NO850785L - Fremgangsmaate ved diagnostisering in vitro og diagnostisk middel - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved diagnostisering in vitro av sykdomstilstander eller predisponering for sykdommer hos dyr, inkl. mennesker, samt diagnostisk middel for gjennomføring av fremgangsmåten.

Ved å analysere visse parametere i celler fra syke dyr inkl. mennesker, eller fra mennesker eller dyr som er predisponerte for visse sykdommer, kan man diagnostisere sykdommen og endog bestemme hvor alvorlig den er, hvorved en egnet behandling kan igangsettes.

Fra begynnelsen kunne bare visse parametere bestemmes på ikke-levende celler som var isolert fra sitt opprinnelige miljø. Fra disse parametere forsøkte man siden å trekke be-stemte slutninger vedrørende sykdommens art og hvor alvorlig den var, men dette var forbundet med stor usikkerhet. Man kan nemlig ikke med sikkerhet vite at det som gjelder for en død celle også gjelder for den levende cellen i mennesker eller dyr.

Med tilveiebringelsen av senere tids metoder for inkubasjon

av levende celler har man fått nye muligheter for å analysere celleaktiviteter i normalt cellemiljø. For å kunne gjennomføre slike analyser må imidlertid celler av en bestemt type isoleres fra celleblandinger i forskjellige dyrkningsmedier. Celle-sammensetningen kan bestemmes ved hjelp av mikroskopering eller med kompliserte og kostbare instrumenter (f.eks. FACS, dvs. "fluorescéin activated cell sorter". For å analysere forskjellige funksjoner i cellene er det nødvendig først å separere de forskjellige celletypene fra hverandre. Herved unngås reaksjon mellom forskjellige celletyper, dvs. at nærværet av en celletype påvirker funksjonen av andre celletyper .

De hittil kjente separeringsmetodene innbefatter separering

i flere trinn, hvorved ca. 10-20% av cellene går tapt i hvert trinn.

Disse kjente metoder krever ofte anvendelse av kostbar apparatur av typen FACS-cellesorterere og stor manuell laboratoriedyktighet hos personalet for at man skal oppnå reproduserbarhet.

Ved hjelp av. foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en ny metode for hurtig og sikker separering av levende celler av en viss type fra en cellekultur eller blod. Metoden krever ingen kostbar apparatur, og kan lett utføres i stor målestokk med stor reproduserbarhet av personalet uten altfor store krav til laboratoriedyktighet.

Oppfinnelsen omfatter således en fremgangsmåte ved diagnostisering in vitro av sykdomstilstander eller av predisponering for visse sykdommer hos dyr inkl. mennesker, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at en suspensjon av levedyktige celler fra dyr bringes i kontakt med magnetiske sfærer, hvilke sfærer derved absorberes på celleveggene eller inkorporeres i cellene, og at de således magnetiserte viable cellene separeres fra suspensjonen ved anbringelse av et ytre magnetfelt, hvoretter de viable cellene anvendes for analyse i av celleparametere, slik som DNA-reparerende evne og/eller enzymaktivitet og/eller immunologisk reaktivitet.

Oppfinnelsen omfatter også et diagnostisk middel for diagnotisering in vitro av sykdomstilstander eller predisponering for visse sykdommer hos dyr inkl. mennesker, hvilket middel er kjennetegnet ved at det utgjøres av magnetiske sfærer omfattende magnetiske partikler som er innesluttet i en polymer matrise.

Magnetiske sfærer er fortrinnsvis mikro- eller nanosfærer

eller -partikler hvis middeldiameter ligger i mikro- eller nanometerområdet, og som kan påvirkes av magnetfelt.

Magnetiske materialer som er egnet for anvendelse i nanosfærene, er beskrevet og generelt tilgjengelige, f.eks. Fe■- i .0 4, Ni-NiO, Ni-TiO^, Mn-Zn, ferritt, Ni osv. Fortrinnsvis anvendes magnetitt

(Fe^O^) p.g.a. at det er lett tilgjengelig og ikke oksyderes i vannholdig miljø. |

Det magnetiske materialet innesluttes i et polymermateriale, f.eks. akrylderivater, agarose, proteiner, kopolymerer mellom akryl og agarose, stivelse og cellulose.

Hensiktsmessig anvendes det en karbohydratpolymer som matrise ettersom det fra dette materialet er lett å fremstille sfærer i det ønskede størrelsesintervallet. Eksempler på egnede karbohydratpolymerer er dekstran, pullullan, glykogen, stivelse, cellulose, agarose, algenat, chitosan eller kara-genan. Dekstran, cellulose og agarose foretrekkes ettersom de er biokjemisk velkarakteriserte og inerte i de fleste bio-logiske systemer. Karbohydratpolymeren kan også modifiseres med f.eks. acetyl-, hydroksypropyl-, propionyl-, hydroksyetyl-, hydroksypropanoylgrupper, forskjellige derivater av akryl-syre eller lignende.

Magnetiske sfærer med en middeldiameter i intervallet 50-900 nanometer kan fremstilles f.eks. ved en metode som er beskrevet i svensk patentsøknad nr. 8201972-0. Ved denne metoden opp-løses en karbohydratpolymer i et oppløsningsmiddel med høy dielektrisitetskonstant til en konsentrasjon som normalt ligger i området 0,1-150% (vekt/volum). Anvendbare oppløsnings-midler er bl.a. dimetylformamid, etylenglykol, sulfolan, dimetylsulfoksyd, propylenkarbonat, vann og formamid eller blandinger derav. Det magnetiske materialet suspenderes i den oppløste karbohydratpolymeren. Det magnetiske materialet består f.eks. av magnetitt (Fe204) med en størrelse på 10-20 nm.

En fremgangsmåte for fremstilling av så små magnetittpartikler er kjent, og disse er kommersielt tilgjengelige via Ferrofluid Corporation, USA. Andre anvendbare magnetiske materialer innbefatter partikler eller kolloider med hovedsakelig innhold av aluminium, nikkel, kobolt, kobber, sølv, mangan eller platina.

Den således oppnådde suspensjon av magnetisk materiale i den oppløste karbohydratpolymeren emulgeres deretter i et emulsjonssystem bestående av nevnte magnetsuspensjon og et et emulsjonsmedium bestående av en væske som er ikke-blandbar med nevnte magnetsuspensjon og hvis ytterligere egenskaper er at den medvirker ved dannelsen av små dråper av magnet-suspens jon i emulsjonsmediet.

Som eksempel på anvendbare emulsjonsmedier kan nevnes vegeta-bilske oljer, fortrinnsvis raps eller maisolje. Andre anvendbare hydrofobe emulsjonsmedier innbefatter parafinoljer eller silikonoljer. En annen type av emulsjonsmedium innbefatter organiske oppløsningsmidler hvori det er oppløst en eller flere emulgeringsmidler. Anvendbare slike organiske oppløsnings-midler omfatter bl.a. xylen, toluen, etylbenzen, dietylbenzen, propylbenzen, etylenklorid og andre lignende oppløsningsmidler samt blandinger derav.

For å emulgere emulsjonen benyttes sonikator eller høytrykks-homogenisator. Den oppnådde emulsjon hvor karbohydratmagnetitt-suspensjonen er emulgert i form av dråper, stabiliseres ved at den overføres til en væske som kan krystallisere karbohydratpolymeren, hvorved det magnetiske materiale innesluttes i polymeren. Anvendbare slike væsker er etanol, metanol og aceton. Fortrinnsvis benyttes aceton. Etter krystallisasjon vaskes nanosfærene ytterligere med aceton. Tørking-kan deretter skje på enkel måte ved rotasjonsinndamping eller lufttørking.

For å lette adsorpsjonen av de magnetiske sfærene på celle-vegger kan det i visse tilfeller være nødvendig å benytte et aktiverende stoff, en såkalt aktivator. Denne kobles først til den magnetiske sfæren og bindes (fortrinnsvis via kovalent binding) deretter til celleveggen. Eksempel på en slik aktivator er tresylklorid.

Vurdering av individuelle risikoer med genotoksisk eksponering er avhengig av isolering av levedyktige cellepopulasjoner fra f.eks. blod, benmarg, hud og maligne eller benigne tumor-vevnader. Man oppnår meget store fordeler med å utføre genotoksiske risikobestemmelser på snevert definerte cellepopulasjoner hvorved effekten av forskyvninger i total-populasjonens sammensetning klart kan skilles fra forskjellig-heter i egenskaper hos en bestemt cellesubpopulasjon.

Den individuelle risikoen for å rammes av visse sykdommer kan reguleres ved hjelp av genetiske faktorer eller miljøfaktorer.

For å uttrykke begge disse faktorer er man avhengig av å kunne foreta kvantitative bestemmelser på viable celler ettersom fysiologiske prosesser kan regulere enten (a) den metaboliske aktivering og nedbrytning av karsinogene/mutagene stoffer, (b) ansamlinger av forløpere, kofaktorer eller endogene kosubstrater, eller

(c) målet på den DNA-skade som har inntruffet.

(1) Genetiske faktorer

Genetisk kontroll av individuelle variasjoner i respons på toksiske miljøeksponeringer er definert som ekogenetikk (Vogel, F., Buselmaier, W., Reichert, W., Kellermann, G., Berg, P. (eds) Human genetic variation in response to medical and environmental agents: Pharmacogenetics and ecogenetics. Human GeneticSuppl. 1:1-192 (1978)). Eksempler på ekogene-tiske faktorer som kan regulere risikoen for genotoksiske eksponeringer, er følgende:

(a) Mikrosomale oksygenaser med blandet funksjon

De fleste karsinogene/mutagene stoffer krever oksydativ meta-bolisme via dannelser av DNA-skadende epoksyder før de blir aktive som karsinocrene/mutaaene stoffer. Således deltar mengdene av enzym og kofaktorer, slik som NADPH, i regulerin-gen av hvor stor DNA-skade som kan induseres. Ettersom mikrosomale enzymer er innesluttet i visse avdelinger i cellen der de er membranbundne, er det av stor betydning å gjennom-føre slike bestemmelser på viable celler for å gjøre individuelle risikovurderinger basert på genetiske mekanismer for predisponering.

(b) Legemid delmetaboliserte enzymer

Når først potensielle DNA-skadende epoksyder er dannet, kan det inaktiveres til ikke-DNA-skadende metabolitter ved epoksydhydrolase og glutationtransferase. Således regulerer mengden av disse enzymer i forhold til hverandre og i forhold til innholdet av mikrosomal.oksygenase med blandet funksjon så vel som kofaktor-konsentrasjoner, slik som glutation,

den intracellulære balanse mellom DNA-skadende mellomprodukter. Som et resultat av dette kan denne intracellulære balansen kontrolleres genetisk, og på ny understrekes betydningen av anvendelse av viable celler for vurdering av den humane risikoen. Andre legemiddelmetaboliserende enzymer som kan være av betydning i dette henseende og hvilke kan påvises i blodceller, er NADPH cytokrom P-450 reduktase, NADH cytokrom C reduktase og DT diaforase.

(c) DNA- reparerende enzymer

Det finnes eksempler på at individer kan lide av mangel på evne til reparere DNA-skader. Mangler av denne type kan lede til en genetisk predisposisjon for kreft. Ettersom det hittil ikke har vært mulig å rense eventuelle DNA-reparerende enzymer fra humane kilder, og ettersom det foreligger en sterk gjen-sidig avhengighet mellom de forskjellige DNA-reparerende enzymatiske aktivitetene, (dvs. aktivitetene til endo-nuklease, eksonuklease, polymerase og ligase) har analyse- metoden hittil blitt gjennomført mer indirekte. Ikke-planlagt DNA-syntese (UDS = Unscheduled DNA synthesis), DNA-strengavbrudd, fjerning av karsinogene stoffer, ADP-ribosyl-transferaseaktivitet, mutasjonsfrekvensanalyser, mikro-kjerneproduksjon, kromosomdefekter,øøsterkromatidutbytter og andre cytogeniske parametre er avhengig av nukleotide-for-løpere og de enzymer som produserer eller nedbryter dem, nukleotide poolubalanser og kofaktorer slik som Mg og NAD<+>.

Alle disse analysemetodene krever dyrking av viable celler, og noen er avhengig av celledeling. Videre er cellulær regulering av den DNA-reparerende enzymatiske aktiviteten via nukleotidpoolbegrensninger av betydning ved vurdering av den genotoksiske risikoen, og denne type av regulerende faktor kan også analyseres ved dyrking av viable celler.

(2) Miljøfaktorer

Det er nå vel dokumentert at mennesker som yrkesmessig ekspo-neres for et antall forskjellige kjemikalier, utvikler kreft og andre sykdommer. Flere forskjellige tester har blitt utviklet for å vurdere risikofylte miljøeksponeringer. Også

her krever nesten alle disse fremgangsmåter isolering og dyrking av viable celler. Fremgangsmåtene .for vurdering av den individuelle genotoksiske risikoen som er nevnt ovenfor,

har tidligere blitt utviklet med cellesystemer fra dyre-modeller, og data har blitt ekstrapolert til mennesker. Herav følger at avhengigheten av analysemetoder for beregning av risikoen for karsinogene/mutagene stoffers innvirkning på

viable cellepopulasjoner også gjelder for andre pattedyr slik som rotter, mus, hamstere, aper osv.

(a) Yrkesmessige og industrielle eksponeringer

Den vanligste metoden for bedømmelse av om et kjemikalium

er skadelig for helsen, er å eksponere celler in vitro for

testkjemikaliet og vurdere den individuelle genotoksiske responsen. Dette kan man ikke gjøre uten å dyrke viable celler i nærvær av testkjemikaliet. Risikoen in vivo vurderes ofte på lignende måte, men sammenligning mellom in vitro-responser gjøres for individer som ikke er eksponerte in vivo for testkjemikaliet.

(b) Ernæringseffekter

Peroksydative prosesser i cellen kan produsere syreradikaler som skader DNA, og de kan aktivere karsinogene/mutagene midler for DNA-bindende mellomprodukter gjennom ko-

oksydative mekanismer. Den DNA-skade som induseres på disse måter, påvirkes hurtig av tilstedeværelser av antikarsinogene stoffer i den intracellulære kjemikaliepoolen. Antikarsinogene stoffer er ofte radikal-nedbrytere slik som vitamin E, 3-karoten, glutation, askorbinsyre eller urinsyre, og nivåene av disse stoffene i cellene kontrolleres delvis gjennom diett. For å analysere den individuelle risikoen er det således viktig å gjennomføre analysemetoder på viable celler der innflytelsen fra slike faktorer kan betraktes. Lipidnæringstilførsel er også av betydning i denne sammenheng. Menbranfluiditet, lipoksygenase og cyklooksygenase (prostaglandinsyntetase) reguleres enten gjennom fosfolipidbundet eller fri arakidon-syre. Forholdet mellom mettede og umettede ekstracellulære fettsyrer kan i sin tur justere den intracellulære fettsyre-poolen. En anriket intracellulær pool av umettede fettsyrer skulle øke tilfellene for syreradikaldannelse og for ko-oksydativ aktivering av karsinogene/mutagene stoffer. Igjen bør egnede risikovurderinger bare gjennomføres på viable målceller der disse regulatorer av den genotoksiske risikoen kan vurderes.

Videre har det ved analyse av DNA-reparasjonsevne hos viable celler vist seg at:

a) personer med høyt blodtrykk

b) eldre mennesker

c) etenoksydeksponerte personer

d) styreneksponerte personer

e) personer som har en genetisk disposisjon for colonkreft

f) personer som har eller har hatt colonkreft

alle har oppvist en dårligere evne til å kunne reparere sitt

DNA etter at cellene i løpet av kort tid har blitt eksponert for et karsinogent stoff.

På samme måte har det vist seg at aktiviteten for et annet enzym (ATP-ribose-transferase) i celler fra pasienter med leukemi har direkte sammenheng med sykdommens malignitetsgrad. Med andre ord kan man med denne analyse direkte avgjøre om pasienten vil kunne helbredes eller ikke.

Ytterligere et område der muligheten til å foreta en analyse på viable celler er av stor betydning, er ved analyse av immunologisk reaktivitet. Funksjonen til forskjellige typer av hvite blodlegemer forverres ofte av at sammensetningen til de testede cellepopulasjonene varierer, av at funksjons-testene er sterkt avhengig av celleantallet, av at forskjellige celletyper påvirker hverandre, dvs. at tilstedeværelsen av en viss celletype påvirker funksjonen til andre

.celletyper. Eksempler på denne tillemping er følgende.

1: Tilstedeværelsen av T-suppressorlymfocytter kan gjøre det umulig å påvise en eventuell eksisterende T-helper-aktivitet respektivt T-cytotoksisitetsaktivitet. Omvendt kan måling av T-suppressorfunskjonen umuliggjøres av samtidig tilstedeværelse av varierende mengde effektorceller.

2: Analyse av cytotoksisk effekt av cytolytiske T-celler kan bli umulig dersom NK-celler samtidig finnes til stede. Omvendt kan NK-cellers aktivitet sikrere bedømmes dersom

T-lymfocytter ikke samtidig er til stede.

Samtidig separering av flere cellesubpopulasjoner muliggjør analyse av celle-celleinteraksjon, f.eks. inhibering av forskjellige T- og B-cellefunksjoner av tilmålt tilblanding av T-suppresorceller. Et annet eksempel er kontrollert tilblanding av monocytter av en viss type til lymfocytter for korrekt bedømmelse av lymfocyttenes reaktivitet, f.eks. proliferativt T-cellesvar på eksponering for antigen som ikke finner sted i fravær av monocytter.

Disse typer av analyse er spesielt vesentlige hos kraft-pasienter, hos pasienter som mottar organtransplantat, hos pasienter med autoimmune sykdommer, samt hos individer med ervervede immundefekter (AIDS) eller medfødte sådanne.

Tilsvarende analyse av inflammatoriske celler som finnes i tumorvevnad, er analog med ovenstående analyse, men komplise-res av samtidig tilstedeværelse av et stort antall tumorceller med varierende egenskaper. Disse tumorceller må i første rekke separeres fra de inflammatoriske cellene, hvilket kan skje gjennom tilgang til monoklonale antistoffer rettet mot forskjellige tumormarkører. Det er også av betydning å kunne studere rensede tumorcellesuspensjoner, m.a.o. forskjellige celleparametere. Analoge forhold gjelder også vev med pågående autoimmunprosess der inflammatoriske celler må adskilles fra fibroblaster og endotel og epiteliale vevceller.

Oppfinnelsen belyses nærmere i nedenstående eksempel.

E ksempel

60 mg tresylaktiverte magnetiske sfærer anvendes for kobling

av 1 mg protein A, hvoretter magnetsfærene stabiliseres med 1,6-diaminoheksan og etylendiamin. Til disse protein A-sfærer

adsorberes deretter antihumant IgG. ' Etter grundig vasking av ikke-bundet ligand inkuberes disse magnetsfærer med 53 millioner mononukleære humane celler fra perifert blod i 4 ml PBS i en time ved +4°C.

Etter magnetisk separering oppnås 8 millioner celler som er adsorbert og separert fra celleblandingen.

På disse "magnetiske celler" ble det deretter utført en bestemmelse av DNA-reparasjonsevne (UDS) ifølge standardi-sert teknikk med følgende resultater.

4 millioner celler pr. kultur.

Denne verdi på UDS kan anses isom helt normal, hvilket viser at den magnetiske separeringen og det faktum at cellene er dekket av magnetiske partikler, ikke påvirker analyse-resultatene .

Claims (2)

1. Fremgangsmåte ved diagnostisering in vitro av sykdomstilstander eller av predisponering for visse sykdommer hos dyr, inkl. mennesker, karakterisert ved at en suspensjon av viable celler fra dyr bringes i kontakt med magnetiske sfærer, hvilke sfærer derved adsorberes på celleveggene eller inkorporeres i cellene, og ved at de således magnetiserte viable celler separeres fra suspensjonen ved anbringelse av et ytre magnetfelt, hvoretter dé -viable cellene anvendes for analyse av celleparametere, slik som DNA-reparasjonsevne og/eller enzymaktivitet og/eller immunologisk reaktivitet.

2. Diagnostisk middel for anvendelse ved diagnostisering in vitro av sykdomstilstander eller predisponering for visse sykdommer hos dyr, inkl. mennesker, karakterisert ved at det utgjøres av magnetiske sfærer omfattende magnetiske partikler innesluttet i en polymer matrise.