NO840880L - Peptid og fremgangsmaate for dets fremstilling - Google Patents

Description

Foreliggende fremgangsmåte angår peptider som inhiberer frigivelsen av gonadotropiner fra hypofysen i pattedyr, inn-befattet menneske; og fremgangsmåter for å forhindre ovulasjon og eller inhibering av frigivelse av steroider. Nærmere bestemt angår foreliggende oppfinnelse peptider

som inhiberer funksjonen til gohadene og frigivelse av stero-idé .hormoner, progesteron og testosteron.

Hypofysen er forbundet via en stilk til den regionen på hjernens underside som kalles hypotalamus. Blant de hormoner som frigjøres fra hypofysenvskal spesielt nevnes det follikkélstimulerende hormon (FSH) og det luteiniserende hormon (LH), som fra tid til annen benevnes gonadotropiner eller gonadotrope hormoner. Disse hormonene regulerer i fellesskap funksjonen til gonadene hvorved det frembringes testosteron i testiklene og progesteron og esterogen i ovarene og videre er også disse hormonene med på å regulere produksjon og modning av gameter.

Frigivelse av et hormon fra hypofysens fremre lapp er vanligvis avhengig av en forutgående frigivelse av en annen type hormoner som frembringes av hypotalamus. En av hypotalamushormonene virker som en utløsende faktur på frigivelsen av de godadotropiske hormoner, særlig LH, og dette hormon vil i det følgende refereres til som GnRH selv om det andre steder er gitt betegnelsene LH-Rh og LRF.

GnRH er isolert og kjennetegnet ved å være dekapeptid med følgende truktur:

p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

Piptider er forbindelser som inneholder to eller flere aminosyrer i hvilke karboksylgruppen til en syre er forbundet med aminogruppen til en annen syre. Formelen til GnRH som angitt ovenfor er i overensstemmelse med konvensjonelle regler for representasjon av peptilder der aminoterminus angis til venstre og karboksylterminus angis til høyre. Aminosyrens posisjon angis ved å numerere aminosyrerestene fra venstre mot høyre. Når det gjelder GnRH er hydroksyldelen i karboksylgruppen til glysin er-stattet med en aminogruppe (NH2). De ovenfor angitte for-kortelser for hver enkelt av aminosyrerrestene er konvensjonell og er basert på trivialnavnet til aminosyren,

det vil si p-Glu er pyroglutansyre, His er histidin, Trp er tryptofan, Ser er serin, Tyr er tyrosin, Gly er glysin, Leu er leucin, Orn er ornitin, Arg er arginin, Pro er prolin, Sar er sarcosin, Phe er fenylalanin og Ala er alanin. Disse aminosyrene sammen med valin, isoleucin, treonin, lysin, aspartinsyre, asparagin, glutamin cystein, metionin, fenylalanin, og prolin anses i alminnelighet å utgjøre de vanlig naturlige forekommende aminosyrer eller aminosyrer av proteinopprinnelse. Med unntak av glycin er aminosyrene i følge oppfinnelsen av L-konfigurasjon med mindre annet er angitt.

Det er velkjent at substitusjon med det aminosyrer i stedet for Gly i 6-stillingen i GnRH decapeptide eller nonapep-tide tilveiebringer GnRH analoger med vesentlig høyere virkning enn GnRH når det gjelder frigivelse av LH og FSH (det vil si gonadotropinene) fra hypofysen i pattedyr. Det er også velkjent at substitusjon med forskjellige aminosyrer i stedet for His (eller utelatelse av His) i 2-stillingen i GnRH decapeptide frembringer analoger med en inhiberende virkning på frigivelsen av LH og andre gonadotropiner fra hypofysen til pattedyr.

Det er grunner til å ville hindre ovulasjon i pattedyr av hunnkjønn og administrasjon av GnrH analoger som er antagonistiske i forhold til den normale funksjonen til GnRH har vært brukt for å undertrykke eller utsette ovulasjon. Av denne grunn er analoger av GnRH som er antagonistiske til GnRH, undersøkt med hensyn til deres mulige bruk som befruktningshindrende middel eller for å regulere de fukt-bare perioder. GnRH antagonister kan også anvendes for å behandledfor tidlig innsettende pubertet og endometriose for å fremskynde vekt av hunndyr. Slike antagonister er også funnet å være anvendelige for å regulere sekresjonen av gonadotropiner i pattedyr av hannkjønn og kan anvendes for å stanse spermatogenese, det vil si som mannlige befruktningshindrende midler, og for behandling av hyper-trofiaprostatae. Det er derforønskelig å tilveiebringe forbedrede peptider som er sterkt antagonistiske i forhold til endogent GnRH og som forhindrer sekresjon av LH og frigivelse av steroider fra gonadene i pattedyr.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer peptider som inhiberer frigivelse av gonadotropiner i pattedyr, menneske inkludert, og forelaggende oppfinnelse tilveiebringer også fremgangsmåter for å inhibere frigivelse av steroider fra gonadene til pattedyr av både hann og hunnkjønn. De forbedrede GnRH analoger er sterkt antagonistiske ovenfor GnRH og har en inhiberende virkning på reproduksjonsprosessene i pattedyr. Disse analoger kan anvendes for å inhibere produksjonen av gonadotropiner og sexhormoner under forskjellige forhold innbefattende fortidlig innsettende pubertet hormonavhengig neoplasia, dysmenorea og endometriose.

I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse er det frem-stilt peptider som sterkt inhiberer sekresjonen av gona-tropiner fra hypofysen til pattedyr, menneske inkludert,

og eller inhiberer frigivelse av steroider fra gonadene. Disse peptidene er analgger av GnRH hvori det har funnet sted en substitusjon i en stilling så som dehydro-Pro, D-pGlu, D-Phe, D-Trp eller jft -(2-naftyl)-D-alanin (i det følgende ^-D-2NAL) en substitusjon i 2-stilling i form av et halogenert D-Phe, en substitusjon i 3-stilling i form av D-Trp eller & -D-2NAL en substiusjon i 6-stilling pluss en substituent i 5-stillingen i form av en halogenert L-Phe eller L-Tyr og eller substitusjon med en diaminosyre med ikke mer enn 5 karbonatomer i 4-stillingen. Substituenten

i 1-stillingen kan modifiseres slik at dens alfaaminogruppe inneholder en asylgruppe så som formyl, acetyl, akrylyl, vinylacetyl eller benzoyl idet acetyl(Ac) og akrylyl(Acr) er foretrukket. Modifisert L-Phe eller L-Tyr i 5-stillingen tilveiebringer økt antagonistisk virkning som et resultat av de særegne modifikasjoner i benzenringen. Enkle substitusjoner av hydrogen foretas i enten 2- eller 3-stilling og som substituenter. velges klor, fluor jod, brom eller ni tro, idet klor og fluor foretrekkes. For eksempel dersom I-Tyr er innført i 5-stillingen, er I tilstede som substituent i meta eller 3-stillingen. Dersom £ -D-NAL er tilstede i 1-stillingen, er en hydrofil det aminosyrerest, så som 4-NH2-D-Phe, 4-guanidino-D-Phe, D-His, D-lys, D-Orn, D-Arg eller D-Har(Homoarginin) tilstede i 6-stillingen. Dersom dehydro-Pro er tilstede i 1-stillingen, foretrekkes det at D-isomeren av en lopofil aminosyre så som D-Trp, D-Phe, D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Tyr, D-Val, D-Ala, D-Ser(OtBu)

3<>>-D-2NAL eller (imBzl)D-His er tilstede i 6-stillingen. Substitusjonene i 4-, 1-. og IC-stillingene kan i alminnelighet skje etter fritt valg.

Siden disse paptidene er meget effektive når det gjelder å inhibere frigivelse av LH, benevnes de ofte som GnRH antagonister. Peptidene inhiberer ovulasjon i hunnpattedyr ved adminastrasjon i meget lave doser proesterøst og er også effektive når det gjelder å fremkalle resorpsjon av be-fruktede egg dersom peptidene administreres kort etter konsepsjon. Disse peptidene er også effektive som befruktningshindrende midler for hannpattedyr.

Nærmere bestemt representerer peptidene i følge oppfinnelsen av"følgende formel I:

X-R1-R2-D-Trp-R4-R5-Rg-R7-Arg-Pro-R1Q

hvori X er hydrogen eller en asylgruppe med 7 eller færre karbonatomer R^er dehydro-Pro, D-pGlu, D-Phe, D-Trp eller $ -D-NAL, R2er Cl-D-Phe, F-D-Phe, No2~D-Phe, C«<Me-4-Cl-

D-Phe, Cl2-D-Phe eller Br-D-Phe, R^er Ser Orn, AAL eller

aBu, R5er Tyr, 3-F-Phe, 2-F-Phe, 3-I-Tyr, 3-CH3~Phe, - 2- CH3-Phe, 3-Cl-Phe eller 2-Cl-Phe, R&er enD-isomer av en lipofil aminosyre eller 4-NH2~D-Phe, D-Lys, D-Orn, D-Har, D-His, 4-gua-D-Phe eller D-Arg, R7er Leu eller Ne<Me-Leu,

og R10er Gly-Nh2, Gly-OCH3, Gly-OCH2CH3, Sar-NH2, D-Ala-

NH2eller NH-Y, hvdri Y er lavere alkyl, cykloalkyl,

fluoro lavere alkyl eller NH-Co-NH-Q.hvori Q er H eller lavere alkyl, idet D-trp i 3-stillingen kan byttes ut med J> -D-2NAL under forutsetning av at når R^ er £ -D-NAL så

er Rg 4-NH2-D-Phe, D-Lys, D-Orn, D-Har, D-His, 4-gua-D-Phe eller D-Arg videre under forutsetning av at når Rj. er Tyr eller 2-Cl-Phe så er R4 „ enten Orn, AA1 eller aBu eller R1.

er & -D-2NAL og Rg er D-His eller 4-gua-D-Phe.

Med P -D-NAL menes D-isomeren av alanin substituert med

naftyl ved & -karbonatomet og som også kan gis betegnelsen. 3- D-NAL. Foretrukket anvendes 3<>>-D-2NAL, i hvilke j£ -karbonatomet er forbundet med naftalen i 2-stillingen i ringstruk-turen: imidlertid kan også J>-D-1NAL anvendes. Med AAL menes £ -amirio-Ala og med aBu menes o< ,& diamino smørsyre idet Ser i 4-stillingen kan byttes ut med AAL, aBu eller Orn. Dersom det utføres en slik utskiftning av Ser er det foretrukket å anvende £ -D-2NAL i 3- og 6-stillingene og dehydro Pro i 1-stillingen.

Peptidene i følge foreliggende oppfinnelse kan syntetiseres ved.klssiske løsningsmiddelsynteser eller ved en fast fase-teknikk under anvendelse av en klormetylert harpiks en metylbenzhydrylaminharpiks (MBHA) en benzhydrylamin (BHA) harpiks eller enhver egnet harpiks som er kjent fra teknikkens område. Fast fasesyntesen utføres ved trinnvis å addere aminosyrene i kjeden på den måten som er beskrevet i detalj i US-patent nr. 4.211.693. Det foretrekkes å addere sidekjedebeskyttende grupper som er velkjente fra teknikkens område, til Ser, Tyr og Arg når disse er tilstede, såvel som til visse substituenter. Sidekjedebeskyttende grupper kan om ønsked adderes til Trp før disse aminosyrer kobles til kjeden som er under oppbygning på harpiksen. En slik metode tilveiebringer den fullt beskyttede intermediære peptido-harpiks.

Mellomprodukter i følge oppfinnelsen kan representeres ved formel II: X<1->R1-D-Trp(X<2>)-Ser(X<3>)-R5(X<4>)-R6(X<5>)-R7-Arg(X<5>)-Pro-X<6>hvori X^" er en ©C-aminobeskyttende gruppe av en type som er kjent for å være anvendelig i den trinnvise syntese av polypeptider og dersom X i det ønskede peptidmaterialet er en bestemt asylgruppe, så kan denne gruppe anvendes som beskyttende gruppe. Blant de typer av^C-aminobeskyttende grupper som dekkes av X"*" er (1) asyltype beskyttende grupper så som formyl(For), trifluoracetyl, ftalyl, p-toluensulfo-nyl(Tos), benzoyl(Bz) benzensulfonyl, o-nitrofenylsulfenyl (Nps), tritylsulfenyl, o-nitrofenoxyacetyl, acrylyl(Acr) kloracetyl acetyl(Ac) og -klorbutyryl (2) aromatiske beskyttelsesgrupper av uretantypen det vil si benzyloksycar-bonyl (Z) og substituert benzyloksykarbonyl så som p-klor-benzyloksykarbonyl (C1Z), p-nitrobenzyloksykarbonyl p-brombenzyloksykarbonyl og p-metoksybenzyloksykarbonyl (3) alifatiske beskyttelsegrupper av uretantypen så som tertbutyloksykarbonyl(Boe) diisopropylmetoksykarbonyl, isopropyloksykarbonyl, etoksykarbonyl og allyloksykarbo-nyl (4) cykloalkylbeskyttelse grupper av uretangruppen så som syklopentyloksykarbonyl, adamantyloksykarbonyl og cykloheksyloksykarbonyl (5) beskyttelsesgrupper av tiouretantypen så som fentyltiokarbonyl (6) alkylbeskyt-telsegrupper så som allyl(Aly) trifenylmetyl(tri tyl) og benzyl (Bzl),(7) trialkylsilangrupper så som trimetylsilan. Den foretrukne oi -aminobeskyttelsegruppe er Boe når X

er hydrogen.

X 2 er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for indol nitrogen så som formyl eller benzyl: i mange synteser er det imidlertid ikke nødvendig å beskytte Trp.

X<3>er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for den alkoholiske hydroksylgruppe i Ser så som acetyl, benzoyl, tetrahydropyranyl, tert-butyl, trityl, benzyl e|ler 2,6-diklorbenzyl idet benzyl er foretrukket. Dersom det er foretatt en utskiktning av Ser, kan X<3>alternativt være en beskyttelsesgruppe for en sidekjede aminogruppe,

så som Tos, Z eller C1Z.

X<4>er hydrogen eller en beskyttelsegruppe for den fenoliske hydroksylgruppen i Tyr dersom Tyr er til stede,

idet beskyttelsesgruppen er tetrahydropyanyl, tert-

butyl, trityl, benzyl, Z, 4-brombenzyloksykarbonyl, eller 2,6-diklorbenzyl. 2,6-diklorbenzyl er foretrukket.

X^ er en beskyttelsesgruppe for sidekjede guanidino gruppen eller aminogrupper eller imidazolegruppen i Arg eller Lys, His eller lignende så som nitro, Tos, trityl, benzyloksykarbonyl, adamantyloksykarbonyl, Z, eller Boe eller en beskyttelsesgruppe for Trp som X<2>

eller X 5 kan være hydrogen, med hvilket det menes at sidekjedegruppeatomene er ubeskyttet. Tos er i alminnelighet foretrukket.

X kan være Gly-0-CH_- [harpiksbærer]

0-CH2~[harpiksbærei^ D-Ala-O-C^- (harpiksbærerj Gly-NH- jharpiksbærerj eller D-Ala-NH- [harpiksbærer] og den kan være en OH, ester, amid eller hydrazid enten av Gly eller D-Ala eller forbundet direkte med Pro.

Kriterie for valg av sidekjedebeskyttelsesgruppene X 2 -X5 er at beskyttelsesgruppen må være stabil ovenfor det reagens som benyttes for å fjerne aminobeskyttelsesgruppen under de reaksjonsbetingelser som anvendes på hvert trinn i syntesen. Beskyttelsesgruppen bør ikke spaltes av under koblingsbetingelsene og beskyttelsesgruppen bør kunne fjernes ved avslutningen av syntesen av den ønskede aminosyresekvens under reaksjonsbetingelser som ikke vil

forandre peptidkjeden.

Dersom X^ gruppen er Gly-O-Cr^- [harpi ksbærerj D-Ala-0-CH2-[harpiksbærer) eller O-Cr^-fharpiksbærei^, er esterfunksjonen til en av de mange funksjonelle gruppene til polystyrenharpiksbæreren representert. Dersom X^ gruppen er Gly-NH- [harpiksbærej3 eller D-Ala-NH- [harpiksbærer} forbinder en amidbinding Gly eller D-Ala til en BHA harpiks eller til en MBHA harpiks.

Dersom X er acetyl, for eksempel i den endelige formel,

er det mulig å anvende acetylgruppen som X"*" beskyttelsesgruppe.for ^ -aminogruppen til D-NAL eller en hvilken som

helst aminosyre som anvendes i 1-stillingen-ved å tilsette den før koblingen av denne siste aminosyre til peptidkjeden. Det er imidlertid foretrukket å utføre en slik reaksjon med peptide på harpiksen (etter at #^-aminogruppen er frigjort mens sidekjedegruppene forblir beskyttet) f.eks. ved om-setning med eddiksyre i nærvær av disykloheksylkarboni-imid (DCC) eller foretrukket med eddiksyre anhydrid eller ved en annen egnet reaksjon som er kjent fra teknikkens område.

Det fullt beskyttede peptid kan avspaltes fra en klormetylert hapiksbærer ved amonolyse, som er velkjent fra teknikkens område, hvorved det fullt beskyttede amidmellom-produktet oppnås. Fjernelsen av peptidets beskyttelse, såvel som avspaltningen av peptide fra en benzhydrylamin-harpiks, kan finne sted ved 0°C med flussyre (HF). Det foretrekkes å tilsette anisol til peptidet før behandlingen med HF. Etter at HF er fjernet under vakuum, behandles det avspaltede ubeskyttede peptidet passende med eter, dekanteres, oppløses i fortynnet eddiksyre og lyofiliseres.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således også en fremgangsmåte for å fremstille et peptid eller et ikke-toksisk salt derav idét peptidet har formelen:

X- R1-R2-D-Trp-R4-R5-Rg-R7-Arg-Pro-R1Q,

hvori X er hydrogen eller en acylgruppe med 7 eller færre karbonatomer R1 er dehydro-Pro, D-pGlu, D-Phe, D-Trp eller > -D-NAL, R2er Cl-D-Phe, F-D-Phe, No2-D-Phe, C<*Me-4-Cl-D-Phe, Cl2-D-Phe eller Br-D-Phe, R4er Ser, Orn, AAL eller aBu, R5er Tyr, £-F-Phe, 2-F-Phe, 3-I-Tyr, 3-CH3~

Phe, 2-CH3-Phe, 3-Cl-Phe eller 2-Cl-Phe, Rg er en D-isomer

av en lipofil aminosyre, 4-NH2~D-Phe, 4-gua-D-Phe, D-His, D-Lys, D-Orn, D-Har eller D-Arg, R? er Leu eller Nø6Me-

Leu, og R1Qer Gly-NH2, Gly-OCH3, Gly-OCH2CH3<Sar-NH2>D-Ala-NH2eller NH-Y, der Y er lavere alkyl, cykloalkyl,

fluor lavere alkyl eller NH-CO-NH-Q hvor Q er H eller lavere alkyl, hvori D-Trp i 3-stillingen kan være byttet ut med £ -D-2NAL under forutsetning av at når R^ er

3 -D-NAL, så er Rg enten 4-NH2~D-Phe, 4-gua-D-Phe,

D-His, D-Lys, D-Orn eller D-Arg videre under forutset-

ning av at når Rj. er Tyr eller 2-Cl-Phe, så er enten R^

Orn, AAL eller aBu eller R, er D-2NAL og Rg er D-His

eller 4-gua-D-Phe, idet fremgangsmåten omfatter (a) og

danne en intermediær forbindelse med formelen: XI- R1-R^-D-Trp(X2)-R4(X3)-R5(X4)-Rg(X5)-R7-Arg(X5)-Pro-X6, hvori X er hydrogen eller en o^-aminobeskyttelsegruppe X 2 er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for indol nitrogenet X<3>er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for den alkoholiske hydroksylgruppe i Ser eller for en side-

kjede aminogruppe X 4er hydrogen eller en beskyttelses-

gruppe for den fenoliske hydroksylgruppe i Tyr, X^ er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for sidekjeden, og X<6>er Gly-0-CH2-(harpiksbærer), 0-CH2~(harpiksbærer), D-Ala-0-CH2-(harpiksbærer), Gly-NH-(harpiksbærer), D-Ala-NH-(harpiksbærer), Gly-NH2, eller estere, amider eller hydrasider,(b) og avspalte en eller flere av gruppene X"*" til X^ og avspalte harpiksbæreren som omfattes av X^

og om ønsket (c) å omdanne et oppnådd peptid til et ikke toksisk salt derav.

Rensing av peptide utføres ved ionebyttekromatografering

på en CMC kolonne etterfulgt av fordelingskromatogragering ved å anvende elueringssystemet: n-butanol, 0,1N eddiksyre (1:1 volumforhold) på en kolonne som er pakket med Sefadex G-25, eller ved å anvende HPLC som er kjent fra teknikkens område.

Peptidene i følge oppfinnelsen er virksomme ved nivåer på mindre enn 100 mikrogram pr. kilogram legemsvekt;. ved admini-strering av peptidene rundt middagstider samme dag som proesterøs for å forhindre ovulering i hunnrotter. For å oppnåen forlenget undertrykkelse av ovuleringen, kan det være nødvendig å anvende doser i området 0,1 til 2,5 milligram pr. kilogram legemsvekt. Disse antagonister er også effektive når det gjelder å forhindre spermatogenese ved regelmessig adminastrering til hannpattedyr- og kan således anvendes som befruktningshindrende midler. Siden disse forbindelser vil redusere testosteronnivået (en uønsket virkning i normale seksuelt aktive hanndyr) vil det være fornuftig å administrere erstatningsdoser med testo-stero sammen med GnRH antagonisten. Disse antagonister kan også anvendes for å regulere produksjonen av gonadotropiner og kjønnssteroider for andre formål som antydet ovenfor .

EKSEMPEL

Peptidéne ifølge tabell I med formelen:

Ac-R1-4-F-D-Phe-D-Trp-Ser-R5-Rg-Leu-Arg-Pro-R10

fremstilles ved den ovenfor angitte fast fasefremgangsmåten.

Som representaktivt eksempel angis riedenunder fast fasesyntesen av det ovenfor angitte peptid nr. 1, som er gitt betegnelsen (ac-J>-D-2NAL<1>, 4-F-D-Phe<2>, D-Trp<3>, 2-CH3-

Phe^, D-Arg<6>J-GnRH. Dette peptide har følgende formel: Ac-3*D-2NAL-4-F-D-Phe-D-Trp-Ser-2-CH3-Phe-D-Arg-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2.

Det anvendes en BHA harpiks og Boc-beskyttet Gly kobles

til harpiksen i løpet av en periode på 2 timer i CF^C^ idet det anvendes et 3-foldig overskudd av Boc-derivatet og DCC som aktiveringsreagens. Glycinresten forbindes til BHA harpiksen over en amidbinding.

Koblingen av hver aminosyrerest følges av vasking, deblokkering og kobling av neste aminosyrerest i overensstemmelse med følgende skjema idet en starter med ca. 5 gram harpiks og anvender en automatisk maskin:

Etter trinn 13 kan det taes en prøve for en ninhydrintest: dersom testen er negativ returnerer en til trinn 1 for kobling av neste aminosyre; dersom testen er positiv eller lett positiv, gjentas trinnet 9 til og med 13.

Det ovenfor angitte skjema anvendes for kobling av hver av aminosyrene i peptidene i følge oppfinnelsen etter at første aminosyre er blitt forankret. Nc(Boc beskyttelse anvendes for hver av de gjenværende aminosyrene gjennom hele syntesen. No(Boc-£ -D-2NAL fremstilles ved metoder som er kjent fra teknikkens stilling, f.eks. slik som beskrevet i US patent hr .';4 . 234 . 5 71 utgitt 18. november 1980. Sidekjeden til Arg beskyttes med Tos. OBzl anvendes som \side-kjédebeskyttelse for hydroksylgruppen i Ser. D-Trp forblir ubeskyttet. Ns<Boc-P-D-2NAL innføres som siste aminosyre. Boc-Arg(Tos) og Boc-D-Trp, som har lav løse-lighet i CH2C12, kobles ved å anvende DMF:CH2C12blandinger.

Etter deblokkering av©d-aminogruppen ved N-terminus, oppnås acetylering ved å anvende store overskudd av eddiksyre anhydrid i diklormetan. Dette frembringer det følgende molekyl: hc- Jb -DNAL-4F-D-Phe-D-Trp-Ser(OBzl)-2CH3-Phe-D-Arg(Tos)-Leu-Arg(T5s)-Pro-Gly-NH- [harpiksbærer) . Avspaltningen av peptide fra harpiksen og den fullstendige fjernelse av beskyttelsen av sidekjedene finner lettvint sted ved 0°C med HF. Anisol tilsettes som oppfangnings-middel ("scavenger") før HF behandlingen. Etter at HF er fjernet under vakuum, ekstraheres harpiksen med 50% eddiksyre og vaskefasene lyofiliseres for å tilveiebringe det rå peptid som pulver.

Peptidet renses deretter ved ionebyttekromatografi på CMC (Whatman CM 32, ved å anvende en gradient av 0,05 til 0,3M NH4OAc i 50/50 metanol/vann) etterfulgt av fordelings-kromatografi på en gelfiltrerings-kolonne ved å anvende elueringssystemet: n-butanol, 0,1N eddiksyre (1:1 - volumforhold).

I følge tynnsjiktkromatogragi med flere forskjellige løs-ningsmiddelsystem, såvel som ved å anvende reversert fase høytrykks væskekromatografi og en vanndig trietylamonium-fosfatløsning pluss acetonitril, syntes peptidet å være homogent. Aminosyreanalyse av det oppnådde rensede peptid er i overensstemmelse med formelen for den fremstilte struktur, idet en slik analyse gir heltallsverdier for hver av aminosyrene i kjeden. Optisk rotasjon målt på et f otoelektrisk polarimeter er [*><} 22)=-2 7, 5°+l ( c=l, 50%

eddiksyre).

Peptidet utprøves in vitro ,og in vivo. In vitrotesten ut-føres ved å anvende dissosierte hypofyseceller fra rotte som er holdt i kultur i 4 dager før utprøvningen. LH nivåene som bevirkes av tilførsel av peptidene undersøkes ved en spesifikk radioimunoassay for rotte LH. Celle-prøvene som anvendes som kontroll, mottar et mål med 3 nanomolar GnRH, mens utprøvningsskålene mottar et mål med 3 nanomolar GnRH pluss et mål med enten den nåværende standardantagonist for samligningsformål, det vil si ^c-dehydro Pro<1>, 4-F-D-Phe<2>, D-Trp3' 6J-GnRH eller det peptid som er under utprøvning, i konsentrasjoner på fra 0,01 til 10 nanamolar. Den mengde LH som utskilles i prøvene som bare er behandlet med GnRH, sammenlignes med den mengde som utskilles fra prøver som er behandlet med peptide pluss GnRH.

Evnen til det testede peptid til å redusere den mengde

LH som frigir av 3 nanomolar GnRH, sammenlignes med til-svarende verdi for nåværende standardpepti. Resultatene beregnet ved å anvende 3 til 5 doser av hver av peptidene ved hjelp av det statistiske program BIOPROG (tilveiebragt av D.. Rodbard NICHD) og som uttrykkes som virkningen i forhold til den nåværende standard. Standardpeptidet blokkerer i alminnelighet 50% av den mengde LH som frigjøres av GnRH ved et forhold som er mindre enn

Det ovenfor beskrevne peptid anvendes også for å bestemme hvor effektivt peptidet er når det gjelder å forhindre ovulering i hunnrotter. I denne testen injiseres et antall modne hunn Sprague-Dawley rotter, hver med en legemesvekt på fra 225 til 250 gram, med 10 mikrogram av peptidet i maisolje omkring middagstider på dagen for proesterøs. Proesterøs er kvelden før esterøs (ovulering). En egen gruppe med hunnrotte anvendes som referanse til hvilke peptidet ikke administeres. Hver av de hunnrotter som anvendes som referanse har ovulering ved esterøs,

mens ingen av de behandlede rotter ovulerer. Følgelig anses peptidet å inneha en signifikant virkning når det gjelder å forhindre ovulering i hunnrotter ved meget lave doser og peptidet anses å være fullstendig effektivt ved doser på omkring 10 mikrogram. Ytterligere utprøving utføres ved lavere doser idet resultatene er gjengitt i den etterfølgende tabell II.

Peptidene 2-17 fremstilles og renses på lignende måte. Etter at aminosyreanalysen er utført, stadfestes renheten ved hplc idet det anvendes forskjelld/ge løsningsmiddel-systemer. In vitroutprøving på lignende måte viser at noen av peptidene har en virkning i forhold til den nåværende standard antagonisk som angitt. In vivoutprøvning utføres med varierende doser for andre peptider og resultatene er angitt i tabell II.

Alle de i tabell I angitte peptider'ansees å være effektive når det gjelder å blokkere GnRH-indusert LH utskillelse in vitro ved en rimelig konsentrasjon. Mange av disse peptidene er langt mer virkningsfulle in vivo enn den nåværende standard.

Aile peptidene ansees å være effektive når det gjelder å forhindre ovulering i hunnpattedyr ved meget lave doser, og enkelte utvalgte peptider ansees å være i det minste dobbelt så virksomme som tidligere kjente og utprøvde GnRH antagonister.

Peptidene i følge oppfinnelsen administreres ofte i form

av farmasøytisk akseptable ikke-giftige salter så som syreaddisjonssalter eller som metallkomplekser, f.eks. metallkomplekser av sink, barium, kalsium, magnesium og aluminium (som ansees å være addisjonssalter når det gjelder foreliggende søknad) eller som kombinasjoner av de to. Illustrer-ende eksempler på slike syreaddisjonssalter er hydroklorid, hydrobromid, sulfat, fosfat, nitra, oksalat, fumarat, glukonat, tannat, maleat, acetat, citrat, benzoat, succiat, alginat, malat, ascofbat og tartrat dersom den aktive bestanddel skal administreres i tablettform kan tabletten inneholde en fermasøytisk akseptabel diluent som innbe-fatter et bindemiddel, så som tragant, maisstivelse eller gelantin et disintegreringsmiddel så som alginsyre og et smøremiddel så som magnesiumstearat. Dersom administra-sjonen ønskes å skje i form av en væske, kan et søknings-middel og eller et aromastoff anvendes som en del av den farmasøytiske akseptable diluent og ved intravenøs administrasjon som isotone saltløsninger eller fosfatbufferløs-ninger.

Farmasøytiske preparater vil i alminnelighet inneholde peptide i blanding med en konvensjonell fermasøytisk akseptabel bærer. Dosen vil vanligvis utgjøre 1 til. 100 mikrogram peptid pr. kilogram legemsvekt når det gies introvenøst, mens orale doser vil være høyere. I det hele tatt vil behandlingen av pasienter med disse peptider i alminnelighet utføres på samme måte som ved den kliniske behandling der en benytter andre antagonister av GnRH.

Disse peptider kan administeres til pattedyr intravenøst, subkukant, intramusklært, oralt, perkutant, f.eks. intranasalt eller intravaginalt for å oppnå inhibering og eller kontroll av fluktbarhet og også i applikasjoner der en reversibel undertrykkelse av den gonadiske aktivitet er påkreveti;'så som ved behandlingen av for tidlig innsettende pubertet eller under bestrålnings eller kjemoterapi. Efektive doser vil variere med administrasjonsformen og ved-kommende art av pattedyrene som blir behandlet. Et eksempel på en typisk doseringsform er en bakteriostatisk vannløsning inneholdende peptide idet løsningen administreres for å oppnå en dose i område fra 0,1 til 2,5 milligram pr. kilo legemesvekt. Oral administrasjon av peptidet kan skje i enten fast eller flytende form.

Selvom oppfinnelsen er beskrevet med hensyn til dets foretrukne utførelseformer, skal det forstås at forandringer og modifikasjoner som vil være åpenbare for en fagmann med på teknikkens område, kan gjøres uten at den forlater opp-finnelsens ramme slik denne er angitt i de etterfølgende krav. F.eks. kan andre substitusjoner som er kjent fra teknikkens område og som ikke reduserer aktiviteten til peptidene anvendes i peptidene i følge oppfinnelsen.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et peptid eller et ikke-toksisk salt derav med formelen: X- R1-R2-D-Trp-R4-R5-Rg-R7-Arg-Pro-R10, hvori X er hydrogen eller en acylgruppe med 7 eller færre karbonatomer, R^ er dehydro-Pro, D-pGlu, D-Phe, D-Trp eller J> -D-NAL, R2 er Cl-D-Phe, F-D-Phe, N02~ D-Phe, C cL Me-4-Cl-D-Phe, C12~ D-Phe eller Br-D-Phe, R4 er Ser, Orn, AAL eller aBu, R,, er Tyr, 3-F-Phe, 2-F-Phe, 3-I-Tyr,

3- CH3-Phe, 2-Ch3 -Phe, 3-Cl-Phe eller 2-Cl-Phe, Rg er en D-isomer av en lipofil aminosyre eller 4-NH2~ D-Phe,

4- gua-D-Phe, D-His, D-Lys, D-Orn, D-Har eller D-Arg, R7 er Leu eller N<*Me-Leu, og R1Q er Gly-NH2 -Gly-OCH3 , Gly-OCH2 CH3 , Sar-NH2 , D-Ala-NH2 eller NH-Y, hvori Y er lavere alkyl cykloalkyl, fluor lavere alkyl eller NH-CO-NH-Q, hvor Q er H eller lavere alkyl, hvori D-Trp i 3-stillingen kan være byttet ut med & -D-2NAL imidlertid under forutsetning av at R^ er -D-NAL, så er Rg 4-NH2~ D-Phe, 4-gua-D-Phe, D-His, D-Lys, D-Orn eller D-Arg videre under forutsetning av at når R^ er Tyr eller 2-Cl-Phe så er enten R. Orn AAL eller aBu eller R. er 4 1 £ -D-2NAL og Rg er D-His eller 4-gua-D-Phe, karakterisert ved at (:å) fremstilles en intermediær forbindelse med formelen: XI- R1-R2-D-Trp ( X2 ) -R4 ( X3 ) -R5 ( X4') -Rg ( X5 ) -Leu-Arg ( X5 ) -Pro-X^, vhori X1 er hydrogen eller en© d-aminobeskyttelses-gruppe, X <2> er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for indolnitrogenet, X <3> er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for den alkoholiske hydroksylgruppen i Ser eller en beskyttelsesgruppe for en sidekjede av aminogruppe, X 4er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for den fenoliske hydroksylgruppe i Tyr, X^ er hydrgoen eller en beskyttelsesgruppe for sidekjeden, og X^ er Gly-0-CH2~ (harpiksbærer), 0-CH2~ (harpiksbærer), D-Ala-0-CH2~ (harpiksbærer), Gly-NH-(harpiksbærer), D-Ala-NH- (harpiksbærer), Gly-NH-, og estere, amider og hydrasider, 1 (b) ved avspaltning av en eller flere av gruppen X til X^ og eller avspaltning av harpiksbæreren som innbefattes av X^ og om ønskes, (c) omdanning av' det oppnådde peptid til et ikke-toksisk salt derav.

2. Fremgangsmåte i følge krav 1, karakterisert ved at X <1> er hydrogen eller en© C-aminobeskyttelsesgruppe, X 2enten er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for indolnitrogenet i Trp idet nevnte beskyttelsesgruppe utgjøres av formyl eller benzyl, X <3> er en beskyttelsesgruppe for den alkoholiske hydroksylgruppe i Ser idet nevnte beskyttelsesgruppe utgjøres av acetyl, benzoyl, tetrahydropyranyl, tert-butyl, trityl, benzyl eller 2,6-diklorbenzyl, X 4 enten er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for den fenoliske hydroksylgruppe i Tyr idet nevnte beskyttelsesgruppe utgjøres av tetrahydropyranyl, tert-butyl, trityl, benzyl, benzyloksykarbonyl, 4-bromo-benzyloksykarbonyl eller 2,6-diklorbenzyl, X 5 enten er hydrogen, .eller en beskyttelsesgruppe for guanidinogruppen i Arg eller aminogruppen i Lys eller imidazolgruppen i His idet nevnte beskyttelsesgruppe utgjøres av nitro, Tos, trityl, benzyloksykarbonyl, adamantyloksykarbonyl, Z eller BOC, og X^ utgjø res av OC^-TharpiksbærerJ , D-A1A-0CH2~ [harpiksbærer} , D-Ala-NH-(harpiksbærer} eller den frie syre ester, amid eller hydrazid av enten Gly eller D-Ala eller direkte forbundet til Pro.

3. Fremgangsmåte i følge krav 2, 1 2 karakterisert ved at X er Boe, X er 3 4 hydrogen, X er benzyl, X er hydrogen eller 2,6-diklor-bensyl, X erT os ogX ^ erG ly-NH- fharpiksbærerj .

4. Fremgangsmåte i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at Rj er 4-Cl-D-Phe eller 4-F-D-Phe.

5. Fremgangsmåte i følge hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at R. er« P-D-2NAL og Rg er D-Arg.

6. Fremgangsmåte i følge hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved 'at R^. er 2-CH^ -Phe, 3-CH3 -Phe eller 3-I-Tyr og R4 er Ser.

7. Fremgangsmåte i følge hvilket som helst av kravene 1 til 6, karakterisert ved at X er Ac eller Acr og R^ er Leu.

8. Fremgangsmåte i følge krav 4, karakterisert ved at X er Ac, R^ er dehydro-Pro, R4 er Ser, Rj. er 3-F-Phe, Rg er D-Trp og R^ er Leu.

9. Fremgangsmåte i følge krav 4, karakterisert ved at X er Ac, R^ er & -D-2NAL, R2 er 4-F-D-Phe, R4 er Ser, R5 er 2-CH3 -Phe, 3-I-Tyr eller 3-CH3~ Phe og Rg er D-Arg.

10. Fremgangsmåte i følge krav 1, karakterisert ved at peptidet har formelen: Ac-dehydro-Pro-4-F-D-Phe-£-D-2NAL-Orn-Tyr-£-D-2NAL-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 .