NO840949L

NO840949L - PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF THE ALFA AMYLASE INACTIVATOR TENDAMISTAT IN CRYSTALLINE FORM

Info

Publication number: NO840949L
Application number: NO840949A
Authority: NO
Inventors: Laszlo Vertesy; Karlheinz Zepf
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1983-03-14
Filing date: 1984-03-13
Publication date: 1984-09-17
Also published as: JPS59192098A; FI840991A0; DK145584D0; FI840991A; DE3309059A1; ZA841851B; DK145584A; ES530517A0; AU2557084A; EP0121788A2; IL71225A0; ES8604307A1

Description

I tysk patent 27 01 890 samt i tysk OffenlegungsschriftIn German patent 27 01 890 as well as in German Offenlegungsschrift

30 38 130 og 31 07 106 omtales en peptidisk a-amylaseinaktivator som også betegnes som HOE 4 67 og tendamistat, og fremgangsmåte til dens fremstilling. I Offenlegungsschrift 3 0 38 13 0 omtales videre de nye høyaktive komponenter HOE 30 38 130 and 31 07 106 refer to a peptidic α-amylase inactivator which is also referred to as HOE 4 67 and tendamistat, and a method for its production. In Offenlegungsschrift 3 0 38 13 0, the new highly active components HOE are further discussed

467 A og HOE 467 B (avbygningsprodukt av HOE 467 A). Såvel HOE 4 67 som også enkeltkomponentene har den evne å hemme amylase/virksomt. På grunn av disse egenskaper kan forbindelsen f. eks. anvendes til regulering av blodsukkerspeilet. 467 A and HOE 467 B (breakdown product of HOE 467 A). Both HOE 4 67 and the individual components have the ability to inhibit amylase/effectively. Due to these properties, the compound can e.g. used to regulate the blood sugar level.

I det følgende står HOE 467 resp. tendamistat såvel som enkeltkomponentene som også for blandingen. In the following, HOE 467 or tendamistat as well as the individual components as well as for the mixture.

Tendamistat er et polypeptid. Isolering og rensning av slike eggehvitestoffer er vanligvis omstendelig, man er ved frem-stillingen vanligvis henvist til kromatografiske eller andre omstendelige fremgangsmåter (se Albert L. Lehninger: "Biochemie" Verlag Chemie, Weinheim 1975, side 115 og følgende). Således Tendamistat is a polypeptide. Isolation and purification of such egg white substances is usually laborious, one is usually referred to chromatographic or other laborious methods during production (see Albert L. Lehninger: "Biochemie" Verlag Chemie, Weinheim 1975, page 115 et seq.). Thus

er også i tysk patent 27 01 890 og det tyske Offenlegungsschrift 30 38 130 blitt omtalt kromatografisk rensemetode på ioneut-vekslere resp. absorbsjonsharpikser. Kromatografiske fremgangsmåter har imidlertid den ulempe at de i teknisk målestokk på grunn av deres omstendelighet forårsaker høye omkostninger er energiintensive og endelig belaster omgivelsene. chromatographic purification method on ion exchangers or absorption resins. Chromatographic methods, however, have the disadvantage that, on a technical scale, due to their complexity, they cause high costs, are energy-intensive and ultimately burden the environment.

Det ble nå overraskende funnet at fra kulturfiltratet av kulturoppløsningen av tendamistat-produserende mikroorganismer etter konsentrering og avsaltning uten etterfølgende kromatografiske fremgangsmåter kan tendamistat bringes direkte til krystallisering og renutvinnes. It was now surprisingly found that from the culture filtrate of the culture solution of tendamistat-producing microorganisms after concentration and desalting without subsequent chromatographic procedures, tendamistat can be brought directly to crystallization and purified.

Oppfinnelsen vedrører følgelig en fremgangsmåte til fremstilling av a-amylaseinaktivator tendamistat i krystallinsk form, samt inaktivatoren fremstilles etter denne fremgangsmåte.. The invention therefore relates to a method for producing the α-amylase inactivator tendamistat in crystalline form, and the inactivator is produced according to this method.

Spesielt foretrukket er et krystallinsk tendamistat for en overveiende del, spesielt 80 % eller mer, består av HOE 467 A. Fremgangsmåten erkarakterisert vedat kulturfiltratet av kulturoppløsningen av tendamistatproduserte mikroorganismer konsentreres og avsaltes, og deretter enten Particularly preferred is a crystalline tendamistat that for the most part, especially 80% or more, consists of HOE 467 A. The method is characterized in that the culture filtrate of the culture solution of tendamistat-producing microorganisms is concentrated and desalted, and then either

a) blandes med 0 til 30 % egnet med vann blandbart organisk oppløsningsmiddel, pH-verdien av denne oppløsning senkes ved a) mixed with 0 to 30% suitable water-miscible organic solvent, the pH value of this solution is lowered by

tilsetning av en i peptidkjemien vanlige syre av 3,2 til 5,5 eller senkes til 2 til 3, og økes en base til 3,2 til 5,5, og det i oppløsningen tilstedeværende tendamistat bringes eventuelt etter tilsetning av podningskrystaller med henstand til krystallisasjon og adskilles eller addition of an acid common in peptide chemistry of 3.2 to 5.5 or lowered to 2 to 3, and a base increased to 3.2 to 5.5, and the tendamistat present in the solution is optionally brought after addition of grafting crystals with a delay of crystallization and separate or

b) en i peptidkjemien vanlige syre innstilles på en pH-verdi mellom 1,0 til 3,0, eventuelt i oppløselige forurensninger b) an acid common in peptide chemistry is adjusted to a pH value between 1.0 and 3.0, possibly in soluble impurities

adskilles den dannede oppløsning, blandes med et for krystallisasjonen av eggehvitestoffer vanlige salt, og det i oppløsningen tilstedeværende tendamistat bringes eventuelt etter tilsetning av podningskrystaller ved henstand til krystallisasjon og adskilles. the formed solution is separated, mixed with a salt common for the crystallization of egg whites, and the tendamistat present in the solution is optionally brought after the addition of grafting crystals to crystallization and separated.

Det utkrystalliserte tendamistat adskilles f. eks. ved filtrering eller sentrifugering fra moderluten og tørkes deretter. Virksomme stoffer er fremstillet ved denne fremgangsmåten meget ren. Hvis nødvendig kan det omkrystalliseres og således igjen renses. The crystallized tendamistat is separated, e.g. by filtration or centrifugation from the mother liquor and then dried. Active substances are produced by this method very cleanly. If necessary, it can be recrystallized and thus purified again.

Ved styring av fermentasjonsparametere f. eks. fermentasjons-tiden, kan i kulturfiltratet den respektive del av komponentene HOE 467 A og HOE 467 B påvirkes, således at kulturfiltratet inneholder en av komponentene i overveiende deler. When controlling fermentation parameters, e.g. fermentation time, in the culture filtrate the respective part of the components HOE 467 A and HOE 467 B can be affected, so that the culture filtrate contains one of the components in predominant parts.

Tendamistatproduserende mikroorganismer er eksempelvis streptomyce tendae ATCC 31 210 og Streptomyce tendae DSM 1912. Ved gjennomføring av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes spesielt kulturfiltratet av kulturoppløsninger av disse to stammer. Da det virksomme stoff hovedsaklig befinner seg i flytende vandige fase av kulturoppløsningen, adskilles fast-stoff delen av kulturoppløsningen på kjent måte, f.eks. ved fra-sugning. Fremgangsmåte til fremstilling av kulturfiltratene omtales eksempelvis i tysk patent 27 01 890. og tysk Offen-legungsschrif t 30 38 130. Den klare vandige fase, kulturfiltratet konsentreres f. eks. ved destillering og avsaltes ved dialyse. Fordelaktig er også ultrafiltrering idet konsentrering og avsaltning kan gjennomføres i et trinn. Tendamistat-producing microorganisms are, for example, streptomyce tendae ATCC 31 210 and Streptomyce tendae DSM 1912. When carrying out the method according to the invention, the culture filtrate of culture solutions of these two strains is used in particular. As the active substance is mainly in the liquid aqueous phase of the culture solution, the solid part of the culture solution is separated in a known manner, e.g. by suction. Procedures for producing the culture filtrates are described, for example, in German patent 27 01 890 and German Offen-legungsschrift 30 38 130. The clear aqueous phase, the culture filtrate, is concentrated, e.g. by distillation and desalted by dialysis. Ultrafiltration is also advantageous, as concentration and desalination can be carried out in one step.

Fremgangsmåte a) gjennomføres hensiktsmessig som følger: Det best mulig avsaltede kulturfiltratet dannet etter den i tysk patent 27 01 890 eller tysk Offenlegungsschrift 30 38 130 omtalte metode og en pH-verdi på 6-8, konsentreres et innhold på 3 til 300 g tendamistat/liter, fortrinnsvis 20 til 100 g/liter væske. 0 til 30 %, fortrinnsvis 5 til 15 % av et egnet med vann blandbart organisk oppløsningsmiddel tilsettes. Det frafiltreres fra eventuelt utfelte forurensninger, og oppløs-ningen konsentreres eventuelt deretter igjen. Egnede oppløs-ningsmidler er f. eks. lavmolekylære alkoholer som metanol, etanol, n-propanol og isopropanol og ketoner, som f. eks. aceton og metyletylketon, spesielt egnet er isopropanol, etanol og aceton. Oppløsningens pH-verdi senkes til 3,2 til 5,5, fortrinnsvis 4,2 til 5,2. Fordelaktig er å gå frem således at syretilsetningen bare foregår til den pH-verdi hvor opp-løsningen akkurat forblir klar (pH 4,6 til 5,2). Procedure a) is carried out appropriately as follows: The best possible desalted culture filtrate formed according to the method described in German patent 27 01 890 or German Offenlegungsschrift 30 38 130 and a pH value of 6-8 is concentrated to a content of 3 to 300 g of tendamistat/ litre, preferably 20 to 100 g/litre of liquid. 0 to 30%, preferably 5 to 15%, of a suitable water-miscible organic solvent is added. Contaminants that may have precipitated are filtered off, and the solution is then possibly concentrated again. Suitable solvents are e.g. low molecular weight alcohols such as methanol, ethanol, n-propanol and isopropanol and ketones, such as e.g. acetone and methyl ethyl ketone, particularly suitable are isopropanol, ethanol and acetone. The pH value of the solution is lowered to 3.2 to 5.5, preferably 4.2 to 5.2. It is advantageous to proceed in such a way that the addition of acid only takes place to the pH value where the solution just remains clear (pH 4.6 to 5.2).

For innstilling av pH-verdien egner det seg i peptidkjemien vanlige syrer, som f. eks. svovelsyre, saltsyre og eddiksyre. Henstand av oppløsningen ved temperaturer fra 0° til 6 0°C fortrinnsvis fra 5° til 25°C fører til krystallisasjon. Det kan også være fordelaktig tilsetning av podekrystaller inntil blandingen. Etter 1 til 50 timer har krystalliseringen fore-gått. Den kan eventuelt fullstendiggjøre ved korrektur av pH-verdien til 3,8 til 5, samt ved avkjøling til 0 til 6°C, og ny henstand til 0,1 til 14 dager. Den dannede J^rystallmasse adskilles deretter på i og for seg kjent måte, omkrystalliseres eventuelt og tørkes. Utbyttet utgjør alt etter forurensninger av utgangsmaterialet (kulturfiltratet) inntil over 95%(referert til innholdet i kulturfiltratet). For setting the pH value, common acids are suitable in peptide chemistry, such as e.g. sulfuric acid, hydrochloric acid and acetic acid. Allowing the solution to stand at temperatures from 0° to 60°C, preferably from 5° to 25°C, leads to crystallization. It can also be advantageous to add seed crystals to the mixture. After 1 to 50 hours, crystallization has taken place. It can possibly be completed by correcting the pH value to 3.8 to 5, as well as by cooling to 0 to 6°C, and a new standstill of 0.1 to 14 days. The formed crystal mass is then separated in a manner known per se, possibly recrystallized and dried. Depending on contamination of the starting material (the culture filtrate), the yield amounts to over 95% (referred to the content of the culture filtrate).

Den omtalte fremgangsmåte er en krystallisasjon av den isoelektriske form av tendamistatet hvis isoelektriske punkt for komponent HOE 467 A er blitt bestemt til 4,35. Maksimum av tungtoppløselighet av denne isoelektriske form, The described method is a crystallization of the isoelectric form of the tendamistate whose isoelectric point for component HOE 467 A has been determined to be 4.35. The maximum of heavy solubility of this isoelectric form,

er selvsagt ved pH 4,35.is of course at pH 4.35.

Hvis det avsaltede og konsentrerte kulturfiltratet er meget forurenset er det fordelaktig å innstille den vandige eller vandige alkoholiske resp. vandige acetoniske oppløsning på If the desalted and concentrated culture filtrate is very contaminated, it is advantageous to set the aqueous or aqueous alcoholic resp. aqueous acetone solution on

pH 2 til 3. Tendamistatet befinner seg i dette pH-området i fravær av salter, klart i oppløsning. Nå kan man ved tilsetning av en lut, f. eks. natronlut heve pH-verdien så vidt at igjen den isoelektriske krystallisasjon kan foregå, altså pH 2 to 3. Tendamistate is in this pH range in the absence of salts, clearly in solution. Now, by adding a lye, e.g. caustic soda raise the pH value to such an extent that again the isoelectric crystallization can take place, i.e

i pH-området 3,2-5,5, fortrinnsvis 3,2-4,5.in the pH range 3.2-5.5, preferably 3.2-4.5.

Tilsvarende fremgangsmåte b) innstilles det avsaltede og konsentrerte kulturfiltrat (oppnådd f. eks. etter i tysk patent 27 01 890, resp. tysk Offenlegungsschrift 30 38 130 omtalte metoder) som inneholder tendamistatet i vandig, opp-løsning, med en i peptidkjemien vanlige syrer til pH 1,0 til 3,0, fortrinnsvis til pH 2,0 til 2,8. Som syrer egner det seg de som er nevnt for fremgangsmåte a). Herved befinner a-amylase-inaktivatoren seg i oppløsning, mens forurensninger som f. eks. fremmedeggehviter kan danne utfellinger som eventuelt etter tilsetning av fellingsmidler kan fjernes ved filtrering resp. sentrifugering. Til den klare sure tendamistat-oppløsning setter man oppløsningen et for krystallisering av eggehvitestoffer vanlig salt. Egnede anioner er eksempelvis klorid, bromid, sulfat, fosfat, citrat, spesielt egnet er klorid-ioner. Som klorider kan det anvendes tallrike uorganiske eller organiske salter, som f. eks. natriumklbrid, kaliumklorid, ammoniumklorid, dimetylamid, hydroklorid eller lignende. Corresponding method b) the desalted and concentrated culture filtrate (obtained, for example, according to methods mentioned in German patent 27 01 890, resp. German Offenlegungsschrift 30 38 130) containing tendamistate in aqueous solution, is mixed with an acid common in peptide chemistry to pH 1.0 to 3.0, preferably to pH 2.0 to 2.8. Suitable acids are those mentioned for method a). Hereby, the α-amylase inactivator is in solution, while contaminants such as e.g. Foreign egg whites can form precipitates which, if necessary, after the addition of precipitants can be removed by filtration or centrifugation. To the clear acidic tendamistat solution, a common salt for crystallization of egg whites is added to the solution. Suitable anions are, for example, chloride, bromide, sulphate, phosphate, citrate, particularly suitable are chloride ions. Numerous inorganic or organic salts can be used as chlorides, such as e.g. sodium chloride, potassium chloride, ammonium chloride, dimethylamide, hydrochloride or the like.

Typen av kation i saltet er av sekundær betydning. Den sure krystallisering foregår i det angitte pH-området med 0,1 til 4-molar kloridtildosering, fortrinnsvis imidlertid med 0,2 til 0,5 mol/liter. The type of cation in the salt is of secondary importance. The acidic crystallization takes place in the specified pH range with 0.1 to 4 molar chloride dosage, preferably however with 0.2 to 0.5 mol/litre.

For isolering av det virksomme stoff sentrifugeres eller filtreres blandingen etter 0,1 til 28 dager, fortrinnsvis etter 4 dager eventuelt etter tilsetning av podningskrystaller. Man får krystallinsk tendamistat som fri syre, hvis basiske grupper foreligger i hydrokloridform, eventuelt ved bromid-sulfat-, eller citratform. For ytterligere rensning kan krystallmassen oppløses i vann under natronluttilsetning idet den resulterende pH-verdi ligger mellom 5,5 og 8. Denne oppløsning kan deretter avsaltes ved dialyse eller ved ultrafiltrering, og deretter tørkes etter i og for seg kjente fremgangsmåter. Utbyttet utgjør alt etter renhet inntil over 90 % (referert til innholdet av kulturfiltratet). To isolate the active substance, the mixture is centrifuged or filtered after 0.1 to 28 days, preferably after 4 days, possibly after the addition of seed crystals. Crystalline tendamistat is obtained as a free acid, whose basic groups are present in hydrochloride form, possibly in bromide-sulphate or citrate form. For further purification, the crystal mass can be dissolved in water with the addition of caustic soda, the resulting pH value being between 5.5 and 8. This solution can then be desalted by dialysis or by ultrafiltration, and then dried according to methods known per se. Depending on purity, the yield is up to over 90% (referred to the content of the culture filtrate).

Krystallene av den sure form og den isoelektriske form er ikke like: Således kan f. eks. krystalliseringen av nye blandinger ikke aksellereres ved påpodning av den eventuelt andre krystall-type: Altså den isoelektriske krystallisasjon ikke med krystallinsk fri tendamistatsyre eller krystallisasjonen i syrer med f. eks. NaCl ikke med den isoelektriske tendamistatform. Derimot fører den artsegne påpodning den eventuelle krystallisasjon til hurtig krystalldannelse. Podningskrystaller fremstiller man etter fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen, idet det som utgangsmaterial anvendes ifølge tysk patent 27 01 890 resp. tysk Offenlegungsschrift 30 38 130 fremstillet HOE The crystals of the acidic form and the isoelectric form are not the same: Thus, e.g. the crystallization of new mixtures is not accelerated by grafting the possibly other crystal type: So the isoelectric crystallization not with crystalline free tendamistatic acid or the crystallization in acids with e.g. NaCl not with the isoelectric tendamistat form. In contrast, the species-specific grafting leads to the eventual crystallization to rapid crystal formation. Grafting crystals are produced according to the method according to the invention, as the starting material is used according to German patent 27 01 890 resp. German Offenlegungsschrift 30 38 130 produced HOE

467 i form av vandigi oppløsning i steden for kulturfiltratet. Ved eventuelt flere ganger omkrystallisering oppnås tenda-mistatpreparater av stor renhet, sammenlignbar med stoffer fremstillet etter en vanlig isoleringsfremgangsmåte. Da imidlertid såvel materialanvendelsen som også den nødvendige energi er forholdsvis liten ved krystallisasjonsfremgangsmåten, er dens anvendelse et verdifullt bidrag til fremstilling av det potente virksomme stoff tendamistat. 467 in the form of an aqueous solution instead of the culture filtrate. By possibly recrystallization several times, tendamistat preparations of high purity are obtained, comparable to substances produced according to a normal isolation procedure. However, since the material use as well as the required energy is relatively small in the crystallization process, its use is a valuable contribution to the production of the potent active substance tendamistat.

Det var overraskende at tendamistat ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremkommer krystallinsk og i høye utbytter, da a-amylase-inaktivatoren hører til eggehvitelegemer, disse høymolekylære forbindelser tenderer bare lite til krystallisering. It was surprising that tendamistat in the method according to the invention appears crystalline and in high yields, as the α-amylase inactivator belongs to egg white bodies, these high molecular weight compounds tend only slightly to crystallize.

Det etter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen dannede tendamistat har en i tysk Offenlegungsschrift 30 38 130 omtalt a-amylasehemmende aktivitet og egner seg derfor f. eks. like-ledes for regulering av blodsukkerspeilet. The tendamistat formed according to the method according to the invention has an α-amylase inhibitory activity described in German Offenlegungsschrift 30 38 130 and is therefore suitable, e.g. likewise for regulating the blood sugar level.

Forbindelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksempler. The connection will be explained in more detail with the help of some examples.

Eksempel 1Example 1

150 liter av den etter angivelsen i det tyske Offenlegungsschrift 30 38 130 fremstilte kulturoppløsning, idet fermentasjons-tiden er nedsatt til 45 til 60 timer befries ved hjelp av sentrifuge (30 00 G) for de uoppløste bestanddeler. Herved oppstår 2 00 liter lysebrunt kulturfiltrat inneholdende 0,5 g tendamistat/liter som konsentreres med en ultrafiltrerings-anlegg til 20 liter og avsaltes. 150 liters of the culture solution prepared according to the specification in the German Offenlegungsschrift 30 38 130, the fermentation time being reduced to 45 to 60 hours, is freed by means of a centrifuge (30 00 G) for the undissolved components. This results in 200 liters of light brown culture filtrate containing 0.5 g of tendamistat/litre, which is concentrated with an ultrafiltration system to 20 liters and desalted.

Eksempel 2Example 2

Konsentratet fra eksempel 1 på 20 liter blandes i første rekke med 5 liter etanol og innstilles deretter med 400 ml 10 %-ig saltsyre til pH 2,3. Den dannede utfelling av høymolekylære fremmedeggehviter frafiltreres. Den klare flytende fase konsentreres deretter ved ultrafiltrering til 8 liter og vaskes idet alkoholdelen senkes til mindre enn 1 %. The concentrate from example 1 of 20 liters is first mixed with 5 liters of ethanol and then adjusted with 400 ml of 10% hydrochloric acid to pH 2.3. The formed precipitate of high molecular weight foreign egg whites is filtered off. The clear liquid phase is then concentrated by ultrafiltration to 8 liters and washed while lowering the alcohol portion to less than 1%.

Til denne oppløsning settes 107 kokesalt. Deretter avkjøles oppløsningen til 1°C og blandes med podningskrystaller. Etter henstand natten over tilsettes tre ganger daglig hver gang 10 g kokesalt til blandingen inntil 90 % av aktiviteten befinner seg i krystallfiltratet. Dette er tilfelle etter 3-4 dager. Etter foretatt krystallisering avsentrifugeres i sentrifuge ved 6000 G, det faste virksomme stoff adskilles og oppløses i maksimalt 2 liter vann under natronluttilsetning, avsaltes ved hjelp av ultrafiltrering og frysetørkes. Ut byttet utgjør 72 g tendamistat (tilsvarende 72 % referert til 200 liter kulturfiltrat) inneholdende minst 90 % HOE 467 A. Add 107 g of sodium chloride to this solution. The solution is then cooled to 1°C and mixed with seed crystals. After standing overnight, 10 g of common salt are added three times a day each time to the mixture until 90% of the activity is in the crystal filtrate. This is the case after 3-4 days. After crystallisation, it is centrifuged in a centrifuge at 6000 G, the solid active substance is separated and dissolved in a maximum of 2 liters of water while adding caustic soda, desalted using ultrafiltration and freeze-dried. The yield amounts to 72 g of tendamistat (corresponding to 72% referred to 200 liters of culture filtrate) containing at least 90% HOE 467 A.

Eksempel 3Example 3

Til 20 liter av det ifølge eksempel 1 fremstilte konsentrat settes iseddik til oppnåelse av pH-verdien på 5,2, samt 2 liter isopropanol. Den derved dannede utfelling av fremmedegge-hvite-forurensning frafiltreres. Det klare filtrat konsentreres ved ultrafiltrering til 10 liter, avkjøles til 6°C og deretter innstilles ved iseddik på PH 4,8. Den til å begynne med klare isopropanoliske oppløsning krystalliserer spontant, blandes med noen podekrystaller. Etter 24 timer er det dannet seg en krystallgrøt hvis pH-verdi senkes til 4,6. Etter ytterligere 48 timer, frasentrifugeres og vaskes med vann. Den lyse krystallmasse frysetørkes deretter uten å bli oppløst. Utbyttet utgjør 61 g (tilsvarende 61 % referert til 200 liter kulturfiltrat) inneholdende minst 90 % HOE 467 A To 20 liters of the concentrate prepared according to example 1, add glacial acetic acid to achieve the pH value of 5.2, as well as 2 liters of isopropanol. The resulting precipitate of foreign egg-white contamination is filtered off. The clear filtrate is concentrated by ultrafiltration to 10 litres, cooled to 6°C and then adjusted with glacial acetic acid to PH 4.8. The initially clear isopropanol solution crystallizes spontaneously, mixing with some seed crystals. After 24 hours, a crystal slurry has formed whose pH value is lowered to 4.6. After a further 48 hours, centrifuge and wash with water. The bright crystal mass is then freeze-dried without being dissolved. The yield amounts to 61 g (corresponding to 61% referred to 200 liters of culture filtrate) containing at least 90% HOE 467 A

Claims

1. Process for producing tendamistat, characterized in that the culture filtrate of culture solutions of tendamistat-producing microorganisms is concentrated and desalted, and then either a) is mixed with 0 to 30% by weight of a suitable water-miscible organic solvent, the pH value of this solution is lowered by adding an acid common in peptide chemistry to 3.2 to 5.5 or lowered to 2 to 3, and is increased by a base to 3.2 to 5.5 and the tendamistat present in the solution is optionally brought after the addition of grafting crystals to crystallization and separated, or b) adjusted with an acid common in peptide chemistry, to a pH value between 1.0 to 3.0, possibly insoluble impurities are separated, the resulting solution is mixed with a salt common for crystallization of egg whites, and the tendamistat present in the solution is optionally brought after addition of seed crystals with delay for crystallization and separated.

2. Method according to claim 1, characterized in that the culture filtrate of the culture solution of Streptomyces tendae ATCC 31 210 or Streptomyces tendae DSM 1912 is used.

3. Method according to claim 1, characterized in that sulfuric acid, hydrochloric acid or acetic acid is used as acid.

4. Method according to claim 1, characterized in that in method a) 5 to 15% isopropanol, ethanol or acetone is used as solvent.

5. Method according to claim 1, characterized in that in method a) a pH value is set between 4.2 and 5.2.

6. Method according to claim 1, characterized in that in method b) a salt is used whose anion is chloride, bromide, sulphate, phosphate or citrate.

7. Method according to claim 1, characterized in that a chloride is used as salt.

8. Crystalline tendamistat formed by a method according to claim 1 or 2.

9. Crystalline tendamistat formed by a method according to claim 1 or 2, consisting to a large extent of HOE 467 A.