NO871737L - RECOMBINANT VIRUS. - Google Patents
RECOMBINANT VIRUS.Info
- Publication number
- NO871737L NO871737L NO871737A NO871737A NO871737L NO 871737 L NO871737 L NO 871737L NO 871737 A NO871737 A NO 871737A NO 871737 A NO871737 A NO 871737A NO 871737 L NO871737 L NO 871737L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- virus
- polypeptide
- antigen
- recombinant
- vaccinia virus
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 49
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 72
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 66
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 65
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 claims description 40
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 claims description 40
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 34
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 26
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 claims description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 18
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 17
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 16
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 14
- 206010035500 Plasmodium falciparum infection Diseases 0.000 claims description 13
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 5
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 claims description 5
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 claims description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 4
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 claims description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 4
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 2
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 68
- 101710137302 Surface antigen S Proteins 0.000 description 67
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 17
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 13
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 9
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 9
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- KQPKMEYBZUPZGK-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-azido-2-nitroanilino)methyl]-5-(hydroxymethyl)-2-methylpyridin-3-ol Chemical group CC1=NC=C(CO)C(CNC=2C(=CC(=CC=2)N=[N+]=[N-])[N+]([O-])=O)=C1O KQPKMEYBZUPZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 5
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 5
- 101001111984 Homo sapiens N-acylneuraminate-9-phosphatase Proteins 0.000 description 5
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 5
- 102100023906 N-acylneuraminate-9-phosphatase Human genes 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 3
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 101150065425 7.5K gene Proteins 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 101710193484 S-antigen protein Proteins 0.000 description 2
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 102100022717 Atypical chemokine receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710117490 Circumsporozoite protein Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000002476 Falciparum Malaria Diseases 0.000 description 1
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 101000678879 Homo sapiens Atypical chemokine receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101100321817 Human parvovirus B19 (strain HV) 7.5K gene Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100268078 Mus musculus Zbtb24 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100335694 Oryza sativa subsp. japonica G1L6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 201000011336 Plasmodium falciparum malaria Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 101900176279 Vaccinia virus Surface antigen S Proteins 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] dihydroxyphosphoryl hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)O[32P](O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 101150026451 csp gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012973 diazabicyclooctane Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 150000004678 hydrides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical class N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000001563 schizont Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002195 soluble material Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- IMNIMPAHZVJRPE-UHFFFAOYSA-N triethylenediamine Chemical compound C1CN2CCN1CC2 IMNIMPAHZVJRPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
REKOMBINANT VIRUSRECOMBINANT VIRUS
Oppfinnelsen vedrører et rekombinant virus og vedrører spesielt et rekombinant vaccinia-virus som er blitt modifisert til å optimalisere immunogenisiteten av fremmede immunogene polypeptider uttrykt derved. The invention relates to a recombinant virus and in particular relates to a recombinant vaccinia virus which has been modified to optimize the immunogenicity of foreign immunogenic polypeptides expressed thereby.
Betegnelsen "rekombinant virus" som anvendt i denne fremstilling betegner infektivt virus som er blitt genetisk modifisert ved innlemmelse av fremmede gener eller genetisk material i virusgenomet. Det modifiserte virus uttrykker da det fremmede gen i form av et "fremmed" polypeptid ved infeksjon av en celle med det rekombinante virus. Betegnelsen "rekombinant vaccinia-virus" har en tilsvarende betydning. The term "recombinant virus" as used in this preparation denotes infectious virus which has been genetically modified by the incorporation of foreign genes or genetic material into the viral genome. The modified virus then expresses the foreign gene in the form of a "foreign" polypeptide upon infection of a cell with the recombinant virus. The term "recombinant vaccinia virus" has a similar meaning.
Siden utviklingen av metoder for uttrykking av fremmede gener i infektivt vaccinica-virus (Mackett et al, 1982; Panicali og Paoletti, 1982) er levende rekombinante vaccinia-virus Since the development of methods for the expression of foreign genes in infectious vaccinia virus (Mackett et al, 1982; Panicali and Paoletti, 1982) live recombinant vaccinia viruses
blitt påvist å ha et stort potensial ved immunisering av dyr mot infeksjon med andre mer skadelige virus. Dette er blitt oppnådd ved å isolere genet for target antigener for vertbeskyttende immunresponser og integrere dem under styring av vaccinica-virus-promoter elementer i' vaccinia-virus genomet. I mange henseender er det fremmede virale antigen som nå uttrykkes av vaccinia-viruset i en nær normal situasjon og dets behandling, modifisering, transport og endelige lokali-sering på overflaten av den infiserte celle kan være meget lignende tilsvarende i en normal infeksjon. Det er derfor ikke overraskende at når herpes simplex glykoprotein D (Paoletti et al., 1984,; Cremer et al., 1985), hepatitis B overflateantigen (Smith et al., 1983; Moss et al., 1984), vesikulaer stomatitis virus glykoprotein G, og influensa virus hemagglutinin (Smith et al., 1983; Panicali et al., 1983) gener innføres i rekombinante vaccinia-virus, kan levende rekombinante virus anvendes for immunisering av dyr mot infeksjon. have been shown to have great potential in immunizing animals against infection with other more harmful viruses. This has been achieved by isolating the genes for target antigens for host protective immune responses and integrating them under the control of vaccinia virus promoter elements into the vaccinia virus genome. In many respects, the foreign viral antigen now expressed by the vaccinia virus is in a near normal situation and its processing, modification, transport and final localization on the surface of the infected cell may be very similar to that in a normal infection. It is therefore not surprising that when herpes simplex glycoprotein D (Paoletti et al., 1984; Cremer et al., 1985), hepatitis B surface antigen (Smith et al., 1983; Moss et al., 1984), stomatitis virus vesicles glycoprotein G, and influenza virus hemagglutinin (Smith et al., 1983; Panicali et al., 1983) genes are introduced into recombinant vaccinia viruses, live recombinant viruses can be used to immunize animals against infection.
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer ved et aspekt et rekombinant virus,karakterisert vedat det inkluderer en kodingssekvens for et hybrid polypeptid, idet det hybride polypeptid omfatter i det minste et immunogent polypeptid-segment som er fremmed for viruset eller virusinfiserte celler i assosiasjon med et overflate- eller membran-assosiert polypeptidsegment for å lokalisere det nevnte hybride polypeptid på eller ved overflaten av virusinfiserte celler. The present invention provides in one aspect a recombinant virus, characterized in that it includes a coding sequence for a hybrid polypeptide, the hybrid polypeptide comprising at least one immunogenic polypeptide segment that is foreign to the virus or virus-infected cells in association with a surface or membrane-associated polypeptide segment to localize said hybrid polypeptide on or at the surface of virus-infected cells.
Ved et spesielt aspekt tilveiebringer denne oppfinnelse et rekombinant vaccinia-virus,karakterisert vedat det inkluderer en kodingssekvens for et hybrid polypeptid, idet det hybride polypeptid omfatter i det minste et immunogent polypeptidsegment som er fremmed for vaccinia-virus eller vaccinia-virus-infiserte celler, i assosiasjon med et overflate- eller membran-assosiert polypeptidsegment til å lokalisere det nevnte hybride polypeptid på eller ved overflaten av vaccinia-virus-infiserte celler. In a particular aspect, this invention provides a recombinant vaccinia virus, characterized in that it includes a coding sequence for a hybrid polypeptide, the hybrid polypeptide comprising at least an immunogenic polypeptide segment that is foreign to vaccinia virus or vaccinia virus-infected cells, in association with a surface or membrane-associated polypeptide segment to localize said hybrid polypeptide on or at the surface of vaccinia virus-infected cells.
Ved et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et DNA-molekyl omfattende en kodingssekvens for et hydrid polypeptid, idet det hybride polypeptid omfatter i det minste et immunogent polypeptidsegment som er fremmed for vaccinia-virus eller vaccinia-virus-infiserte celler i assosiasjon med et overflate- eller membran-assosiert polypeptidsegment til å lokalisere det hybride polypeptid på eller ved overflaten av vaccinia-virus-infiserte celler. In a further aspect, the invention provides a DNA molecule comprising a coding sequence for a hydride polypeptide, the hybrid polypeptide comprising at least one immunogenic polypeptide segment that is foreign to vaccinia virus or vaccinia virus-infected cells in association with a surface or membrane-associated polypeptide segment to localize the hybrid polypeptide on or at the surface of vaccinia virus-infected cells.
Ved enda et ytterligere aspekt tilveiebringes et hybrid polypeptid omfattende i det minste et immunogent polypeptidsegment som er fremmed for vaccinia-virus eller vaccinia-virus-inf iserte celler i assosiasjon med et overflate- eller membran-assosiert polypeptidsegment til å lokalisere det nevnte hybride polypeptid på eller ved overflaten av vaccinia-virus-infiserte celler. In yet another aspect, a hybrid polypeptide comprising at least an immunogenic polypeptide segment foreign to vaccinia virus or vaccinia virus-infected cells in association with a surface or membrane-associated polypeptide segment is provided to localize said hybrid polypeptide on or at the surface of vaccinia virus-infected cells.
Den foreliggende oppfinnelse illustreres som et eksempel ved uttrykking av et hybrid polypeptid basert på det utskilte repetitive plasmodiale antigen (S-antigenet) i et rekombinant vaccinia-virus. The present invention is illustrated as an example by expressing a hybrid polypeptide based on the secreted repetitive plasmodial antigen (S-antigen) in a recombinant vaccinia virus.
Genene for et stort antall aseksuelle blodtrinns antigener av Plasmodium falciparum er blitt isolert og sekvensbestemt i håp om å identifisere vertbeskyttende antigener (Kemp et al., 1983). Et antall av disse antigengener er blitt uttrykt i rekombinante vaccinia-virus. Effektiv immunisering kan i mange tilfeller avhenge av at det fremmede antigen uttrykkes korrekt på overflaten av den virusinfiserte celle. Over-flateproteiner i forholdsvis kompliserte organismer som f.eks. protozoa-parasitter vil da ikke kunne finne sin vei til overflaten når de relevante gener innføres i mammalceller. F.eks. må P.falciparum proteiner lokalisert i mem-branen av vert-erythrocyten gjennomgå en ganske komplisert bane gjennom membranene av parasitt-vacuolen før de når denne endelige bestemmelse, og denne vei er ikke forstått. The genes for a large number of asexual blood stage antigens of Plasmodium falciparum have been isolated and sequenced in the hope of identifying host protective antigens (Kemp et al., 1983). A number of these antigenic genes have been expressed in recombinant vaccinia viruses. Effective immunization can in many cases depend on the foreign antigen being correctly expressed on the surface of the virus-infected cell. Surface proteins in relatively complicated organisms such as e.g. protozoa parasites will then not be able to find their way to the surface when the relevant genes are introduced into mammalian cells. E.g. must P.falciparum proteins located in the membrane of the host erythrocyte undergo a rather complicated path through the membranes of the parasite vacuole before reaching this final destination, and this pathway is not understood.
S-antigen proteinene i Plasmodium falciparum utskilles av parasitten i det rom som separerer den begrensende membran av de delende parasitter og den indre membran av den røde blodcelle som initialt dannes under invagineringsprosessen som følger med parasittinvasjonen i den røde blodcelle og som deretter utvikles under parasittveksten. Immunogull-elektro-mikroskopering indikerer at dette rom, kjent som parasitt-vacuolen, fylles med S-antigen kort før bruddet av den modne schizont. Sekvensen av gener for to av disse S-antigenmolekyler (Cowman et al., 1984) indikerer nærvær av et kort område ved 5' enden av genet som ville kode for et hydrofobt signalpeptid, men ingen andre signifikante områder med hydrofobe egenskaper i resten av genet, i samsvar med denne karakterisering som et utskilt protein. Disse signaler blir gjenkjent nøyaktig når dette protein uttrykkes i vaccinia-virus-infiserte mammalceller i in vitro kultur. The S-antigen proteins in Plasmodium falciparum are secreted by the parasite in the space that separates the limiting membrane of the dividing parasites and the inner membrane of the red blood cell which is initially formed during the invagination process that accompanies the parasite invasion of the red blood cell and which then develops during parasite growth. Immunogold electromicroscopy indicates that this compartment, known as the parasite vacuole, fills with S antigen shortly before rupture of the mature schizont. The sequence of genes for two of these S-antigen molecules (Cowman et al., 1984) indicates the presence of a short region at the 5' end of the gene that would code for a hydrophobic signal peptide, but no other significant regions of hydrophobic properties in the rest of the gene , consistent with this characterization as a secreted protein. These signals are recognized accurately when this protein is expressed in vaccinia virus-infected mammalian cells in in vitro culture.
Et primært mål for det arbeid som førte til den foreliggende oppfinnelse var å undersøke bruken av det levende rekombinante vaksinevirus ved tilførsel av plasmodiale blodtrinns-antigener for immunisering av dyr og å sammenligne immun-responsene med dem som oppnås under anvendelse av peptider utviklet ved rekombinante DNA metoder eller ved kjemisk syntese. En teoretisk fordel med metoden med levende viral til-førsel er at den bedre vil stimulere den cellulære gren av immunsystemet som kan være av største viktighet ved effek-tiviteten av antiparasitt-vaksiner. A primary objective of the work leading to the present invention was to investigate the use of the live recombinant vaccine virus in the delivery of plasmodial blood stage antigens for the immunization of animals and to compare the immune responses with those obtained using peptides developed by recombinant DNA methods or by chemical synthesis. A theoretical advantage of the method of live viral delivery is that it will better stimulate the cellular branch of the immune system, which can be of the greatest importance in the effectiveness of anti-parasite vaccines.
Antistoff-responser til det utskilte S-antigen uttrykt av rekombinant vaccinia-virus i infiserte kaniner og mus er små. I begge tilfeller topper antistoff-innholdet tidlig etter infeksjon og svinner hurtig. Disse responser forsterkes ikke ved utfordring med enten en annen immunisering med rekombinant virus eller med kjemisk syntetiserte concatamerer av det II aminosyre-repeterende polypeptid i vandig oppløsning. Forsterkning med S-antigen |3-galaktosidase-fusjonert polypeptid i FCA resulterer ikke alltid i en større anti S-antigen-respons enn den som sees ved immunisering av native mus med en primær injeksjon av dette fusjonerte polypeptid. Det er imidlertid funnet at addisjon av et transmembran-domene for-bedrer immunogenisiteten av vaccinia S-antigen rekombinanten slik at viktigheten ved presentasjon på overflaten av den virus-infiserte celle indikeres. Antibody responses to the secreted S antigen expressed by recombinant vaccinia virus in infected rabbits and mice are small. In both cases, the antibody content peaks early after infection and declines rapidly. These responses are not enhanced by challenge with either another immunization with recombinant virus or with chemically synthesized concatamers of the II amino acid repeating polypeptide in aqueous solution. Boosting with S-antigen β-galactosidase-fused polypeptide in FCA does not always result in a greater anti-S-antigen response than that seen when immunizing native mice with a primary injection of this fused polypeptide. However, it has been found that addition of a transmembrane domain improves the immunogenicity of the vaccinia S antigen recombinant so that the importance of presentation on the surface of the virus-infected cell is indicated.
Resultatene av dette arbeid med S-antigenet antyder den gene-relle metode hvor et fremmed, ikke-overflate immunogent polypeptid assosieres med overflaten av vaccinia-infiserte celler som et hybrid molekyl. I det foreliggende tilfellet har muse-immunoglobulin-genet vært anvendt for å tilveiebringe de sekvenser som er nødvendig for uttrykking av det immunogene polypeptid på den infiserte celleoverflate. Andre overflate-antigenmolekyler som kan effektivt uttrykkes på overflaten av vaccinia-infiserte celler kunne imidlertid like godt bli anvendt for å tilveiebringe disse sekvenser. Ideelle kandidatmolekyler ville f.eks. inkludere et vacci nia-virus overflateprotein eller innførte antigener som HBSAg. The results of this work with the S antigen suggest the general method whereby a foreign, non-surface immunogenic polypeptide associates with the surface of vaccinia-infected cells as a hybrid molecule. In the present case, the mouse immunoglobulin gene has been used to provide the sequences necessary for expression of the immunogenic polypeptide on the infected cell surface. However, other surface antigen molecules that can be efficiently expressed on the surface of vaccinia-infected cells could equally well be used to provide these sequences. Ideal candidate molecules would e.g. include a vaccinia virus surface protein or introduced antigens such as HBSAg.
Ytterligere egenskaper og trekk ved oppfinnelsen er beskrevet i de etterfølgende eksempler og de vedføyde tegninger som fremlegges for illustrering og ikke på noen skal ansees som begrensende for rammen av den foreliggende oppfinnelse. Further properties and features of the invention are described in the following examples and the attached drawings which are presented for illustration and in no way should be considered as limiting the scope of the present invention.
EKSEMPEL 1EXAMPLE 1
Fig. 1 illustrerer konstruksjonen av transfeksjonsplasmider inneholdende det deleterte S-antigen-gen av FCQ27/PNG (FC27) isolat av P.falciparum. (a) viser strukturen av den genomiske kopi av FC27 S-antigen-genet med sekvenser som koder for et signalpeptid (mørk skyggelegging) og omtrent 100 kopier av den 11 aminosyre-repeterende peptidsekvens vist under genet. (b) viser det 4000bp genomiske subklon FC27.4.S beskrevet av Cowman et al. (1984) inneholdende alle ikke-repeterende sekvenser av S-antigen-genet, men bare 13 kopier av repeteringssekvensen som skyldes spontane delesjoner som opptrådte under kloning i E.coli. Dette DNA ble spaltet ved Ahalll restrik-sjons-endonuklease seter 40 basepar 5' og 35 basepar 3' til kodingsområdet av genet. Etter addisjon av EcoRI linkere ble dette fragment klonet inn i det unike EcoRI restriksjonssete av pGS62 (se forsøksprosedyrene) til å gi plasmidet pV8. Ved denne konstruksjon er S-antigen-genet lokalisert umiddelbart nedstrøms fra vaccinia-virus 7.5K genpromoteren og er flankert på begge sider med vaccinia-virus TK gensekvenser som vist ved (c). Ved en separat kloning beskrevet detaljert i fig. 4 og forsøksprosedyre ble et hybrid S-antigen-gen inneholdende en immunoglobulin-transmembransekvens (skravert) og intracellulært domene (punktert) konstruert fra pV8 til å generere plasmidet pVA20 som er vist delvis i (d) . Fig. 2 er en Western avtrykksanalyse av S-antigen fremstilt av BSC1 celler infisert med det rekombinante vaccinia-virus V8 (spor 2 og 3) sammenlignet med avtrykket frembragt av E.coli under kontroll av pUC9 |9-galaktosidase-promoter (spor 1). Sporene 2 og 3 viser de relative mengder av S-antigen assosiert med de virus-infiserte celler og dyrkingsmediet 48 timer etter infeksjon. Dyrkingsmediet ble sentrifugert ved 12,000 g i 3 minutter før analyse. Filtere var forsynt med gensøker med et kanin-antisera som gjenkjenner bare den 11 aminosyre-repeterende del av S-antigenet. Fig. 3 viser tidsforløpet for syntese og utskilling av S-antigen i vaccinia-infiserte BSC1 celle-monolag. Celler ble infisert i 1 time med lpfu/celle. Ved dette tidspunkt ble Fig. 1 illustrates the construction of transfection plasmids containing the deleted S-antigen gene of the FCQ27/PNG (FC27) isolate of P.falciparum. (a) shows the structure of the genomic copy of the FC27 S-antigen gene with sequences encoding a signal peptide (dark shading) and approximately 100 copies of the 11 amino acid repeat peptide sequence shown below the gene. (b) shows the 4000bp genomic subclone FC27.4.S described by Cowman et al. (1984) containing all non-repetitive sequences of the S-antigen gene, but only 13 copies of the repetitive sequence due to spontaneous deletions that occurred during cloning in E.coli. This DNA was cleaved by AhalII restriction endonuclease sites 40 base pairs 5' and 35 base pairs 3' to the coding region of the gene. After addition of EcoRI linkers, this fragment was cloned into the unique EcoRI restriction site of pGS62 (see Experimental Procedures) to give plasmid pV8. In this construct, the S antigen gene is located immediately downstream of the vaccinia virus 7.5K gene promoter and is flanked on both sides by vaccinia virus TK gene sequences as shown at (c). In a separate cloning described in detail in fig. 4 and experimental procedure, a hybrid S-antigen gene containing an immunoglobulin transmembrane sequence (shaded) and intracellular domain (dotted) was constructed from pV8 to generate the plasmid pVA20 shown in part in (d). Fig. 2 is a Western blot analysis of S-antigen produced by BSC1 cells infected with the recombinant vaccinia virus V8 (lanes 2 and 3) compared to the imprint produced by E.coli under the control of the pUC9 |9-galactosidase promoter (lane 1 ). Lanes 2 and 3 show the relative amounts of S antigen associated with the virus-infected cells and the culture medium 48 hours after infection. The culture medium was centrifuged at 12,000 g for 3 minutes before analysis. Filters were probed with a rabbit antisera that recognizes only the 11 amino acid repeating portion of the S antigen. Fig. 3 shows the time course for synthesis and secretion of S-antigen in vaccinia-infected BSC1 cell monolayers. Cells were infected for 1 hour with lpfu/cell. At this point was
inoculatet fjernet og friskt medium ble tilsatt. En prøve av dyrkingsmediet ble tatt ved forskjellige tidspunkt etter infeksjon og underkastet sentrifugering ved 12,000 g i 3 minutter. Supernatenten fra denne sentrifugering ble tatt ut for analyse. De resterende celler og medium ble skrapet fra skålene og kvantitativt overført til et friskt rør. Etter ultralyd-behandling ble det tatt en prøve som ble oppløst i SDS-prøvebuffer for analyse med SDS/PAGE. Like fraksjoner av hver prøve ble analysert. Filtere var forsynt med gensøker med et kanin-antisera som spesifikt gjenkjente den 11 aminosyre repetisjon av S-antigenet. the inoculum was removed and fresh medium was added. A sample of the culture medium was taken at various time points after infection and subjected to centrifugation at 12,000 g for 3 minutes. The supernatant from this centrifugation was taken out for analysis. The remaining cells and medium were scraped from the dishes and quantitatively transferred to a fresh tube. After ultrasound treatment, a sample was taken which was dissolved in SDS sample buffer for analysis with SDS/PAGE. Equal fractions of each sample were analyzed. Filters were probed with a rabbit antisera that specifically recognized the 11 amino acid repeat of the S antigen.
Fig. 4 er en skjematisk fremstilling av trinnene anvendt ved subkloningen av musemembran IgG transmembransekvensen inn i Sphl setet ved 3' enden av FC27 S-antigen-genet. Et 186bp Haelll fragment som koder for det transmembrane intracellulære området og en del av "hengselområdet" ble isolert fra yl cDNA klonen beskrevet av Tyler et al., 1982. Sphl linker DNA ble tilsatt endene av dette fragment som etter Sphl behandling ble klonet inn i Sphl setet av S-antigen klonen pFC27 Aha2 for å utvikle den nye klon pA20. EcoRI fragment-ene fra disse plasmider inneholdende S-antigen-genet ble så klonet inn i EcoRI kloningssetét av vektoren pGS62 (se fig. Fig. 4 is a schematic representation of the steps used in the subcloning of the mouse membrane IgG transmembrane sequence into the Sphl site at the 3' end of the FC27 S-antigen gene. A 186bp Haelll fragment encoding the transmembrane intracellular region and part of the "hinge region" was isolated from the yl cDNA clone described by Tyler et al., 1982. Sphl linker DNA was added to the ends of this fragment which, after Sphl treatment, was cloned into Sphl site of the S-antigen clone pFC27 Aha2 to develop the new clone pA20. The EcoRI fragments from these plasmids containing the S-antigen gene were then cloned into the EcoRI cloning site of the vector pGS62 (see fig.
1) til å utvikle plasmidene pV8 henholdsvis pVA20. Sekvensen ved forbindelsesstedet mellom S-antigen-genet og immunoglobulingenet er vist nederst og indikerer den nye aminosyresekvens ved forbindelsesstedet. Aminosyrene alanin og prolin, indikert med en stjerne, er ikke tilstede i noen av de parentale proteiner ettersom de utvikles av Sphl linker DNA sekvensene. Seks aminosyrer i det ekstracellulære domene av immunoglobulingenet er tilstede i det nye hybride protein. Fig. 5 viser at S-antigenet som frembringes av celler infisert med det VA20 rekombinante virus ikke lenger utskilles. Prøver av infiserte celler og dyrkingsmedium ble samlet som beskrevet i fig. 3 48 timer etter infeksjon med enten V8 eller VA20 rekombinant virus med lpfu/celle. Den totale mengde av S-antigen viser seg å forbli den samme selv om meget lite utskilles i mediet i tilfellet av VA20 infiserte celler. Western-prøver ble foretatt med et kanin anti-FC27 S-antigen repetert antisera. Fig. 6: BSC-1 celler infisert i 48 timer med enten det V8 eller VA20 rekombinante virus ble gjort oppløselig i 0,05%Triton X114 i 1 time ved 4°c.Uoppløselig material og kjerner ble fjernet ved hjelp av sentrifugering med lav has-tighet. Ved å heve temperaturen til 37°C separerte en uklar suspensjon av uoppløselige Triton X114 miceller ved sentrifugering ved 37°C og hver fraksjon ble renset på nytt ved hjelp av en ytterligere syklus med Triton X114 fordeling. S-antigenet tilstede i detergent og vandig fase ble bestemt ved hjelp av Western-avtrykksanalyse under anvendelse av kanin anti-repetert antisera (R210). Fig. 7 viser indirekte immunofluoresCens av BSG1 celler in-, fisert 18 timer tidligere med rekombinant virus VA20 (A og C) eller V8 (B og D). Celler ble enten fiksert før farging (A og B) for å permeabilisere cellene og tillate deteksjon av intracellulært S-antigen eller fiksert etter farging for å 1) to develop the plasmids pV8 and pVA20 respectively. The sequence at the junction between the S-antigen gene and the immunoglobulin gene is shown at the bottom and indicates the new amino acid sequence at the junction. The amino acids alanine and proline, indicated by an asterisk, are not present in any of the parental proteins as they are developed by the Sphl linker DNA sequences. Six amino acids in the extracellular domain of the immunoglobulin gene are present in the new hybrid protein. Fig. 5 shows that the S-antigen produced by cells infected with the VA20 recombinant virus is no longer secreted. Samples of infected cells and culture medium were collected as described in Fig. 3 48 hours after infection with either V8 or VA20 recombinant virus with lpfu/cell. The total amount of S antigen is found to remain the same although very little is secreted into the medium in the case of VA20 infected cells. Western blots were performed with a rabbit anti-FC27 S antigen repeated antisera. Fig. 6: BSC-1 cells infected for 48 hours with either the V8 or VA20 recombinant virus were solubilized in 0.05% Triton X114 for 1 hour at 4°C. Insoluble material and nuclei were removed by centrifugation at low haste. Raising the temperature to 37°C separated a cloudy suspension of insoluble Triton X114 micelles by centrifugation at 37°C and each fraction was purified again by a further cycle of Triton X114 partitioning. The S antigen present in detergent and aqueous phase was determined by Western blot analysis using rabbit anti-repeat antisera (R210). Fig. 7 shows indirect immunofluorescence of BSG1 cells infected 18 hours earlier with recombinant virus VA20 (A and C) or V8 (B and D). Cells were either fixed before staining (A and B) to permeabilize the cells and allow detection of intracellular S antigen or fixed after staining to
detektere S-antigen lokalisert på overflaten av de infiserte celler (C og D). detect S-antigen located on the surface of the infected cells (C and D).
Fikseringen ble foretatt med iskold 95% etanol, 5% eddiksyre. Kanin 210 antisera med 1:500 fortynning ble anvendt for loka-lisering av S-antigenet. Et FITC-konjugert geit-anti-kanin-konjugat ble så anvendt som det annet antistoff før anbring-elsen i glycerol inneholdende det fluorescente stabilise-ringsmiddel DABCO. Celler ble fotografert under UV-belysning og olje-neddykning. Forstørrelse X400. Fig. 8 viser antistoff-innholdene i muse-sera assaybedømt 3 uker etter en enkel IP-immuniseriag med 1x10 7 PFU av V8 eller VA20 rekombinant virus. Mikrotiterskåler med nitti-seks brønner ble belagt med et FC27 S-antigen repetert//^-galaktosidase fusjonspolypeptid-preparat ved en forut bestemt optimal konsentrasjon på 3 ^,ug/ml. Preimmune sera ble seriefortynnet for å bestemme den fortynning hvor halv maksi-mal absorpsjon ble oppnådd. Disse verdier avsettes for både iBALB/c.H-2 og 129/J stammer av de anvendte mus. Fig. 9 er en avsetning av absorpsjonsverdiene oppnådd ved en typisk ELISA-assaybestemmelse av kanin-antisera tatt en til The fixation was carried out with ice-cold 95% ethanol, 5% acetic acid. Rabbit 210 antisera with 1:500 dilution was used for localization of the S antigen. An FITC-conjugated goat anti-rabbit conjugate was then used as the second antibody prior to mounting in glycerol containing the fluorescent stabilizer DABCO. Cells were photographed under UV illumination and oil immersion. Magnification X400. Fig. 8 shows the antibody contents in mouse sera assayed 3 weeks after a single IP immunization series with 1x10 7 PFU of V8 or VA20 recombinant virus. Ninety-six well microtiter plates were coated with an FC27 S-antigen repeat//^-galactosidase fusion polypeptide preparation at a predetermined optimal concentration of 3 µg/ml. Preimmune sera were serially diluted to determine the dilution at which half maximal absorption was achieved. These values are set for both iBALB/c.H-2 and 129/J strains of the mice used. Fig. 9 is a plot of the absorption values obtained by a typical ELISA assay determination of rabbit antisera taken one to
g g
fem uker etter en enkel ID injeksjon av 10 PFU av levende rekombinant virus VA20. Sera ble assaybestemt for både anti S-antigen-antistoffene som beskrevet i fig. 8 med en standard fortynning på 1:320 av sera (prikket linje) og for anti-vaccinia-antistoffer under anvendelse av plater belagt med BPL inaktivert vaccinia-virus med en standard fortynning på 1:2580 av serumet (heltrukne linjer). (B) viser absorpsjonsverdiene oppnådd ved ELISA-assaybedømmelse hvor individuelle kanin-antisera ble assaybestemt for anti S-antigen-antistoffer to uker etter intradermal immunisering med 10 g PFU av rekombinant virus V8 (prikkede linjer) eller VA20 (heltrukne linjer). five weeks after a single ID injection of 10 PFU of live recombinant virus VA20. Sera were assayed for both the anti S-antigen antibodies as described in fig. 8 with a standard dilution of 1:320 of the sera (dotted line) and for anti-vaccinia antibodies using plates coated with BPL inactivated vaccinia virus with a standard dilution of 1:2580 of the serum (solid lines). (B) shows the absorbance values obtained by ELISA assay assessment where individual rabbit antisera were assayed for anti S-antigen antibodies two weeks after intradermal immunization with 10 g PFU of recombinant virus V8 (dotted lines) or VA20 (solid lines).
ForsøksprosedyrerTrial procedures
Plasmidkonstruksjoner. 880bp Ahalll fragment inneholdende en deletert versjon av FC27 S-antigen-genet ble isolert fra den genomiske EcoRI klon FC27.4.S beskrevet av Cowman et al., Plasmid constructs. 880bp AhalII fragment containing a deleted version of the FC27 S antigen gene was isolated from the genomic EcoRI clone FC27.4.S described by Cowman et al.,
(1984). EcoRI linkere ble tilsatt før kloning av dette fragment inn i pUC9. Denne 880bp subklon (pFC27 Aha2) kodet for den fullstendige 3' ende av S-antigenet inkluderende den 23 aminosyre hydrofobe signalsekvens og den 68 aminosyre bevarte aminoterminus, 13 kopier av det 11 aminosyre-repeterende peptid hvorav det anslås at det er 100 kopier i de udeleterte protein, og den fullstendige 35 aminosyre-sekvens i den bevarte karboksy-terminale ende av molekylet. Likeledes var det 40 og 35 basepar av 5' henholdsvis 31 ikke-kodende flan-kerende DNA. Dette 880bp EcoRI fragment ble så klonet inn i det eneste EcoRI kloningssete i vaccinia-transfeksjonsvektor-en pGS62 som ble konstruert ved delesjon av en av EcoRI res-triksjonsenzym-setene i vektoren pGS20 beskrevet av Mackett et al., (1984). (1984). EcoRI linkers were added before cloning this fragment into pUC9. This 880bp subclone (pFC27 Aha2) encoded the complete 3' end of the S antigen including the 23 amino acid hydrophobic signal sequence and the 68 amino acid conserved amino terminus, 13 copies of the 11 amino acid repeating peptide of which there are estimated to be 100 copies in the undeleted protein, and the complete 35 amino acid sequence in the conserved carboxy-terminal end of the molecule. Likewise, there were 40 and 35 base pairs of 5' and 31 non-coding flanking DNA, respectively. This 880bp EcoRI fragment was then cloned into the single EcoRI cloning site in the vaccinia transfection vector pGS62 which was constructed by deletion of one of the EcoRI restriction enzyme sites in the vector pGS20 described by Mackett et al., (1984).
Rekombinanter ble selektert hvori S-antigen-genet ble innført i den korrekte orientering 3' til vaccinia 7.5K protein tidlig genpromoter og flankert på hver side av 5' og 3<1>endene av vaccinia-virus TK gensekvenser av plasmidvektoren. Denne nye konstruksjon, pV8, ble anvendt for transfeksjon av CV1 celler infisert med vill type vaccinia-virus som dannet det rekombinante vaccinia-virus V8, inneholdende S-antigen-genet. Recombinants were selected in which the S-antigen gene was inserted in the correct orientation 3' to the vaccinia 7.5K protein early gene promoter and flanked on either side by the 5' and 3<1> ends of the vaccinia virus TK gene sequences of the plasmid vector. This new construct, pV8, was used for transfection of CV1 cells infected with wild-type vaccinia virus producing the recombinant vaccinia virus V8, containing the S-antigen gene.
Addisjon av musemembran immunoglobulin- transmembransekvensen til S- antigen- genet. 186bp Haelll fragment inneholdende sekvenser som koder for seks aminosyrer i hengselområdet, 26 aminosyrer i transmembran-domenet og 28 aminosyrer i det intracellulære domene av muse IgG, immunoglobulin isolert fra yl cDNA klonen beskrevet av Tyler et al., (1982). Sphl linker DNA med sekvensen 5'-CCGCATGCGG-3' ble så ligert til Haelll fragmentet, kuttet med Sphl og klonet inn i det eneste Sphl sete lokert 65bp fra 3' enden av S-antigen-genet i sub- Addition of the mouse membrane immunoglobulin transmembrane sequence to the S antigen gene. 186bp Haelll fragment containing sequences coding for six amino acids in the hinge region, 26 amino acids in the transmembrane domain and 28 amino acids in the intracellular domain of mouse IgG, immunoglobulin isolated from the yl cDNA clone described by Tyler et al., (1982). Sphl linker DNA with the sequence 5'-CCGCATGCGG-3' was then ligated to the Haelll fragment, cut with Sphl and cloned into the single Sphl site located 65bp from the 3' end of the S-antigen gene in the sub-
klonen pFC27 Aha2.the clone pFC27 Aha2.
Den resulterende klon pA20 inneholdende det innskutte Sphl fragment i den korrekte orientering i forhold til S-antigen-genet, ble så kuttet med EcoRI og ~*1080bp fragmentet ble klonet i den riktige orientering inn i EcoRI setet av pGs62 vektoren beskrevet i det foregående til å plasmidet pVA20. Dette plasmid DNA ble anvendt for transfeksjon av vaccinia-infiserte CV1 celler for å frembringe det rekombinante vaccinia-virus VA20. The resulting clone pA20 containing the inserted Sphl fragment in the correct orientation relative to the S-antigen gene was then cut with EcoRI and the ~*1080bp fragment was cloned in the correct orientation into the EcoRI site of the pGs62 vector described above to to the plasmid pVA20. This plasmid DNA was used for transfection of vaccinia-infected CV1 cells to produce the recombinant vaccinia virus VA20.
Metoder for fremstilling og seleksjon av rekombinant vaccinia- virus . Methods for the production and selection of recombinant vaccinia virus.
Metoden er som beskrevet av Mackett et al., (1984) med den unntagelse at enkle virusplater ble selektert ved hjelp av to runder med endepunktfortynning i 96-brønners mikrotiterskåler inneholdende monolag av TK~ 143 celler i nærvær av 25 The method is as described by Mackett et al., (1984) with the exception that single virus plaques were selected using two rounds of endpoint dilution in 96-well microtiter plates containing monolayers of TK~ 143 cells in the presence of 25
yug/ml 5-bromdeoksyuridin (BUdR). Rekombinante virus inneholdende S-antigen-genene ble selektert for nærvær av DNA ved hjelp av flekkavtrykksanalyse eller for fremstilling av S-antigen som ble detektert ved hjelp av et høy-titer poly-klonat antisera, R210, dannet ved immunisering av kaniner med et ^-galaktosidase-fusjonert polypeptid fra klon Agl6 (Coppel et al., 1983) inneholdende 23 kopier av det 11 aminosyre FC27 S-antigen-repeterende polypeptid. yug/ml 5-bromodeoxyuridine (BUdR). Recombinant viruses containing the S-antigen genes were selected for the presence of DNA by blot analysis or for the production of S-antigen which was detected by a high-titer polyclonal antisera, R210, produced by immunization of rabbits with a ^ -galactosidase-fused polypeptide from clone Agl6 (Coppel et al., 1983) containing 23 copies of the 11 amino acid FC27 S-antigen repeat polypeptide.
Uttrykning av S- antigen i rekombinante vaccinia- infiserte celler. Expression of S antigen in recombinant vaccinia-infected cells.
Sammenflytende monolag av BSC-1 celler ble rutinemessig infisert med lpfu/celle med renset rekombinant virus og fikk inkubere ved 37°C i 18 til 48 timer og ved dette tidspunkt ble de infiserte celler og/eller supernatanten høstet og oppløst i SDS, prøvebuffer og kokt; Prøver ble så analysert ved hjelp av immunoavtrykk og gensøkt med et kanin-anti S-antigen antisera, R210, som gjenkjenner den repeterende Confluent monolayers of BSC-1 cells were routinely infected with lpfu/cell of purified recombinant virus and allowed to incubate at 37°C for 18 to 48 hours, at which time the infected cells and/or supernatant were harvested and dissolved in SDS, sample buffer and boiled; Samples were then analyzed by immunoprinting and probed with a rabbit anti-S antigen antisera, R210, which recognizes the repetitive
epitop av S-antigen molekylet.epitope of the S-antigen molecule.
Triton X114 fordeling.Triton X114 distribution.
Rekombinante vaccinia-infiserte celler ble oppløst i 0,5% Triton X114 i PBS i 1 time ved 4°C. Etter sentrifugering ved 2000 omdreininger pr. minutt for å fjerne kjerner i Triton X114 ble oppløselig material påført over et underlag av 6% Triton i 0,06% sukrose/PBS og deretter ble temperaturen hevet til 37°C. Den uklare suspensjon av uoppløselig material ble fjernet ved sentrifugering ved 37°C. Denne fraksjon som benevnes Triton X114 pellet, vil inneholde de inte-grale membranproteiner på grunn av den større affinitet av deres hydrofobe transmembransekvenser for Triton X114 detergent som blir uoppløselig ved forhøyet temperatur (Bordier, 1981). Supernatanten inneholdende oppløselige proteiner ble også samlet. Hver fraksjon ble underkastet en ytterligere syklus med rensing for å redusere forurensning. Prøver av hver fraksjon ble så tilsatt til SDA prøvebuffer og analysert ved hjelp av immunoavtrykk. Recombinant vaccinia-infected cells were dissolved in 0.5% Triton X114 in PBS for 1 hour at 4°C. After centrifugation at 2000 revolutions per minute to remove nuclei in Triton X114, soluble material was applied over a layer of 6% Triton in 0.06% sucrose/PBS and then the temperature was raised to 37°C. The cloudy suspension of insoluble material was removed by centrifugation at 37°C. This fraction, called Triton X114 pellet, will contain the integral membrane proteins due to the greater affinity of their hydrophobic transmembrane sequences for Triton X114 detergent which becomes insoluble at elevated temperature (Bordier, 1981). The supernatant containing soluble proteins was also collected. Each fraction was subjected to a further cycle of purification to reduce contamination. Samples of each fraction were then added to SDA sample buffer and analyzed by immunoblotting.
Immunofluorescens.Immunofluorescence.
BSC-1 celler ble dyrket på sterile glassoverdekninger i en periode på 6 timer hvoretter de ble infisert med 0,5 pfu/ celle med enten de V8 eller VA20 rekombinante viruser eller TK~ ikke-rekombinant virus som kontroll. Etter 18 timer BSC-1 cells were grown on sterile glass coverslips for a period of 6 hours after which they were infected at 0.5 pfu/cell with either the V8 or VA20 recombinant viruses or the TK~ non-recombinant virus as a control. After 18 hours
ble glassoverdekningene renset i kold PBS og deretter farget umiddelbart med kanin anti-S-antigen antisera etterfulgt av FITC konjugerte saue anti-kanin antistoffer. Celler ble så etterfiksert i kold 95% etanol/ 5% iseddik før innføring under glycerol og synliggjøring ved hjelp av fluorescens-mikroskopi . the glass coverslips were washed in cold PBS and then stained immediately with rabbit anti-S-antigen antisera followed by FITC-conjugated sheep anti-rabbit antibodies. Cells were then post-fixed in cold 95% ethanol/5% glacial acetic acid before introduction under glycerol and visualization using fluorescence microscopy.
En parallell gruppe av infiserte celler ble fiksert i kold 95% etanol: 5% iseddik før farging for permeabilisering av cellene. A parallel group of infected cells was fixed in cold 95% ethanol:5% glacial acetic acid before staining to permeabilize the cells.
Immunisering av dyrImmunization of animals
Kaniner ble immunisert med en enkel intradermal injeksjon av 10 8 PFU av renset rekombinant eller TK — villtype-virus på deres nedre del av ryggen etterfulgt av en annen immunisering seks uker senere. Lesjoner kom til syne under huden i løpet av noen få dager etter en første immunisering og nådde en størrelse på omtrent 1 til 1,5 cm diameter. Leilighetsvis dannet disse lesjoner sår. Lesjoner kunne ikke lenger sees etter to uker. Det ble tatt blod fra kaninene med en ukes mellomrom og sera ble analysert for anti-S-antigen eller anti-vaccinia antistoffer ved en ELISA-assaybestemmelse. Innavlede mus med tilpasset alder og vekt av forskjellige stammer ble immunisert ved hjelp av en enkel IP injeksjon med 1x10 7 PFU virus etterfulgt av en ytterligere tilførsel tre uker senere. Sera ble vanligvis samlet tre uker etter den første immunisering og 12 døgn og tre uker etter den fornyede behandling. Anti7S-antigen og anti-vaccinia antistoffinnhold ble assaybestemt ved seriefortynning av seraene ved en ELISA-assaybestemmelse . Rabbits were immunized with a single intradermal injection of 10 8 PFU of purified recombinant or TK — wild-type virus on their lower back followed by another immunization six weeks later. Lesions appeared under the skin within a few days after an initial immunization and reached a size of approximately 1 to 1.5 cm in diameter. Occasionally these lesions formed ulcers. Lesions could no longer be seen after two weeks. Blood was taken from the rabbits at one-week intervals and sera were analyzed for anti-S antigen or anti-vaccinia antibodies by an ELISA assay. Age-matched and weight-matched inbred mice of different strains were immunized by a single IP injection with 1x10 7 PFU virus followed by a further infusion three weeks later. Sera were usually collected three weeks after the first immunization and 12 days and three weeks after the renewed treatment. Anti7S antigen and anti-vaccinia antibody content was assayed by serial dilution of the sera by an ELISA assay determination.
ResultaterResults
FC27 S- antigen- gen av P. falciparum uttrykkes i rekombinant vaccinia- virus. The FC27 S antigen of P. falciparum is expressed in recombinant vaccinia virus.
Et 880bp Ahalll fragment av den FC27 genomiske klonen FC27.4.S. (Cowman et al, 1985) (fig. lb) ble klonet inn i EcoRI setet av vaccinia-virus-transfeksjonsplasmidet pGS62 (et derivat av pGS20 beskrevet av Mackett et al., 1984). Ved denne konstruksjon ligger initieringskodonet for S-antigen-genet 40bp nedstrøms fra EcoRI kloningssetet som ligger inn-til vaccinia 7,5K genpromoteren (fig. lc). Initiering av translasjon ved dette metioninkodon og terminasjon ved terminasjonskodonet 822 nukleotider nedstrøms bør resultere i et protein med lengde 274 aminosyrer og størrelse omtrent 28K dalton etter spaltning av signalpeptidet. Dette protein skulle inneholde 13 kopier av det 11 aminosyre-repeterende polypeptid. En cDNA klon betegnet Agl6 som koder for denne repeterende epitop er tidligere beskrevet (Coppel et al., 1983). Fra sekvensen i dette cDNA må P.falciparum segmentet av dets stabile fi- galaktosidase-fusjonerte polypeptid bestå i sin helhet av gjentagende 11 aminosyrepolypeptider. Kanin-antistoffer til dette fusjonerte polypeptid gjenkjenner det 220K dalton native S-antigen molekyl (Coppel et al., 1983). Disse antistoffer reagere spesifikt med proteiner fremstilt av det rekombinante vaccinia-virus V8 både ved plate immuno-assay-bestemmelser og ved immunoavtrykk av protiner isolert fra V8 infiserte celler (fig. 2b, rute 2). Den tilsynelatende størrelse av molekylet er imidlertid mye større enn 27K dalton forutsagt fra sekvensen. Videre.var det også tilstede et antall mindre rikelige små og større bånd. Den avvikende molekylvekt skyldes ikke glykosylering av proteiner ettersom proteiner med samme tilsynelatende molekylvekt fremstilles i Escherichia coli under styring av ^-galaktosidase-promoter-elementer av pUC9 (fig. 2, spor 1). Videre var DNA-innskuddet i det rekombinante virus avgjort av riktig lengde (data ikke vist). Det antas at unormale SDS bindingsegenskaper resulterer i denne avvikende molekylvektbestemmelse på SDA/ PAGE. Således synes S-antigenet å bli syntetisert i rekombinante vaccinia-infiserte celler under styring av vaccinia-promoter elementer. An 880bp AhalII fragment of the FC27 genomic clone FC27.4.S. (Cowman et al, 1985) (Fig. 1b) was cloned into the EcoRI site of the vaccinia virus transfection plasmid pGS62 (a derivative of pGS20 described by Mackett et al., 1984). In this construction, the initiation codon for the S-antigen gene is located 40bp downstream from the EcoRI cloning site adjacent to the vaccinia 7.5K gene promoter (Fig. 1c). Initiation of translation at this methionine codon and termination at the termination codon 822 nucleotides downstream should result in a protein of length 274 amino acids and size approximately 28K daltons after cleavage of the signal peptide. This protein should contain 13 copies of the 11 amino acid repeating polypeptide. A cDNA clone designated Agl6 encoding this repetitive epitope has been previously described (Coppel et al., 1983). From the sequence in this cDNA, the P.falciparum segment of its stable fig-galactosidase-fused polypeptide must consist entirely of repeating 11 amino acid polypeptides. Rabbit antibodies to this fused polypeptide recognize the 220K dalton native S-antigen molecule (Coppel et al., 1983). These antibodies react specifically with proteins produced by the recombinant vaccinia virus V8 both by plate immunoassay determinations and by immunoprinting of proteins isolated from V8 infected cells (Fig. 2b, lane 2). However, the apparent size of the molecule is much larger than the 27K daltons predicted from the sequence. Furthermore, a number of less abundant small and larger bands were also present. The deviating molecular weight is not due to glycosylation of proteins as proteins of the same apparent molecular weight are produced in Escherichia coli under the control of β-galactosidase promoter elements of pUC9 (Fig. 2, lane 1). Furthermore, the DNA insert in the recombinant virus was determined to be the correct length (data not shown). It is believed that abnormal SDS binding properties result in this aberrant molecular weight determination on SDA/PAGE. Thus, the S antigen appears to be synthesized in recombinant vaccinia-infected cells under the control of vaccinia promoter elements.
S- antigenet utskilles fra vaccinia- infiserte cellerThe S antigen is secreted from vaccinia-infected cells
Monolag av BSC1 celler ble infisert med renset rekombinant virus V8. Etter 1 time ble virus inoculatet erstattet med friskt medium og deretter ble cellene og dyrkingsmediet høstet ved forskjellige tidspunkt, separert ved sentrifugering og underkastet analyse ved immunoavtrykk. Detekterbare mengder av S-antigen begynte å komme tilsyne i mediet 3-4 timer etter infeksjon (fig. 3) og økte i løpet av de neste 48 timer til å nå en total på over 65% av det totale syntetiserte S-antigen (fig. 2b og c). Kontrollforsøk med anti- vaccinia antistoffer viste at dette ikke skyldes virus tilstede i supernatantmaterialet (data ikke vist). Monolayers of BSC1 cells were infected with purified recombinant virus V8. After 1 hour, the virus inoculum was replaced with fresh medium and then the cells and the culture medium were harvested at different time points, separated by centrifugation and subjected to analysis by immunoprinting. Detectable amounts of S-antigen began to appear in the medium 3-4 hours after infection (Fig. 3) and increased during the next 48 hours to reach a total of over 65% of the total synthesized S-antigen (Fig. .2b and c). Control experiments with anti-vaccinia antibodies showed that this is not due to virus present in the supernatant material (data not shown).
Det er klart at S-antigenet utskilles fra den vaccinia-infiserte eukaryotiske celle på svært lignende måte som det utskilles fra parasitten inn i den parasitt-holdige vacuole sent i schizogenien. Disse data indikerer at gjenkjennelses-signalene som f.eks. signalpolypeptidet gjenkjennes til tross for species-forskjellene. It is clear that the S-antigen is secreted from the vaccinia-infected eukaryotic cell in a very similar manner as it is secreted from the parasite into the parasite-containing vacuole late in schizogeny. These data indicate that the recognition signals such as the signal polypeptide is recognized despite the species differences.
Immunisering av dyr med V8 rekombinant virusImmunization of animals with V8 recombinant virus
Tre kaniner ble immunisert som beskrevet i forsøksprosedyr-ene. Antistoffinnholdene var ikke over.preimmune nivåer i to av tre tilfeller og mindre enn 1:50 i en tredje kanin. Anti-vaccinia antistoffer nådde et meget høyt nivå i alle tre dyr. Tretten stammer av mus med 3 dyr i hver gruppe ble også vak-sinert. Bare marginale økninger i antistoffinnhold over preimmune verdier ble iakttatt ved en 1:20 fortynning av serum. Three rabbits were immunized as described in the experimental procedures. Antibody levels did not exceed preimmune levels in two of three cases and less than 1:50 in a third rabbit. Anti-vaccinia antibodies reached a very high level in all three animals. Thirteen strains of mice with 3 animals in each group were also vaccinated. Only marginal increases in antibody content above preimmune values were observed at a 1:20 dilution of serum.
Det konkluderes at til tross for det høye uttrykningsnivå av S-antigenet ble dette utskilte molekyl ikke gjenkjent effektivt av immunsystemet antagelig på grunn av at det ikke ble presentert skikkelig på overflaten av de virusinfiserte celler . It is concluded that despite the high level of expression of the S-antigen, this secreted molecule was not recognized effectively by the immune system presumably because it was not presented properly on the surface of the virus-infected cells.
Addisjon av en transmembran- sekvens til S- antigenetAddition of a transmembrane sequence to the S antigen
Et fragment av en muse fl cDNA klon inneholdende sekvenser som koder for en del av hengselregionen og hele de transmembrane- og intracellulære domener ble klonet i ramme inn i Sphl setet ved 3' enden av S-antigen-genet ved hjelp av Sphl buttendeadaptorer for utvikling av det hybride gen, pVA20 (se fig. 4). Dette gen ble så innført i det samme kloningssted i pGS62 vektoren som V8 klonen og transfektert inn i vaccinia-inf iserte CV1 celler som beskrevet i forsøksprosedyrene. Ut-trykningsnivået av dette hybride protein var lignende som for V8 rekombinanten, men proteinet ble ikke lenger utskilt fra det vaccinia-infiserte celler (fig. 5). A fragment of a mouse fl cDNA clone containing sequences encoding part of the hinge region and the entire transmembrane and intracellular domains was cloned in frame into the Sphl site at the 3' end of the S-antigen gene using Sphl butt-end adapters for development of the hybrid gene, pVA20 (see Fig. 4). This gene was then introduced into the same cloning site in the pGS62 vector as the V8 clone and transfected into vaccinia-infected CV1 cells as described in the experimental procedures. The expression level of this hybrid protein was similar to that of the V8 recombinant, but the protein was no longer secreted from the vaccinia-infected cells (Fig. 5).
Triton X114 fordelingsforsøk (Bordier, 1981) ble gjennomført for å teste hvorvidt ved dette kriterium det hybride S-antigen inneholdende transmembransegmentet oppførte seg som et typisk integralt membranprotein. Faktisk, mens V8 proteinet opptrer eksklusivt som et hydrofilt oppløselig protein, for-delte hoveddelen av VA20 proteinet seg i detergentfasen (fig. 6) og dette indikerte at den hydrofobe transmembransekvens hadde konvertert det oppløselige S-antigen-protein i et mem-branassosiert protein. BSC-1 celler infisert med enten VA20 eller V8 rekombinant virus ble underkastet de indirekte immunofluorescens 18 timer etter infeksjon. Celler ble enten fiksert før farging i kold 95% etanol-5% eddiksyre for peir-meabilisering av membranene og å tillate cytoplasmisk merking med antistoffer eller ble fiksert etter farging for å vise bare overflatebundet antigen. Resultatene, vist i fig. 7, indikerer at der ikke var noen overflatemerking av de V8 infiserte celler, og tydelig merking på overflaten av VA20 infiserte celler. Ved høyere antistoff-konsentrasjoner kunne et lite, men tydelig nivå for overflatemerking sees på V8 infiserte celler. Triton X114 distribution experiments (Bordier, 1981) were carried out to test whether, by this criterion, the hybrid S-antigen containing the transmembrane segment behaved as a typical integral membrane protein. Indeed, while the V8 protein behaves exclusively as a hydrophilic soluble protein, the bulk of the VA20 protein distributed in the detergent phase (Fig. 6) and this indicated that the hydrophobic transmembrane sequence had converted the soluble S-antigen protein into a membrane-associated protein . BSC-1 cells infected with either VA20 or V8 recombinant virus were subjected to indirect immunofluorescence 18 hours after infection. Cells were either fixed before staining in cold 95% ethanol-5% acetic acid to permeabilize the membranes and allow cytoplasmic labeling with antibodies or were fixed after staining to show only surface-bound antigen. The results, shown in fig. 7, indicates that there was no surface labeling of the V8 infected cells, and clear labeling on the surface of VA20 infected cells. At higher antibody concentrations, a small but clear level of surface labeling could be seen on V8 infected cells.
Immunisering av dyr med VA20Immunization of animals with VA20
To stammer av mus som ga forskjellige responser til vaccinia antistoffer etter den primære immunisering med V8 rekombinant virus ble valgt for analyse av immunogenisiteten av VA20 viruset. Responsen for disse mus til IP injeksjoner med 10 7 PFU av V8 og VA20 virus er vist i fig. 8. Tre kaniner ble også behandlet og resultatene er vist i fig. 9. Fig. 9a viser at anti-S-antigen Ab-innholdene i de VA20 immuniserte kaniner toppet seg to uker etter immunisering til tross for det faktum at anti-vaccinia antistoffinnholdene fortsatte å stige i den neste tre ukers periode. Det samme var tilfellet med kaninresponsene til V8 rekombinanten selv om responsene her var meget små og vanskelige å måle. I fig. 9B sammen-lignes sera som gir maksimum responser i alle seks kaniner som mottok V8 og VA20 rekombinantene ved en ELISA-assaybestemmelse ved seriefortynning av serumet. Til tross for store forskjeller mellom de individuelle innhold av sera fra de tre kaniner er en klar økning i immunogenisiteten av proteinet tydelig. Two strains of mice that gave different responses to vaccinia antibodies after the primary immunization with V8 recombinant virus were selected for analysis of the immunogenicity of the VA20 virus. The response of these mice to IP injections with 10 7 PFU of V8 and VA20 virus is shown in fig. 8. Three rabbits were also treated and the results are shown in fig. 9. Fig. 9a shows that anti-S antigen Ab levels in the VA20 immunized rabbits peaked two weeks after immunization despite the fact that anti-vaccinia antibody levels continued to rise over the next three week period. The same was the case with the rabbit responses to the V8 recombinant, although the responses here were very small and difficult to measure. In fig. 9B compares sera giving maximum responses in all six rabbits that received the V8 and VA20 recombinants by an ELISA assay determination by serial dilution of the serum. Despite large differences between the individual contents of sera from the three rabbits, a clear increase in the immunogenicity of the protein is evident.
EKSEMPEL 2EXAMPLE 2
Eksempel 1 er et spesifikt eksempel på en mer generell metode hvor biologisk viktige molekyler som i seg selv ikke er overflate-antigen-molekyler, kan redirigeres til overflaten av rekombinante vaccinia-virus-infiserte celler. Dette eksempel viser også hvor viktig denne overflatelokalisering av antigenet er for innføring av gode immunresponser overfor det fremmede innførte antigen. Example 1 is a specific example of a more general method in which biologically important molecules that are not themselves surface antigen molecules can be redirected to the surface of recombinant vaccinia virus-infected cells. This example also shows how important this surface localization of the antigen is for the introduction of good immune responses to the foreign introduced antigen.
Antigenet valgt for eksempel 1, rnalarie-S-antigenet, har hit-til ikke vært påtenkt som en mulig vaksinekandidat primært på grunn av at den immuno-dominante repeteringsdel av molekylet er bemerkelsesverdig varierende. Disse repeterende struk-turer varierer enormt med hensyn til deres antall, lengde og aminosyresammensetning og dette påvirker sterkt deres immuno-logiske egenskaper, men synes ikke å skulle påvirke deres opptreden som utskilte proteiner. The antigen chosen for example 1, the rnalarie S antigen, has so far not been considered as a possible vaccine candidate primarily because the immunodominant repeat portion of the molecule is remarkably variable. These repetitive structures vary enormously with regard to their number, length and amino acid composition and this greatly affects their immunological properties, but does not seem to affect their behavior as secreted proteins.
Det foreliggende eksempel illustrerer at det er mulig å erstatte den S-antigen-repeterende epitop med en urelatert sekvens som er av betydning som et vaksinemolekyl. Disse hybride molekyler, som i tillegg inneholder en passende transmembran-forankringssekvens, skulle i mange tilfeller bli like effektivt transportert til overflaten av den rekombinante virusinfiserte celle som det hybride S-antigen-molekyl beskrevet i det foregående. The present example illustrates that it is possible to replace the S-antigen repeating epitope with an unrelated sequence which is of importance as a vaccine molecule. These hybrid molecules, which additionally contain a suitable transmembrane anchoring sequence, should in many cases be as efficiently transported to the surface of the recombinant virus-infected cell as the hybrid S-antigen molecule described above.
I det følgende er anført de nødvendige prosedyrer for å dele tere den repeterende del av S-antigen-molekylet og erstatte den med en annen repeterende epitop. Som eksempel er valgt Asn-Ala-Asn-Pro (NANP) sekvensen i circumsporozoitt-kappeproteinet (som andre har vist å være den kritiske epitop ved utvikling av immunitet til det infektive sporozoitt-trinn av falciparum malaria). Denne nye epitop kan imidlertid like godt avledes fra molekyler av de andre malaria-livssyklus-trinn eller fra antigener av andre klinisk viktige patogener. Dettte eksempel er således bare et eksempel på en metode hvorved man kan "skreddersy" en antigen determinant inn i et "bærer"-molekyl beregnet for å avgi denne epitop til overflaten av rekombinante vaccinia-virus-infiserte celler. Det er også vist at et ytterligere rekombinant virus, et murint retrovirus, også er i stand til å utrykke produktet av det hybride VA20 gen på overflaten av virusinfiserte museceller i kultur og viser at denne metode kan være generelt anvend-bar for en rekke forskjellige antigene epitoper uttrykt i hvilke som helst av et antall "bærer"-epitoper ved en rekke forskjellige rekombinante virale vektorsystemer. Fig. 10 er en skjematisk fremstilling av de nødvendige mani-pulasjoner for å deletere de 33bp S-antigen-repeterende sekvenser fra pVA20 og erstatte dem med sekvenser som koder for 16, 32 og 48 kopier av den 4 aminosyre-repterende epitop av P.falciparum circumsporozitt-kappeproteinet. Fig. 11 er en skjematisk fremstilling av P.falciparum circumsporozoitt-kappeprotein-genet (øverst) og viser sekvensen av den dominerende 4 aminosyre-repeterende enhet, NANP. Herunder er vist sekvensene av de syntetiske oligonukleotider anvendt ved syntese av det nye innskudd og (nederst) er vist sekvensen av 5' og 3'forbindelses-områder mellom det BamHl kuttede plasmid pLK8 S-antigen sekvenser) og de nye innskuddssekvenser. Bemerk at 6BP adaptorsekvensene vist i de heltrukne rektangler ved 5' og 3' endene av innskuddet, Sau3A setene som flankerer innskuddet og hvorledes et BamHl sete bare regenereres ved 5' enden av innskuddet. 5' og 3' In the following, the necessary procedures for dividing the repetitive part of the S-antigen molecule and replacing it with another repetitive epitope are listed. As an example, the Asn-Ala-Asn-Pro (NANP) sequence in the circumsporozoite coat protein (which others have shown to be the critical epitope in the development of immunity to the infective sporozoite stage of falciparum malaria) has been chosen. However, this new epitope could equally well be derived from molecules of the other malaria life cycle stages or from antigens of other clinically important pathogens. This example is thus only one example of a method by which one can "tailor" an antigenic determinant into a "carrier" molecule designed to deliver this epitope to the surface of recombinant vaccinia virus-infected cells. It has also been shown that a further recombinant virus, a murine retrovirus, is also able to express the product of the hybrid VA20 gene on the surface of virus-infected mouse cells in culture and shows that this method can be generally applicable to a number of different antigens epitopes expressed in any of a number of "carrier" epitopes by a variety of different recombinant viral vector systems. Fig. 10 is a schematic representation of the necessary manipulations to delete the 33bp S-antigen repeat sequences from pVA20 and replace them with sequences encoding 16, 32 and 48 copies of the 4 amino acid repeat epitope of P. falciparum circumsporosite coat protein. Fig. 11 is a schematic representation of the P. falciparum circumsporozoite coat protein gene (top) showing the sequence of the dominant 4 amino acid repeat unit, NANP. Shown below are the sequences of the synthetic oligonucleotides used in the synthesis of the new insert and (at the bottom) the sequence of the 5' and 3' connection areas between the BamH1 cut plasmid pLK8 S-antigen sequences) and the new insert sequences are shown. Note that the 6BP adapter sequences shown in the solid rectangles at the 5' and 3' ends of the insert, the Sau3A sites flanking the insert and how a BamH1 site is only regenerated at the 5' end of the insert. 5' and 3'
refererer til endene av kodingstråden av innskudds DNA.refers to the ends of the coding strand of the insert DNA.
Fig. 12 viser dobbelttrådet DNA sekvenseringsreaksjoner av DNA fra plasmider P6.44, P66.6 og p.666.34 inneholdende henholdsvis 16, 32 og 48 kopier av den 12bp repeterende sekvens av P.falciparum circumsporozoitt-proteinet. For tydelighet-ens skyld er bare "A" reaksjoner vist for de 3 konstruksjon-er. Til venstre er vist sekvensen av kodingstråden av det syntetiske oligonukleotid anvendt i konstruksjonene med sekvensen 5' AACVCCAACCC-3' . Som de kan sees forekommer to par av A-dubletter i hver kopi av repeteringssekvensen. Den sek-venserende primer var et 17 nukleotid homologt til kodings-trådsekvensene lokalisert 20bp 5' til BamHl setet. Fig. 13 er et immunoavtrykk av proteiner avledet fra rekombinante virus-infiserte BSC-1 celler gensøkt med et antisera (R516 anti NANP^-KLH) produsert ved immunisering av kaniner med et syntetisk peptid med lengde 12 aminosyrer som koder for 3 kopier av den 4 aminosyresekvens NANP konjugert til KLH. Dette antiserum gjenkjenner polypeptidene produsert av celler infisert med rekombinant virus (V6.44) inneholdende det -6.44 hybride gen som er beskrevet i det foregående, men ikke fremstilt i et parallelt forsøk med celler infisert med en lignende konstruksjon inneholdende urelaterte sekvenser innskutt ved BamHl setet (V-kontroll). Molekylvekter i Kdal-ton er vist til høyre. Fig. 12 shows double-stranded DNA sequencing reactions of DNA from plasmids P6.44, P66.6 and p.666.34 containing respectively 16, 32 and 48 copies of the 12bp repetitive sequence of the P.falciparum circumsporozoite protein. For the sake of clarity, only "A" reactions are shown for the 3 constructs. On the left is shown the sequence of the coding strand of the synthetic oligonucleotide used in the constructions with the sequence 5' AACVCCAACCC-3'. As can be seen, two pairs of A doublets occur in each copy of the repeat sequence. The sequencing primer was a 17 nucleotide homologous to the coding strand sequences located 20bp 5' to the BamHI site. Fig. 13 is an immunoprint of proteins derived from recombinant virus-infected BSC-1 cells probed with an antisera (R516 anti NANP^-KLH) produced by immunization of rabbits with a synthetic peptide of length 12 amino acids encoding 3 copies of the 4 amino acid sequence NANP conjugated to KLH. This antiserum recognizes the polypeptides produced by cells infected with recombinant virus (V6.44) containing the -6.44 hybrid gene described above, but not produced in a parallel experiment with cells infected with a similar construct containing unrelated sequences inserted at the BamH1 site (V control). Molecular weights in Kdal tons are shown on the right.
Delesjon av S- antigen repetringssekvensenDeletion of the S antigen repeat sequence
Før deletering av S-antigen repeteringssekvensen fra pVA20 konstruksjonen beskrevet i det foregående, ble et antall endringer foretatt med pGS62 vektoren anvendt ved dens konstruksjon. Først ble Clal setet i pBR322 delen av plasmidet fjernet ved delvis kutting med Clal, Klenow "filling-in" og religering. Et 251BP Tagl - EcoRI fragment fra den sterke bakterielle promoter LacUV5/Trp ble innskutt i det nå unike Clal setet i vaccinia-TK gendelen av vektoren, under anvend else av en syntetisk oligonukleotidadaptor (AATTATCGAT) for å omdanne EcoRI setet til et Clal sete (Amann et al., 1983). Dette utviklet den nye vektor pGS62 tac (vist øverst i fig. 10). Under anvendelse av denne vektor kan uttrykking av gener innskutt i det multiple kloningssetet (MCS) av vektoren kontrolleres i bakterier såvel som i virusinfiserte celler. BahmHl setet ble så deletert fra MCS ved hjelp av BamHl kutting, Klenow "filling-in" og religering under utvikling av det nye plasmid pGS62-tac(BamHl^). 1088bp Ecorl fragmentet fra pVA20 ble klonet inn i EcoRI setet av MCS for å utvikle plasmidet pCL4. Prior to deletion of the S-antigen repeat sequence from the pVA20 construct described above, a number of changes were made to the pGS62 vector used in its construction. First, the ClaI site in the pBR322 portion of the plasmid was removed by partial cutting with ClaI, Klenow "filling-in" and religation. A 251BP Tagl - EcoRI fragment from the strong bacterial promoter LacUV5/Trp was inserted into the now unique ClaI site in the vaccinia-TK gene portion of the vector, using a synthetic oligonucleotide adapter (AATTATCGAT) to convert the EcoRI site to a ClaI site ( Amann et al., 1983). This developed the new vector pGS62 tac (shown at the top of Fig. 10). Using this vector, expression of genes inserted into the multiple cloning site (MCS) of the vector can be controlled in bacteria as well as in virus-infected cells. The BahmHl site was then deleted from the MCS by means of BamHl cutting, Klenow "filling-in" and religation during development of the new plasmid pGS62-tac(BamHl^). The 1088bp EcoRI fragment from pVA20 was cloned into the EcoRI site of MCS to develop plasmid pCL4.
Ved et parallelt kloningsforsøk ble det isolerte EcoRI fragment av pVA20 kuttet med Sau3A. Dette enzym kutter bare en gang i hver av S-antigen repeteringssekvensene. De ikke-repeterte fragmenter 5<1>og 3' til repeteringsdelene ble isolert og ligert inn i EcoRI setet av vektoren pGS62-tac (BamHlA) for å utvikle den nye konstruksjon pLK8 vist i fig. 10. In a parallel cloning experiment, the isolated EcoRI fragment of pVA20 was cut with Sau3A. This enzyme cuts only once in each of the S-antigen repeat sequences. The non-repeat fragments 5<1> and 3' to the repeats were isolated and ligated into the EcoRI site of the vector pGS62-tac (BamH1A) to develop the new construct pLK8 shown in fig. 10.
Plasmidet pLK8 inneholder S-antigen-genet med mindre enn en full kopi av den 33bp repeterende sekvens og med et unikt BamHl sete lokalisert inne i denne resterende delvise repe-teringssekvens. Det er inn i dette setet at passende opp-bygde sekvenser som koder for antigene determinanter kan klones slik at den S-antigen repeterende epitop passende er-stattes . Plasmid pLK8 contains the S-antigen gene with less than one full copy of the 33bp repeat sequence and with a unique BamHI site located within this remaining partial repeat sequence. It is into this seat that appropriately constructed sequences that code for antigenic determinants can be cloned so that the S-antigen repetitive epitope is suitably replaced.
De innkommende sekvenser i den situasjon som er beskrevet i dette eksempel må ha BamHl "klebrige ender" og må være bygget opp på en slik måte at leserammen for hele det hybride gen opprettholdes. Dette krever at den totale lengde av det innskutte DNA bør være et likt multiplum av 3 basepar og at leserammen er i fase med GAT kodonet ved GGATCC BamHl setet ved 5' enden av (kodetråden av) innskuddet. The incoming sequences in the situation described in this example must have BamHl "sticky ends" and must be constructed in such a way that the reading frame for the entire hybrid gene is maintained. This requires that the total length of the inserted DNA should be an even multiple of 3 base pairs and that the reading frame is in phase with the GAT codon at the GGATCC BamH1 site at the 5' end of (the coding strand of) the insert.
Det er også antatt at epitopen som skal uttrykkes bør repe- teres så mange ganger som mulig for å maksimalisere dens immunogenisitet endog selv om denne epitop bare er represen-tert en gang i det native antigen-molekyl. It is also believed that the epitope to be expressed should be repeated as many times as possible to maximize its immunogenicity even if this epitope is only represented once in the native antigen molecule.
Som et eksempel er det valgt en 12bp sekvens som koder for den dominante NANP aminosyre-repeterte epitop av P.falciparum circumsporozoitt-kappeproteinet valgt. Det innsees imidlertid at de samme prosedyrer like godt kunne anvendes for de lineære epitoper eller "mimotopene" av konforme epitoper av andre antigen-molekyler. As an example, a 12bp sequence encoding the dominant NANP amino acid repeat epitope of the P.falciparum circumsporozoite coat protein has been selected. However, it is realized that the same procedures could equally well be used for the linear epitopes or "mimotopes" of conformal epitopes of other antigen molecules.
I dette eksempel er det valgt å kjemisk syntetisere den korte 12bp sekvens som koder for NANP peptidet som muliggjør at kodonene kan "mammalianiseres" for optimal uttrykking i rekombinante vaccinia-virus-infiserte mammalceller. Det kan være av viktighet ved den optimale uttrykking av fremmede proteiner fra species som f.eks. P.falciparum som fremviser en sterk tendens i deres foretrukne kodonbruk bort fra den som sees i mammalceller. Innskuddet kunne imidlertid også avledes fra naturlig forekommende sekvenser så lenge det opp-fyller kravene til lengde og fase som beskrevet i det foregående. In this example, it has been chosen to chemically synthesize the short 12bp sequence that codes for the NANP peptide which enables the codons to be "mammalianized" for optimal expression in recombinant vaccinia virus-infected mammalian cells. It may be important for the optimal expression of foreign proteins from species such as e.g. P.falciparum exhibiting a strong tendency in their preferred codon usage away from that seen in mammalian cells. However, the insert could also be derived from naturally occurring sequences as long as it meets the requirements for length and phase as described above.
Syntese av en ny repeterende epitop og dens innsetting i kroppen av S- antigen- genet Synthesis of a new repetitive epitope and its insertion into the body of the S antigen gene
De følgende prosedyrer er beskrevet skjematisk i fig. 11.The following procedures are described schematically in fig. 11.
To komplementære oligonukleotid-sekvenser 5'-AACGCCAACCCC-3' og 5'-GGTTGGCGTTGG-3' ble fremstilt på et Applied Biosystems oligonukleotid-syntetiseringsapparat og renset ved hjelp av HPLC. Disse ble så kinasebehandlet før restrukturering og ligering på standard måte. Oligonukleotidene var konstruert slik at endene var komplementære bare i en orientering som sikret at bare "hode til hale" ligering av de dobbelttrådede monomerer var mulig. De ligerte fragmenter ble så størrel-sesfraksjonert på en agarosedel med lav geltemperatur og DNA molekylene i størrelsesområdet fra 180 til 600bp ble isolert og renset fra agarosen. Disse størrelsesfraksjonerte molekyler ble så ligert med BamHl kuttet/kalve-intestinalfosfa-tasebehandlet pLK8 plasmid DNA i nærvær av to kinasebehand-lede syntetiske oligonukleotider med sekvensen 5'-GATCCC-3' og 5<1->GATCGG-3<1>. Disse adaptorer var konstruert for å tillate ligering av de 3' overhengende CC og GG ender av det repeterende oligonukleotidfragment til de 5' overhengende GATC "klebrige ender" av pLK8 og å sikre at innskuddssekvensen var "i ramme" med S-antigen-sekvensen. Two complementary oligonucleotide sequences 5'-AACGCCAACCCC-3' and 5'-GGTTGGCGTTGG-3' were prepared on an Applied Biosystems oligonucleotide synthesizer and purified by HPLC. These were then kinase treated before restructuring and ligation in the standard way. The oligonucleotides were designed so that the ends were complementary only in an orientation that ensured that only "head to tail" ligation of the double-stranded monomers was possible. The ligated fragments were then size fractionated on an agarose part with a low gel temperature and the DNA molecules in the size range from 180 to 600 bp were isolated and purified from the agarose. These size-fractionated molecules were then ligated with BamHI cut/calf intestinal phosphatase-treated pLK8 plasmid DNA in the presence of two kinase-treated synthetic oligonucleotides with the sequence 5'-GATCCC-3' and 5<1->GATCGG-3<1>. These adapters were designed to allow ligation of the 3' overhanging CC and GG ends of the repetitive oligonucleotide fragment to the 5' overhanging GATC "sticky ends" of pLK8 and to ensure that the insert sequence was "in frame" with the S-antigen sequence.
Rekombinate bakterielle kloner inneholdende 12bp sekvensen ble selektert ved koloni-hybridisering under anvendelse av et gamma-( 32P)-ATP kinasebehandlet oligonukleotid med sekvensen 5'-AACGCCAACCCC-3' . Recombinant bacterial clones containing the 12bp sequence were selected by colony hybridization using a gamma-(32P)-ATP kinase-treated oligonucleotide with the sequence 5'-AACGCCAACCCC-3'.
Plasmid DNA ble isolert fra de positive kloner og kuttet med restriksjonsenzymer for å bestemme de kloner som inneholdt de lengste innskudd. Et antall av disse ble så sekvensert under anvendelse av den dobbelttrådede DNA sekvenseringsprosedyre på alkali-denaturerte plasmid DNA preparater til å selektere en klon med et innskudd i riktig orientering og bekrefte dets forutsatte sekvens. Dette plasmid DNA (p6.44, fig. 10) ble så transfektert direkte inn i. villtype vaccinia-virus-infiserte celler for å frembringe TK~ rekombinant virus som beskrevet i det foregående. Plasmid DNA was isolated from the positive clones and cut with restriction enzymes to determine the clones containing the longest inserts. A number of these were then sequenced using the double-stranded DNA sequencing procedure on alkali-denatured plasmid DNA preparations to select a clone with an insert in the correct orientation and confirm its predicted sequence. This plasmid DNA (p6.44, Fig. 10) was then transfected directly into wild-type vaccinia virus-infected cells to generate TK~ recombinant virus as described above.
Økning av lengden av den repeterende epitop ved ytterligere subkloning Increasing the length of the repetitive epitope by further subcloning
Det nye 192bp innskudd i hybridgenet p6.44 flankeres av Sau3A seter som tillater at innskuddet kan isoleres og renses fra det rekombinante plasmid. Bare et BamHl sete ved 5' av kodingstråden av innskuddet blir imidlertid regenerert i denne hybrid (se fig. 11). Det rekombinante plasmid kan således lineariseres med BamHl, fosfatasebehandles og ligeres med det isolerte 192bp Sau3A fragment. Plasmid DNA ble fremstilt fra de transformerte bakterier som resulterte fra denne kloning og kuttet med restriksjonsenzymer til å selektere kloner med dobble (eller tredobbelte) innskudd. Disse ble så sekvensert for å bestemme hvilke som var i korrekt orientering og å beskrefte den forutsagte sekvens. Disse nye hybrider har også et unikt Bamhl sete ved 5' enden av innskuddet og denne prosess kan gjentas mange ganger og øker størrelsen av innskuddet til en hvilken som helst ønsket lengde. I dette eksempel er det blitt fremstilt innskudd inneholdende 16(p6.44), 32(p66.6) og 48)p666.34) kopier av den 12bp repeterte sekvens av CSP genet (se fig. 10 og 12). The new 192bp insert in the hybrid gene p6.44 is flanked by Sau3A sites that allow the insert to be isolated and purified from the recombinant plasmid. However, only a BamH1 site at 5' of the coding strand of the insert is regenerated in this hybrid (see Fig. 11). The recombinant plasmid can thus be linearized with BamHI, treated with phosphatase and ligated with the isolated 192bp Sau3A fragment. Plasmid DNA was prepared from the transformed bacteria resulting from this cloning and cut with restriction enzymes to select clones with double (or triple) inserts. These were then sequenced to determine which were in the correct orientation and to confirm the predicted sequence. These new hybrids also have a unique Bamhl site at the 5' end of the insert and this process can be repeated many times increasing the size of the insert to any desired length. In this example, inserts have been produced containing 16(p6.44), 32(p66.6) and 48)p666.34) copies of the 12bp repeated sequence of the CSP gene (see fig. 10 and 12).
Karakterisering av det hybride antigen og dets uttrykking i rekombinante virus- infiserte celler Characterization of the hybrid antigen and its expression in recombinant virus-infected cells
Når de er blitt innført i rekombinante vaccinia-virus testes disse hybride gener i virus-infiserte celler for å se om det fremstilles et stabilt hybrid protein som kan gjenkjennes av antistoffer som er spesifikke for epitopen. Et eksempel på dette er beskrevet i fig. 13 som viser et Western-avtrykk av proteiner fremstilt fra V6.44 virus-infiserte mammal BSC-1 celler gensøkt med et kanin antisera dyrket mot et syntetisk peptid med lengde 12 aminosyrer omfatter 3 kopier av NANP peptidet. Once introduced into recombinant vaccinia viruses, these hybrid genes are tested in virus-infected cells to see if a stable hybrid protein is produced that can be recognized by antibodies specific for the epitope. An example of this is described in fig. 13 showing a Western blot of proteins prepared from V6.44 virus-infected mammalian BSC-1 cells probed with a rabbit antisera raised against a synthetic peptide of length 12 amino acids comprising 3 copies of the NANP peptide.
HenvisningerReferrals
Bordier, C. (1981). Phase separation of integral membrane proteins in Triton X114. J.Biol.Chem 256, 1604-1607. Bordier, C. (1981). Phase separation of integral membrane proteins in Triton X114. J. Biol. Chem 256, 1604-1607.
Coppel, R.L., Cowman. A.F., Lingelbach, K.R., Brown, G.B., Saint, R.B., Kemp, D.J. and Anders, R.F. (1983). Isolate-specific S-antigen of Plasmodium falciparum contains a repeated sekvens of eleven amino acids. Nature, 306, 751-756. Coppel, R. L., Cowman. A.F., Lingelbach, K.R., Brown, G.B., Saint, R.B., Kemp, D.J. and Anders, R.F. (1983). Isolate-specific S-antigen of Plasmodium falciparum contains a repeated sequence of eleven amino acids. Nature, 306, 751-756.
Cremer, K.J., Mackett, M. Wohlenberg, C, Notkins, A.L. and Cremer, K.J., Mackett, M. Wohlenberg, C, Notkins, A.L. duck
Moss, B. (1985). Vaccinia virus recombinant expressing herpes simplex virus type 1 glyco-protein D prevents latent herpes in mice. Science 228, 737-740. Moss, B. (1985). Vaccinia virus recombinant expressing herpes simplex virus type 1 glyco-protein D prevents latent herpes in mice. Science 228, 737-740.
Guan, J-L and Rose, J.K. (1984). Conversion of a secretory protein into a transmembrane protein results in its transport to the golgi complex but not to the cell surface. Cell 37, 779-787. Guan, J-L and Rose, J.K. (1984). Conversion of a secretory protein into a transmembrane protein results in its transport to the golgi complex but not to the cell surface. Cell 37, 779-787.
Kemp, D.J., Coppel, R.L., Cowman, A.F., Saint, R.B., Brown, B.V. and Anders, R.F. (1983). Expression of Plasmodium falciparum blood-stage antigens in Escherichia coli: Detec-tion with antibodies from immune humans. Proe.Nati.Acad.Sei. USA 80, 3787-3791. Kemp, D.J., Coppel, R.L., Cowman, A.F., Saint, R.B., Brown, B.V. and Anders, R.F. (1983). Expression of Plasmodium falciparum blood-stage antigens in Escherichia coli: Detection with antibodies from immune humans. Proe.Nati.Acad.Sei. USA 80, 3787-3791.
Mackett, M., Smith, G.L. and Moss, B. (1982). Vaccinia virus: A selectable eukaryotic cloning and expression vec-tor. Proe.Nati.Acad.Sei. USA 79, 7415-7419. Mackett, M., Smith, G.L. and Moss, B. (1982). Vaccinia virus: A selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proe.Nati.Acad.Sei. USA 79, 7415-7419.
Macket, M., Smith, G.L. and Moss, B. (1984). General method for production and selection of infectious vaccinia virus recombinants expressing foreign genes. J.Virol. 49, 857-864. Mackett, M., Smith, G.L. and Moss, B. (1984). General method for production and selection of infectious vaccinia virus recombinants expressing foreign genes. J. Virol. 49, 857-864.
Moss, B., Smith, G.L., Gerin, J.L. and Purcell, R.H. (1984). Live recombinant vaccinia virus protects chimpanzees against hepatitis B. Nature 311, 67-69. Moss, B., Smith, G.L., Gerin, J.L. and Purcell, R.H. (1984). Live recombinant vaccinia virus protects chimpanzees against hepatitis B. Nature 311, 67-69.
Panicali, D. and Paoletti, E. (1982). Construction of pox viruses as cloning vectors: Insertion of the thymidine kinase gene of herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus. Proe.Nati.Acad.Sei. USA 79, 4927-4931. Panicali, D. and Paoletti, E. (1982). Construction of pox viruses as cloning vectors: Insertion of the thymidine kinase gene of herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus. Proe.Nati.Acad.Sei. USA 79, 4927-4931.
Panicali, D., Davis, S.W., Weinberg, R.L. and Paoletti, E. Panicali, D., Davis, S.W., Weinberg, R.L. and Paoletti, E.
(1983). Construction of liver vaccines by using genetically engineered pox viruses: Biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin. (1983). Construction of liver vaccines by using genetically engineered pox viruses: Biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin.
Proe.Nati.Acad.Sei. USA 80, 5364-5368.Proe.Nati.Acad.Sei. USA 80, 5364-5368.
Paoletti, E., Lipinskas, B.R., Samsonoff, C, Mercer, S. and Panicali, D. (1984). Construction of liver vaccines using genetically engineered pox viruses: Biological activity of vaccinia virus recombinants expressing the hepatitis B surface antigen and the herpes simplex glycoprotein D. Proe. Nati.Acad.Sei. USA 81, 193-197. Paoletti, E., Lipinskas, B.R., Samsonoff, C, Mercer, S. and Panicali, D. (1984). Construction of liver vaccines using genetically engineered pox viruses: Biological activity of vaccinia virus recombinants expressing the hepatitis B surface antigen and the herpes simplex glycoprotein D. Proe. Nati.Acad.Sei. USA 81, 193-197.
Smith, G.L., Mackett, M. and Moss, B. (1983a). Infectious vaccinia virus recombinants that express hepatitis B virus surface antigen. Nature 302, 490.495. Smith, G.L., Mackett, M. and Moss, B. (1983a). Infectious vaccinia virus recombinants that express hepatitis B virus surface antigen. Nature 302, 490,495.
Smith, G.L., Murphy, B.R. and Moss, B. (1983b). Construction and characterization of an infectious vaccinia virus recombinant that expresses the influena hemagglutinin gene and induces resistance to influenza virus infection of hamsters. Proe.Nati.Acad.Sei. USA 80, 7155-5159. Smith, G.L., Murphy, B.R. and Moss, B. (1983b). Construction and characterization of an infectious vaccinia virus recombinant that expresses the influenza hemagglutinin gene and induces resistance to influenza virus infection of hamsters. Proe.Nati.Acad.Sei. USA 80, 7155-5159.
Tyler, B.M., Cowman, A.F., Gerondakis, S.D., Adams, J.M. and Bernard, 0. (1982). mRNA for surface immunoglobulin Ychains encodes a highly conserved transmembrane seguence and a 28-residue intracellular domain. Proe.Nati.Acad.Seie. USA 79, 2009-2012. Tyler, B.M., Cowman, A.F., Gerondakis, S.D., Adams, J.M. and Bernard, 0. (1982). mRNA for surface immunoglobulin Ychains encodes a highly conserved transmembrane sequence and a 28-residue intracellular domain. Proe.Nati.Acad.Seie. US 79, 2009-2012.
Valenzuela, P., Coit, D., Medina-Selby, M.A., Kuo, C.H., Van Nest, G., Burke, R.L., Bull, P., Urdea, M.S. and Graves, P.V. Valenzuela, P., Coit, D., Medina-Selby, M.A., Kuo, C.H., Van Nest, G., Burke, R.L., Bull, P., Urdea, M.S. and Graves, P.V.
(1985). Antigen engineering in yeast: Synthesis and assembly of hybrid hepatitis B surface antigen-herpes simplex 1 gD particles. Biotechnology 3, 323-326. (1985). Antigen engineering in yeast: Synthesis and assembly of hybrid hepatitis B surface antigen-herpes simplex 1 gD particles. Biotechnology 3, 323-326.
Amann, E., Brosius, J. and Ptashne, M., 1983, Vectors bearing a hybri Trp - Lac promoter useful for regulated expression of cloned genes in E. coli, Gene, 25, 167-178. Amann, E., Brosius, J. and Ptashne, M., 1983, Vectors bearing a hybrid Trp - Lac promoter useful for regulated expression of cloned genes in E. coli, Gene, 25, 167-178.
Claims (11)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPH219885 | 1985-08-29 | ||
| PCT/AU1986/000256 WO1987001386A1 (en) | 1985-08-29 | 1986-08-29 | Recombinant virus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO871737D0 NO871737D0 (en) | 1987-04-27 |
| NO871737L true NO871737L (en) | 1987-06-15 |
Family
ID=25640588
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO871737A NO871737L (en) | 1985-08-29 | 1987-04-27 | RECOMBINANT VIRUS. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| NO (1) | NO871737L (en) |
-
1987
- 1987-04-27 NO NO871737A patent/NO871737L/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO871737D0 (en) | 1987-04-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Langford et al. | Anchoring a secreted plasmodium antigen on the surface of recombinant vaccinia virus-infected cells increases its immunogenicity | |
| KR0156545B1 (en) | Recombinant coccidiosis vaccines | |
| EP0236145B1 (en) | Processes for the production of hcmv glycoproteins, antibodies thereto and hcmv vaccines, and recombinant vectors therefor | |
| US5242829A (en) | Recombinant pseudorabies virus | |
| EP0261940A2 (en) | Pseudorabies vaccines and DNA vectors for recombination with pox viruses | |
| US5403581A (en) | Coccidiosis vaccines | |
| US5597570A (en) | Protein recognized by antibodies raised against native P28 of schistosoma mansoni | |
| EP0398944A4 (en) | Gene expression system (particularly for rotavirus vp7 protein) involving a foreign signal peptide and optionally a transmembrane anchor sequence | |
| US6610295B1 (en) | Processes for the production of HCMV glycoproteins, antibodies thereto and HCMV vaccines, and recombinant vectors therefor | |
| AU594087B2 (en) | Recombinant vaccinia virus sxpresses hybrid polypeptides on virus infected cell surface | |
| Ellis et al. | Structure and expression of the knob-associated histidine-rich protein of Plasmodium falciparum | |
| WO1988002757A1 (en) | Hybrid proteins or polypeptides | |
| US6113917A (en) | Modified polypeptides for enhanced immunogenicity | |
| JP3375347B2 (en) | Recombinant vaccine against Marek's disease | |
| NO871737L (en) | RECOMBINANT VIRUS. | |
| AU604711B2 (en) | Novel vaccines | |
| Yang et al. | Addition of the MSA1 signal and anchor sequences to the malaria merozoite surface antigen 1 C-terminal region enhances immunogenicity when expressed by recombinant vaccinia virus | |
| JPH08280390A (en) | Recombinant dna vector coding melanoma-related antigen | |
| AU665195B2 (en) | Immunogenic peptides or polypeptides of the BVD virus and related viruses, vaccines incorporating them or expressing them, methods and means of production thereof | |
| AU8150687A (en) | Hybrid proteins or polypeptides | |
| JPH0622757A (en) | Recombinant marek's disease virus and its production | |
| WO1999055860A1 (en) | Host-encoded protein expressed on marek's disease (mdv)-infected cells and antibody thereto | |
| WO1991000911A1 (en) | Dna coding for a polypeptide signal sequence in vaccinia virus |