ble vist å bestå primært av triglycerider som bestemt ved TLC. Alkalisk hydrolyse og GC/MS analyse av de resulterende fettsyre metyllestere viste at 14:0, 16:0, 16:1, 17:0, 18:0 og 18:2 var de hovedsakelige triglyceridfettsyrer.

Andre hydrokarboner (f. eks. pentan, cykloheksan, cyklopen-tan, benzen osv.) kan benyttes istedet for heksan for den ovenfor angitte separering. Metanol, N-propanol og acetoni-trll kan benyttes istedet for etanol for separeringen. Andre metoder kan også benyttes som man tidligere har sett og som det er klart for fagmannen 1 Kates, M. (1972) "Techniques of Lipidology: Isolation, Analysis and Identification of Lipids". (North-Holland Elsevier P. 269-610). Disse metoder kan bl.a. inkludere aceton precipitering, oppløsningsmiddel utskilling ved bruk av motstrømsfordeling, kolonnekromato-grafi og/eller høytrykksvaeske kromatograf I.

Deretter ble det gjennomført en Foch fordeling (Folen, J. et al. (1957) "J. Biol.Chem." 226:497-509). Etanol-LP ble oppløst i kloroform:metanol I forholdet 2:1 (20 volumer volum/vekt) og 0,2 volumer vann tilsatt og passende grundig blandet og tillatt separering. Den øvre fase ble fjernet og den nedre fase vasket med 0,4 volumer metanol:vann 1:1. De øvre faser ble kombinert og begge faser bragt til tørr tilstand i vakuum for å oppnå Folch-UP og Folch-LP materiale.

Folch-LP materialet ble oppløst i kloroform og underkastet kromatograf! på en kieselsyresøyle "Unlsil" (Vance, D.E. et al. (1967) "J. Lipid. Res." 8:621). "Unisil"-kolonnen ble eluert suksessivt med 20 volumer kloroform, aceton:metanol 9:1 og metanol for å oppnå de nøytrale lilpid-, glycolipid-henholdsvis fosfolipidfraksjoner. Den nøytrale lipidfraksjon besto hovedsakelig av triglycerider og små mengder kolesterol og frie fettsyrer som detektert ved TLC-analyse. Aceton glycolipidfraksjonen ble bestemt ved TLC og komponentene migrerte som om heksocylceramid, lactosylceramid, globotriao-sylceramid og globosid var tilstede. HPLC analyse av de nedre fase glycolipider viste Gle Cer (Nfa), 26$; Gal Cer (N fa), 9, 6% ; Gle Cer (H fa)+ Gal Cer (H fa) + Gb0se4Cer, 26$. Metanol fosfolipidfraksjonen ble undersøkt med TLC og komponenter som migrerte som fosfatidylserin, fosfatidylcho-lin og sfingomyelin var tilstede.

Folch-UP materialet ble oppløst i metanol:vann 1:1 (omtrent 20 vekt-# av etanolfasematerialet) (ca. 3 mg/l) og påført på en C18 revers-fase patron (BondElut) (Williams, M. et al.

(1980) "J. Neurochem." 35:266-269) som så ble vasket med fire volumer metanol:vann 1:1 fulgt av eluering med fire volumer kloroform:metanol 2:1. De to vaskinger ble separat oppsamlet og fordampet til tørr tilstand/flin vakuum/fR for å oppnå ikke-lipid materiale (ikke-lipid UP) og lipidmateriale (lipid-UP).

Lipid-UP materialet ble oppløst i metanol:kloroform:vann 60:30:8 og påført på en DEAE-Sephadex [acetat] kolonne (Christie, W.W: (1982) "Lipid Analysis" Pergamon Press, 2 utg. s. 109-110). Kolonnen ble eluert med 10 volumer av det samme oppløsning for å oppnå det nøytrale lipid øvre fase fraksjon (nøytral lipid-UP) bestående av et glycollpid som migrerte under globocid) og små mengder av mere komplekse glycolipider. Kolonnen ble så eluert med metanol:kloroform:-0,8 M natrium acetat 60:30:8 for å oppnå gangliocidfraksjonen. Fraksjonene ble fordampet til tørr tilstand/flin vakuum/fR. Gangliocidfraksjonen ble avsaltet med en C18 reversfasepatron som beskrevet ovenfor. HPTLC viste nærværet av GM3, GMi, GD3og flere mindre polysialogangliosider (GDla og GTlb). GD3forholdet til Gle:Gal var 1:1 og hovedfettsyre komponentene var 16:01, 18:0, 18:1, 24:0 og 24:1. Neuramina-dase behandling ga lactosylceramid. Den frigjorte sialsyre var N-acetylneuraminsyre. Et strømningskart for fraksjoneringsskjemaet er vist nedenfor i Fig. 1.

Omenta ble ekstrahert fra felin- og bovinkilder som tidligere beskrevet (Goldsmxisth et al,@. (1984) "J. Amer. Med. Assn." 252:15. s. 2034-2036) for å oppnå en kloroform metanolekstrakt, CME, også kjent som CMFr. Dette CMFr ekstraheres ytterligere med heksan for derved å gi en nøytral lipidfraksjon fra dette CMFr, kjent som HxCMFr. Andre 1ipidekstraher-ingsmetoder kan også benyttes. Oppfinnelsen er ikke begrenset til ekstraheringsmetoden som er beskrevet ovenfor som kun skal være illustrerende. Bovin-, ovnin- og porcinomenta kan også ekstraheres på samme måte.

Det er også mulig å ekstrahere omentum ved bruk av andre organiske oppløsningsmidler for å oppnå aktive anglogene fraksjoner. Det skal også bemerkes at bruken av superkritisk gassekstrahering for ekstrahering av omentumfaktorer er beskrevet i den paralleltløpende US-SN 793 622.

Superkritisk gassekstrahering benyttes også for å ekstrahere omentalmaterialet som i den paralleltløpende US-SN 793 622. Her blir et superkritisk fluid, SCF, nemlig C02, benyttet for å ekstrahere omentum. Et SCF har øket oppløsningsevne ved temperaturer over det kritiske trykk Pc og den kritiske temperatur Tc.

CO2benyttes. Polare materialer slik som gangliosider forblir i resten mens ekstrakten inneholder de mere ikke polare eller lipidmateriale slik som triglycerid. De benyttede temperaturer er 38 - 39°C og trykkene 3.500 psig. Således kan disse tilstander unngå ekstrahering med toksiske stoffer eller ineffektiv ekstrahering eller bruk av kostbare og tidkrevende ekstraheringer og materialer.

Lipider fortrenges fra homogeniserte cellemembraner eller andre komplekser som involverer proteiner med amfipatiske detergensmolekyler som gjør proteinene "oppløselige" i vandige media. Det frigjorte lipidmateriale gjenvinnes ved flotering etter sentrifugering. En liste av mulige detergen-ser er gitt i tabellene A og B. Disse benyttes i konsentra-sjoner fra 0,1 til 2,0$ vekt/volum og en pH-verdi fra 7,0 til 8,0.

Omenta kan ekstraheres som ovenfor etter finoppdeling i flytende nitrogen.

Det skal henvises til tegningene.

Figur 1 er et flytdiagram av fraksjoneringsskjemaet for katteomenta. Figur 2 viser sårlukningsdata for åpne sår for spesifikke kontroll- (1) og f orsøkshunder (2-5). Figur 3 (A-F) viser sårheling over et tidsrom for et sår på en kontroilhund. Figur 4 viser midlere hastigheter for sårlukning som en helling gitt ved lineær regresjon av logaritmen (sårarealet) oppført mot tiden i uker.

Eksemplene skal kun være illustrerende.

Eksempel I

Epitelsår heling.

Hudsår i full tykkelse inkludert de underliggende cutane muskler ble foretatt over thora- abdominal- og lumbararealet hos 20 voksne hunnbeagler av Dr. Dudley Johnston ved University of Pennsylvania School of Veterinary Medicine, Philadel-phia, PA. Hver hund hadde seks sår, tre på hver side av dorsal midtlinjen, hvert sår målte 4 cm x 4 cm. Sårene var i tilsvarende posisjoner på hver hund. Alle hunder var av samme alder, kjønn og slekt og hadde en vekt på 6,4 til 8,2 kg. Alle hunder var helt ut kondisjonerte forsøkshunder med utmerket helse. For den første kirurgiske prosedyre og etterfølgende sårmålinger og biopsi ble hundene beroliget med 100 jjg/kg intramuskulært oksymorfon og 0,02 mg/kg intramuskulært atropin. Kort anestesi ble indusert med 2 mg/kg intravenøst tiopenton og fortsatt til virkning.

Hvert sår ble merket med et kvadrat før sårinnsnitt. Tatoveringsmerkene gikk inn I den oppskårede sone og merkene tjente som indikasjon for den opprinnelige kant av såret på fotografier. Åpne sår etter kirurgien eller medikering ble dekket med et vaselinbind av ikke-adherende type, absorber-ende bomull og en kroppsbandasje. De to sentrale eller abdominale sår hos alle hunder ble umiddelbart podet med full tykkelse av hud oppnådd fra det ved siden av liggende lumbarsår. Hver poding ble suturert på plass med åtte enkle avbrutte suturer.

Hvert sår ble fotografert etter operasjon ved bruk av en fiksert 1inse-såravstand. Avstanden og arealet for såret ble bestemt fra fotografiene som beskrevet nedenfor. Sårheling for hver gruppe ble bedømt kvantitativt som beskrevet nedenfor på dagene 3, 7, 10, 14, 18, 21, 28 og 31.

De tyve hunder ble oppdelt i fem grupper på 4 hunder her som vist i Fig. 2.

I de 4 kontrollhunder (Gruppe 1 hundene A, B, C og D, ble sårene behandlet hver 8. time ved varm isotonisk saltoppløsn-ing for å fjerne skorper, verk osv. Sårbandasjer ble påført igjen hver 3. behandling (en gang daglig).

I 4 f orsøkshunder (Gruppe 2: hundene E, F, G og I) var det topisk påføring av enten bovin- eller felin CMFr (0,3 g). Ved slutten av den kirurgiske protokoll ble kloroform-metanolekstrakt (CMFr) fra katte- eller bovinekstrakt påført på såroverflaten og dette ble dekket med vaselinbind. CMFr ble også påført på den autopodede hud. Sårene ble renset hver 8. time som for kontrollsårene. CMFr ble påført igjen under vaselInbindet hver 8. time men bare til åpne sår (ingen podinger).

På ytterligere 4 forsøkshunder (Gruppe 3: hundene H, J, K og L) var det topisk pluss systemisk påføring av felin- eller bocin CMFr. Topisk påføring skjedde som ovenfor. I tillegg fikk disse hunder daglig intramuskulære injeksjoner av felin-eller bovin CMFr, 0,5 ml/kg kroppsvekt. Lipidmaterialet ble varmet til 37" C umiddelbart før administrering for å senke viskositeten og å tillate injeksjon med en sprøyte og en nål nr. 19. Hundene i denne gruppe ble behandlet både topisk og systemisk med enten bovin- eller felin CMFr.

I ytterligere 4 forsøkshunder (Gruppe 4: hundene M, N, 0 og P) var det systemiske påføring av CMFr. Hundene M, N, 0 og P fikk daglig intramuskulære injeksjoner av CMFr, 0,5 ml/kg kroppsvekt. Hundene ble behandlet som for kontrollsår.

I ytterligere 4 forsøkshunder (Gruppe 5: hundene R, S, T og U) var det topisk påføring av HxCMFr. Dette skjedde som for den topiske påføring ovenfor, bortsett fra at den hovedsakelig triglyceridholdlge fraksjon av bovin- eller felin HxCMFr ble påført på sårene.

Hvert åpent sår ble bedømt hver 24. time for generelt utseende og ble fotografert hver 3. eller 4. dag for å bedømme totalstørrelse (kontraksjonsgrad og størrelsen av det epitelealiserte areal). Sårene ble fotografert på dagene 3, 7, 10, 14, 18, 21, 24, 28 og 31. Film-subjektavstanden var identisk for alle fotografier og, som en ytterligere sjekk for enhetlig størrelse av bildet, ble en metrisk måleanordn-ing festet til normal hud nær sårområdet og tatt med på billedet. Fotografiene ble senere brukt for å beregne 1) den totale sårstørrelse og 2) størrelsen av det ikke-eteliali-serte areal. For å beregne sårarealet ble de fotografiske bilder forstørret ved hjelp av en LEITZ VALOY II forstørrer med en 50 NIKON 1:2,8 mm linse. De fotografiske bilder ble forstørret slik at 1 cm på skalaen tilsvarte 3,5 cm. Hvert fotografiske bilde ble presset ned på hvitt papir for å gi en tegning av det totale sårareal (ytre sår) og en tegning av det ikke-epitelialiserte areal (Indre sår). Overflateare-alene for de ytre sår og det indre sår ble beregnet ved datamaskinanalyse ved bruk av en Apple II E computer, en Houston Instrument HIPAD DIGITIZER og en halvautomatisk billedanalysør (0PT0MAX INC., 9 Ash Street, Rt, 130, Hollis New Hampshire). En korreksjonsfaktor for billedforstørrelse ble inkludert i datamaskinprogrammet. Sårarealene ble statistisk analysert ved analyse av varianse og kovarianse ved gjentatte målinger (BMPD Statistical Software, Inc. 1964 Westwood Blvd., Suite 202, University of California, Los Angeles, CA).

En punch biopsi ble oppnådd fra hver sårkant for histologisk bedømmelse av angiogenese og hudlevedyktighet på dagene 7, 14, 21 og 28. Blposier inkluderte nærliggende hud, sårkanten og epitelialisert sår. Biopsiene ble undersøkt av en patolog som visste om biopsidagen men Ikke behandlingsgruppen. Biposiene ble undersøkt kvantitativt for angiogenesegrad og kvalitativt for helbredelsesmaturitet.

Eksempel II

Bedømmelse av sårkontraksjon.

Alle hunder tålte godt de kirurgiske prosedyrer og sårbanda-sjene og forble sunde hunder forsøksperioden. Lokaltoleranse av dette produkt var utmerket og det ble ikke observert irritasjon eller betennelse. Reaksjonene på triglyceridfrak-sjonen er diskutert nedenfor. I en prelimnær pilotprøve var CMFr2OSé i en standard salvebase ekstremt Irriterende, noe som må skyldes salvebasen.

CMFrvar vanskelig å injisere lokalt pga. konsistensen. Injeksjon med en nål nr. 19 var mulig kun etter oppvarming. CMFr av bovinopprinnelse hadde en tykkere konsistens enn CMFr av katteopprinnelse og ble dårlig absorbert etter intramucku-lær injeksjon. Materialet injisert 24 timer før tøt ut fra hudåpninger og kunne føles i vevene. Det oppsto ikke med CMFrav katteopprinnelse. Ingen lokal Infeksjon eller abscesser ble funnet etter intramuskulær injeksjon.

1. Åpne sår:

Alle sår øket i størrelse umiddelbart etter inngrepet og den opprinnelige kvadratiske form ble deformert ved muskelkon- traksjon. En distinkt linje av regenererende epitel ble funnet ved 7 dager I alle sår uten noen synlig differanse mellom gruppene. Sår som fikk triglycerider hadde en sårutsondring som var mere viskøs, tykkere, gulere og luktet noe mer enn utsondringen fra andre sår.

Indre sår

Det indre sårareal representerte det areal av såret som ble tilbake etter kontraksjon og epitelialisering. De indre sårarealer ble bedømt statistisk ved å sammenligne kvadrat-røttene av arealene. I hver gruppe på 4 hunder var det 16 sår, oppdelt i 4 venstre thora-, 4 venstre lumbar-, 4 høyre thora- og 4 høyre lumbarsår. Gruppene ble sammenlignet på basis av totale sår, nemlig 16, og sår i hvert anatomiske område, nemlig 4. Sårareal smål inger på hver 8. dag var tilgjengelig for analyse, tilsammen 16 sår i 4 grupper på 8 dager utgjorde 512 sårarealer. En oppsummering av alle sår er vist i Tabell I. En økning i helingsgraden oppsto i venstre thorasår som bel behandlet systemisk med CMFr (Gruppe 4) og i de venstre abdominalsår i alle behandlingsgrupper

(Tabellene 2 og 3). Det kan sees i Tabell 4 analysen for første avhengige variabel (overflateareal), at differanser basert på lokalitet, side, tid og gruppe (LSTG) er signifikant, T = 0,019 og differanser basert på sider og grupper, SG, kunne vær signifikant, T = 0,1611. Differanser basert på lokalitet og ikke side var mindre sannsynlig signifikante. Dette er fremhevet i tabellene 2 og 3.

Ytre sår.

Et tilsvarende antall sår og grupper ble bedømt ved å sammenligne det ytre sårareal. Dette areal representerer størrelsen av såret kun etter sårkontraksjon. Ingen behandlingsgruppe ga signifikant økning i sårlukningshastigheten, imidlertid var differansen mellom grupper basert på sidetid og gruppe, ST6, sannsynligvis signifikant med T = 0,0785 (Tabell 5 og 6).

Den lineære bevegelseshastighet for sårkantenen ble bestemt ved utjevning for å oppnå en parameter for kvantitativ sammensetning av kontraksjonshastighetene. Sårarealer bestemmes ved ortofleks digital koordinatsensor koblet med en programmerbar utskrivende kalkulator (Snowden, John M.

(1981): Wound contraction. A quantitative interpretation. AJEBAM 59:203).

Periferien av hvert sår ble observert etterhvert som helingen skred frem. Etter hvert som hvert 4 cm x 4 cm sår helet og ble mindre, dvs. at kantene beveget seg innover mot sentrum, var det et areal med dannet nytt epitel E. Datamaskinen målte arealet av såret som viste reduksjon og målte derved sluttresultatet av sårhelingen, dvs. hvor hurtig arret var dannet.

Neovaskularisering ble bedømt histologisk, både kvalitativt og kvantitativt. Den kvantitative måling var avhengig av bruken av spesielle flekker for endothelium og tellingstall og størrelse av karene.

I Fig. 2 vises resultatene av forsøk der katte- C og bovin B CMFr og HxCMFr ble påført både topisk og systematisk til sårene. Areal 1 representerte kontrollhundene. Areal 2 representerte de sår på hundene som var behandlet topisk med katte- og bovin CMFr. Areal 3 viste de hundesår som var behandlet både topisk og systemisk med katte- og bovin CMFr. Areal 4 representerte de hundesår som var behandlet systemiske med bovin- og katte CMFr. Areal 5 viste de sår som var behandlet topisk med katte- og bovinnøytral omental lipid Hx CMFr. Hver vertikal søyle representerer tiden for såret til heling på hver hund, dvs. A, B, C og D osv. er individuelle hunder. Fig. 3 viser sekvensiell heling av et slikt kontrollsår.

Tidligere forsøk som er gjort med sårheling på denne måte viser irritasjon av sårene når en CMFr ekstrakt i en salve base påføres topisk. Dette forsinket sårhelingen. Salvebasen var "Aquaphor" fra Beiersdorf Inc. Norwalk, Conn. og inneholdt petrolatum, mineralolje, mineralvoks (ceresinvoks) og ullvoksolje (lanolin, alkohol og kolesterol). Sår som fikk ren CMFr som ovenfor helet godt uten irritasjon og epitelialiseringen var hurtigere og mere fullstendig enn i kontroilhundene.

De uventede og uvanlige helingsegenskaper og den ikke-irriterende karakter for sårene av CMFr (eller CMFr heksan-fraksjonen) er derfor ny og uventet, spesielt fordi den har et kremlignende utseende.

Det ble bemerket en viss aksellerert heling hos behandlede hunder. CMFr behandlede hunder viste vanligvis ikke de utstrakte helingstider som finnes i kontrolldyrene på opptil 34 dager. Generelt reduserte CMFr antallet langsomme helere i gruppen. Denne effekt vises også for det systemiske forsøk (areal 4 i diagrammet). Generelt helet kontrollene i gjennomsnitt i løpet av 31 dager, areal 3 og 4 i løpet av 29 dager og areal 2 (kun topisk) i løpet av 32 dager. Fig. 3 (A-F) viser fotografier av den progressive heling av et kontrollhund B sår for dagene 3, 7, 10, 14, 18, 21, 24, 28 og 31.

Derfor viser den systemiske gruppe 3 og 4 en to dagers hurtigere helingshastighet, altså 6,4$ hurtigere enn kontrollene ).

Statisktisk analyse som ovenfor viser at dette er signifikant for de systemiske grupper (Gruppe 4 fra Fig. 2) i motsetning til kontrollen.

Ytterligere analyse av disse data viser systemisk behandling eller en kombinasjon av systemisk og topisk behandling med det omentale CMFr materiale som synes å øke sårlukningshastigheten, spesielt i 3. og 4. helingsuke sammenlignet med kontrollene. En økning opptil 124$ av den normale verdi ble oppnådd.

De midlere verdier for sårarealet i cm<2>(f. eks. oppnådd ved å opphøye kvadratrotverdiene i Tabell i annen potens) ble konvertert til logaritmisk form (dvs. logaritmen av sårarealet). Perioden for sårhelingsforsøket ble delt inn i 4 uker. Data for den første uken ble oppnådd fra dagene 1, 3 og 7, den annen uke fra dagene 7, 10 og 14, den tredje uke fra dagene 14, 18 og 21 og den fjerde uke fra dagene 21, 24 og 28. Sårarealet for dag 1 ble satt til 16 cm<2>som var størrelsen på det opprinnelige sår.

Sårlukningshastigheten ble bedømt fra hellingen som oppnås ved en lineær regresjon av logaritmen (sårarealet) som en funksjon av tiden (i dager). Korrelasjonskoeffisienter for hver regresjon var utmerket med verdier som i de fleste tilfeller lå fra 0,9500 til 0,998. Resultatene er vist i Tabell 7. De midlere hastigheter (dvs. fra summen av alle seter) for hver behandlingsgruppe (dvs. kontroll, topisk osv.) er også vist i Tabell 7 og plottet i Fig. 4. Denne figur inneholder også prosentual relativ økning eller reduksjon i de midlere sårlukningshastigheter for hver behandlingsgruppe som en funksjon av tiden.

Ved sammenligning av de systemiske 3. uke resultater mot kontrollen oppnås en statistisk signifikant p verdi på 0,089 (student T prøven). Ved sammenligning av de topiske og systemiske 3. uke resultater mot kontrollen oppnås det en statistisk signifikant p verdi på 0,0532. Det er vanskelig-ere å bevise signifikans for den 4. behandlingsuke pga. det stor standardavvik slik at man her stoler på middelverdien.

Når det gjelder topisk mot kontroll er p verdien 0,07 for den andre uke. Her sees det en virkelig reduksjon av sårhelingen og så en fordel for sårhelingen i den 3. uke.

Uventede resultater er at systemisk bruk av CMFr forbedrer epitelsårhelingstiden med hurtigere dannelse av arr som vist.

Omentalmaterialet kan benyttes fra forskjellige pattedyrkil-der ogsås, sammen eller i forskjellige kombinasjoner av fraksjoner. Denne sårhelingseffekt skal ikke strengt være begrenset til hunder men det er klart at den kan gjelde andre pattedyr også.

Omentalmateriale med HxCMFr eller CMFr kan også være brukbare i hudpleieprodukter for å fremme heling av kutt, skrap og sår.

Denne uventede aksellerasjon av epithelialiseringen bør øke graden av autologt hudpodings "opptak" og føre til hurtigere helbredelse av kirurgiske og andre hudsår.

Hudpodinger.

Veterinærlitteraturen antyder at kun ca. 20% av en fulltyk-kelses hudpoding vil overleve. Hudpodinger avhenger for overlevelse av utvikling av blodtilførsel og hvis denne kan forbedres kan øket overlevelse forventes. Prosentual overlevelse kan lett bestemmes ved å måle størrelsen av sårkanten før og etter heling. Enhver såroverflate i et areal med podingstap dekkes av hudkontraksjon som trekker inn kantene av det opprinnelige sår. To funn oppsto fra dette forsøk. For det første syntes det ikke å være noen signifikant differanse mellom gruppene. Det andre funn er sannsynligvis viktigere og indikerer en vid variasjon i prosentual overlevning av podinger mellom hunder i en enkelt gruppe. I kontrollsårene lå overlevelsen fra 98$ til 40$. Dette indikerer det enorme problem som må tas med i betraktning ved beskyttelse av podinger mot eksterne påvirk-ninger, bevegelse, friksjon mot bandasjer, selvskade fra hundenes side osv. Som et resultat skal negative resultater ikke direkte bevise at en angiogen respons ikke var tilstede (se Tabell 8).

Histopatologi .

Biopsiprøver ble oppnådd ved hudpunch biopsi for hvert sår på dagene 7, 14, 21 og 28. Alle prøver inkluderte originalhud, sårkant og regenererende vev. Prøvene ble fiksert i formal-dehyd, innleiret i parafin og flekket med hematoksylin og eosin. Hvert snitt ble bedømt for ny vevdannelse, fibro-plasiagrad og betennelsesgrad. Hver parameter ble gitt en bedømmelse på 1+ = mild, 2+ = moderat eller 3+ = alvorlig. Resultatene er tabellført i Tabell 9. Bedømmelsene var lavest i gruppen behandlet med triglycerider. Ingen for-skjeller ble sett i de andre tre behandlingsgrupper.

EKSEMPEL II

CMFr ble også funnet å ha en antibakteriell virkning som i den følgende prøve av Liberco Testing Inc., 123 Hawthorne Street, Roselle PArk, N.J. på felin CMFr:

Analysemetode:

U.S.P. XXI antimikrobiell preservativ effektivitet side 1151.

Bakteriene som ble benyttet i dette studium ble holdt som buljongkulturer og deretter dyrket på agarslanter. 0,1 ml av en 24 timers buljonkultur av prøvebakterien og 0,1 ml av 100 ml av en vasking av en agarslant ble tilsatt til 20 ml av prøven og godt blandet. Prøven ble lagret 1 romtemperatur i hele prøveperioden. Etter lagring I 2 dager, 1 uke, 2 uker, 3 uker og 4 uker ble en del av den inkuberte prøve fjernet og bragt på plate ved serlefortynningsmetoden. Bakteriene ble bragt på plate på tryptisk soyaagar med letheen og inkubert i 48 timer ved 35° C. Gjær og sopp ble bragt på plate på potetdekstrose agar med letheen og inkubert ved romtemperatur i 1 uke. Platene ble undersøkt for overlevere og prosentual reduksjon, mot det opprinnelige antall organismer som ble tilsatt, ble beregnet.

Samtidig med at denne prøve ble satt opp ble 0,1 ml av prøveorganismene tilsatt til 20 ml sterilt peptonvann. Dette ble umiddelbart bragt på plate for å bestemme antallet organismer som var tilsatt til prøven. Dette er kulturkon-trollen.

Claims (17)

1. Fremgangsmåte for forbedret sårepitelialisering hos pattedyr,karakterisert vedat den omfatter: å behandle epitelsår med farmakologisk aktive doser av pattedyr omentalfraksjoner i det vesentlige bestående av lipider.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at det farmakologiske aktive materialet ytterligere består av gangliocid.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at den farmakologisk aktive lipidfraksjon oppnås ved ekstrahering med minst et organisk oppløsningsmiddel.

4 . Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisertved at ekstraheringen er en kloroform-metanolekstraher-ing.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisertved at den farmakologisk aktive lipidfraksjon er en heksanekstrakt av kloroform-metanolfraksjonen.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at den farmakologisk aktive lipidfraksjon er en superkritisk gassekstrakt av omentum.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at fraksjonene påføres topisk.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at fraksjonene påføres systemisk.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at fraksjonene påføres systemisk og topisk.

10. Fremgangsmåte Ifølge krav 1 for behandling av autologers hudpodinger.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at den videre omfatter en antibakteriell og/eller fungicid effekt.

12. Preparat fra pattedyr omentum,karakterisertved at det består i det vesentlige av isolerte gangliosider og lipider for øket sårheling og epitelialisering.

13. Preparat ifølge krav 12,karakterisert ved at det i det vesentlige består av lipider.

14. Preparat ifølge krav 12,karakterisert vedat det i det vesentlige består av gangliosid.

15. Preparat Ifølge krav 12,karakterisert vedat det i det vesentlige består av triglyserider.

16. Fremgangsmåte for in vitro behandling av vev eller organer fra pattedyr,karakterisert vedat den omfatter å bruke fysiologisk aktive mengder av blandinger av omentum avledede isolerte lipid- og gangliosidmaterialer i mengder tilstrekkelig til å tilveiebringe forbedret vascularisering og/eller epitelialisering i vevet eller organet.

17. Fremgangsmåte for fremstilling av angiogene aktive lipidmat-erialer fra omentum ved bruk ved forbedret sårheling og epitelialisering hos pattedyr,karakterisertved at den omfatter å ekstrahere pattedyromental vev med et oppløsningsmiddel omfattende minst et organisk oppløsning-smiddel for å oppnå angiogent aktivt lipid- og/eller ganglio-sidmateriale som kan benyttes for forbedret sårheling og epitelialisering.